ИНГИБИТОР ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК A01N65/00 A01N65/42 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, более конкретно к средствам защиты растений от фитопатогенов, а именно к ингибитору вируса табачной мозаики (ВТМ), включающему выделенные из чеснока посевного Allium sativum L. пептидно-белковые компоненты: комплекс «лектин-аллиназа» и пептиды с молекулярной массой 4300-4500 Да.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в сельском хозяйстве в качестве экологически безопасного эффективного средства защиты растений, получаемого из доступного растительного сырья.

В литературе не имеется сведений об использовании в сельском хозяйстве в качестве средства защиты растений от вируса табачной мозаики на листьях табака каких-либо биологически активных веществ, выделенных из чеснока посевного Allium sativum L.

Известен ряд синтетических и природных ингибиторов вируса табачной мозаики на листьях различных растений, в том числе табака, в частности 2-хлор-3-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенон [RU патент РФ №2144767 (2000)], 2,5-дихлор-3-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 [RU патент РФ №2145166 (2000)], 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин (ДГТ) [Шмыгля В.А., Постников Д.А., Кинякин Н.Ф. Химизация сельского хозяйства, 1990, №5, 57-59; Schuster G. Acta Phytopat. Entomol. Hungarica, 1986, 21 (1/2), 15-21] и кинетин - ингибитор природного происхождения [Бабоша А.В. В сб. научн. тр.: Биотехнология в картофелеводстве. М.: РСХА, 1991, 104-110].

Известно, что 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин снижает степень зараженности листьев табака ВТМ приблизительно на 50% при концентрациях (4,5-9,0)×10^-3 М (или 0,5-1,1 мг/мл) [Шмыгля В.А., Постников Д.А., Кинякин Н.Ф. Химизация сельского хозяйства, 1990, №5, 57-59; Schuster G. Acta Phytopat. Entomol. Hungarica, 1986, 21 (1/2), 15-21]. Недостатками ДГТ являются высокая острая токсичность (ЛД₅₀=5,0 мг/кг), относящая его к чрезвычайно опасным веществам согласно ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности, неэффективность при концентрациях ниже 10^-3 М и фитотоксичность при концентрациях выше 10^-3 М.

Кинетин, ингибитор природного происхождения, снижает зараженность листьев табака ВТМ на 42% при концентрации 10^-6 М (или 2,15×10^-4 мг/мл) [Бабоша А.В. В сб. научн. тр.: Биотехнология в картофелеводстве. М.: РСХА, 1991, 104-110]. К недостаткам кинетина относятся трудоемкий и сложный процесс его выделения и его высокая острая токсичность (его ЛД₅₀ составляет 4,7 мг/кг, что соответствует чрезвычайно опасным соединениям по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности).

2,5-Дихлор-3-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 [RU патент РФ №2145166 (2000)] обеспечивает снижение зараженности листьев табака ВТМ на 55% при концентрациях 10^-10-10^-9 М (3,17×10^-8 - 3,17×10^-7 мг/мл), относится к классу умеренно токсичных веществ (ЛД₅₀ составляет 225 мг/кг) согласно ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности и в среднеэффективных ингибирующих ВТМ концентрациях не вызывает раздражения кожных покровов.

2-Хлор-3-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенон [RU патент РФ №2144767 (2000)] снижает зараженность листьев табака ВТМ на 45-50% при концентрациях 10^-10-10^-9 М (2,76×10^-8 - 2,76×10^-7 мг/мл), не раздражая при этом кожных покровов, и относится к классу умеренно токсичных веществ, поскольку его ЛД₅₀ составляет 220 мг/кг [ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности].

Основными недостатками двух последних умеренно токсичных циклопентеноновых ингибиторов ВТМ на листьях табака являются многостадийные способы их получения из гексахлорциклопентадиена и негативные последствия их широкого использования, связанные с их накоплением в почве, водоемах и грунтовых водах.

Среди перечисленных аналогов того же назначения наиболее близкими по эффективности к заявляемому изобретению являются 2,5-дихлор-3-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 [RU патент РФ №2145166 (2000)] и 2-хлор-3-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенон [RU патент РФ №2144767 (2000)]. В качестве прототипа выбран 2-хлор-3-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенон.

Следует отметить, что весьма перспективным направлением исследований для расширения ассортимента средств защиты растений от фитопатогенов является создание экологически безопасных «натуральных» средств защиты растений для замены широко применяемых химических средств, которые наносят вред окружающей среде и способствуют появлению новых видов фитопатогенов, устойчивых к действию ядохимикатов.

Задачей настоящего изобретения является создание достаточно эффективного и экологически безопасного ингибитора вируса табачной мозаики из доступного растительного сырья.

Задача решается:

заявляемым ингибитором вируса табачной мозаики, содержащим выделенные из чеснока посевного Allium sativum L. пептиды с молекулярной массой 4300-4500 Да и белковый комплекс "лектин-аллиназа" при массовом соотношении пептиды:комплекс 0,1:(1-20), который эффективен при разведении водой до концентрации общего белка 10^-15-10^-9 мг/мл, предпочтительно 10^-11 мг/мл; и

способом получения указанного ингибитора, включающим экстракцию луковиц чеснока посевного Allium sativum L. водно-солевым раствором при 4-5°С, разделение экстракта на пептидную и белковую фракции обработкой сульфатом аммония и последующим центрифугированием, выделение пептидов с молекулярной массой 4300-4500 Да из супернатанта и белкового комплекса "лектин-аллиназа" - из осадка, приготовление смеси выделенных пептидов и белкового комплекса требуемого состава.

Источником получения заявляемого ингибитора вируса табачной мозаики, поражающего растения, является водно-солевой экстракт из луковиц чеснока посевного Allium sativum L., богатого различными биологически активными веществами. Экстракцию очищенных и измельченных луковиц чеснока проводят при пониженной температуре 4-5°С, что позволяет устранить неспецифический протеолиз белков. Добавление к экстракту сульфата аммония приводит к осаждению крупных белков, в то время как в растворе остаются пептиды.

С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) из супернатанта выделяют основные представленные в нем пептиды - с молекулярной массой от 4300 до 4500 Да.

Из белкового осадка, образовавшегося после обработки экстракта сульфатом аммония, с помощью гельпроникающей ВЭЖХ выделяют комплекс лектина чеснока с молекулярной массой 6400 Да и аллиназы чеснока с молекулярной массой 54000 Да. (Следует отметить, что в литературе описан комплекс «лектин-аллиназа», выделяемый из луковиц чеснока Allium sativum L., однако никаких данных о его биологических свойствах не приведено [Smeets К., Van Damme E.J., Van Leuven F., Peumans W.J. Glycoconj J., 1997, 14 (3), 331-343].)

Было проведено исследование активности пептидной и белковой фракций, выделенных из водно-солевого экстракта луковиц чеснока Allium sativum L., в отношении вируса табачной мозаики на листьях табака. Оказалось, что ни пептиды с молекулярной массой 4300-4500 Да, ни комплекс «лектин-аллиназа» по отдельности не оказывают никакого действия на ВТМ, тогда как их смеси обладают выраженной ингибирующей активностью в отношении этого вируса.

Заявляемый ингибитор вируса табачной мозаики содержит выделенные из чеснока посевного Allium sativum L. пептиды с молекулярной массой 4300-4500 Да и комплекс «лектин-аллиназа» при массовом соотношении пептиды:комплекс, составляющем 0,1:(1-20), и эффективен в отношении ВТМ на листьях табака в диапазоне концентраций общего белка 10^-15-10^-9 мг/мл, при оптимальном значении 10^-11 мг/мл.

Заявляемый ингибитор не проявляет фитотоксичности во всем диапазоне биологически активных концентраций, а также безвреден для человека и животных, поскольку его составляющие выделены из природного источника - чеснока Allium sativum L., который не только употребляется человеком в пищу, но и широко используется для лечения и профилактики различных заболеваний. В частности, экстракты чеснока применяются в фитотерапии для восстановления нормальных обменных функций организма [RU патент РФ №2171112], активно добавляются в различные продукты питания [RU патент РФ №2460309], а также могут быть использованы в качестве усилителя активности лекарственных средств [RU патент РФ №2155062].

Заявляемый ингибитор вируса табачной мозаики имеет следующие преимущества при сравнении с прототипом и аналогами:

более низкая минимальная ингибирующая концентрация и более широкий диапазон концентраций, в которых проявляется противовирусная активность (10^-15-10^-9 мг белка/мл);

низкая эффективная концентрация;

отсутствие фитотоксичности;

получение ингибитора из доступного растительного сырья;

безвредность для человека и животных в диапазоне биологически активных концентраций;

экологически безопасная технология защиты растений.

Техническим результатом изобретения является экологически безопасный ингибитор вируса табачной мозаики на листьях табака, эффективный при низких концентрациях и получаемый из доступного растительного сырья.

Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, в которых описан способ получения заявляемого ингибитора (пример 1), определение его активности на листьях табака (примеры 2-7) и установление фитотоксичности (пример 8).

Пример 1

Очищенные луковицы чеснока посевного Allium sativum L. в количестве 3 кг нарезают на фрагменты 1×1 см, заливают 10 л водно-солевого раствора состава (М): NH₄NO₃ - 2,06×10^-2, KNO₃ - 1,88×10^-2, СаСl₂ - 3,0×10^-3, MgSO₄ -1,5×10^-3, KН₂РO₄ - 1,25×10^-3 и выдерживают в холодильнике при 4-5°С в течение 4-5 ч. К полученному таким образом экстракту после центрифугирования при 3000 g в течение 30 мин при постоянном перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до получения насыщенного раствора (780 г/л) для осаждения белков и затем смесь инкубируют в течение 20 дней при 4-5°С. После 30-минутного центрифугирования при 10000 g для удаления солей супернатант диализуют при 4-5°С против воды, а осадок - против 0,05 М фосфатного буфера (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:50).

Обессоленный супернатант концентрируют при 36-40°С и далее разделяют на фракции с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на гидрофобной колонке Kromasil С18 (Россия) (4,6×250 мм) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США). Элюцию осуществляют в градиенте концентраций ацетонитрила (2-96%) в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты (рН 2,2) со скоростью 1 мл/мин в течение 60 мин. Детекцию проводят при 214 нм. Полученные ВЭЖХ-фракции анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Выделяют фракцию объемом 1 мл с концентрацией белка 40 мкг/мл, содержащую пептиды с молекулярной массой 4300-4500 Да.

Обессоленный белковый осадок растворяют в минимальном объеме 0,05 М фосфатного буфера и фракционируют с помощью высокоэффективной гельпроникающей хроматографии на колонке Bio-Sil TSK-125 300×7,5 мм (Япония) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США). Элюцию осуществляют 0,05 М фосфатным буфером. Полученные ВЭЖХ-фракции анализируют электрофоретически в 12,5%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выделяют фракцию, которая характеризуется полосами, соответствующими молекулярным массам 6400 и 54000 Да. Проведенный триптический анализ характеристических белков в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием показывает, что белок с молекулярной массой 6400 Да гомологичен А-цепи маннозоспецифичного агглютинина (лектина) чеснока, а белок с молекулярной массой 54000 Да представляет собой фермент аллиназу. В указанных условиях получают фракцию, содержащую комплекс "лектин-аллиназа", объемом 50 мл с концентрацией белка 100 мкг/мл.

Объединяют пептидную фракцию и комплекс "лектин-аллиназа" в различных массовых соотношениях - от 0,1:1 до 0,1:20. Полученные объединенные компоненты путем десятикратного последовательного разведения водой доводят до требуемой концентрации белка.

Пример 2

Семена табака Nicotiana tabacum сорта Xanthi (NN) высевают в общий горшок с почвой. Через 2 недели после появления всходов растения пересаживают в индивидуальные горшки (400 мл) и выращивают в камере искусственного климата при 16-часовой продолжительности дня и температуре 22°С днем и 20°С ночью. Для опытов используют растения в фазе 5-6 настоящих листьев. Для заражения используют сок растения табака, инфицированного ВТМ, разбавленный в 10 тысяч раз дистиллированной водой (предварительно подбирают концентрацию инокулюма так, чтобы при нанесении 30-50 мкл водной суспензии вируса на листе образовывалось от 100 до 200 некрозов). Для одного варианта опыта отбирают по 5 листьев с разных растений. Левую половину листа обрабатывают 60 мкл смеси с карборундом, содержащей 30 мкл раствора ингибитора с концентрацией белка 10^-11 мг/мл при соотношении компонентов пептиды:комплекс = 0,1:1 и 30 мкл суспензии вируса табачной мозаики. Правую половину листа обрабатывают 60 мкл смеси с карборундом, содержащей равные объемы дистиллированной воды и суспензии ВТМ. Обработанные листья помещают во влажную камеру при 22°С, количество некрозов подсчитывают через три-четыре дня. Количество некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывают отдельно для каждой половины листа. Для оценки достоверности полученных результатов используют критерий Стьюдента (компьютерная программа STATISTICA 6.0, StatSoft Inc.). Обработка листьев табака сорта Xanthi заявляемым ингибитором достоверно снижает образование некрозов в 1,5 раза, что соответствует биологической эффективности 33,8%.

Пример 3

Обработка зараженных ВТМ листьев табака сорта Xanthi по методике, описанной в примере 2, заявляемым ингибитором ВТМ при соотношении компонентов пептиды:комплекс, равном 0,1:1 и концентрации белка 10^-9 мг/мл достоверно снижает образование некрозов в 1,2 раза, что соответствует биологической эффективности 16,7%.

Пример 4

Обработка зараженных ВТМ листьев табака сорта Xanthi по методике, описанной в примере 2, заявляемым ингибитором ВТМ при соотношении компонентов пептиды:комплекс = 0,1:1 и концентрации белка 10^-15 мг/мл достоверно снижает образование некрозов в 1,3 раза, что соответствует биологической эффективности 23,1%.

Пример 5

Обработка зараженных ВТМ листьев табака сорта Xanthi по методике, описанной в примере 2, только пептидсодержащей фракцией при концентрации белка 10^-11 мг/мл не оказывает действия на ВТМ.

Пример 6

Обработка зараженных ВТМ листьев табака сорта Xanthi по методике, описанной в примере 2, только комплексом "лектин-аллиназа" при концентрации белка 10^-11 мг/мл не оказывает действия на ВТМ.

Пример 7

Обработка зараженных ВТМ листьев табака сорта Xanthi по методике, описанной в примере 2, заявляемым ингибитором ВТМ при соотношении компонентов пептиды:комплекс = 0,1:25 и концентрации белка 10^-11 мг/мл не оказывает действия на ВТМ.

Пример 8

Обработка не зараженных ВТМ листьев табака сорта Xanthi по методике, описанной в примере 2, заявляемым ингибитором ВТМ при соотношении пептиды:комплекс «лектин-аллиназа» = 0,1:1 и концентрации белка 10^-11 мг/мл не приводит к какому-либо поражению тканей листьев, что позволяет говорить об отсутствии фитотоксичности у заявляемого ингибитора ВТМ, т.е. о его безопасности для растений.

Группа изобретений относится к защите сельскохозяйственных культур от вирусных заболеваний, конкретно к ингибитору вируса табачной мозаики (ВТМ) на листьях табака. Ингибитор вируса табачной мозаики получают следующим образом. Луковицы посевного чеснока Allium sativum L. обрабатывают водно-солевым раствором при 4-5°С и выдерживают в течение 4-5 ч с последующим центрифугированием при заданных параметрах с получением экстракта. Полученный экстракт обрабатывают сульфатом аммония, осуществляют инкубирование при заданных параметрах с последующим центрифугированием с получением супенаттанта и осадка. Из полученного супенатанта выделяют пептидную фракцию с молекулярной массой 4300-4500 Да, а из осадка - белковую фракцию, содержащую комплекс "лектин-аллиназа”, и готовят смесь выделенных пептидов и белкового комплекса с массовым соотношением пептиды:белковый комплекс, равным 0,1:(1-20). Группа изобретений позволяет снизить зараженность вирусом табачной мозаики листьев табака. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 пр.

1. Ингибитор вируса табачной мозаики на листьях табака, содержащий выделенные из чеснока посевного Allium sativum L. пептиды с молекулярной массой 4300-4500 Да и белковый комплекс "лектин-аллиназа" при массовом соотношении пептиды:комплекс, равном 0,1:(1-20).

2. Ингибитор вируса табачной мозаики по п. 1, эффективный при разведении водой до концентрации общего белка 10^-15-10^-9 мг/мл, предпочтительно 10^-11 мг/мл.

3. Способ получения ингибитора вируса табачной мозаики по п. 1, включающий экстракцию луковиц чеснока посевного Allium sativum L. водно-солевым раствором при 4-5°С, разделение экстракта на пептидную и белковую фракции обработкой сульфатом аммония и последующим центрифугированием, выделение пептидов с молекулярной массой 4300-4500 Да из супернатанта и белкового комплекса "лектин-аллиназа" из осадка, приготовление смеси выделенных пептидов и белкового комплекса требуемого состава.