Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C02F101/32 B09C1/10 C12R1/38 

Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, предназначенного для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов воде, в дерново-подзолистой почве, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.

Известен штамм бактерий Exiguobacterium sp. ELA-6, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C [Патент RU 2564105 C1, 27.09.2015, Бюл. № 27].

Известен штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C [Патент RU 2560272 C1, 20.08.2015, Бюл. № 23].

Известен биопрепарат, содержащий нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis. [SU № 1805097 A1, C02F 3/34, E02B 15/04, 1993.03.30].

Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, Bacillus sp., см. патенты РФ [RU № 2083667 С1, C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, 1997.07.10; RU № 2115629 С1, C12F 3/34, В09С 1/10, 1998.07.20; RU № 2182529 С1, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, 2002.05.20; RU № 2204597 C2, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, 2003.05.20].

Известные штаммы и биопрепараты направлены на очистку от нефти и нефтепродуктов в водных средах и почвах, но нет описания их работы на конкретных почвах и грунтах.

Задача изобретения – получение штамма бактерий, обеспечивающего активизацию биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.

В этом состоит технический результат.

Для достижения технического результата из загрязненного грунта, отобранного с участка железнодорожного полотна в г. Сыктывкар Республики Коми, выделен штамм бактерий Pseudomonas yamanorum, способный активизировать биодеструкцию нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM В-3033D.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды – Пептон – 20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSO₄х7H₂O – 0,5 г; температура – 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Штамм характеризуется следующими признаками:

I. Культурально-морфологические:

На среде МПА колонии точечные Ø < 1 мм, со слизистым чехлом (до 5 мм), палево-желтые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. В среду диффундирует неоново-желтый пигмент. На средах Чапека-Докса, Виноградского и КАА окраска колоний палевая, на средах Виноградского и КАА не образует слизи. На средах Эндо и Гисса с глюкозой отмечено обильное образование слизи.

II. Физиолого-биохимические:

Аэроб с окислительным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Каталазаположительный. Способен к нитрификации. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит.

III. Данные молекулярно генетического анализа:

> S1-09.15 6SrRNA ,

AGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAaACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTwATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTtGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG-AGTGGGTTGCACCAGAAGTAGcTAG

> S1-09.15 gyrase_subunit_B ,

aACTCCTATAAaGTATCCGGCGGTTTGCACGGTGTAGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTTTCTGAAGAGCTGATCCTGACTGTACGTCGTAGCGGCAAGATCTGGGAACAGACTTACGTTCATGGTGTTCCACAGGAACCGATGAAAATCGTCGGTGACAGCGAAAGCACTGGTACGCAGATTCACTTCAAGCCTTCGGCTGAAACCTTCAAGAACATCCACTTCAGCTGGGACATTCTGGCCAAGCGGATTCGTGAACTGTCTTTCCTGAACTCCGGTGTGGGTATCGTCCTCAAGGACGAACGCAGCGGCAAGGAAGAGCTGTTCAAGTACGAAGGCGGCCTGCGTGCGTTCGTTGAATACCTGAACACCAACAAGACCGCGGTCAATCAGGTGTTCCACTTCAACATCCAGCGTGAAGACGGCATCGGCGTAGAAATCGCCCTGCAGTGGAACGACAGCTTCAACGAGAACCTGTTGTGCTTCACCAACAACATTCCTCAGCGCGATGGCGGTACTCACCTGGTGGGTTTCCGTTCTGCACTGACGCGTAACCTGAACACCTACATCGAAGCGGAAGGCCTGGCGAAGAAACACAAAGTCGCCACCACCGGTGACGATGCCCGCGAAGGCCTAACCGCCATTATCTCGGTCAAGGTTCCGGATCCGAAGTTCAGCTCCCAGACCAAAGACAAGCTGGTGTCCTCCGAAGTGAAGACAGCGGTCGAACAGGAAATGGGCAAGTACTTCTCCGACTTCCTGCTGGAAAACCCGAACGAAGCCAAGCTGGTTGTCGGCAAGATGATCGACGCAGCACGGGCTCGTGAAGCGGCGCGTAAAGCCCGTGAGATGACGCGTCGTAAAGGTGCGCTGGATATCGCCGGCCTGCCGGGCAAACTGGCTGACTGCCAGGAGAAAGACCCTGCCCTCTCCGAACTGTACCTGGTGGAAGGTGACTC

S1-09.15_gyrB (фрагмент белковой последовательности)

SYKVSGGLHGVGVSVVNALSEELILTVRRSGKIWEQTYVHGVPQEPMKIVGDSESTGTQIHFKPSAETFKNIHFSWDILAKRIRELSFLNSGVGIVLKDERSGKEELFKYEGGLRAFVEYLNTNKTAVNQVFHFNIQREDGIGVEIALQWNDSFNENLLCFTNNIPQRDGGTHLVGFRSALTRNLNTYIEAEGLAKKHKVATTGDDAREGLTAIISVKVPDPKFSSQTKDKLVSSEVKTAVEQEMGKYFSDFLLENPNEAKLVVGKMIDAARAREAARKAREMTRRKGALDIAGLPGKLADCQEKDPALSELYLVEGD

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на на 1000 мл воды – Пептон – 20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSO₄х7H₂O – 0,5 г; агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Способность штамма к биодеструкции нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах. Результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1. Биодеструкция нефтепродуктов в присутствии штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D.

Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти и отработанного масла. На 1 л воды добавляли NaNO₃ - 5,0 г; KН₂РО₄ - 3,0 г; KCl -0,5 г; MgSO₄x5H₂O - 0,5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение 20 минут в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры. В колбы добавили (по схеме опыта) 0,1 г сырой нефти или отработанного масла и 0,5 мл наработанного штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D (титр клеток 10⁹ КОЕ). Контрольную колбу микроорганизмами не заражали.

Условия опыта: культивирование в течение 14 суток (220 об/мин) при комнатной температуре.

Спустя 1 и 14 суток в пробах проводили определение нефтепродуктов.

Содержание нефтепродуктов в почве анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат – 02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98.

Как видно из таблицы 1, содержание остаточных углеводородов уменьшилось за 14 суток на 36.8 – 96%.

Таблица 1

Изменение концентрации нефтепродуктов в водных пробах

Вариант опыта Концентрация нефтепродуктов в пробах после экспозиции, мг 1 сутки 14 суток Контроль (водная среда + отработанное масло) 58.9 68.8 Среда + 0.1 г отработанного масла + 0.5 мл штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D 55.4 37.2 Контроль (водная среда + нефть) 85.8 68.7 Среда + 0.1 г нефть + 0.5 мл штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D 45.2 26.9

Пример 2.В масляный грунт – 250 г, отобранный с участка железнодорожного полотна добавляли биомассу штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D (титр клеток 10⁹ КОЕ) в количестве 25 мл и перемешивали. Биомассу штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D нарабатывали на среде следующего состава: на 1000 мл воды – Пептон – 20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSO₄х7H₂O – 0,5 г; при температуре – 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации. Контролем служил необработанный масляный грунт, отобранный с железнодорожного полотна. Масляный грунт представлял из себя мелкую песчано-гравийную смесь, сильно загрязненную маслом.

Пробы анализировали на остаточное содержание нефтепродуктов в начале эксперимента, спустя 30 и 90 суток.

В процессе очистки наблюдается динамика снижения остаточных нефтепродуктов в масляном грунте (табл. 2). Эффективность очистки составила 35 % за 90 суток.

Таблица 2

Изменение концентрации нефтепродуктов в пробах масляного грунта

Вариант опыта Концентрация нефтепродуктов в пробах после экспозиции, мг/г 0 суток 30 суток 90 суток Контроль (масляный грунт) 20.0 ± 5.0 20.0 ± 5.0 20.0 ± 5.0 Масляный грунт + 5 мл штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D 17.0 ± 5.0 16.0 ± 5.0 13.0 ± 4.0

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D, предназначенный для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги. Изобретение обеспечивает уменьшение содержания остаточных углеводородов в водной среде за 14 дней на 36.8 – 96% и эффективность очистки в масляном грунте 35% за 90 суток. 2 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.