Вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05 культуральная инактивированная сорбированная Российский патент 2023 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной.

Ящур - это вирусное, остро протекающее заболевание парнокопытных животных, характеризующееся лихорадкой и афтозными поражениями слизистой оболочки в полости рта, кожи вымени (молочной железы) и конечностей. Молодняк легче заражается и тяжелее переносит заболевание. Источником болезни являются больные ящуром животные, а также содержавшиеся совместно с больными длительное время, находящиеся в инкубационном (скрытом) периоде болезни, выделяющие вирус во внешнюю среду с содержимым и стенками афт (изъязвления округлой формы) на языке по стенкам полости рта, с молоком, слюной и фекалиями [1, 2, 3].

Существует 7 серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1].

В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Важность их знания заключается в том, что требуется очень тщательно подбирать вакцину, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Восстановление после переболевания животным каким-либо одним серотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3]. Однако, вирусы ящура могут демонстрировать частичную перекрестную защиту в пределах одного серотипа.

Наблюдаемая генетическая вариация в геноме вируса ящура является результатом двух процессов. Во-первых, это ошибки, которые возникают в результате репликации вирусной РНК и отсутствия репарации кодируемой РНК-зависимой РНК-полимеразы. Во-вторых, - конкурентный отбор, который воздействует на геном. В природной среде в результате будут преобладать изоляты новых генетических линий, которые включают в свой геном требуемые для данной среды характеристики [4].

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Было показано, что генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [5, 6, 7]. Внутритиповая рекомбинация происходит чаще, чем рекомбинация, и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре осуществляются легче в 3'-части генома, чем в участках генома, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [7]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус может приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [8].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием факторов клеток-хозяев и вируса. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [9].

Для выявления генетических связей между различными изолятами и штаммами обычно применяют нуклеотидное секвенирование. Следовательно, в условиях вспышки можно проследить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [6, 10].

Репрезентативные штаммы/изоляты для каждого топотипа вируса ящура перечислены ниже. Они могут образовывать основные опорные точки филогенетического дерева. В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных генетических линий и сублиний.

Серотип О ящура является наиболее распространенным во всем мире и изучен очень широко. Серотип О разделен на 11 топотипов: EAST AFRICA 1-4 (Восточная Африка) (ЕА-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 and -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA).

Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных топотипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов.

Тип С уже в течение более 10 лет не был изолирован нигде в мире. Некоторые ученые считают необходимым объявить серотип С искорененным и прекратить производство вакцин против него. Тип С включает в себя 3 следующих топотипа: AFRICA, ASIA, EURO-SA.

По данным WRLFMD (World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - Всемирная референтная лаборатория по ящуру) в серотип Азия-1 вируса ящура входит 1 топотип ASIA, который включает в себя 8 охарактеризованных генетических линий и некоторые изоляты, которые в настоящее время еще не отнесли ни к одной линии. Подразделения на сублинии не отмечается в настоящее время. В топотип ASIA входят следующие генетические линии: G-I, G-II, G-III, G-IV, G-V, G-VI, G-VIII, Sindh-08.

В серотипе SAT-1 выделяют следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERn ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA 1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII.

Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I-XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы.

Серотип SAT-3 включает в себя 5 следующих топотипов: I (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), II (WESTERn ZIMBABWE, WZ), III (nORTHWEST ZIMBABWE, nWZ), IV, V (East Africa, EA) [7, 8, 9, 10, 11, 12].

Таким образом, представлено широкое генетическое разнообразие вируса ящура во многих странах мира. Данное многообразие обусловлено высокой степенью изменчивости РНК-содержащих вирусов и активным перемещением данного возбудителя на территории Азии, Африки и Южной Америки.

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [11]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

В соответствии с Руководством МЭБ (OIE) рекомендуется проводить следующие защитные и профилактические меры:

1) обязательная вакцинация восприимчивых животных;

2) всех вновь приобретенных животных регистрировать в учреждениях государственной ветеринарной службы и осуществлять карантинирование животных перед вводом в основное стадо;

3) соблюдать требования зоогигиенических норм и правил содержания животных;

4) приобретать корм из благополучной территории и др. [3].

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Возникающие в мире вспышки ящура демонстрируют, что данная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Споры о наиболее эффективном способе реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, по-прежнему сосредоточены на использовании вакцин [8, 9, 11]. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа.

Создание подобных вакцин является актуальной задачей.

Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой окружающей зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.

Одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура, является экстренная вакцинация. Критерии, определяющие успешное проведение данной вакцинации, включают следующие характеристиками:

1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге;

2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин;

3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью;

4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.

Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение экстренной вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [13].

Учитывая опасность возникновения ящура в РФ и высокую вероятность в этом случае больших экономических потерь, особое значение приобретает проблема экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных.

Для улучшения мер борьбы с заболеванием в эндемичных странах важно отслеживать текущие варианты распространения полевых изолятов вируса ящура для обеспечения того, чтобы в короткие сроки иметь возможность исследования биологических свойств интересующего изолята и разработать эффективную вакцину из вызвавшего вспышку штамма вируса [12, 13, 14, 15, 16].

На территории Российской Федерации вспышки ящура серотипа А имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Регионы РФ, граничащие с Китаем, Монголией, Азербайджаном и Грузией подвержены очень высокой степени риска заноса ящура [14].

Вспышки ящура серотипа А на территории Российской Федерации регистрировались в 2013-2014 гг.В Забайкальском крае и Амурской области был выявлен вирус ящура серотипа А, относящийся к генотипу A/ASIA/SEA-97. На территории Карачаево-Черкесской Республики и Краснодарского края вспышки ящура были вызваны вирусом, относящимся к генотипу A/ASIA/Iran-05^SIS-10 [12].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа А, которые применяются для производства противоящурных вакцин:

- штамм А №550/Азербайджан/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А₂2/Ирак 24/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А/Турция/2006 (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм А №2166/Краснодарский/2013 (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм А №2155/Забайкальский/2013 (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII).

Изолят «А/AFG/14/2017» вируса ящура был передан в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Афганистана в 2017 г. для проведения фундаментальных научных исследований. В результате последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток получен штамма А/Афганистан/2017 [17].

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, проведенного в институте Пирбрайта и в ФГБУ «ВНИИЗЖ», выделенный изолят «А/AFG/14/2017» и соответственно штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура принадлежат к серотипу А, топотипу ASIA, генетической линии Iran-05, сублинии FAR-11. Данный штамм значительно отличается по своей генетике от производственных штаммов вируса ящура серотипа А.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Юго-Восточной Азии, а также Ближнего Востока, вероятность риска заноса вируса ящура данного генотипа на территорию нашей страны очень высока. В связи с этим возникла необходимость разработать новую вакцину против ящура, вызванного штаммом А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А (генотип A/ASIA/Iran-05)) [1], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма А/Турция/2006, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроокиси алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена не менее 3,0 мкг/см³, содержание 10% раствора гидроокиси алюминия - 50-60% по объему, концентрация сапонина - 1,5 мг/см³.

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH, в качестве поддерживающей среды применяют раствор Эрла без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит гидроокись алюминия и сапонин. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма серотипа А представляет собой суспензию, состоящую преимущественно из 146S компонента вируса ящура, который является иммуногенной составляющей вакцинного препарата.

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его недостаточной иммуногенной активности относительно изолятов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, активно циркулирующих в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка противоящурной инактивированной культуральной сорбированной вакцины, обеспечивающей эффективную защиту восприимчивых животных против полевых изолятов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, распространенных на территории Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,0 мкг; 2) гидроокись алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 50-60% по объему (5-6% в пересчете на сухое вещество), 3) сапонин в количестве 1,5 мг, 4) поддерживающая среда - до 1 см³ по объему.

Изолят «А/AFG/14/2 017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Афганистана в провинции Вонаба (Wonabah) в населенном пункте Панджшер (Panjsher) в 2017 году. Из данного изолята в процессе проведения в ФГБУ «ВНИИЗЖ» фундаментальных научных исследований получен штамм А/Афганистан/2017, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №378 - деп / 22-12 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5% от общего объема при рН среды 7,4-7,6. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,01% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Афганистан/2017 представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 3,0 мкг инактивированного 146S компонента вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроокиси алюминия.

Вакцину против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена (инактивированный 146S иммуногенный компонент) и 10%-ного раствора гидроокиси алюминия в соотношении 40-50% на 50-60%» по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в концентрации 1,5 мг/см³. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные вирионы вируса ящура, которые обеспечивают формирование иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральная инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 3,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.

4. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия и сапонин.

5. Вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия 5-6% в пересчете на сухой остаток в комплексе с сапонином в концентрации 1,5 мг в 1,0 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Афганистан/2017 генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроокись алюминия и сапонин, добавка в виде поддерживающей среды в готовом препарате в следующих количествах:

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и на Ближнем Востоке.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего востока.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Положение штамма А/Афганистан/2017 на филогенетическом древе вируса ящура серотипа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁). Штамм выделен красным цветок и обозначен A/AFG/2017.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма А/Афганистан/2017 генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма А/Афганистан/2017 генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура.

Штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу A/ASIA/Iran-05^FAR-11 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 20-25 нм [5].

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус ящура стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Инфекционный агент не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе, реакции связывания комплемента и нейтрализации.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена белка VP₁ штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм А/Афганистан/2017 принадлежит к топотипу ASIA, генетической линии Iran-05, сублинии FAR-11.

Антигенное родство (ri) штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура изучено в перекрестном исследовании в реакции микронейтрализации (РМН) штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм А №550/Азербайджан/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А₂₂/Ирак 24/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А/Турция/2006 (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм А №2166/Краснодарский/2013 (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм А №2155/Забайкальский/2013 (генотип A/ASIA/SEA-97),

- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII)

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 10² ТЦД₅о гомологичного и гетерологичного вируса определяли в реакции микронейтрализации при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение ri определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [19].

Значение ri в РМН интерпретировали следующим образом:

при >0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма А/Афганистан/2017 составили ri от 0,06 до 0,24, что свидетельствовало об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А (табл. 1).

Биотехнологические характеристики

Штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура репродуцируется в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражают вирусом из расчета 0,001-0,100 ТЦД₅₀/клетка. Концентрация общего вирусного белка в суспензии по итогам исследования составляет 2,40±0,11 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRTAH, равной 4,05±0,10 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₆₀/кл. и продолжительности репродукции вируса 10,65±0,53 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура равен 7,22±0,06 lg ТЦД₅₀/ см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяют с помощью ранее разработанной методики РСК [18]. Содержание данного компонента составляет 72,74±2,42% (1,74±0,08 мкг/см³).

Гено- и хемотаксономическая характеристика.

Штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной позитивной молекулой РНК с молекулярной массой 2,8×10⁶ Д и длиной 8500 н.о. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является белок VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5%) белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

При репродукции в биосистеме вирус ящура образует 4 варианта компонентов: 146S частицы (вирионы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁-VP₂-VP3-VP₄; 75 S компонент, лишенный РНК и включающий в себя 60 копий полипептида VP₁-VP₃-VP₀; 12S частицы, представленные белками VP₁, VP₂, VP₃; 3,8S субъединицы, состоящие из неструктурного белка VP_g. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А/Афганистан/2018 вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,8. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к щелочам, кислотам, формальдегиду, УФ-облучению, у-облучению, действию высоких температур.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом A/ASIA/Iran-05^FAR-11 и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.

Получена высокоиммуногенная вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральная инактивированная сорбированная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования

Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (652 н.о.) штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура типа А. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура типа А.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура референтного вакцинного штамма А/Афганистан/2018 с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма А/Афганистан/2017 генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А/Афганистан/2017 генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Проведен филогенетический анализ штамма А/Афганистан/2017. Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт.Этот анализ включал 32 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность ID-гена штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 632 позиции. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма А/Афганистан/2017 и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа А определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый штамм А/Афганистан/2017 относится к серотипу А топотипу ASIA генетической линии Iran-05, сублинии FAR-11, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма А/Афганистан/2017 к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл/см³, доза заражения вирусом -0,01 ТЦД₆₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 15-17 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,95±0,10 до 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,34±0,02 до 1,14±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,14±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 95,98 до 99,14%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 в промышленных масштабах

В процессе промышленного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла MEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хенкса с 2,5% ГБК. Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅о/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 15-30 ч. Результаты репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что при репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла MEM, позволяющая за 15-17 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100%) с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,14±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса с добавлением 2,5% гидролизата белков крови показатели репродукции вируса были значительно ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла MEM с добавлением 2% сыворотки крови КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100% в течение 15-30 ч (табл.3). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 15-17 ч развитие ЦПД достигало 95-100%) с накоплением 146S частиц, равным 1,14±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,80±0,10 lg ТЦДзо/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом А/Афганистан/2017 при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 15-30 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%). По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 3, наибольшее накопление «полных» частиц вируса достигалось при дозе заражения 0,1-0,01 ТЦД₆₀/кл. и составило 1,14±0,03 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30:1) поддерживающая среда - среда Игла MEM; 2) температурный режим культивирования -37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,1-0,01 ТЦД₆₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температуру и дозу заражения.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,60. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 10-12 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 4.

Как следует из таблицы 4, при культивировании вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 1,04±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 1,30±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 1,78±0,03 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ -1,80±0,05 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура оптимальной является концентрация клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,25±0,15 lg ТЦД₅₀/см³.

Большая концентрация клеток позволяла получить такой же выход продукта с небольшим увеличением. С экономической точки зрения, таким образом, для репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура оптимально использовать суспензию клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 3,5 млн кл./см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние фактора температуры на суспензионное культивирование штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в культуре клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С.Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,45-7,60. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного 90-100%, в течение 10-28 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 10-12 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,78±0,03 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,25±0,15 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 10-30 ч по цитопатическому действию (ЦПД), равного 90-95%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 4, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,10-0,01 ТЦД₆₀/кл. (1,78±0,03 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,25±0,15 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение параметров суспензионного культивирования штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма А/Афганистан/2017 в суспензионной культуре клеток ВНК-21: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования -37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД₆₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма А/Афганистан/2017

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,02°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,05%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 проводили в течение 12 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, полная инактивация инфекционной активности культурального вируса ящура штамма А/Афганистан/2017, репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения инактиванта.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в реакции связывания комплемента для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,76±0,10 мкг/см³, a 146S+75S компонента - 2,35±0,08 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма А/Афганистан/2017

Суспензию вируса ящура штамма А/Афганистан/2017, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, подвергают инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010 и 0,007%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 в количественном варианте реакции связывания комплемента определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 6.

Как следует из данных таблицы 6, в результате очистки антигена вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали незначительное уменьшение содержания 146S компонента вируса по сравнению с исходными значениями (до очистки) на 2,3% в готовом продукте. При этом концентрация балластного белка уменьшалась на 46%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,007%) содержание 146S частиц снижалось на 1,7%, а концентрация балластного белка только на 36%). Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма А/Афганистан/2017, пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,010%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования антигена штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура

Культуральную инактивированною суспензию штамма

А/Афганистан/2017, полученную с применением суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 9 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50%) к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью гидроокиси алюминия (10%) коллоидный раствор 50-60%) от общего объема, антиген вируса - 40-50%).

До и после процесса концентрирования антигена вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Как следует из данных таблицы 7, при концентрировании антигена штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 6 раз. Применяя метод сорбирования с помощью гидроокиси алюминия, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура в суспензии в 9 раз (без потерь). Таким образом, оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 является метод сорбирования с применением коллоидного раствора гидроокиси алюминия.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант

Для изготовления противоящурной моновалентной сорбированной вакцины из антигена штамма А/Афганистан/2017 в качестве адъюванта была выбрана гидроокись алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении моновалентной сорбированной вакцины против вируса ящура использовали 5-6% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 1,5 мг/см³.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR'ⁿ культуральной инактивированной сорбированной

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма А/Афганистан/2017 изготовили противоящурную моновалентную сорбированную инактивированную вакцину с применением в качестве адъювантов гидроокиси алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ готового антигена составило 15,69 мкг/см³ (таблица 7).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученной противоящурной инактивированной сорбированной вакцины был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу КРС (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Проводили иммунизацию 2 голов КРС вакциной против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной в дозе 2 см³.

Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации и на 14 сутки после иммунизации животных исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «PrioCHECK®FMDVNSELISAfor in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 8, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС<50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной Для определения авирулентности вакцины на КРС, отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали КРС массой 250-300 кг.В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта проводили путем внутримышечного введения вакцины КРС в дозе 6,0 см³. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации допускается повышение температуры тела животного до 41°С и возможна держаться на этом уровне в течение 1-3 суток.

По результатам исследований вакцина была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11культуральной инактивированной сорбированной по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,00±0,18 log2 SN50, с разведением 1/4 (5 голов) - 4,90±0,14 log₂ SN₅₀, с разведением 1/16 (5 голов) - 3,55±0,21 log₂ SN50. (табл.9). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR'^U культуральной инактивированной сорбированной на естественно восприимчивых видах животных.

Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, различными разведениями вакцины, заражали контрольным штаммом А/Афганистан/2017 вируса ящура, адаптированного к этим животным, в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,2 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 9, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде и в разведении 1/4, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом. Все 10 животных остались живы и без видимых поражений. Вакцина, введенная в разведении 1/16, защитила 4 из 5 животных.

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 24,25 ПД₅₀ и 0,08 ИмД₆₀ для КРС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как экспериментальная резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральная инактивированная сорбированная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid nadzor/146902 (Дата обращения: 03.05.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 14.04.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed.-Paris, 2015-Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов A. H., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. -V. 23.- P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16.- P. 746-754.

12. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харюв, 2013. - С. 37-38.

13. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

14. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов / Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.

15. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy / Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

16. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

17. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/find ref lab reports.htm (дата обращения 15 октября 2020 г.).

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMD vaccine from a

strain A-AFG-2017.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-10-10">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-09-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>464</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-09-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Федеральный центр охраны здоровья

животных&quot; (ФГБУ ВНИИЗЖ)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI ARRIAH</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура из штамма

А/Афганистан/2017 нового генотипа А/ASIA/Iran-05FAR-11 культуральная

инактивированная сорбированная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccactgccggggagtcagcagaccctgtcaccaccaccgttgaga

actacggtggtgagacacagactcagcgacgtcaccacacggacgtcggcttcatcatggacaggtttgt

gaaaatcacccctgtgaaccccacgcacgtcattgacctcatgcagacacaccagcacgcgttggtgggt

gccctcttgcgtgcggccacgtactacttctctgatttggagattgtggtgcgccacgaaggcaacttga

cgtgggtgcccaatggggcgcctgagggagccctggccaacacaagcaaccctaccgcctaccacaggca

gccgttcacgagacttgcgctcccttacactgcgccgcaccgagtgttggcaacagtgtacaacggggta

agtaagtactccacaactggtggcggtagaaggggtgacctgggctctcttgcggcgcgggtcgccgcac

agctgcccagctctttcaattttggtgcaattcgggccacgaccatccacgagcttctcgtgcgtatgaa

acgtgccgagctctactgcccccgaccactgctggcagtggaagtgtcgtcgcaggacagacacaagcag

aagatcattgcacctgcaaaacagctcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQTQRRHHTDVGFIMDRFVKITPVNPTH

VIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHEGNLTWVPNGAPEGALANTSNPTAYHRQPFTRLALPY

TAPHRVLATVYNGVSKYSTTGGGRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRP

LLAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральной инактивированной сорбированной. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма А/Афганистан/2017 вируса ящура нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, адъювант гидроокись алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, Ближнего Востока и на границах Российской Федерации с этими регионами. 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11 культуральная инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «А/Афганистан/2017» вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphthovirus, серотипа А, генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №378 - деп/22-12 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», в эффективном количестве.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа А.

3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа А.

4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1,0 см³ готового препарата.

5. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта она содержит гидроокись алюминия в комплексе с сапонином.

6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что она содержит адъювант гидроокись алюминия предпочтительно в количестве 5-6% в пересчете на сухое вещество и сапонин с содержанием 1,5 мг в 1,0 см³ готового препарата.

7. Вакцина по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05^FAR-11, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа А, адъювант - гидроокись алюминия и сапонин, добавку в виде поддерживающей среды в готовом препарате в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Афганистан/2017 генотипа A/ASIA/Iran- 05^far-11 вируса ящура не менее 3,0 мкг/см³ Гидроокись алюминия 5-6% (в пересчете на сухое вещество) Сапонин 1,5 мг/см³ Поддерживающая среда до 1,0 см³