Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной.
Ящур - очень заразное заболевание парнокопытных животных. Эта болезнь была впервые описана в 16 веке и стала первым животным патогеном, идентифицированным как вирус. Недавние вспышки ящура в развитых странах и их значительные экономические последствия усилили озабоченность правительств во всем мире. Этиологический агент, вирус ящура (FMDV), подробно изучен на генетическом, структурном и биохимическом уровнях, а также с точки зрения его антигенного разнообразия [1, 2, 3].
Первая письменная характеристика ящура, вероятно, датируется 1514 годом, когда Fracastorius Н. описал аналогичную болезнь крупного рогатого скота в Италии [4]. Почти 400 лет спустя, в 1897 году, Леффлер и Фрош продемонстрировали, что вирус ящура вызывается фильтруемым агентом. Это была первая демонстрация того, что болезнь животных может быть вызвана фильтруемым агентом, и положила начало эре вирусологии.
Существует 7 серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP1), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1].
В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Важность их знания заключается в том, что требуется очень тщательно подбирать вакцину, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Иммунная система организма после переболевания животным каким-либо одним серотипом ящура не обеспечивает защиту против другого серотипа и тем более других генетических линий [3]. Однако, вирусы ящура могут демонстрировать частичную перекрестную защиту в пределах одного серотипа.
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [5, 6, 7]. Внутритиповая рекомбинация происходит чаще, чем рекомбинация, и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре осуществляются легче в 3'-части генома, чем в участках генома, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [7]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус может приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [8].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием факторов клеток-хозяев и вируса. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [6, 9, 10].
Репрезентативные штаммы/изоляты для каждого топотипа вируса ящура серотипа А перечислены ниже. Они могут образовывать основные опорные точки филогенетического дерева. В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных генетических линий и су 6 линий.
Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных топотипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов. Топотип ASIA включает в себя следующие генетические линии: А22, Iran-87, Iran-96, Iran-99, Iran-05, A15, Thai-87, Sea-97, G VII. Топотип AFRICA включает в себя следующие генетические линии: G I, G II, G III, G IV, G V, G VI, G VII. Топотип EURO-SA включает в себя следующие генетические линии: А5, А12, А 24, А 81. Выделяют еще одну группу с неопределенным названием, в которую входят генетические линии А11 и G VIII (зафиксированы в Германии и в Кении в XX в.) [11].
Таким образом, представлено широкое генетическое разнообразие вируса ящура серотипа А. Данное многообразие обусловлено высокой степенью изменчивости РНК-содержащих вирусов и активным перемещением данного возбудителя на территории Азии, Африки и Южной Америки.
По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.
Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [6, 7, 8, 9, 10, 11].
Возникающие в мире вспышки ящура демонстрируют, что данная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Споры о наиболее эффективном способе реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, по-прежнему сосредоточены на использовании вакцин [8, 9, 12, 13]. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.
Одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура, является экстренная вакцинация. Критерии, определяющие успешное проведение данной вакцинации, включают в себя доступ к вакцине, которая отличается следующими характеристиками: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.
Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [14].
Учитывая опасность возникновения ящура в РФ и высокую вероятность в этом случае больших экономических потерь, особое значение приобретает проблема экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных.
На территории Российской Федерации вспышки ящура серотипа А имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Регионы РФ, граничащие с Абхазией, Грузией, Южной Осетией, Азербайджанской республикой, Республикой Казахстан, КНР, Монголией, КНДР подвержены высокой степени риска заноса вируса ящура [15].
В Российской Федерации вспышки ящура серотипа А регистрировались в 2013-2014 гг. На территории Забайкальского края и Амурской области был выявлен вирус ящура серотипа А, относящийся к генотипу A/ASIA/Sea-97. На территории Карачаево-Черкесской Республики и Краснодарского края вспышки ящура были вызваны вирусом, относящимся к генотипу A/ASIA/Iran-05SIS-10[11, 17].
В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура серотипа А, которые применяются для производства противоящурных вакцин:
- штамм А №550/Азербайджан/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),
- штамм А22/Ирак 24/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),
- штамм А/Турция/2006 (генотип A/ASIA/Iran-05),
- штамм А №2166/Краснодарский/2013 (генотип A/ASIA/Iran-05S1S-10),
- штамм А №2155/Забайкальский/2013 (генотип A/ASIA/Sea-97),
- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII).
Изолят «A/IRN/2018» вируса ящура был передан в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Ирана в 2018 г.для проведения фундаментальных научных исследований.
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, проведенного в институте Пирбрайта и в ФГБУ «ВНИИЗЖ», выделенный изолят «A/IRN/2018» и соответственно полученный из него штамм А/Иран/2018 вируса ящура принадлежат к типу А, топотипу ASIA, генетической линии Iran-05, сублинии SIS-13. Данный штамм значительно отличается по своей генетике от производственных штаммов вируса ящура серотипа А [16].
Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Юго-Восточной Азии, а также Ближнего Востока, вероятность риска заноса вируса ящура данного генотипа на территорию нашей страны очень высока. В связи с этим возникла необходимость разработать новую вакцину против ящура штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура серотипа А (генотип A/ASIA/Iran-05)) [1], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма А/Турция/2006, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроокиси алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена не менее 3,0 мкг/см3, содержание 10% раствора гидроокиси алюминия - 50-60% по объему, концентрация сапонина - 1,5 мг/см3, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см3.
В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH, в качестве поддерживающей среды применяют раствор Эрла без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит гидроокись алюминия. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма серотипа А представляет собой суспензию, состоящую преимущественно из 146S компонента вируса ящура, который является иммуногенной составляющей вакцинного препарата.
Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его недостаточной иммуногенной активности относительно изолятов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13, активно циркулирующих в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока.
Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка противоящурной инактивированной культуральной сорбированной вакцины, обеспечивающей эффективную защиту восприимчивых животных против полевых изолятов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13, распространенных на территории Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против вируса ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13 культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.
Разработанная вакцина (предлагаемое изобретение) в 1,0 см3 препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А/Иран/2018 вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,0 мкг; 2) гидроокись алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 50-60% по объему (5-6% в пересчете на сухое вещество), 3) сапонин в количестве 1,5 мг, 4) поддерживающая среда - до 1,0 см3.
Изолят «A/IRN/2018» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Ирана в населенном пункте Керман (Kerman) в 2018 году. Из данного изолята в процессе проведения в ФГБУ «ВНИИЗЖ» фундаментальных научных исследований получен штамм А/Иран/2018, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №379 - деп / 22-13 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5% от общего объема при рН среды 7,4-7,6. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,010% от общего объема.
Авирулентный и очищенный антиген штамма
А/Иран/2018 вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см3 не менее 3,0 мкг инактивированных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроокиси алюминия (Al(ОН)3).
Вакцину против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена (инактивированный 146S иммуногенный компонент) и 10% раствора гидроокиси алюминия в соотношении 40-50% на 50-60% по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в концентрации 1,5 мг/см3. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные вирионы вируса ящура, которые обеспечивают формирование иммунитета.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:
1. Вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная инактивированная сорбированная.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13 вируса ящура в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13 вируса ящура в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.
2. Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 3,0 мкг в 1,0 см3 готового вакцинного препарата.
3. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.
4. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия в комплексе с сапонином.
5. Вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия 5-6% в пересчете на сухой остаток в комплексе с сапонином в концентрации 1,5 мг в 1,0 см3 готового препарата.
6. Авирулентный и очищенный антиген штамма А/Иран/2018 генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроокись алюминия и сапонин, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:
Предлагаемая вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13 культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS- вируса ящура, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и на Ближнем Востоке.
Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS- вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего востока.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг.1 - Положение штамма А/Иран/2018 на филогенетическом древе вируса ящура серотипа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP1). Штамм выделен красным цветок и обозначен A/IRN/2018.
Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP1 штамма А/Иран/2018 генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13 вируса ящура;
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP1 штамма А/Иран/2018 генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 вируса ящура.
Штамм А/Иран/2018 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм А/Иран/2018 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу A/ASIA/Iran-05SIS-13 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 20-25 нм [5].
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А/Иран/2018 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус ящура стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе, реакции связывания комплемента и нейтрализации.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена, кодирующего белок VP1 штамма А/Иран/2018 вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм А/Иран/2018 принадлежит к топотипу ASIA, генетической линии Iran-05, сублинии SIS-13 (Фиг.1).
Антигенное родство (ri) штамма А/Иран/2018 вируса ящура изучено в перекрестном исследовании в реакции микронейтрализации (РМН) штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:
- штамм А №550/Азербайджан/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),
- штамм А22/Ирак 24/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),
- штамм А/Турция/2006 (генотип A/ASIA/Iran-05),
- штамм А №2166/Краснодарский/2013 (генотип A/ASIA/Iran-05SIS-10),
- штамм А №2155/Забайкальский/2013 (генотип A/ASIA/Sea-97),
- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII)
Титр антител в референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 102 ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [19].
Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом:
при>0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;
при<0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.
Показатели антигенного родства при изучении штамма А/Иран/2018 составили r1 0,03 - 0,22, что свидетельствовало об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А (таблица 1).
Биотехнологические характеристики
Штамм А/Иран/2018 вируса ящура репродуцируется в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражают вирусом из расчета 0,001-0,100 ТЦД50/клетка. Концентрация ОВБ в суспензии составляет 3,12±0,07 мкг/см3. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма А/Иран/2018 вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH, равной 3,98±0,14 млн клеток/см3, дозе заражения 0,005 ТЦД50/клетка и продолжительности репродукции вируса 9,95±0,86 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура равен 8,73±0,22 lg ТЦД50/см3. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяют с помощью ранее разработанной методики РСК [18]. Содержание данного компонента составляет 75,43±0,74% (2,36±0,05 мкг/см3).
Гено- и хемотаксономическая характеристика.
Штамм А/Иран/2018 вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106 Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной позитивной молекулой РНК с молекулярной массой 2,8×106 Д и длиной 8500 н.о.
Основным антигенным белком является белок VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует. К неструктурным белкам вируса ящура относятся следующие пептиды: L-протеаза, 2А-, 2 В-, 2С-, 3А-белки, VPg1, VPg2, VPg3, 3С-пропептид, 3D-белок (РНК-зависимая РНК-полимераза).
При репродукции в биосистеме вирус ящура образует 4 варианта компонентов: 146S частицы (вирионы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP1-VP2-VP3-VP4; 75S компонент, лишенный РНК и включающий в себя 60 копий полипептида VP1-VP3-VP0; 12S частицы, представленные белками VP1, VP2, VP3; 3,8S субъединицы, состоящие из неструктурного белка VPg. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А/Иран/2018 вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,45-7,75. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к щелочам, кислотам, формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, действию высоких температур.
Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH (срок наблюдения). При титровании вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток почки свиньи IB-RS-2 определяли биологическую активность вируса.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А/Иран/2018 вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13.
Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом A/ASIA/Iran-05SIS-13, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.
Получена высокоиммуногенная вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная инактивированная сорбированная.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Генетическая характеристика штамма А/Иран/2018 вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP1) (639 н.о.) штамма А/Иран/2018 вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа А. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP1) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура серотипа А.
Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP1 вируса ящура вакцинного штамма А/Иран/2018 с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А/Иран/2018 генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 вируса ящура представлена SEQ ID NO: 1. Последовательность аминокислот ID-гена, кодирующего белок VP1 штамма А/Иран/2018 генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 вируса ящура отражена на SEQ ID NO: 2.
Проведен филогенетический анализ штамма А/Иран/2018. Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 32 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность ID-гена штамма А/Иран/2018 вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 639 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].
В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP1) штамма А/Иран/2018 и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа А определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг.1).
По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый штамм А/Иран/2018 относится к серотипу А топотипу ASIA генетической линии Iran-05, сублинии SIS-13, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.
Пример 2. Адаптация штамма А/Иран/2018 к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.
Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,01 ТЦД50/КЛ. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма А/Иран/2018 проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 15-18 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,80±0,10 до 7,75±0,101g ТЦД50/см3.
Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,75±0,10 lg ТЦД50/см3). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,41±0,03 до 1,20±0,03 мкг/см3. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,20±0,03 мкг/см3). Степень достоверности (R2) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 96,31 до 99,42%). Таким образом, на протяжении 6 ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма А/Иран/2018 вируса ящура к перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30.
Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма А/Иран/2018 в промышленных масштабах.
В процессе промышленного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток.
На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма А/Иран/2018 вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла MEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хенкса с 3,0% ГБК. Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД50/КЛ. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 15-30 ч. Результаты репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 3.
Из данных таблицы 3 видно, что при репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла MEM, позволяющая за 15-17 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,20±0,02 мкг/см3 и титром инфекционной активности 7,50±0,10 lg ТЦД50/см3. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса показатели репродукции вируса были ниже.
На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла MEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100% в течение 15-28 ч (таблица 3). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 15-17 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,20±0,02 мкг/см3 и титром инфекционной активности вируса 7,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом А/Иран/2018 при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД50/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 15-30 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 3, наибольшее накопление «полных» частиц вируса достигалось при дозе заражения 0,1-0,01 ТЦД50/кл. и составило 1,20±0,02 мкг/см3 с титром инфекционной активности вируса 7,50±0,10^ТЦД50/см3.
Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30:
1) поддерживающая среда - среда Игла MEM;
2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С;
3) доза заражения вирусом - 0,1-0,01 ТЦД50/КЛ.
Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в промышленных масштабах.
При промышленном культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температуру и дозу заражения.
На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма А/Иран/2018 вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см3. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-11 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 4.
Как следует из таблицы 4, при культивировании вируса ящура штамма А/Иран/2018 в суспензионной клеточной линии
BHK-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см3 составило 0,87±0,03 мкг/см3, с концентрацией 3,0 млн кл./см3 -1,71±0,03 мкг/см3, с концентрацией 3,5 млн кл./см3 - 2,00±0,03 мкг/см3, и с концентрацией 4,0 млн кл./см3 - 2,36±0,05 мкг/см3. Как следует из полученных данных, для репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура оптимальной является концентрация клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см3. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,73±0,22 lg ТЦД50/см3. Большая концентрация клеток позволяла получить такой же выход продукта с небольшим увеличением. С экономической точки зрения, таким образом, для репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура оптимально использовать суспензию клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 4,0 млн кл./см3.
На следующем этапе работы исследовали влияние фактора температуры на суспензионное культивирование штамма А/Иран/2018 вируса ящура в культуре клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД50/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного 90-100%, в течение 9-27 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма А/Иран/2018 вируса ящура в суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 9-11 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,36±0,05 мкг/см3) и титром инфекционной активности вируса 8,73±0,22 lg ТЦД50/см3.
В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 10-30 ч до цитопатического действия, равного 90-95%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 4, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,10-0,01 ТЦД50/кл. (2,36±0,05 мкг/см3) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,73±0,22 lg ТЦД50/см3.
Таким образом, проведено изучение параметров суспензионного культивирования штамма А/Иран/2018 вируса ящура в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма А/Иран/2018 в суспензионной культуре клеток ВНК-21:
1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см3;
2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С;
3) доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД50/кл.
Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма А/Иран/2018.
По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,02°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,05%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма А/Иран/2018 проводили в течение 12 часов при температуре 37°С и рН 7,5-7,6 с перемешиванием.
Для определения времени полной инактивации после добавления АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 5.
Как видно из таблицы 5, полная инактивация инфекционной активности культурального вируса ящура штамма А/Иран/2018, репродуцированного в культиваторах, произошла через 8 часов после внесения инактиванта.
Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в реакции связывания комплемента для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,32±0,10 мкг/см3, a 146S+75S компонента - 2,85±0,08 мкг/см3.
Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма А/Иран/2018.
Суспензию вируса ящура штамма А/Иран/2018, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, подвергают инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,007, 0,010 и 0,013%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма А/Иран/2018 в количественном варианте реакции связывания комплемента определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 6.
Как следует из данных таблицы 6, в результате очистки антигена вируса ящура штамма А/Иран/2018 с помощью ПГМГ в концентрации 0,007% отмечали снижение концентрации балластного белка на 21,6%, иммуногенных компонентов - на 2,5%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,010% наблюдали снижение количества балластного белка на 38,6%), 146S компонента - на 3,4%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,013% содержание балластного белка уменьшалось на 40,0, а иммуногенных компонентов - на 9,3%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма А/Иран/2018, пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,010%.
Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма А/Иран/2018 вируса ящура.
Культуральную инактивированною суспензию штамма А/Иран/2018, полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 8 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью гидроокиси алюминия (10% коллоидный раствор 50-60%, антиген вируса - 40-50% от общего объема).
До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма А/Иран/2018 определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 7.
Как следует из данных таблицы 7, при концентрировании антигена штамма А/Иран/2018 вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 6,5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 7,0 раз. Применяя метод сорбирования с помощью гидроокиси алюминия, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма А/Иран/2018 вируса ящура в суспензии в 7,75 раз (потери незначительны - 3,1%). Таким образом, исследуя условия концентрирования антигена штамма А/Иран/2018, пришли к выводу о том, что оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура является метод сорбирования с применением коллоидного раствора гидроокиси алюминия.
Пример 8. Подбор адьюванта и соотношения антиген-адъювант.
Для изготовления противоящурной моновалентной сорбированной вакцины из антигена штамма А/Иран/2018 в качестве адъюванта был выбран раствор гидроокиси алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении моновалентной сорбированной вакцины против вируса ящура использовали 5-6% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 1,5 мг/см3.
Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05S1S-13 культуральной инактивированной сорбированной.
Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма А/Иран/2018 изготовили вакцину против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральную инактивированную сорбированную с применением в качестве адъювантов гидроокиси алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см3 готового антигена составило 17,67±0,10 мкг/см3 (таблица 7).
Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной.
Из полученной вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см3. Первую группу КРС (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи.
Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.
Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после начала тестирования вакцины на авирулентность и безвредность и на 14 сутки после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 8, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС<50%).
Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной.
Для определения авирулентности вакцины на КРС отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см3. В исследовании использовали КРС массой 250-300 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.
Контроль безвредности продукта на КРС проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см3. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,2°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток.
По результатам исследований вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная инактивированная сорбированная была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.
Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной по способности индуцирования вирус нейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.
На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (№1-5), средние значения титра антител составили 7,15±0,14 log2 SN50, с разведением 1/4 (№6-10) - 4,80±0,11 log2 SN50, с разведением 1/16 (№11-15)-3,55±0,33 log2 SN50. (таблица 9). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log2 SN50), что соответствует требованиям международных стандартов [3].
Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной на естественно восприимчивых видах животных.
Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом А/Иран/2018 вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 104,0 ИД50/0,20 см3 (в две точки по 0,10±0,05 см3). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.
Результаты контрольного заражения представлены в таблице 9, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде и в разведении 1/4, введенная в однократной дозе (2,0 см3) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом всех животных (10 из 10 голов).
Вакцинный препарат, введенный в разведении 1/16, защитил 4 из 5 животных. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 24,25 ПД50 и 0,08 ИмД50 для КРС.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как экспериментальная резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная инактивированная сорбированная»:
1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru /directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 03.09.2022).
2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 14.08.2022).
3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2015-Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p.13-21.
8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et. al.] // Vaccine. -December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.
9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref labs/find ref lab reports.htm (Дата обращения 14.08.2022).
12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.
13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля // Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С.37-38.
14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol.4(10). - P. 475-479.
15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов / Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.
16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.
17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.
19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.
20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.
21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.
22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.
23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.
24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="0.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"
productionDate="2022-09-15">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-09-15</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>465</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-09-15</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура из штамма
А/Иран/2018 нового генотипа А/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральная
инактивированная сорбированная</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accaccaccgccggggagtcagcagaccctgttaccaccaccgttgaga
actacggcggtgaaacacaggtgcagcgacgtcaacacactgacgtcggtttcatcatggacaggtttgt
gaaaatcaaccctgtgagccccacgcacgtcatcgatctcatgcaaacgcaccagcacgcgctggtaggt
gcccttttgcgtgcagccacgtactacttctccgacttggagattgtggtgcgtcacgatggcaatttga
cgtgggtgcccaatggagcacctgaaggagccttggctaacacaagcaatcccactgcttaccacaggca
gccattcaccagacttgccctcccttacaccgcgccgcaccgagtgctggcaacagtgtacaacggggtg
aacaagtactccacaactagtgatagcagaaggggcgatctgggctctcttgcggcgcgagtcgccgcac
agctacccagttctttcaattttggtgcaatccgggccacgaccatccatgagcttctcgtgcgcatgaa
acgcgctgagctctattgccctaggcccctgctggcagtggaagtgttgtcttcggacagacacaaacaa
aagatcattgcccctgcaaaacagcttttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVGFIMDRFVKINPVSPTH
VIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPEGALANTSNPTAYHRQPFTRLALPY
TAPHRVLATVYNGVNKYSTTSDSRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRP
LLAVEVLSSDRHKQKIIAPAKQLL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Вакцина против ящура из штамма А/Афганистан/2017 нового генотипа A/ASIA/Iran-05 культуральная инактивированная сорбированная | 2022 |
|
RU2798293C1 |
Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I из штамма "А/Танзания/2013" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2815536C1 |
Вакцина против ящура из штамма "A/Египет/EURO-SA/2022" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2817381C1 |
Штамм А/Иран/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А | 2022 |
|
RU2799602C1 |
Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2из штамма "О N2356/Пакистан/2018" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2810131C1 |
Вакцина против ящура генотипа O/EA-2 из штамма "O/Кения/2017" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2802192C1 |
Вакцина против ящура генотипа О/ЕА-3 из штамма "О N2241/Эфиопия/2011" культуральная инактивированная эмульсионная | 2023 |
|
RU2816264C1 |
Вакцина против ящура генотипа SAT-1/NWZ культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2809219C1 |
Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма "О N2383/Приморский/2019" культуральная инактивированная эмульсионная | 2023 |
|
RU2804803C1 |
Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X из штамма "SAT-1/Нигерия/2015" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2810132C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура из штамма А/Иран/2018 нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 культуральной инактивированной сорбированной. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма А/Иран/2018 вируса ящура нового генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, адъювант гидроокись алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, Ближнего Востока и на границах Российской Федерации с этими регионами. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл., 14 пр.
1. Вакцина против ящура инактивированная сорбированная культуральная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что состоит из активного вещества в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура Aphtae epizooticae «А/Иран/2018», сем. Picornaviridae, рода Aphthovirus, серотипа А, генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №379 - деп/22-13 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», в эффективном количестве, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,0 мкг; адъюванта - гидроокиси алюминия 10%-ного коллоидного раствора с содержанием 50-60% по объему 5-6% в пересчете на сухое вещество, сапонина в количестве 1,5 мг, поддерживающей среды - до 1,0 см3.
2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой вирусную суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа А, генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13.
3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 и адъювант гидроокись алюминия в комплексе с сапонином, в эффективном соотношении: 50-40% и 50-60% по объему, соответственно.
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А ИНАКТИВИРОВАННАЯ СОРБИРОВАННАЯ | 2012 |
|
RU2526570C2 |
ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ СОРБИРОВАННАЯ ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А | 2014 |
|
RU2563345C1 |
WILLIAM T.G, et al., Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response, Pachecoa, Vaccine., December 2005, V | |||
Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб | 1921 |
|
SU23A1 |
Коловратный двигатель | 1927 |
|
SU5775A1 |
Авторы
Даты
2023-07-07—Публикация
2022-11-23—Подача