СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ИЗ ЧЕЛЮСТИ Российский патент 2022 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к гистологии, стоматологии, и может быть использовано для выделения изолированных клеток из челюсти.

Известен метод выделения клеток из пульпы зуба ферментативным способом. Для этого зуб помещают в чашку Петри диаметром 60 мм, где проводят предварительное промывание пульпарной камеры зуба 2 мл 0,5% раствора коллагеназы II типа, после чего зуб находится в 2 мл 0,5% раствора коллагеназы II типа в течение 1 часа при 37°С. Затем выделенные клетки в 2 мл раствора коллагеназы II типа собирают в пробирку объемом 15 мл, куда для остановки процесса ферментации было добавляют питательную среду DMEM/F12 (ПанЭко) [1]. Недостатками указанного способа является использование ферментов. Также известен способ культивирования клеток пульпы, полученных путем помещения удаленных зубов в раствор фосфатно-солевого буфера со смесью антибиотиков. После этого равномерной механической нагрузкой зубы раскалывают с помощью молоточка и свинцовой пластинки и в последующем осторожно стерильным пинцетом извлекают цельную пульпу. В стерильных условиях пульпу измельчают и переносят в шестилуночный планшет для дальнейшего культивирования [2]. Недостатками указанного способа является проведение эксперимента в стерильных условиях, а также использование молоточка для равномерного раскола, что является затруднительным.

Прототипом заявленного изобретения является способ получения препаратов изолированных клеток дермы [3]. Положительными в данном способе являются возможность выделения клеточных компонентов из дермы, широкий спектр применения. Недостатком указанного способа является то, что он позволяет выделять клеточные структуры только из мягких тканей.

Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей выделения клеток из челюстей. Технический результат предлагаемого изобретения: снижение затрат в ходе выделения изолированных клеток челюсти, возможность получения качественных клеточных структур.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что фиксированную в формалине челюсть переносят в декальцинирующую жидкость на 10 суток, затем переносят в пробирку, заливают 1 мл 50% раствора гидроксида калия, через час челюсть достают, нарезают микротомным лезвием на мелкие фрагменты, переносят в свежий 50% раствор гидроксида калия в количестве 1 мл на 15 часов при температуре 20°С, промывают дистиллированной водой пятикратно при температуре 20°С, гомогенизируют материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, с проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, доводят объем образца до 1 мл и переносят на предметное стекло.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Фиксированную в гистологическом забуференном 10% нейтральном формалине челюсть, полученную от лабораторного животного, или ее фрагмент помещают в декальцинирующий раствор СофтиДек на основе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), предварительно разбавленный в 2 раза дистиллированной водой, на 10 суток с периодическим перемешиванием (можно использовать шейкер или любые другие перемешивающие устройства) при комнатной температуре. По истечении времени, образец переносят в емкость с 1 мл 50% раствора гидроксида калия, через 1 час челюсть или ее фрагмент достают и нарезают микротомным лезвием на мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, помещают полученные фрагменты в емкость со свежим раствором 50% раствора гидроксида калия в объеме 1 мл и оставляют при комнатной температуре на 24 часа. После этого удаляют раствор щелочи путем аспирации пипеткой Пастера и наливают дистиллированную воду при температуре 20°С в объеме 5 мл. Гомогенизируют материал при помощи струи воды из пипетки Пастера объемом 2 мл в течение 3 минут, доводят объем воды в пробирке до 10 мл и центрифугируют в течение 5 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют воду из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, измеряют рН при помощи универсальной индикаторной бумаги, добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Цикл гомогенизации и центрифугирования повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, но не менее пяти раз. После достижения целевого уровня рН 6,0 в надосадочной жидкости суспендируют полученный материал путем многократного пассажа содержимого пробирки пипеткой Пастера, полученную суспензию переносят на предметное стекло для последующего изучения.

Способ позволяет расширить возможности выделения изолированных клеток челюсти для последующего изучения их морфологии.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Лямина, С.В., Калиш, С.В., Рунова, Г.С., Малышев, И.Ю. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из пульпы зуба и их характеристика // Современные проблемы науки и образования. - 2017. - Т. 5, С. 189-189.

2. Сагитов И.И., Шафигуллина А.К., Салеева Г.Т., Гомзикова М.О., Ризванов А.А., Киясов А.П. Получение популяции эктомезенхимных клеток со свойствами стволовых и прогениторных клеток из пульпы постоянных зубов // Гены и клетки. - 2014. - Т. 9. - №3.

3. Кашутин С.Л., Журавлёв Л.М., Вилова К.Г., Мизгирёв Д.В., Зашихин А.Л. Способ получения препаратов изолированных клеток дермы. Патент №2617237, заявка 2015124695, 23.06.2015, Бюллетень №12.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, стоматологии и цитологии. Обрабатывают фиксированные в формалине заранее измельченные образцы челюстей при температуре 20°С 50% гидроксидом калия. Затем гомогенизируют материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием и проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут, до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0. Переносят материал на стекла для дальнейшего изучения. При этом перед обработкой щелочным раствором челюсть подвергают действию декальцинирующего раствора СофтиДек на основе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), предварительно разбавленного в 2 раза дистиллированной водой, придающего челюстям форму, позволяющую измельчить, провести обработку раствором щелочи и выделить изолированные клетки для дальнейшего изучения. Способ позволяет расширить возможности выделения изолированных клеток челюсти для последующего изучения их морфологии.

Способ выделения изолированных клеток из челюсти, заключающийся в обработке фиксированных в формалине заранее измельченных образцов челюстей при температуре 20°С 50% гидроксидом калия, гомогенизации материала струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут, проведением циклов гомогенизации и центрифугирования до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, с переносом материала на стекла для дальнейшего изучения, отличающийся тем, что перед обработкой щелочным раствором челюсть подвергают действию декальцинирующего раствора СофтиДек на основе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), предварительно разбавленного в 2 раза дистиллированной водой, придающего челюстям форму, позволяющую измельчить, провести обработку раствором щелочи и выделить изолированные клетки для дальнейшего изучения.