СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к цитологии.

Препараты изолированных клеток применяются в цитологических исследованиях при изучении процессов гистогенетического развития различных тканей, изучении цитофизиологических закономерностей формирования гипертрофических и атрофических процессов.

В настоящее время известны способы получения изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей [1, 2].

В качестве прототипа использован способ получения препаратов изолированных клеток [2], включающий в себя длительную (14 - 20 сут) фиксацию ткани в 10% формалине, диссоциацию в 50% водном растворе KOH в течение 16 - 20 часов, гомогенизацию полученного материала стеклянной палочкой, промывку полученной суспензии и нанесение ее на предметное стекло с последующей окраской.

Однако недостатком существующего способа является невозможность избирательного выделения заданных тканевых компонентов органов, что является необходимым условием осуществления количественного селективного анализа определенных клеточных элементов.

Задачей изобретения является получение препаратов, содержащих только те типы клеток, которые необходимо исследовать.

Указанная задача достигается тем, что фиксированные ткани замораживают, из срезов толщиной 20 - 40 мкм прицельно выделяют фрагмент из заданных тканевых компонентов органов, диссоциируют его в 50% KOH 2,5 - 3 ч при t = 18 - 20^oC, отмывку производят пятикратно водой t = 18 - 20^oC по 5 мин.

Предложенный способ заключается в том, что фиксированный в течение 14 - 20 сут в 10% формалине кусочек органа замораживают хлорэтилом. Из срезов толщиной 20 - 40 мкм прицельно, под контролем микроскопа, выделяют фрагмент, содержащий заданные тканевые компоненты, диссоциируют его в 50% водном растворе KOH в течение 2,5 - 3 ч, отмывают материал дистиллированной водой при температуре 18 - 20^oC пятикратно по 5 мин. Гомогенизацию полученного материала производят при помощи струи воды из микропипетки. Из полученной суспензии готовят мазки по общепринятой методике. Ввиду того, что при прицельном выделении объем получаемой ткани составляет 0,1 - 0,05 см³, чтобы избежать повреждения клеток необходимо проводить диссоциацию не более 2,5 - 3 ч при температуре 18-20^o. Как правило, при данном режиме диссоциации происходит корректное разделение клеток, без нарушения целостности клеточных мембран. Изменение режимов обработки в сторону уменьшения времени экспозиции в щелочи или снижения температуры раствора не приводит к полному разделению клеток. Отмывку материала от щелочи производят пятикратно по 5 мин дистиллированной водой, удаляя старую порцию надосадочной жидкости и добавляя дистиллированную воду (до 10 мл). При этом достигается полное освобождение материала от щелочи. Менее тщательная отмывка материала служит источником появления кристаллов KOH на мазках и ухудшению взаимодействия материала с красителями при окраске. Увеличение числа промывок ведет к неоправданной потере клеточного материала.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

При исследовании миоцитов, входящих в состав стенки бронхов легкого и проведении диссоциации способом, описанным в [1, 2], взвесь клеток будет включать в себя гладкие миоциты и бронхов и расположенных рядом кровеносных сосудов. Это не позволяет проводить дифференцированный анализ мышечных клеток, входящих в состав стенки воздухоносных путей.

Поэтому кусочки ткани фиксируют в 10% формалине на фосфатном буфере (pH = 7,2 - 7,4) в течение 14 - 20 сут. После этого материал замораживают хлорэтилом и на санном микротоме изготавливают срезу толщиной 50 - 60 мкм. Полученные срезы переносят на предметное стекло и под стереомикроскопом, в режиме темного поля, с помощью микроманипулятора производят выделение из препарата нужного участка ткани. Для точной ориентации один из срезов толщиной 10 мкм, предварительно окрашивают гематоксилин-эозином и используют в качестве ориентира. Необходимый фрагмент вырезают и помещают в пробирку с 1,0 мл 50% водного раствора KOH на 2,5 - 3 ч при температуре 18 - 20^o. По прошествии данного времени избыток щелочи удаляют микропипеткой, и в пробирку добавляют 10 мл дистиллированной воды t = 18 - 20^o на 5 мин. После этого воду удаляют из пробирки микропипеткой и материал вновь заливают свежей порцией дистиллированной воды. Указанную операцию повторяют 4 - 5 раз. Контроль pH материала осуществляют постоянно в течение операции. После полного освобождения материала от щелочи последнюю порцию воды тщательно удаляют микропипеткой и в пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды. При гомогенизации материала используют силу гидроудара струи жидкости из микропипетки, что оказывает более щадящее воздействие, чем при разрушении агломератов клеток стеклянной палочкой или другом механическом воздействии. Для этого путем осторожного пассажа содержимого пробирки микропипеткой достигают получения однородной взвеси клеток, из которой готовят мазки по общепринятой методике.

На чертеже показан препарат, содержащий диссоциированные гладкие миоциты бронхов (увеличение 200).

В отличие от серийных срезов при анализе препаратов изолированных клеток снимается комплекс технических ошибок (неравномерность толщины гистологических препаратов, различный уровень срезов клеток и ядер, нечеткость границ клеток в составе пласта), возникающих при морфометрических и цитоспектрофотометрических исследованиях.

Данный способ позволяет:
производить прицельное выделение микрофрагментов тканей различных органов, что дает возможность селективного анализа диссоциированных клеток, входящих только в состав изучаемых структур тканей,
не деформирует структуру исследуемой ткани,
позволяет подготовить избирательную диссоциацию любых типов клеточных элементов, т. к. структуры, содержащие клетки другого вида, исключаются из анализа на предварительном этапе данного метода исследования,
щадящий режим обработки материала сокращает время, затрачиваемое на выполнение исследования, приблизительно в 10 раз и увеличивает на выходе количество неповрежденных клеточных форм.

Источники информации
1. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А. и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей. Цитология, 1975, т. 12, N 11, стр. 1332-1338.

2. Коган М.Е., Белов Л.Н., Леонтьева Т.А. Определение количества клеток в различных органах и тканях после щелочной диссоциации - Архив патологии, 1976, т. 38, N 1, стр. 77-80 (прототип).

Способ может быть использован в цитологии для цитологических исследований при изучении процессов гистогенетического развития различных тканей, изучении цитофизиологических закономерностей формирования гипертрофических и атрофических процессов. Получают препараты, содержащие только те типы клеток, которые необходимо исследовать. Для этого фиксированные формалином в течение 14 - 20 сут ткани замораживают. Из срезов толщиной 20 - 40 мкм прицельно выделяют фрагмент из заданных тканевых компонентов органов. Диссоциируют его в 50% KOH 2,5 - 3 ч при температуре 18 - 20^oC и производят пятикратно отмывку водой при комнатной температуре 18 - 20^oC по 5 мин. Способ позволяет производить прицельное выделение микрофрагментов тканей различных органов, что дает возможность селективного анализа диссоциированных клеток, входящих только в состав изучаемых структур тканей. 1 ил.

Способ получения препаратов изолированных клеток путем щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей с последующей отмывкой и разделением, отличающийся тем, что фиксированные ткани замораживают, из срезов толщиной 20 40 мкм прицельно выделяют фрагмент из заданных тканевых компонентов органов, диссоциируют в щелочи 2,5 3,0 ч при 18 20^oС, отмывку производят пятикратно водой при 18 20^oС по 5 мин.