СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ДЕРМЫ Российский патент 2017 года по МПК A61K35/36 

Описание патента на изобретение RU2617237C2

Изобретение относится к цитологии, дерматологии и может быть использовано для получения изолированных клеток дермы с целью цитометрии и фенотипирования.

Известны способы получения изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей [1, 2]. Прототипом заявленного изобретения является способ получения препаратов изолированных клеток [3], включающий в себя длительную (14-20 суток) фиксацию ткани в 10% формалине, с последующим замораживанием кусочка ткани хлорэтилом, приготовление срезов препарата на микротоме, окрашивание гематоксилин-эозином, диссоциацию в 50% водном растворе гидроксида калия в течение 2,5-3 часов, отмывание дистиллированной водой, при температуре 18-20°С пятикратно, по 5 минут, гомогенизацию материала струей воды из микропипетки, приготовление мазков из полученной суспензии по общепринятой методике. Описанный способ позволяет приготовить суспензию изолированных клеток для последующего изучения. Однако недостатками описанного способа являются необходимость использования в процессе приготовления суспензии хлорэтила, необходимость выполнения срезов замороженного материала на микротоме и получение суспензии с низкой концентрацией клеток за счет потери клеточного материала на этапе отмывания. Задача предлагаемого изобретения: получение более концентрированных препаратов клеток, содержащихся в дерме. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение затрат в процессе выделения изолированных клеток дермы, возможность получения более качественных клеточных изолятов за счет более высокой их концентрации.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что фиксированные в формалине кусочки кожи нарезают микротомным ножом при температуре 18-20°С мелкими фрагментами, заливают 1 мл 50% гидроксида калия на 15 часов при температуре 18-20°С, промывают дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизируют клеточный материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Фиксированный в течение 14 суток в гистологическом забуференном 10% нейтральном формалине кусочек кожи без предварительной заморозки нарезают микротомным ножом (или микротомным лезвием) на мелкие фрагменты толщиной до 3 мм, помещают полученные фрагменты в центрифужную градуированную пробирку. Заливают фрагменты 1 мл 50% водного раствора гидроксида калия на 15 часов, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации пипеткой Пастера и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 5 мл. Гомогенизируют материал при помощи струи воды из пипетки Пастера объемом 2 мл в течение 2-3 минут, доводят объем воды в пробирке до 10 мл и центрифугируют в течение 5 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют воду из пробирки таким образом, чтобы клеточный осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, измеряют рН при помощи универсальной индикаторной бумаги, добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Цикл гомогенизации и центрифугирования повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН 4,0-5,0 в надосадочной жидкости суспендируют полученный клеточный материал путем многократного пассажа содержимого пробирки пипеткой Пастера, полученную суспензию клеток наносят на предметное стекло, готовят мазки по общепринятой методике.

Способ позволяет расширить возможности получения концентрированных клеточных суспензий для выделения и последующего изучения клеток дермы. Заявленный способ является менее затратным по сравнению с описанными ранее способами, позволяет выполнять приготовление материала без использования заморозки хлорэтилом или другим методом, не требует применения микротома и окрашивания среза гематоксилин-эозином. Кроме того, применение в заявленном способе этапа центрифугирования материала позволяет достичь более высокой концентрации изолированных клеток в суспензии и предотвратить потерю клеток во время гомогенизации.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А. и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей. Цитология, 1975, Т. 12, №11, стр. 1332-1338.

2. Коган М.Е., Белов Л.Н., Леонтьева Т.А. Определение количества клеток в различных органах и тканях после щелочной диссоциации. Архив патологии, 1976, Т. 38, №1, стр. 77-80 (прототип).

3. Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., Лисишников Л.В. Способ получения препаратов изолированных клеток. Патент РФ 2104524, заявка 94018751/14, 23.05.1994.

Похожие патенты RU2617237C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ ВОЛОКОН ДЕРМЫ 2020
  • Горбатова Любовь Николаевна
  • Шутский Никита Алексеевич
  • Кашутин Сергей Леонидович
  • Малявская Светлана Ивановна
  • Шагров Леонид Леонидович
  • Мизгирев Денис Владимирович
  • Чухчин Дмитрий Германович
RU2764514C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ИЗ ЧЕЛЮСТИ 2021
  • Горбатова Любовь Николаевна
  • Шутский Никита Алексеевич
  • Кашутин Сергей Леонидович
  • Малявская Светлана Ивановна
  • Шагров Леонид Леонидович
  • Мизгирев Денис Владимирович
  • Оправин Александр Сергеевич
  • Мызнова Карина Игоревна
RU2776930C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК 1994
  • Зашихин А.Л.
  • Агафонов Ю.В.
  • Лисишников Л.В.
RU2104524C1
Способ комплексной морфологической диагностики рака яичников 2015
  • Леонов Михаил Генрихович
  • Беляева Софья Александровна
  • Ершова Янина Хаим-Беньяминовна
RU2640189C2
Способ изготовления клеточного блока клеточного материала 2019
  • Тихонов Яков Николаевич
  • Назарова Ирина Владимировна
  • Рева Иван Владимирович
  • Цегольник Екатерина Вадимовна
  • Тудаков Владислав Сергеевич
  • Рева Галина Витальевна
  • Енина Светлана Владимировна
  • Горелик Максим Зимулович
  • Олексенко Олеся Михайловна
  • Коцюрбий Евгений Анатольевич
  • Тилик Татьяна Валерьевна
  • Толмачёв Валерий Евгеньевич
RU2722661C1
Способ определения количества коллагена в ткани 2018
  • Малявская Светлана Ивановна
  • Кашутин Сергей Леонидович
  • Шутинский Никита Алексеевич
  • Шагров Леонид Леонидович
  • Мизгирёв Денис Владимирович
  • Аксенов Андрей Сергеевич
  • Чухчин Дмитрий Германович
RU2689337C1
Способ приготовления клеточных блоков на основе эксфолиативного материала шейки матки и цервикального канала 2020
  • Волкова Лариса Владимировна
  • Козлов Николай Николаевич
  • Демин Максим Викторович
  • Антишина Анастасия Андреевна
RU2740431C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 2005
  • Захарова Галина Порфирьевна
  • Шабалин Владимир Владимирович
  • Янов Юрий Константинович
  • Тырнова Елена Валентиновна
  • Клячко Людмила Леонидовна
  • Шабалина Оксана Николаевна
RU2293324C2
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ ИЗ МОКРОТЫ 2010
  • Жаков Ярослав Игоревич
  • Бабайлов Михаил Сергеевич
  • Брюхин Геннадий Васильевич
  • Минина Елена Евгеньевна
  • Куличков Владимир Ильич
  • Ишимова Валентина Сергеевна
RU2430362C1
СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УРОВНЯ КОНТАМИНАЦИИ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ПОСЕВЕ НА ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ Mycobacterium tuberculosis complex 2022
  • Шарипов Рауль Ахнафович
  • Мавзютов Айрат Радикович
  • Галеева Люция Ревовна
  • Байгузина Зария Рашитовна
  • Сидоров Игорь Вячеславович
RU2786394C1

Реферат патента 2017 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ДЕРМЫ

Изобретение относится к цитологии, дерматологии и касается способа получения препаратов изолированных клеток дермы, что может быть использовано для получения препаратов изолированных клеток дермы с целью цитометрии и фенотипирования. Способ осуществляют следующим образом: после фиксации в формалине кусочков кожи нарезают их при температуре 18-20°С микротомным ножом, обрабатывают 50% гидроксидом калия в течение 15 часов, гомогенизируют клеточный материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии. Изобретение обеспечивает уменьшение затрат при выделении изолированных клеток дермы, возможность получения более качественных клеточных изолятов за счет более высокой концентрации клеток.

Формула изобретения RU 2 617 237 C2

Способ получения препаратов изолированных клеток дермы, заключающийся в обработке фиксированных в формалине кусочков кожи 50% гидроксидом калия, гомогенизации клеточного материала струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, отличающийся тем, что фиксированные кусочки при температуре 18-20°C нарезают микротомным ножом, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2617237C2

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ И ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ 2008
  • Парфенова Елена Викторовна
  • Ткачук Всеволод Арсеньевич
  • Рубина Ксения Андреевна
  • Калинина Наталья Игоревна
  • Сысоева Вероника Юрьевна
RU2382077C1
КОМПОЗИЦИЯ ФИЛЛЕРА ДЛЯ МЯГКИХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ИНЪЕКЦИИ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2007
  • Хан Бин
  • Чой Дзай До
  • Нам Мин Дзунг
RU2396084C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК КОЖИ 2007
  • Макеев Олег Германович
  • Зубанов Павел Сергеевич
  • Улыбин Алексей Игоревич
RU2345781C2
WO 2006125991 A1, 30.11.2006.

RU 2 617 237 C2

Авторы

Кашутин Сергей Леонидович

Журавлёв Леонид Михайлович

Вилова Ксения Геннадьевна

Мизгирёв Денис Владимирович

Зашихин Андрей Леонидович

Даты

2017-04-24Публикация

2015-06-23Подача