ИНГИБИТОР ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ НА ЛИСТЬЯХ ТАБАКА Российский патент 2000 года по МПК A01N37/06 

Изобретение относится к органической химии, конкретно к 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенону (I), который может быть использован в сельском хозяйстве в качестве ингибитора вируса табачной мозаики на листьях табака.

В литературе нет сведений по использованию в сельском хозяйстве в качестве ингибитора вируса табачной мозаики (ВТМ) 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенона (I). Поэтому при испытаниях в качестве аналогов по свойствам были использованы синтетическое вещество - ингибитор фитопатогенных вирусов 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин (ДГТ) (аналог пиримидина) [1,2] и биологически активное вещество кинетин (природный пурин) [3], которые вызывают ингибирование ВТМ на листьях табака в диапазоне равном 45-50%.

Так, известный ингибитор вируса табачной мозаики (ВТМ) - 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин (ДГТ) обеспечивает снижение зараженности листьев табака ВТМ относительно контроля на ≈ 50% в интервале концентраций 0,1-0,05 вес. % (что составляет 0,9•10^-2 - 4,5•10³ М) (см. табл. 2), т.е. это соединение при концентрациях ниже 10^-3 М малоэффективно, а при концентрациях выше 10^-3 М оно фитотоксично [1, 2]. Кроме того, это соединение германского производства и в России не выпускается.

Известное природное соединение - кинетин [3] хотя и обеспечивает снижение зараженности листьев табака ВТМ на 42% при более низкой концентрации (10^-6 М), однако его выделение является довольно трудоемким и сложным процессом.

Следует отметить, что соединения кинетин и ДГТ по классификации вредных веществ (ГОСТ 12.1.007-76 С СБТ) [4] являются токсичными (ЛД₅₀ кинетина и ДГТ составляет 4,7 и 5,0 мг/кг соответственно).

В заявленном техническом решении впервые предложено в качестве ингибитора ВТМ на листьях табака использовать 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенон (I), синтез которого базируется на доступном крупнотоннажном сырье - гексахлорциклопентадиене [5].

Проведенные испытания показали (см. табл. 2), что соединение (I) более эффективно и снижает зараженность листьев табака ВТМ на 45-50% при более низких концентрациях 10^-10 - 10^-9 М. Снижение концентрации (I) ниже 10^-10 М нецелесообразно, а при повышении концентрации более 10^-8 М зараженность ВТМ снижается только на 20-30%, т.о. для эффективного снижения зараженности листьев табака ВТМ на 50% оптимальной является концентрация 10^-9 М, что в 10³ раз меньше эффективной концентрации кинетина (10^-6) и в 10⁶ раз меньше эффективной концентрации ДГТ (10^-3).

2-Хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенон (I) получают в условиях известного способа селективным окислительным расщеплением алленовой двойной связи 2,5-дихлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5-пропадиенил-2-циклопентенона системой OsO₄-NaIO₄ согласно приведенной в работе [6] методике (см. пример 1). Выход продукта - 86%.

В известной ссылке [6] при получении 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-димeтoкcи-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I) представлены только физико-химические характеристики и не были исследованы его утилитарные свойства. Нами впервые обнаружено, что соединение (I) может быть использовано в качестве ингибитора ВТМ, в связи с этим и были проведены испытания по выявлению его острой токсичности на мышах, а также было изучено его раздражающее и аллергизирующее влияние на кожные покровы мышей, кроликов и морских свинок. Результаты испытаний показали (см. табл. 1), что соединение (I) относится к умеренно токсичным веществам (ЛД₅₀ 220 мг/кг) [4] и не оказывает раздражающего и аллергизирующего действия на кожные покровы животных [7].

Сущность поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z- (карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I).

К раствору 2.94 г 2,5-дихлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5- пропадиенил-2-циклопентенона [8] в 90 мл ТГФ прилили 1,4 мл 1% водного раствора OsO₄ и по истечении 20 мин к образовавшейся черного цвета смеси добавили по каплям раствор 8,8 г NaIO₄ в 60 мл воды. Смесь перемешивали 2 часа. После завершения реакции (ТСХ) выпавший осадок NaIO₃ отфильтровали, фильтрат разбавили 20 мл воды и продукт экстрагировали CHCl₃ (3х50 мл). Объединенные экстракты сушили Na₂SO₄, остаток после упаривания растворителя очищали колоночной хроматографией на SiO₂. Получили 2,8 г (86%) соединения 1. Т.пл. 140-141^oC. ИК-спектр (ν , см^-1): 1580 (N-C= CCl-C=O), 1700 (С=0), 1712 (COOH), 3270. Найдено %: С 47.53; H 5.13; Cl 12.73; N 4.92. C₁₁H₁₄O₅ClN. Вычислено %. С 47.94; H 5.08; Cl 12.88; N 5.08. Спектр ЯМР ¹H ( δ , м.д., CDCl₃): 3.30 с (6H, 2MeO), 3.52 с (3H, CH₃N), 3.70 с (3H, CH₃N), 6.10 с (1H, С= CH), 15.60 уш. с (1H, COOH). Спектр ЯМР ¹³С ( δ , м.д., CDCl₃): 42.29 и 42.45 (CH₃N), 52.04 (OMe), 103.53 (C⁴), 110.06 (C²), 123.72 (=CH), 138.88 (C⁵), 161.96 (C³), 164.99 (COOH), 181.94 (C¹).

Пример 2. Острая токсичность 2-хлор-3N-диметиламино-4,4- диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I).

Острая токсичность предлагаемого соединения (I) изучалась на белых беспородных мышах массой 18-20 г при условии однократного введения в желудок (per os) в дозах от 50 до 400 мг/кг [7]. ЛД₅₀ исследуемого соединения (I) составила 220 (200-242) мг/кг. ЛД₅₀ 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазина была 5,0 (5,5-4,5) мг/кг, а ЛД₅₀ кинетина - 4,7 (5,8-4,2) мг/кг (табл. 1).

Следовательно, предлагаемое соединение 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенон (I) входит в класс умеренно опасных веществ (151-5000 мг/кг, Гост 12.1.007-76 [4]) при пероральном введении.

Пример 3. Раздражающее действие 2-хлор-3N-диметиламино-4,4- диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I)
Раздражающее действие 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z- (карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I) на кожу изучалось в опытах на мышах по общепринятой методике [7] , а также на кроликах и морских свинках [7]. Установлено, что однократный 2-часовой контакт кожи хвоста мышей как с чистым раствором соединения (I) среднеэффективной концентрации (10^-9 М), так и эмульсией препарата (1) в полном адъюванте Фрейнда не вызывает гиперемии кожи и отторжения эпителия на поверхности контакта с веществом.

При нанесении трех капель раствора соединения (I) в среднеэффективной концентрации (10^-9 М) на выстриженный участок боковой поверхности туловища кроликов через 24 часа визуально не наблюдалось ни гиперемии, ни сухости и раздражения эпителия. У морских свинок при аналогичных условиях опыта также не выявлено раздражающее действие.

Следовательно, предлагаемое соединение 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенон (I) не вызывает раздражения кожных покровов животных при непосредственном контакте.

Пример 4. Аллергенная активность 2-хлор-3N-диметиламино- 4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I).

Аллергенные свойства предлагаемого соединения исследовали по методу Алексеевой-Петкевич на морских свинках [7] . При этом внутрикожно первой группе животных в наружную поверхность уха был введен 0,1 мл вещества (I) в виде водной суспензии среднеэффективной концентрации (10^-9 М), а другим группам - более концентрированную (10^-8 М) суспензию исследуемого вещества (I). На 11-ый день опыта выполнялось тестирование путем нанесения на выстриженный участок кожи водной суспензии препарата (I) в среднеэффективной концентрации (10^-9). Через 24 и 48 часов после нанесения кожных проб визуально не отмечено покраснение кожи на участках тестирования.

Следовательно, продукт (I) не обладает аллергенным действием.

Пример 5. Антивирусная активность 2-хлор-3N-диметиламино- 4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I).

Испытания указанного соединения (I) проводили в лабораторных условиях методом in vitro на модельной системе "хозяин - патоген" [9]. Диски листьев табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун, инокулированные вирусом табачной мозаики, инкубировали в течение 72 часов в чашках Петри с концентрацией 2-хлор-3N-диметиламино-4,4- диметокси-5Z-(кapбоксиметилен)-2-циклопентенона (I) 1•10^-9 М. Для инокулирования использовали очищенный препарат вируса ВТМ с исходной концентрацией 10 мкг/мл, в объеме 0,1 мл на один лист табака. Об антивирусной активности исследуемого соединения судили по проценту ингибирования ВТМ в сравнении с зараженным контролем, взятым за 100%, и контролем чистым (0). Наличие вируса определяли методом Elisa [9], используя серийные наборы реактивов НИИКУ.

Данные испытаний по концентрациям 1•10^-10, 1•10^-8, 1•10^-7, 1•10^-6 М приведены в табл. 2.

Технико-экономическое преимущество
1) Предлагаемый в качестве ингибитора ВТМ на листьях табака - 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-4,4-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенон относится к биологически активным соединениям, обладает антивирусными свойствами и при концентрациях 10^-9 - 10^-10 М обеспечивает эффективное снижение (на 45-50%) зараженности листьев табака ВТМ. Известный 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин снижает зараженность на ≈ 50% при концентрациях 10^-2 - 10^-3 М, что в 10⁷ - 10⁶ раз выше концентрации заявленного. Кинетин снижает зараженность на 42% при концентрации 10^-6 М, что в 10³ раз выше концентрации заявленного.

2) По токсичности 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z- (карбоксиметилен)-2-циклопентенон также имеет преимущество перед 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазином и кинетином, так как ЛД₅₀ соединения (I) составляет 220 мг/кг, а ЛД₅₀ ДГТ и кинетина составляет соответственно 4,7 и 5,0 мг/кг.

3) 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2- циклопентенон не вызывает раздражения и аллергии кожных покровов, а значит, безвреден для людей и животных в момент обработки сельскохозяйственных растений.

Литература
1.Шмыгля В.А., Постников Д.А., Кинякин Н.Ф. Химиотерапия вирусных болезней / Химизация сельского хозяйства. - М.: Агропромизд., 1990. -Т 5. - С. 57-59.

2. Schuster G. Necessities, Problems and Results of the Development and Application of Antiphitoviral Substances against Tobacco Viruses/ Acta Phytopat. Entomol. Hungarica. - 1986. - V. 21. - N. 1-2. - P. 15-21.

3. Бабоша А.В. Исследование биологических свойств растительных олигоаденилатов /Научн. тр. Биотехнология в картофелеводстве, РСХА, НИЛ картофельного хозяйства. - Москва, 1991. - С. 104-110.

4. Гост 12.1.007-76 С СБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.

5. Толстиков Г.А., Исмаилов С.А., Мифтахов М.С. /Ж. Орг. химии. - 1989. - Т. 25. - Вып. 7. - С. 1566-1567.

6. Толстиков Г.А., Исмаилов С.А., Мифтахов М.С./ Ж. Орг. химии. - 1991. - Т. 27. - Вып. 12. - С. 2547-2552.

7. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств /М., 1988 г. - 19 с.

8. Толстиков Г.А., Исмаилов С.А., Прищепова Е.В., Мифтахов М.С./ Ж. Орг. химии. - 1991. - Т. 27. - Вып. 12. - С. 2539-2546.

9. Инструкция по использованию иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля /Коренево, НИИКХ, 1990. - 28с.

Изобретение относится к органической химии, конкретно к использованию 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона в сельском хозяйстве в качестве ингибитора вируса табачной мозаики на листьях табака. Предлагаемый в качестве ингибитора 2-хлор-3N-диметиламино-4,4- диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенон высокоэффективен, он при низких концентрациях (10^-9 - 10^-10M) обеспечивает снижение зараженности листьев табака вирусом табачной мозаики на 45 - 50%, он малотоксичен - ЛД₅₀ составляет 220 мг/кг, не вызывает раздражения и аллергии кожных покровов, следовательно, безвреден для людей и животных при обработке сельскохозяйственных растений. 2 табл.

Применение 2-хлор-3N-диметиламино-4,4-диметокси-5Z-(карбоксиметилен)-2-циклопентенона (I) общей формулы

в качестве ингибитора вируса табачной мозаики на листьях табака.