Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2017 года по МПК G01N33/58 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и разработанной отрицательной регрессионной модели зависимости величины порогового цикла амплификации от концентрации 146S-частиц.

Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое относится к категории трансграничных инфекций [2, 9]. Возбудитель принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [8]. Характерной особенностью вируса ящура является наличие 7 типов: О, А, С, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и множества топотипов с различными генетическими характеристиками [3]. При репродукции в биосистеме вирус ящура образует 3 варианта специфических компонентов: 146S-компонент («полные» частицы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представляет собой комплекс белков VP₁, VP₂, VP₃, VP₄; 75S-частицы, лишенные РНК и включающие в себя 60 копий полипептида VP₁-VP₃-VP₀; 12S-частицы, представленные белками VP₁, VP₂, VP₃ [6].

Система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота, а также контроль уровня напряженности иммунитета [4, 10]. При промышленном производстве противоящурных вакцин большое значение имеет концентрация 146S-частиц, которые обладают всеми биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, непосредственно влияющими на иммуногенность вакцины [2]. Исходя из этого, каждую партию сырья для производства противоящурной вакцины исследуют на определение концентрации 146S-компонента, применяя количественный вариант реакции связывания комплемента (РСК). Однако данный метод имеет ряд недостатков: трудоемкость и продолжительность проводимого анализа (не менее 3 суток), невозможность одновременного исследования большого количества проб, достаточно высокая себестоимость процедуры [1]. В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ.

Задачей настоящего изобретения являлась разработка более чувствительного и специфичного экспресс-метода определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача была решена благодаря созданию нового способа определения концентрации 146S-компонента (C_146S) вируса ящура в сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ, с помощью которого между значениями концентрации 146S-частиц и порогового цикла амплификации (Q) выявлена зависимость, отраженная в виде отрицательной линейной корреляции с высоким коэффициентом - 0,9959. Построенная отрицательная регрессионная модель вида C_146S=-3,401(Ct)+99,333 позволяет оценивать концентрацию «полных» частиц вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины.

Сущность изобретения заключается в новом подходе по определению концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ и отрицательной регрессионной модели. Заявляемый способ основан на проведении ОТ-ПДР-РВ с учетом сигнала с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. По итогам анализа оценивали интенсивность флуоресцентного сигнала, определяли значения порогового цикла амплификации. На основании выборки известных значений концентрации 146S-компонента вируса ящура разных типов и установленных показателей пороговых циклов амплификации разработали отрицательную регрессионную модель, позволяющую определять содержание 146S-компонента по результатам ОТ-ПЦР-РВ.

В настоящее время метод ОТ-ПЦР-РВ применяют исключительно для обнаружения вируса ящура в образцах афтозного патологического материала диких и домашних парнокопытных животных. Для оценки концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины используют РСК. По сравнению с РСК метод ОТ-ПЦР-РВ отличается высокой чувствительностью и специфичностью, является более экономичным, позволяет одновременно исследовать несколько десятков проб вируссодержащего материала для вакцины, а время проведения анализа сократить до 3-4 часов [5, 7, 11]. Исходя их этого, актуально применять данный метод и разработанную отрицательную регрессионную модель для определения концентрации 146S-частиц вируса ящура в сырье для вакцины. Ключевым элементом заявляемого способа является установление отрицательной линейной корреляционной зависимости между содержанием 146S-компонента разных типов вируса ящура в сырье для вакцины и пороговым циклом амплификации в виде регрессионной модели.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении метода ОТ-ПЦР-РВ и разработанной регрессионной модели для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины.

Сведений о разработке предлагаемого способа определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины авторами не обнаружено.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости порогового цикла амплификации от концентрации 146S-компонента вируса ящура.

Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура, эквивалентными концентрациям 146S-компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/мл. Выделяют РНК вируса ящура из вируссодержащего сырья для вакцины, а также из образцов отрицательного и положительных контролей. Элюаты РНК вируса ящура добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:10. Проводят реакцию с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, анализируют полученные данные для определения величины порогового цикла амплификации. Смесь для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие компоненты: специфичные праймеры и TagMan флуоресцентномеченые зонды (каждый) - 10 пм, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) - 10 мМ, MgCl₂ - 5 мМ, Taq ДНК-полимераза - 1 ед., AMV-ревертаза - 2,5 ед.

ОТ-ПЦР-РВ проводят при следующих температурных и временных параметрах:

- обратная транскрипция: 42°С в течение 15-20 мин,

- предварительная денатурация: 94-95°С в течение 4-5 мин,

- полимеразная цепная реакция:

- денатурация: 94-95°С в течение 15-20 с,

- отжиг праймеров: 55-57°С в течение 15-20 с,

- элонгация: 60-65°С в течение 20 с.

Амплификацию проводят в течение 40-45 циклов.

Проводят постановку ОТ-ПЦР-РВ с определением величины порогового цикла амплификации, которая обратно пропорциональна концентрации РНК вируса ящура и, соответственно, 146S-компонента.

Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины в процессе построения отрицательной регрессионной модели. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е), а также коэффициент детерминации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины.

Пример 1. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» в сырье для моновалентной сорбированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура, эквивалентными концентрациям 146S-компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/мл, а также отрицательный контроль, представляющий собой суспензию клеток линии ВНК-21/2-17, не инфицированную вирусом ящура. Стандартным методом выделяют РНК вируса ящура из вируссодержащего сырья для моновалентной сорбированной вакцины, образцов отрицательного и положительных контролей. Подготавливают смесь для проведения ОТ-ПЦР-РВ, которая включает в свой состав следующие компоненты: специфичные праймеры и TagMan флуоресцентномеченые зонды (каждый) - 10 пм, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) - 10 мМ, MgCl₂ - 5 мМ, Taq ДНК-полимераза - 1 ед., AMV-ревертаза - 2,5 ед. Элюаты РНК вируса ящура добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:10. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл.

Постановку ОТ-ПЦР-РВ осуществляют на термоциклере BioRad CFX-96 при следующих температурных и временных режимах: обратная транскрипция: 42°С в течение 15-20 мин, предварительная денатурация: 94-95°С в течение 4-5 мин, полимеразная цепная реакция: денатурация: 94-95°С в течение 15-20 с, отжиг праймеров: 55-57°С в течение 15-20 с, элонгация: 60-65°С в течение 20 с. Амплификацию проводят в течение 40-45 циклов.

Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager, определяющего величину порогового цикла амплификации, которая обратно пропорциональна концентрации РНК вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» и, соответственно, 146S-компонента. Результаты эксперимента по представлению системы параллельной оценки величины порогового цикла амплификации (C_t) и концентрации 146S-компонента вируса ящура (C_146S) в контрольных образцах отражены в таблице 1. Значения C_t для всех разведений 146S-компонента с концентрациями от 0,1 до 20,0 мкг/мл находятся в диапазоне от 29,2 до 23,1, соответственно. На основании полученных данных построена линейная регрессионная модель связи между фиксированным показателем C_t и зависимым параметром концентрации 146S-компонента: C_146S=-3,401(Ct)+99,333 (график). Эффективность реакции амплификации (Е) составляет 96,70%. В отрицательном контроле геном вируса ящура не выявлен.

На графике видно, что между концентрацией 146S-компонента вируса ящура и пороговым циклом амплификации существует зависимость, которая отражена в виде отрицательной линейной корреляции. Фактический коэффициент детерминации (R²) стремится к 1 и составляет 0,9886, что подтверждает высокую достоверность полученных результатов. Параллельно исследуемые и контрольные пробы тестировали в РСК для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура.

Как следует из таблицы 1 видно, что значение порогового цикла амплификации исследуемого сырья для производства моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» составило 28,64±0,04. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C_146S=-3,401 (Ct)+99,333 (график), значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» составило 1,93 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,90±0,05 мкг/мл). Отсюда следует, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет оценивать содержание 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины.

На следующем этапе работы по стандартной методике определяли и сравнивали иммуногенную активность моновалентной сорбированной вакцины против ящура «О/Саудовская Аравия/08» при разных способах определения 146S-компонента. Результаты исследования представлены в таблице 2, из которой следует, что при иммунизации крупного рогатого скота моновалентной сорбированной вакциной против ящура «О/Саудовская Аравия/08» с концентрацией 146S-компонента в сырье для вакцины 1,90±0,05 мкг/мл (по данным РСК) и 1,93 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 5,45±0,23 log₂ и 5,55±0,10 log₂, соответственно. Полученные средние значения титра антител коррелируют между собой, а также со значениями концентрации 146S-компонента, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Таким образом, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08».

Пример 2. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Подготовку и проведение анализа сырья для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура в ОТ-ПЦР-РВ осуществляли так же, как указано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 1, из которой видно, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья для производства моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» составило 28,61±0,03. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C_146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура типа «О/Саудовская Аравия/08» составило 2,03 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,96±0,06 мкг/мл). Отсюда следует, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет оценивать содержание 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» в сырье для вакцины.

Произведенную из полученного сырья вакцину стандартным методом оценивали на иммуногенность, проводя заражение крупного рогатого скота. Далее проводили сравнение иммуногенной активности моновалентной эмульгированной вакцины против ящура «О/Саудовская Аравия/08» при разных способах определения 146S-компонента. Результаты исследования представлены в таблице 3, из которой видно, что при иммунизации животных вакциной с концентрацией 146S-компонента 1,96±0,06 мкг/мл (по данным РСК) и 2,03 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 5,60±0,10 log₂ и 5,85±0,13 log₂, соответственно. Полученные средние значения титра антител коррелируют между собой, а также со значениями концентрации 146S-компонента, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Таким образом, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08».

Пример 3. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «АЛГурция/06» в сырье для моновалентной сорбированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» исследовали методом ОТ-ПЦР-РВ так же, как описано в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 1, в которой указано, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья составило 28,59±0,02. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком функции C_146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» составило 2,10 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,97±0,06 мкг/мл). Следовательно, разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ дает возможность определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура типа «А/Турция/06» в сырье для вакцины.

Моновалентную сорбированную вакцину против ящура топотипа «А/Турция/06» стандартным способом тестировали на иммуногенность в процессе заражения крупного рогатого скота. Определяли титр накопления специфичных антител и тем самым сравнивали иммуногенную активность вакцины при разных способах оценки содержания 146S-компонента. Результаты исследования продемонстрированы в таблице 4, из которой следует, что при иммунизации животных вакциной с концентрацией 146S-компонента 1,97±0,06 мкг/мл (по данным РСК) и 2,10 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления антител составил 5,65±0,17 log₂ и 6,10±0,10 log2, соответственно. Полученные средние значения титра близки друг к другу, а также коррелируют со значениями концентрации 146S-компонента, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Следовательно, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать содержание 146S-компонента в сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06».

Пример 4. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Постановку ОТ-ПЦР-РВ для анализа сырья для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» проводили, как указано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 1, которая показывает, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья для производства моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» составило 28,56±0,02. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C_146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» составило 2,20 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (2,07±0,08 мкг/мл). Отсюда следует, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» в сырье для вакцины.

На следующем этапе работы по стандартной методике определяли и сравнивали иммуногенную активность моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» при разных способах определения концентрации 146S-компонента. Результаты анализа отражены в таблице 5, из которой следует, что при иммунизации крупного рогатого скота данной вакциной с концентрацией 146S-компонента в сырье 2,07±0,08 мкг/мл (по данным РСК) и 2,20 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 6,00±0,11 log₂ и 6,35±0,10 log₂, соответственно. Средние значения титра накопления антител близки друг к другу и значениям концентрации 146S-компонента, определенным в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Иными словами, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06».

Пример 5. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для моновалентной сорбированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» анализировали методом ОТ-ПЦР-РВ, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 1, в которой указано, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья составило 28,60±0,02. Применяя разработанную регрессионную модель, отраженную графиком функции Q46S=-3,401(Ct)+99,333, рассчитывали значение концентрации 146S-компонента вируса ящура типа «Asia-1/Shamir/3/89», которое составило 2,06 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,92±0,09 мкг/мл). Таким образом, разработанная регрессионная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет оценивать содержание 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для вакцины.

Произведенную из полученного сырья вакцину стандартным методом исследовали на иммуногенность, проводя заражение крупного рогатого скота. Далее проводили сравнение иммуногенной активности моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» при разных способах определения концентрации 146S-компонента. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 6, из которой видно, что при иммунизации животных вакциной с концентрацией 146S-компонента 1,92±0,09 мкг/мл (по данным РСК) и 2,06 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме иммунизированных животных составил 5,50±0,18 log2 и 6,00±0,25 log2, соответственно. Полученные средние значения титра антител коррелируют между собой, а также со значениями концентрации 146S-частиц, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Следовательно, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно определять концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89».

Пример 6. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Исследование сырья для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в ОТ-ПЦР-РВ проводили, как указано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 1, из которой видно, что значение порогового цикла амплификации анализируемого вируссодержащего сырья для производства моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» составило 28,54±0,03. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C_146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» составило 2,27 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (2,00±0,11 мкг/мл). Таким образом, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ дает возможность определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для вакцины.

На следующем этапе работы стандартным методом определяли и сравнивали иммуногенную активность моновалентной эмульгированной вакцины против ящура «Asia-1/Shamir/3/89» при разных способах определения содержания 146S-компонента. Результаты анализа представлены в таблице 7, из которой видно, что при иммунизации крупного рогатого скота данной вакциной с концентрацией 146S-компонента в сырье 2,00±0,11 мкг/мл (по данным РСК) и 2,27 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 6,00±0,22 log₂ и 6,25±0,22 log₂, соответственно. Средние значения титра коррелируют между собой и значениям концентрации 146S-компонента, определенным в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Иными словами, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89».

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность одновременного исследования большого количества проб для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины в течение 3-4 часов. В предлагаемом изобретении между концентрацией 146S-частиц и пороговым циклом амплификации установлена зависимость, отраженная в виде отрицательной линейной корреляции с высоким коэффициентом - 0,9959. Разработанная математическая регрессионная модель вида C_146S=-3,401(Ct)+99,333 позволяет оценивать концентрацию 146-компонента вируса ящура разных топотипов в сырье для производства вакцины.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с последующим применением разработанной регрессионной модели.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»:

1. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. - Суздаль, 1994. - 92 с.

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A.L. and Garland, A.J.M. (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease. J. Compr. Pathol., V. 129. - p. 268-282.

4. Annual OIE/FAO FMD Reference Laboratory Network Report / N. Ferris, N. Knowles [et al.]. - Pirbright, 2007. - URL: http://www. wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reporst.htm

5. Enhanced laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease by real-time polymerase chain reaction / A.E. Shaw, S.M. Reid, D.P. King [et al.] // Rev. Sci. Techn. OIE. - 2004. - Vol. 23, №3. - P. 1003-1009.

6. Gartwright, В., Brown, F. and Chapman, W.G. (1980) Serological and immunological relationships between the 146S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus. Journal of General Virology. - V. 50. - p. 369-375.

7. Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-and-mouth disease / A. Shaw, S. M. Reid, K. Ebert [et al.] // J. Virol. Methods. - 2007. - Vol. 143, N 1. - C. 81-85.

8. Lubroth, J., Rodri'guez, L. and Dekker, A. (2006) Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9^th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. p. 517-536.

9. OIE. (2008) Foot and mouth disease. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 6^th ed., Ch. 2/1/5/ World Organisation for Animal Health (OIE), Paris, France.

10. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - 7^th ed. - Paris, 2012. - Vol. 1, Chap. 2.1.5. - p. 166-169.

11. Rapid detection of foot-and-mouth disease virus, influenza A virus and classical swine fever virus by high-speed real-time RT-PCR / K. Wernike, M. Beer, B. Hoffmann // Journal of Virological Methods. - 2013. - Vol. 193, №l. - P. 50-54.

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин и предназначено для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье. Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура. Выделяют РНК вируса ящура из сырья для вакцины. Элюаты добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ. Проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. Определяют величину порогового цикла амплификации. Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в сырье. Изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с последующим применением разработанной отрицательной регрессионной модели. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 6 пр.

1. Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для производства вакцины с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), включающий следующие стадии:

- подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура, эквивалентными концентрациям 146S-компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/мл;

- выделяют РНК вируса ящура из сырья для вакцины, образцов отрицательного и положительных контролей;

- элюаты РНК вируса ящура добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:10;

- проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, анализируют полученные данные для определения величины порогового цикла амплификации;

- определяют величину порогового цикла амплификации, обратно пропорциональную концентрации РНК вируса ящура и, соответственно, 146S-компонента;

- устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины в процессе построения отрицательной регрессионной модели;

- оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е), а также коэффициент детерминации (R²);

- рассчитывают значение концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе разработанной регрессионной модели.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на основании установленной в ОТ-ПЦР-РВ величины порогового цикла амплификации (C_t) рассчитывают значение концентрации 146S-компонента (C_146S) вируса ящура разных типов с применением разработанной регрессионной модели:

C_146S=-3,401(C_t)+99,333.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие компоненты: специфичные праймеры и TagMan флуоресцентномеченые зонды (каждый) - 10 пм, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) - 10 мМ, MgCl₂ - 5 мМ, Taq ДНК-полимераза - 1 ед., AMV-ревертаза - 2,5 ед.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОТ-ПЦР-РВ проводят с соблюдением следующих режимов:

- обратная транскрипция: 42°C в течение 15-20 мин,

- предварительная денатурация: 94-95°C в течение 4-5 мин,

- полимеразная цепная реакция:

- денатурация: 94-95°C в течение 15-20 с,

- отжиг праймеров: 55-57°C в течение 15-20 с,

- элонгация: 60-65°C в течение 20 с.