СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭЛАСТИЧЕСКИХ ВОЛОКОН ИЗ ТКАНИ АОРТЫ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 C07K14/78 A61L27/24 

Изобретение относится к гистологии, регенеративной медицине и может быть использовано для выделения отдельных волокон эластина аорты.

Известен способ получения эластических волокон из затылочной связки плода крупного рогатого скота путем обработки гомогенизированной связки 5 М гуанидином с последующим расщеплением коллагеназой. Полученный препарат состоит из эластических волокон, морфологически идентичных тем, что наблюдались in vivo. Микрофибриллярные компоненты этих эластических волокон удаляют либо протеолитическими ферментами, либо восстановлением дисульфидных связей дитиоэритритолом в 5 М гуанидине [1]. Недостатками указанного способа являются дороговизна, а также большие затраты времени. Также известен способ получения сухого гидролизата эластина, заключающийся в выделении белка - эластина из выйной связки, полученной при жиловке шейного отруба крупного рогатого скота, которую зачищают от остатков мышечной и жировой тканей путем последовательной экстракции ацетоном, эфиром и щелочью с последующим высушиванием и измельчением [2]. Недостатками указанного способа являются применение токсичного ацетона и механической обработки.

Прототипом заявленного изобретения является способ выделения коллагеновых волокон дермы [3], позволяющий выделять волокна из ткани дермы.

Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей выделения эластических волокон из ткани аорты. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение материальных и временных затрат в процессе выделения эластических волокон из ткани аорты.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что образец аорты измельчают, промывают дистиллированной водой. После удаления промывных вод, проводят ферментативный гидролиз материала 1% раствором коллагеназы II типа с ферментативной активностью 230 ед/мг. Емкость с содержимым помещают в шейкер-инкубатор на 2 часа при температуре 37°С и 250 оборотов в минуту. По истечении времени проводят промывку материала в дистиллированной воде и центрифугируют при 3400 оборотов в минуту в течение 5 мин 3 раза. После этого, промытый образец выдерживают в формалине в течение 2 недель. Фиксированные в формалине кусочки аорты нарезают микротомным ножом при температуре 18-20°С мелкими фрагментами, заливают 40% раствором гидроксида калия в объеме, достаточном для полного погружения материала на 24 часа при температуре 18-20°С, промывают дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизируют материал при помощи многократного пассажа содержимого пипеткой Пастера и центрифугируют при 1600 оборотов в минуту в течение 10 минут, с последующим суспендированием, с проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, материал переносят в пробирку Эппендорф, замораживают полученную суспензию при -80°С, лиофильно высушивают при 0,080 мбар и -40°С, полученный лиофилизат после полного высушивания переносят на двухсторонний скотч для дальнейшего исследования в электронно-сканирующем микроскопе.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Образец аорты измельчают, промывают дистиллированной водой. После удаления промывных вод, проводят ферментативный гидролиз материала 1% раствором коллагеназы II типа с ферментативной активностью 230 ед/мг. Емкость с содержимым помещают в шейкер-инкубатор на 2 часа при температуре 37°С и 250 оборотов в минуту. По истечении времени проводят промывку материала в дистиллированной воде и центрифугируют при 3400 оборотов в минуту в течение 5 мин 3 раза. После этого промытый образец выдерживают в гистологическом забуференном 10% нейтральном формалине в течение 2 недель. Фиксированный в формалине кусочек аорты животного, полученный путем нарезки скальпелем, без предварительной заморозки нарезают микротомным ножом (или микротомным лезвием) на мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, помещают полученные фрагменты в центрифужную градуированную пробирку. Заливают фрагменты 40% водным раствором гидроксида калия в объеме, достаточном для полного погружения материала на 24 часа, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации пипеткой Пастера и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 3 мл. Гомогенизируют материал при помощи многократного пассажа содержимого пипеткой Пастера объемом 2 мл в течение 10 минут, доводят объем воды в пробирке до 10 мл и центрифугируют в течение 10 минут при 1600 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют воду из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, измеряют рН при помощи универсальной индикаторной бумаги, добавляют дистиллированную воду до объема 3 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Цикл гомогенизации и центрифугирования повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее пяти раз. После достижения целевого уровня рН в надосадочной жидкости суспендируют полученный материал путем многократного пассажа содержимого пробирки пипеткой Пастера, полученную суспензию переносят в градуированную пробирку Эппендорф, вместимостью 1,5 мл, замораживают при -80°С и лиофильно высушивают. После полного высушивания лиофилизат переносят на двухсторонний скотч для дальнейшего исследования в электронно-сканирующем микроскопе.

Способ позволяет расширить возможности получения отдельных эластических волокон для последующего изучения их морфологии, без применения гистологических красок. Заявленный способ позволяет снизить материальные и временные затраты на проведение анализа по сравнению с описанными ранее способами, позволяет выполнять приготовление материала без использования пастеризации или стерилизации, не требует применения микротома, дополнительного окрашивания и сушки конечного продукта. Кроме того, применение в заявленном способе этапов ферментативного гидролиза и центрифугирования материала позволяет достичь более высокого содержания отдельных эластических волокон в лиофилизате, избегая присутствия коллагеновых волокон и карбогидратов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Russell R., Paul В. THE ETASTIC FIBER // TEE JOURNAL OF CELL BIOLOGY. - 1969. - №40. - C. 366.

2. Битуева Э.Б., Жамсаранова С.Д. Способ получения сухого гидролизата эластина. Патент №2617237, заявка 2003123478-13, 23.07.2003, Бюллетень №4.

3. Горбатова Л.Н., Шутский Н.А., Кашутин С.Л., Малявская С.И., Шатров Л.Л., Мизгирев Д.В., Чухчин Д.Г. Способ выделения коллагеновых волокон дермы. Патент 2020142837, 23.12.2020, Бюллютень №2.

Изобретение относится к гистологии, регенеративной медицине и может быть использовано для выделения эластических волокон из ткани аорты. Измельчают фрагменты аорты, предварительно обработанные и промытые в дистиллированной воде и центрифугированные при 3400 об/мин в течение 5 мин трехкратно, замачивании в формалине и обработке раствором гидроксида калия с полным погружением материала в течение 24 ч при температуре 18-20°С, промывании дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизации при помощи многократного пассажа содержимого пипеткой Пастера, центрифугировании при 1600 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием, проведении не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала, переносе полученной суспензии в градуированную пробирку Эппендорф вместимостью 1,5 мл, замораживании при -80°С и лиофильном высушивании при 0,080 мбар и -40°С, с последующим переносом лиофилизата на двухсторонний скотч для дальнейшего исследования. При этом предварительную обработку образца аорты подвергают ферментативному гидролизу 1% раствором бактериальной коллагеназы II типа ферментативной активностью 230 ед./мг в шейкер-инкубаторе в течение 2 ч при температуре 37°С и 250 об/мин. Замачивают образец аорты в 10% забуференном формалине в течение 2 недель, используют 40% раствор гидроксида калия, циклы гомогенизации и центрифугирования проводят до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0. Изобретение обеспечивает уменьшение материальных и временных затрат в процессе выделения эластических волокон из ткани аорты.

Способ выделения эластических волокон из ткани аорты, заключающийся в измельчении фрагментов аорты, предварительно обработанных и промытых в дистиллированной воде и центрифугированных при 3400 об/мин в течение 5 мин трехкратно, микротомным ножом, их замачивании в формалине и обработке раствором гидроксида калия в объеме, достаточном для полного погружения материала в течение 24 ч при температуре 18-20°С, промывании дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизации материала при помощи многократного пассажа содержимого пипеткой Пастера, центрифугировании при 1600 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием, проведении не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала, переносе полученной суспензии в градуированную пробирку Эппендорф вместимостью 1,5 мл, замораживании при -80°С и лиофильном высушивании при 0,080 мбар и -40°С, с последующим переносом лиофилизата на двухсторонний скотч для дальнейшего исследования, отличающийся тем, что предварительную обработку образца аорты подвергают ферментативному гидролизу 1% раствором бактериальной коллагеназы II типа ферментативной активностью 230 ед./мг в шейкер-инкубаторе в течение 2 ч при температуре 37°С и 250 об/мин, замачивают образец аорты в 10% забуференном формалине в течение 2 недель, используют 40% раствор гидроксида калия, циклы гомогенизации и центрифугирования проводят до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0.