ИНГИБИТОР ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ НА ЛИСТЬЯХ ТАБАКА Российский патент 2000 года по МПК A01N43/50 

Изобретение относится к органической химии, конкретно к 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенону-1 (I), который может быть использован в сельском хозяйстве в качестве ингибитора вируса табачной мозаики на листьях табака.

В литературе нет сведений по использованию в сельском хозяйстве в качестве ингибитора вируса табачной мозаики (ВТМ) 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I). Поэтому при испытаниях в качестве аналогов по свойствам были использованы синтетическое вещество - ингибитор фитопатогенных вирусов, 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин (ДГТ) (аналог пиримидина) [1, 2] и биологически активное соединение кинетин (природный пурин) [3], которые вызывают ингибирование ВТМ на листьях табака в диапазоне, равном 45-50%.

Так, известный ингибитор - 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин (ДГТ) обеспечивает снижение зараженности листьев табака ВТМ относительно контроля на ~ 50% в интервале концентраций 0,1-0,05 вес.% (что составляет 0,9•10^-2 - 4,5•10^-3 М) (см. табл. 2), т.е. это соединение при концентрациях ниже 10^-3 М малоэффективно, а при концентрациях выше 10^-3 М оно фитотоксично [1, 2]. Кроме того, это соединение германского производства и в России не выпускается.

Известное природное соединение - кинетин [3] хотя и обеспечивает снижение зараженности листьев табака ВТМ на 42% при более низкой концентрации 10^-6 М, однако выделение кинетина является довольно трудоемким и сложным процессом.

Кроме того следует отметить, что соединения кинетин и ДГТ по классификации вредных веществ (ГОСТ 12.1.007-76 С СБТ) [4] являются токсичными (ЛД₅₀ кинетина и ДГТ составляет 4,7 и 5,0 мг/кг соответственно).

В заявленном техническом решении предложено в качестве ингибитора ВТМ на листьях табака использовать 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 (I), синтез которого базируется на доступном крупнотоннажном сырье - гексахлорциклопентадиене [5] . Ранее соединение (I) было использовано как проявляющее антиагрегационную активность тромбитов [6]. Нами впервые предложено использовать 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 (I) в качестве ингибитора ВТМ на листьях табака.

Соединение (I) получают в условиях способа.

К перемешиваемому раствору 2,86 г 2,3,5-трихлор-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 в 30 мл метанола при 20^oC в течение 0,5 ч прибавили по каплям раствор 1,36 г имидазола в 10 мл метанола, после чего массу перемешивали еще 2 ч. По истечении реакции (ТСХ) отгоняли метанол, прибавляли к остатку воду, экстрагировали хлороформом, сушили над безводным Na₂SO₄ и упарили хлороформ. После хроматографирования на силикагеле (элюент: гексан-этилацетат, 1: 1) получили 2,47 г (70% от теорет.) 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I) в виде маслянистой жидкости.

Проведенные испытания показали (см. табл. 1), что соединение (I) более эффективно и в интервале концентраций 10^-10 - 10^-8 М снижает зараженность листьев табака ВТМ на 40-55%. Снижение концентрации (I) ниже 10^-10 М нецелесообразно, при повышении концентрации до 10^-7 М зараженность ВТМ снижается только на 30%, т.о. для снижения зараженности листьев табака ВТМ на 55% оптимальной является концентрация 10^-10 - 10^-9 М, что в 10⁴ - 10³ раз меньше эффективной концентрации кинетина (10^-6 М) и в 10⁷ - 10⁶ раз меньше эффективной концентрации ДГТ (10^-3 М).

В связи с тем, что соединение (I) может быть использовано в качестве ингибитора ВТМ на листьях табака, были проведены испытания по выявлению его острой токсичности на мышах, а также было изучено его раздражающее и аллергизирующее влияние на кожные покровы мышей, кроликов и морских свинок. Результаты испытаний показали (см. табл. 2), что соединение (I) относится к умеренно токсичным веществам (ЛД₅₀ 225 мг/кг [4] и оно не оказывает раздражающего и аллергизирующего действия на кожные покровы животных [7].

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Антивирусная активность 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I).

Испытания указанного соединения (I) проводили в лабораторных условиях методом in vitro на модельной системе "хозяин - патоген" [8]. Диски листьев табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун, инокулированные вирусом табачной мозаики, инкубировали в течение 72 часов в чашках Петри с концентрацией 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I) 1•10^-9 М. Для инокулирования использовали очищенный препарат вируса ВТМ с исходной концентрацией 10 мкг/мл, в объеме 0,1 мл на один лист табака. Об антивирусной активности исследуемого соединения судили по проценту ингибирования ВТМ в сравнении с зараженным контролем, взятым за 100%, и контролем чистым (O). Наличие вируса определяли методом Elisa [8], используя серийные наборы реактивов НИИКУ.

Данные испытаний по концентрациям 1•10^-10, 1•10^-8, 1•10^-7, 1•10^-6 М приведены в таблице 1.

Пример 2. Острая токсичность 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I).

Острая токсичность предлагаемого соединения (I) изучалась на белых беспородных мышах массой 18-20 г при условии однократного введения в желудок (per os) в дозах от 50 до 400 мг/кг [7]. ЛД₅₀ исследуемого соединения (I) составила 225 (155-321) мг/кг. ЛД₅₀ 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазина (ДГТ) была 5,0 (5,5-4,5) мг/кг, а ЛД₅₀ кинетина - 4,7 (5,8-4,2) мг/кг.

Следовательно, предлагаемое соединение 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 (I) входит в класс умеренно опасных веществ (151-5000 мг/кг, ГОСТ 12.1.007-76 [4] при пероральном введении.

Пример 3. Раздражающее действие 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I).

Раздражающее действие 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I) на кожу изучалось в опытах на мышах по общепринятой методике [7] , а также на кроликах и морских свинках [7]. Установлено, что однократный 2-часовой контакт кожи хвоста мышей как с чистым раствором соединения (I) среднеэффективной концентрации (10^-9 М), так и эмульсией соединения (I) в полном адъюванте Фрейнда не вызывает гиперемии кожи и отторжения эпителия на поверхности контакта с веществом.

При нанесении трех капель раствора соединения (I) в среднеэффективной концентрации (10^-9 М) на выстриженный участок боковой поверхности туловища кроликов через 24 часа визуально не наблюдалось ни гиперемии, ни сухости и раздражения эпителия. У морских свинок при аналогичных условиях опыта также не выявлено раздражающее действие.

Следовательно, предлагаемое соединение 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 (I) не вызывает раздражения кожных покровов животных при непосредственном контакте.

Пример 4. Аллергенная активность 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 (I).

Аллергенные свойства предлагаемого соединения исследовали по методу Алексеевой-Петкевич на морских свинках [7] . При этом внутрикожно первой группе животных в наружную поверхность уха был введен 0,1 мл вещества (I) в виде водной суспензии среднеэффективной концентрации (10^-9 М), а другим группам - более концентрированную (10^-8 М) суспензию исследуемого вещества (I). На 11-ый день опыта выполнялось тестирование путем нанесения на выстриженный участок кожи водной суспензии соединения (I) в среднеэффективной концентрации (10^-9). Через 24 и 48 часов после нанесения кожных проб визуально не отмечено покраснение кожи на участках тестирования.

Следовательно, продукт (I) не обладает аллергенным действием.

Технико-экономическое преимущество
1) Предлагаемый в качестве ингибитора ВТМ на листьях табака - 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 при концентрациях (10^-9 - 10^-10 М) обеспечивает эффективное снижение (на 55%) зараженности листьев табака ВТМ. Известный 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин снижает зараженность на 50% при концентрации 10^-2 - 10^-3 М, что в 10⁷ - 10⁶ раз выше концентрации заявленного. Кинетин снижает зараженность на 42% при концентрации 10^-6 М, что в 10³ раз выше концентрации заявленного.

2) По токсичности 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 (I) также имеет преимущество перед 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазином и кинетином, так как ЛД₅₀ соединения (I) составляет 225 мг/кг, а ЛД₅₀ кинетина и ДГТ составляет соответственно 4,7 и 5,0 мг/кг.

3) 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2- циклопентенон-1 (I) не вызывает раздражения и аллергии кожных покровов, а значит безвреден для людей и животных в момент обработки сельскохозяйственных растений.

Литература
1. Шмыгля В.А., Постников Д.А., Кинякин Н.Ф. Химиотерапия вирусных болезней /Химизация сельского хозяйства. - М.: Агропромизд., 1990. - Т. 5. - С. 57-59.

2. Schuster G. Necessities, Problems and Results of the Development and Application of Antiphitoviral Substances against Tobacco Viruses / Acta Phytopat. Entomol. Hungarica. - 1986. V. 21. - N. 1-2. - P. 15-21.

3. Бабоша А.В. Исследование биологических свойств растительных олигоаденилатов /Научн. тр. Биотехнология в картофелеводстве, РСХА, НИЛ картофельного хозяйства. - Москва, 1991. - С. 104-110.

4. ГОСТ 12.1.007-76 С СБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.

5. Толстиков Г.А., Исмаилов С.А., Мифтахов М.С./Ж. Орг. химии. - 1991. - Т. 27. - Вып. 12 - С. 2547-2552.

6. А.С. 1796626 (СССР). 1993 г.

7. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. - М., 1988 г. - 19 с.

8. Инструкция по использованию иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля /Коренево, НИИКХ, 1990. - 28 с.

Изобретение относится к органической химии, конкретно к использованию 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 в сельском хозяйстве, в качестве ингибитора вируса табачной мозаики на листьях табака. Предлагаемый в качестве ингибитора 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенон-1 высокоэффективен, он при низких концентрациях (10^-9 - 10^-10 М) обеспечивает снижение зараженности листьев табака вирусом табачной мозаики на 55%, он малотоксичен - ЛД₅₀ составляет 225 мг/кг, не вызывает раздражения и аллергии кожных покровов, следовательно, безвреден для людей и животных при обработке сельскохозяйственных растений. 2 табл.

Применение 2,5-дихлор-3N-имидазолил-4,4-диметокси-5-аллил-2-циклопентенона-1 общей формулы

в качестве ингибитора вируса табачной мозаики на листьях табака.