Способ диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, клинической молекулярной биологии, генетическим исследованиям и может быть использовано в качестве способа диагностики наследственных болезней почек у детей с первых дней жизни.

Наследственные болезни почек - это генетически-гетерогенная группа заболеваний, обусловленная мутациями в генах, белковые продукты которых могут вызывать нарушение целостности клубочкового фильтра и приводить к развитию нефротического синдрома.

Нефротический синдром (НС) - клинико-лабораторный симптомокомплекс, характеризующийся протеинурией, гипопротеинемией, гипоальбуминемией, диспротеинемией; гиперлипидемией, липидурией а также отеками. НС возникает при ряде приобретенных, наследственных, врожденных заболеваний почек у детей [Benoit et al. 2010; Santin et al. 2011; Saleem 2012.] Особое место занимает НС, возникший у детей первого года жизни (врожденный и инфантильный, или младенческий), являющийся генетически обусловленным состоянием. Подавляющее большинство таких больных резистентны ко всем видам стероидной и иммуносупрессивной терапии, что значительно усложняет их лечение и ухудшает прогноз. Поскольку только на основании одних клинических признаков идентифицировать пациентов с врожденным нефротическим синдромом не представляется возможным, для поиска первопричины развития таких заболеваний необходимо проведение молекулярно-генетической диагностики. Выявление генетической причины развития болезни у пациентов с резистентными формами нефротического синдрома необходимо прежде всего с целью корректирования дальнейшей тактики лечения таких больных.

Обычно для поиска мутаций в кодирующих областях генов, ответственных за развитие того или иного заболевания, используется классический метод прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру, также известный как метод обрыва цепи (Sanger F., Ni-clein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. т.74. c. 5463-5467. и Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase // J Mol Biol. - 1975. т. 94. с. 444-448). Недостаток метода заключается в том, что он не позволяет выявлять протяженные дупликации и крупные структурные перестройки генов, требуются дополнительные методы исследования для уточняющей диагностики, а при необходимости исследования протяженных участков генома (свыше 10 т.п.н.) значительно возрастают стоимость и трудоемкость исследования.

Известны способы диагностики некоторых типов наследственных болезней почек, сопровождающихся проявлениями НС, основанные на анализе отдельных генов методом прямого автоматического секвенирования. Например: http://www.dnalab.ru/diseases-diagnostics/nephrosis-congenital-finnish-type.

Ряд зарубежных компаний, например NewGene (США), для диагностики различного спектра наследственных заболеваний использует в своей практике подходы на основе секвенирования нового поколения (СНП). Однако, как правило, диагностика основана на секвенировании всего экзома (совокупности кодирующих последовательностей всех генов). Такой метод является дорогостоящим, а также требует проведения сложного биоин-форматического анализа. Наряду с секвенированием экзома некоторые компании, например Baylor Miraca Genetics Laboratories (США), Fulgent Diagnostics - Temple City, CA, USA для диагностики отдельных групп заболеваний в том числе и нефротического синдрома предлагают также таргетное секвенирование методом СНП, путем анализа последовательностей отдельных генов.

Секвенирование нового поколения (СНП) - техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее первичной структуры, которая позволяет «прочитать» единовременно несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляют с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл (G.А. Pavlopoulos, A. Oulas, Е. Iacucci, et al. (2013) Unraveling genomic variation from next generation sequencing data. BioData Mining, 6:13 doi:10.1186/1756-0381-6-13. Next-Generation DNA Sequencing Informatics by Stuart Brown, Cold Spring Harbor, 2013).

Наиболее близким является способ диагностики наследственных болезней почек, используемый компанией Prevention Genetics (США), http://preventiongenetics.com/clinical-dna-testing/test/steroidresistant-nephrotic-syndrome-srnsfocal-segmental-glomerulosclerosis-fsgs-nextgen-sequencing-ngs-panel/1917/, выбранный нами за прототип.

Этот способ заключается в осуществлении молекулярной диагностики наследственных болезней почек, сопровождающихся клинической картиной НС, путем анализа последовательностей 14 генов. Метод осуществляют с помощью технологии СНП на платформе Illumina, используя обогащение Reversible Dye Terminator (RDT).

Задача предлагаемого изобретения заключается в разработке способа ранней диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей на основе секвенирования нового поколения.

Технический результат заявляемого способа состоит в повышении точности постановки диагноза у пациентов с клиническими проявлениями нефротического синдрома финского типа у детей.

Сущность способа диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения, заключается в анализе кодирующих, прилегающих интронных, 3' и 5' нетранслируемых областей генов NPHS1, NPHS2, PLCE1, TRPC6, ACTN4, WT1, COL4A5, CD2AP, COL4A3, COL4A4, путем проведения молекулярно-генетический анализа с использованием технологии таргетного обогащения SeqCap EZ на платформе 454 и, в случае выявления патогенных мутаций, с.3478С>Т гена NPHS1 и c.1120A>G гена CD2AP в гетерозиготном состоянии, делают вывод о наличии врожденного нефротического синдрома финского типа.

Показанием к использованию предлагаемого способа является наличие у пациента клинических и лабораторно-инструментальных проявлений нефротического синдрома.

Новым является то, что для осуществления способа используется технология таргетного обогащения SeqCap EZ (NimbleGen, Германия), которая за счет применения уникальной последовательности зондов позволяет одновременно анализировать у 12 пациентов все участки генов, мутации в которых могут приводить к развитию одной из наиболее распространенных болезней почек. Преимущества SeqCap EZ связаны с уникальным дизайном зондов, позволяющим эффективно и равномерно захватывать исследуемые регионы генов, что значительно снижает материальные расходы на секвенирование и дает возможность анализировать дополнительные образцы в рамках того же бюджета. Кроме того, данная технология за счет высокой плотности и равномерности обогащения таргетных участков позволяет наиболее точно и эффективно выявить мутации, находящиеся на концах экзонов, а также в прилегающих интронных областях.

Способ осуществляют следующим образом.

На начальном этапе из цельной венозной крови пациентов выделяют ядерную геномную ДНК. Далее ДНК фрагментируют до определенного размера с помощью газообразного азота, после чего осуществляют лигирование к фрагментам ДНК специфических адаптеров и амплификацию полученной библиотеки ДНК. Фрагментированные библиотеки проводят согласно заводскому протоколу. Для исследования берут 800 нг ДНК каждого образца. Качество биоматериала проверяют на спектрофотометре NanoVue GE по соотношению поглощения света при длинах волн 260/280 нм (не ниже 1,8) и 260/230 нм (не ниже 2). Степень деградации ДНК проверяют при помощи проведения обзорного гель электрофореза в агарозном геле. Далее проводят этап гибридизации, в результате которого полученные фрагменты (пулы) ДНК определенной длины гибридизуются со специфичными олигонуклеотидами (SeqCap EZ Oligo), комплиментарными целевым последовательностям генома. В нашем случае олигонуклеотиды подобраны таким образом, чтобы с достаточным перекрытием захватить все кодирующие, прилегающие интронные, 3' и 5' нетранслируемые области генов NPHS1, NPHS2, PLCE1, TRPC6, ACTN4, WT1, COL4A5, CD2AP, COL4A3, COL4A4. Несвязанные фрагменты удаляют на этапе отмывки с помощью специального буфера. Обогащение проводят согласно заводскому протоколу. Для одного обогащения берется 100 нг каждой из 12 библиотек (суммарно 1200 нг). После этого происходит амплификация обогащенного пула фрагментов. Конечным продуктом на этапе гибридизации является библиотека последовательностей, включающая в себя все таргетные области, готовые для высокопроизводительного секвенирования. После этого проводят этап создания эмульсии в котором захваченные фрагменты ДНК соединяются с микрогранулами. После смешивания фрагмент библиотеки захватывается олигонуклеотидом на грануле. Каждый из этих фрагментов: затем комплексы гранул смешивают с масляной эмульсией. Смешивание и встряхивание приводит к тому, что вода образует капли вокруг гранул, называемые эмульсией. Последующим этапом является эмульсионная ПЦР, включающая в себя клональную амплификацию обогащенной библиотеки в эмульсии на полистирольных частицах, отмывку полученных частиц и их подсчет. Процесс выполняют таким образом, что каждая капля эмульсии содержит только один фрагмент ДНК. Конечным продуктом на этапе эмульсионной ПЦР является образование миллионов копий каждого фрагмента ДНК на поверхности каждой гранулы. После этого все гранулы с ДНК загружают в специальную пластину (слайд), в которой в каждой лунке помещается только одна гранула и проводится пиросеквенирование. Помимо частиц с ДНК-матрицей, в каждую лунку помещают другие частицы - каждая с иммобилизованными на ее поверхности ферментами, необходимыми для пиросеквенирования. Пиросеквенирование проводят на платформе 454 с использованием секвенатора Junior (Roche, Германия). Реактивы, необходимые для реакции секвенирования, на определенном этапе последовательно подают в проточную камеру прибора, куда помещается слайд, с гранулами. В процессе пиросеквенирования при встраивании каждого последующего нуклеотида оптической схемой прибора регистрируют излучение фотонов, после чего сигнал корректируется с учетом уровня фона. Интенсивность нормализованного сигнала для каждой конкретной лунки во время поступления в проточную камеру определенного нуклеотида пропорциональна числу встроенных нуклеотидов. Высокая точность расшифровки последовательности достигается тем, что система осуществляет многочисленное прочтение одного и того же фрагмента, что позволяет построить единую обобщенную последовательность таргетных фрагментов ДНК. Отдельные прочтения одного и того же участка ДНК выравниваются относительно друг друга исходя из интенсивности сигналов в момент протекания через камеру того или иного нуклеотида, а не на основе последовательности этих прочтений. Затем соответствующие сигналы усредняют и только тогда записывают полученную последовательность. Такой подход значительно улучшает качество расшифровки последовательности и предоставляет возможность оценки ее качества. В процессе пиросеквенирования, осуществляемого в нашем способе, суммарная протяженность исследуемых участков генома для одного образца составляет 0,8 т.п.н. Это позволяет проводить за один запуск одновременный анализ 12 образцов (библиотек) с более чем 20-кратным средним покрытием таргетных участков.

Далее проводят анализ полученных геномных данных. Тримминг и картирование проводят при помощи программного обеспечения GSReference Mapper. Полученные генетические вариации аннотируются программным пакетом Alamut Batch. Клинически значимые геномные варианты проверяются с использованием базы данных по мутациям HGMD Professional. Анализ ранее неописанных мутаций проводят с помощью компьютерной программы Alamut Visual, позволяющей определять функциональную значимость мутаций. Результатом проведенной биоинформатической обработки геномных данных является заключение о наличии или отсутствии у пациента геномных вариаций, которые могут приводить к развитию того или иного наследственного заболевания соединительной ткани. В случае выявления патогенных мутаций, с. 3478С>Т гена NPHS1 и c. 1120A>G гена CD2AP в гетерозиготном состоянии, делают вывод о наличии врожденного нефротического синдрома финского типа.

Клинический пример осуществления способа.

Девочка М., 5 лет 8 мес. Ребенок от 4 беременности. С рождения у ребенка имеет место симптомокомплекс нефротического синдрома (протеинурия до 13,5 г/л, гипо- и диспротеинемия - общий белок 39 г/л, альбумины - 10-13 г/л, гиперхолестеринемия - до 15 мкмоль/л), гематурия до 100 в п/зр. По морфологическим показателям в 2011 году установлен диагноз - врожденный нефротический синдром. У пациентки наблюдается терминальная стадия хронической почечной недостаточности, в настоящее время находится на перитонеальном диализе. С целью постановки диагноза изначально был проведен поиск мутаций в гене NPHS2 методом прямого автоматического секвенирования. Мутаций не выявлено. Далее методом секвенирования нового поколения был выполнен анализ кодирующих, прилегающих интронных, 3' и 5' нетранслируемых областей генов NPHSL NPHS2, PLCE1, TRPC6, ACTN4, WT1, COL4A5, CD2AP, COL4A3, COL4A4, мутации в которых приводят к развитию наиболее распространенных наследственных болезней почек, сопровождающихся наличием симтомокомплекса нефротического синдрома. Выявлены мутации с. 3478С>Т гена NPHS1 и c. 1120A>G гена CD2AP в гетерозиготном состоянии, которые могут приводить к развитию нефротического синдрома. На основании данных клинической картины, а также результатов молекулярно-генетических исследований установлен диагноз врожденный нефротический синдром финского типа.

Проведенный биоинформатичекий анализ выявленных мутаций позволяет сделать вывод о наличии у пациента генетически детерменированного нефротического синдрома финского типа, что в свою очередь даст возможность существенно скорректировать тактику терапии такого больного с первых дней жизни, сократить последствия возможной инвалидизации и значительно повысить качество жизни таких пациентов.

В результате осуществления данного способа с использованием технологии таргетного обогащения SeqCap EZ на платформе 454 проводится наиболее эффективный молекулярно-генетический анализ, целью которого является выявление патогенных мутаций для максимально быстрой и точной постановки диагноза у пациента с клиническими проявлениями НС.

Предлагаемый способ обладает достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и точностью в диагностике наследственных болезней почек, что позволит проводить дальнейшие целенаправленные профилактические мероприятия данной группы заболеваний. Оценка эффективности предлагаемого способа прогнозирования проводилась путем подтверждения выявленных мутаций классическим методом Сэнгера.

Способ разработан и внедрен в лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии лабораторного отдела ФГБУ «НЦЗД» Минздрава России.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения. Проводят молекулярно-генетический анализ кодирующих, прилегающих интронных, 3' и 5' нетранслируемых областей генов NPHS1, NPHS2, PLCE1, TRPC6, ACTN4, WT1, COL4A5, CD2AP, COL4A3, COL4A4 с использованием технологии таргетного обогащения SeqCap EZ на платформе 454. В случае выявления мутаций с.3478С>Т гена NPHS1 и c.1120A>G гена CD2AP в гетерозиготном состоянии делают вывод о наличии врожденного нефротического синдрома финского типа. Изобретение позволяет сделать вывод о наличии генетически детерменированного нефротического синдрома, что в свою очередь дает возможность скорректировать тактику терапии больного с первых дней жизни, сократить последствия возможной инвалидизации и повысить качество жизни пациента. 1 пр.

Способ диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения, заключающийся в анализе кодирующих, прилегающих интронных, 3' и 5' нетранслируемых областей генов NPHS1, NPHS2, PLCE1, TRPC6, ACTN4, WT1, COL4A5, CD2AP, COL4A3, COL4A4, путем проведения молекулярно-генетического анализа с использованием технологии таргетного обогащения SeqCap EZ на платформе 454 и в случае выявления патогенных мутаций с.3478С>Т гена NPHS1 и c.1120A>G гена CD2AP в гетерозиготном состоянии делают вывод о наличии врожденного нефротического синдрома финского типа.