Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая конъюгат интерферона-альфа Российский патент 2017 года по МПК A61K38/21 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, содержащей интерферон-альфа или его конъюгат, и ее применению в лечении рака совместным введением с противораковыми агентами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Человеческий интерферон, являющийся разновидностью цитокинов, представляет собой белок, ингибирующий пролиферацию вирусов, раковых клеток и тому подобного, активируя иммунные ответы организма и апоптоз раковых клеток. В зависимости от типа клеток, образующих интерферон, интерфероны делят на три подкласса, то есть интерферон-альфа, интерферон-бета и интерферон-гамма. В частности, интерферон-альфа образуют В-лимфоциты, нулевые лимфоциты и макрофаги, и он обладает противовирусной и противоопухолевой активностью, активирует NK-клетки (натуральные клетки-киллеры) и обладает супрессивными свойствами в отношении клеток костного мозга.

По данным недавних клинических исследований, рекомбинантный человеческий интерферон-альфа обладает терапевтическим потенциалом для лечения широкого спектра солидных опухолей, при этом в продаже имеются два типа интерферонов, полученных методом рекомбинантных ДНК (рекомбинантный интерферон-α-2b (интрон A (Intron-A), Schering Corp.); рекомбинантный интерферон-α-2а (роферон (Roferon), Hoffmann-La Roche, Inc.). Интрон А показан для применения в лечении злокачественной меланомы в комбинации с хирургическим лечением, агрессивной фолликулярной неходжкинской лимфомы в комбинации с химиотерапией антрациклинами, местного лечения остроконечных кондилом, лечения волосатоклеточного лейкоза и связанной с AIDS саркомы Капоши. Роферон показан для применения в лечении хронического миелогенного лейкоза (CML) с филадельфийской хромосомой и связанной с AIDS саркомы Капоши. Также известна их эффективность при раке мочевого пузыря (Torti, F.M. et al., J. Clin. Onco., 3, 506-512, 1985) и раке почки (Vugrin, D. et al., Cancer treat. Rep., 69, 817-820, 1985). Недавно интерферон, модифицированный полиэтиленгликолем (PEG), был утвержден для применения в лечении злокачественной меланомы. Однако нативный интерферон-альфа или PEG-модифицированный интерферон-альфа, как сообщалось, демонстрируют слабый противораковый эффект по причине короткого периода полувыведения и низкой эффективности.

Рак представляет собой аномальный рост клеток, обусловленный множеством изменений экспрессии генов, приводящих к нарушению баланса пролиферации клеток и гибели клеток, что ведет к инвазии и разрушению близлежащих тканей, отдаленным метастазам и, в конечном счете, к летальному исходу. Известно, что раковые клетки проходят аномальное деление и дифференцировку, возникают в любой ткани организма, что обусловлено одним фактором или их комбинацией. Этими факторами являются средовые факторы, такие как широкий спектр химических веществ или радиация, инфекционные заболевания, такие как вирусные инфекции, и наследственные факторы. Рак можно классифицировать на несколько сотен типов в зависимости от пораженных органов и клеток, составляющих раковую ткань.

Для лечения рака применяют хирургическое лечение, лучевую терапию и химиотерапию, но химиотерапия и лучевая терапия связаны с проблемой тяжелых побочных эффектов, таких как рвота и тошнота, цитопения, инфекция, кахексия, воспаление слизистой оболочки, выпадение волос и так далее. В частности, побочные эффекты химиотерапии могут существенно влиять на жизнь пациента и быстро снижают соблюдение схемы лечения пациентом.

В то же время прогноз 5-летней выживаемости при раке поджелудочной железы неблагоприятен и составляет менее 5%. Поскольку рак поджелудочной железы обычно диагностируют на поздних стадиях, оперативное лечение показано менее чем у 20% пациентов. Несмотря на резекцию, рецидивы, обусловленные микрометастазами и поражением лимфатических узлов, возникают почти у 50% пациентов, чаще всего в течение 2 лет. Известно, что из всех видов рака желудочно-кишечного тракта рак поджелудочной железы является одним из видов рака с наиболее высокой летальностью, и что он представляет собой злокачественную опухоль, являющуюся четвертой по распространенности причиной смерти от рака в странах Запада, и шестой - в Корее. Несмотря на наличие рака поджелудочной железы лишь у 2-3% пациентов с раковым заболеванием им обусловлены 6% всех летальных исходов, связанных с раком. Независимо от типа химиотерапии средняя выживаемость при местнораспространенном раке поджелудочной железы и метастатическом раке поджелудочной железы составляет 8-12 месяцев и 3-6 месяцев соответственно, и, таким образом, летальность при раке поджелудочной железы очень высока.

В настоящее время эффективным способом лечения поздних стадий рака поджелудочной железы является внутривенное введение гемцитабина (Lilly), аналога нуклеозида 2'-дезоксицитидина, способного индуцировать гибель клеток рака поджелудочной железы человека и ингибировать рост и прогрессирование опухоли. Тем не менее, эффективность введения гемцитабина самого по себе является низкой со средней общей выживаемостью 5,7 месяца. Недавно эрлотиниб (Tarceva) в комбинации с гемцитабином был одобрен для лечения метастатического рака поджелудочной железы, и комбинированная терапия гемцитабином и эрлотинибом увеличила 1-годовую выживаемость пациентов с раком поджелудочной железы с 18% до 24% по сравнению с введением гемцитабина самого по себе. Тем не менее, важный при химиотерапии показатель, средняя общая выживаемость, был повышен лишь на 0,33 месяца. Эрлотиниб является низкомолекулярным ингибитором тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и оказывает одинаковое действие на раковые клетки и на быстро делящиеся нормальные клетки. Поэтому он более токсичен, чем введение гемцитабина самого по себе, и приводит к резистентности при длительном применении.

По этой причине были предприняты попытки комбинированной терапии гемцитабином/интерфероном-альфа, гемцитабином/цисплатином, гемцитабином/капецитабином и гемцитабином/авастином, помимо комбинации гемцитабина с эрлотинибом. Однако полученные терапевтические эффекты являются неудовлетворительными.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что конъюгат интерферона-альфа, полученный связыванием интерферона-альфа с константной областью иммуноглобулина через непептидильный полимер, демонстрирует более продолжительный период полувыведения in vivo и более высокую противораковую активность, чем обычный интерферон-альфа, и, в частности, его совместное введение с противораковым агентом, таким как гемцитабин, оказывает синергические ингибирующие эффекты, демонстрируя очень высокую противораковую активность, что позволило сделать настоящее изобретение. Они также обнаружили, что совместное введение противоракового агента и конъюгата интерферона-альфа, имеющего высокую противораковую активность, позволяет снизить вводимую дозу противораковых агентов, уменьшая побочные эффекты противораковых агентов и повышая приверженность пациентов к лечению.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, содержащей интерферон-альфа или его конъюгат с полимером.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, содержащей конъюгат интерферона-альфа, полученный связыванием интерферона-альфа с константной областью иммуноглобулина через непептидильный полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля-пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, полимолочной кислоты, полимолочной-гликолевой кислоты, липополимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, дополнительно содержащей противораковый агент, выбранный из ингибитора Ras, ингибитора Raf, ингибитора MAP/ERk киназы (MEK) и ингибитора митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), совместно с конъюгатом интерферона-альфа.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения рака, включающего введение субъекту указанной фармацевтической композиции.

ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению демонстрирует более продолжительный период полувыведения in vivo и более высокую противораковую активность, чем обычный интерферон-альфа, и, в частности, его совместное введение с противораковым агентом, таким как гемцитабин, оказывает синергетические ингибирующие эффекты на рост и пролиферацию раковых клеток, демонстрируя очень высокую противораковую активность. Противораковая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет длительный период полувыведения in vivo и высокую противораковую активность, что позволяет существенно снизить частоту введения. Совместное введение противораковых агентов и конъюгата интерферона-альфа, имеющего высокую противораковую активность, позволяет снизить вводимую дозу противораковых агентов, уменьшая побочные эффекты противораковых агентов и повышая соблюдение режима лечения пациентами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 представлена диаграмма, на которой показаны ингибирующие эффекты интерферона-альфа и конъюгата интерферона-альфа по одному воплощению настоящего изобретения на пролиферацию раковых клеток in vitro у клеток Дауди.

На ФИГ. 2 представлена диаграмма, на которой показаны изменения размера опухоли после введения конъюгата интерферона-альфа по одному воплощению настоящего изобретения бестимусной мыши (бестимусной BALB/c), которой была проведена подкожная трансплантация клеток рака яичника человека (SK-OV-3).

На ФИГ. 3 представлена диаграмма, на которой показаны изменения размера опухоли после совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по одному воплощению настоящего изобретения бестимусной мыши (бестимусной BALB/c), которой была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (ВхРС-3).

На ФИГ. 4 представлена диаграмма, на которой показаны изменения размера опухоли после совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по одному воплощению настоящего изобретения бестимусной мыши (бестимусной BALB/c), которой была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (Panc-1).

На ФИГ. 5 показаны изображения размера опухоли по данным аутопсий отдельных мышей после совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по одному воплощению настоящего изобретения бестимусной мыши (бестимусной BALB/c), которой была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (Panc-1).

Группа Вводимые лекарственные средства G1 Наполнитель G2 Гемцитабин (40 мг/кг, Q3D, внутривенная инъекция) G3 Гемцитабин + длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа (40 мг/кг, Q3D, внутривенная инъекция + 30 мкг/кг QW, подкожная инъекция) G4 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа (30 мкг/кг QW, подкожная инъекция) G5 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа (150 мкг/кг QW, подкожная инъекция)

На ФИГ. 6 представлена диаграмма, на которой показаны изменения размера опухоли после совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по одному воплощению настоящего изобретения бестимусной мыши (бестимусной BALB/c), которой была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (Miapaca-2).

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, содержащая интерферон-альфа.

Интерферон-альфа по настоящему изобретению, являющийся разновидностью цитокинов, представляет собой белок, ингибирующий пролиферацию вирусов, раковых клеток и тому подобного, путем активации иммунных ответов организма и апоптоза раковых клеток. Интерферон-альфа продуцируется В-лимфоцитами, нулевые лимфоцитами и макрофагами, и он обладает противовирусной и противоопухолевой активностью, активирует NK-клетки (натуральные клетки-киллеры) и обладает супрессивными свойствами в отношении клеток костного мозга. Предпочтительно, интерферон-альфа может представлять собой интерферон-альфа-2b, интерферон-альфа-2а или тому подобное.

Человеческий интерферон-альфа имеет молекулярную массу от 17500 до 21000 и очень высокий титр внутренней активности, составляющий 2×10⁸ ME на белок (мг). В организме интерферон-альфа представляет собой белок, содержащий 165 аминокислот, и интерферон-альфа-2а (SEQ ID NO:1) и интерферон-альфа-2b (SEQ ID NO:2) имеют лизин и аргинин в положении 23, соответственно.

При использовании здесь интерферон-альфа включает нативный интерферон-альфа, его агонисты, производные, фрагменты и варианты, и агонист означает вещество, связывающееся с рецептором интерферона-альфа in vivo, демонстрируя биологическую активность, идентичную или соответствующую биологической активности интерферона-альфа, безотносительно структуры интерферона-альфа, и производное означает пептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% гомологична нативному интерферону-альфа, где некоторые группы аминокислотных остатков могут быть химически замещены, удалены или модифицированы, и который сохраняет функцию интерферона-альфа. Фрагмент означает пептид, где одна или более аминокислот добавлены или удалены на N-конце или С-конце нативного интерферона-альфа, в который могут быть добавлены искусственные аминокислоты (например, аминокислота D-типа), и который сохраняет функцию интерферона-альфа. Вариант означает пептид, имеющий одну или более аминокислотных последовательностей, отличающихся от аминокислотных последовательностей нативного интерферона-альфа, и сохраняющий функцию интерферона-альфа. Агонист, производные, фрагменты и варианты интерферона-альфа связываются с рецептором интерферона-альфа in vivo и демонстрируют биологическую активность, идентичную или соответствующую биологической активности нативного интерферона-альфа.

Способ получения интерферона-альфа, который можно использовать в настоящем изобретении, описан в патенте Кореи №10-0360594. Полное описание включено в настоящее изобретение в качестве ссылки. Тем не менее, интерферон-альфа не ограничен интерфероном-альфа в соответствии с патентом Кореи №10-0360594, и объем настоящего изобретения включает интерферон-альфа, который легко может получить специалист в данной области техники. Таким образом, в настоящем изобретении могут быть применены навыки специалистов в данной области техники по получению интерферона-альфа.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, содержащая конъюгат с полимером, где интерферон-альфа связан с полимером.

При использовании здесь термин «конъюгат с полимером» представляет собой форму интерферона-альфа, конъюгированную с полимером. Полимер, используемый в конъюгате, включает все полимеры, которые могут увеличивать период полувыведения in vivo и терапевтическую эффективность. Например, полимер может представлять собой, без ограничения, полимер, такой как полиэтиленгликоль, и белок, такой как антитело, фрагмент антитела, фибронектин, альбумин, фрагмент иммуноглобулина или эластин.

В конъюгате с полимером интерферон-альфа и полимер могут быть связаны друг с другом непосредственно или связаны через пептидный линкер или непептидильный линкер, такой как, без ограничения, непептидильный полимер. Конъюгат с белковым полимером может быть получен в форме слитого белка из клетки или клеток с применением методик генной инженерии, или интерферон-альфа и белковый полимер могут быть получены по отдельности и затем связаны друг с другом ех vivo с применением химических методик. Конъюгат интерферона-альфа, где интерферон-альфа конъюгирован с полимером, может быть получен способом, описанным в патенте Кореи №10-0725315, и его полное описание включено в настоящее изобретение путем ссылки. Тем не менее, способ получения конъюгата интерферона-альфа не ограничен указанным патентом и включает все способы связывания полимера с интерфероном-альфа для увеличения периода полувыведения интерферона-альфа. Таким образом, объем настоящего изобретения включает конъюгаты интерферона-альфа, которые могут быть легко получены специалистами в данной области техники.

Кроме того, конъюгат с полимером может представлять собой конъюгат интерферона-альфа, где интерферон-альфа связан с константной областью иммуноглобулина через непептидильный полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля-пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, липополимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации. В настоящем изобретении конъюгат с полимером, где интерферон-альфа связан с константной областью иммуноглобулина через непептидильный полимер, и конъюгат интерферона-альфа могут быть использованы взаимозаменяемо.

Константная область иммуноглобулина означает от одного до четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4, и свободна от вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, или константного домена 2 тяжелой цепи (C_H2) и константного домена 3 тяжелой цепи (C_H3), и свободна от константного домена 1 легкой цепи (C_L1) и константного домена 1 тяжелой цепи (C_H1). Кроме того, она может дополнительно содержать шарнирную область, и шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Она может также представлять собой фрагмент с делецией относительно большой части аминокислотной последовательности C_H2 и/или C_H3. Конкретно, константная область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой: (1) домен C_H1, домен C_H2, домен C_H3 и домен C_H4; (2) домен C_H1 и домен C_H2; (3) домен C_H1 и домен C_H3; (4) домен C_H2 и домен C_H3; (5) комбинацию одного или более доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области); и (6) димер каждого домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Константная область иммуноглобулина по настоящему изобретению может иметь происхождение от IgG, IgA, IgD, IgE или IgM, и каждый домен константной области иммуноглобулина может представлять собой гибрид доменов разного происхождения, имеющих происхождение от иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM. Гибрид означает, что последовательности, соответствующие двум или более константным областям иммуноглобулина разного происхождения, присутствуют в одноцепочечной константной области иммуноглобулина. В настоящем изобретении возможны различные типы гибридов. Например, гибриды доменов могут состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4 IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, и могут содержать шарнирную область.

Кроме того, при образовании димера или мультимера, полипептиды, кодирующие одноцепочечные константные области иммуноглобулинов одинакового происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения. Например, димер или мультимер может быть получен комбинированием двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов константных областей IgG, IgA, IgM, IgD и IgE.

Предпочтительно, это может быть константная область иммуноглобулина, полученная из IgG или IgM, являющихся наиболее распространенными белками в крови человека. В определенном воплощении настоящего изобретения была использована константная область иммуноглобулина, полученная из IgG. IgG могут также быть разделены на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и в настоящем изобретении возможны их комбинации или гибриды. Предпочтительно, могут быть использованы подклассы IgG2 и IgG4, и в определенном воплощении настоящего изобретения был использован Fc-домен IgG4, свободный от эффекторных функций, таких как комплементзависимая цитотоксичность (CDC).

Соответственно, агликозилированный Fc-домен человеческого IgG4 является наиболее предпочтительным носителем лекарственного средства. Fc-домен, имеющий происхождение от человека, предпочтителен по сравнению с Fc-доменом, имеющим происхождение от источника, не являющегося человеком, поскольку последний может действовать в организме как антиген, индуцируя образование антител к нему.

Кроме того, константная область иммуноглобулина может быть представлена в форме, имеющей нативные углеводные цепи, увеличенные углеводные цепи по сравнению с нативной формой, или уменьшенные углеводные цепи по сравнению нативной формой, или может быть представлена в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление углеводных цепей константной области иммуноглобулина может быть осуществлено способами, хорошо известными в данной области техники, такими как химический способ, ферментативный способ или генно-инженерный способ с использованием микроорганизма. В данном случае удаление углеводных цепей из константной области иммуноглобулина приводит к резкому снижению аффинности связывания с комплементом (c1q) и снижению или утрате антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, что позволяет избежать индукции ненужных иммунных ответов in-vivo. В этом отношении дегликозилированная константная область иммуноглобулина, полученная химическим или ферментативным удалением углеводной цепи, или агликозилированная константная область иммуноглобулина, полученная в прокариотах, предпочтительно в E. coli, может быть более подходящей для задачи настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.

Константная область иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и ее производные (мутанты). Производное аминокислотной последовательности представляет собой последовательность, отличающуюся от нативной аминокислотной последовательности делецией, вставкой, неконсервативной или консервативной заменой одного или более аминокислотных остатков или их комбинацией. Например, известно, что аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331 Fc IgG играют важную роль в связывании антител, и они могут быть использованы в качестве подходящей мишени для модификации. Кроме того, возможны различные производные, не имеющие остатка, образующего дисульфидную связь, или нескольких N-концевых остатков нативного Fc, или имеющие дополнительный метиониновый остаток на N-конце нативного Fc. Более того, эффекторные функции могут быть устранены удалением комплементсвязывающего мотива, например C1q-связывающего мотива, или мотива ADCC (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности). Методики получения таких производных последовательности константной области иммуноглобулина раскрыты в публикациях международных заявок на патенты №№ WO 97/34631 и WO 96/32478.

В данной области техники известны аминокислотные замены в белках и пептидах, обычно не меняющие активность молекул (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее типичны замены Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

По необходимости, возможна модификация аминокислот, такая как фосфорилирование, сульфатирование, акрилирование, гликозилирование, метилирование, фарнезилирование, ацетилирование, амидирование и так далее.

Указанные выше производные константной области представляют собой производные, обладающие биологической активностью, идентичной константной области по настоящему изобретению, и улучшенной структурной стабильностью, например, против нагревания, рН или тому подобного.

Кроме того, эти константные области иммуноглобулинов могут быть получены от человека или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, предпочтительно от человека. Константная область, имеющая происхождение от человека, предпочтительна по сравнению с константной областью, имеющей происхождение от источника, не являющегося человеком, поскольку последняя может действовать в организме как антиген, индуцируя образование антител к ней.

Эти Fc-области могут быть получены из нативных форм, выделенных от людей и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или могут представлять собой рекомбинантные области или их производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В данном случае они могут быть получены из нативного иммуноглобулина выделением полноразмерных иммуноглобулинов из организма человека или животных и их обработкой протеолитическим ферментом. Например, папаин расщепляет нативный иммуноглобулин на Fab- и Fc-области, а обработка пепсином приводит к получению pF'c- и F(ab)₂-фрагментов. Эти фрагменты можно подвергнуть, например, гель-хроматографии для выделения Fc или pF'c.

В конкретном воплощении настоящего изобретения была использована агликозилированная Fc-область, имеющая происхождение от человеческого IgG4, представляющая собой рекомбинантную Fc-область иммуноглобулина, полученную из микроорганизма.

Непептидильный полимер по настоящему изобретению означает биологически совместимый полимер, содержащий две или более повторяющиеся единицы, связанные друг с другом любой ковалентной связью, за исключением пептидной связи.

Непептидильный полимер, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из, без ограничения, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, таких как PLA (полимолочная кислота) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липополимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, предпочтительно полиэтиленгликоля. Кроме того, объем настоящего изобретения включает их производные, хорошо известные в данной области техники и легко получаемые специалистами в данной области техники.

Пептидный линкер, используемый в слитом белке, полученном обычным способом внутрирамочного слияния, имеет недостатки, заключающиеся в его легком расщеплении протеолитическим ферментом in vivo, что не позволяет носителю обеспечить достаточный ожидаемый эффект увеличения периода полувыведения активного лекарственного средства из крови. Тем не менее, в настоящем изобретении для поддержания периода полувыведения активного лекарственного средства из крови может быть использован непептидильный полимер, устойчивый к протеолитическому ферменту. Таким образом, непептидильный полимер может быть использован без каких-либо ограничений, при условии, что он устойчив к протеолитическому ферменту в организме. Предпочтительно, непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа и предпочтительно от 1 до 20 кДа. Кроме того, непептидильный полимер по настоящему изобретению может представлять собой один полимер или комбинацию полимеров разных типов.

Непептидильный полимер, используемый в настоящем изобретении, имеет реакционно-способную группу, способную связываться с константной областью иммуноглобулина и интерфероном-альфа, на обоих концах. Непептидильный полимер имеет реакционно-способную группу на обоих концах, которая может быть выбрана из группы, состоящей из альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного. Сукцинимидное производное может представлять собой сукцинимидилпропионат, сукцинимидилкарбоксиметил, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат.

Реакционно-способные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или разными. Например, непептидный полимер может иметь малеимидную группу на одном конце и на другом конце, альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу.

В частности, когда непептидильный полимер имеет реакционно-способную альдегидную группу на обоих концах, он эффективно связывается на обоих концах с интерфероном-альфа и константной областью иммуноглобулина при минимальном неспецифичном взаимодействии. Конечный продукт, полученный восстановительным алкилированием через альдегидную связь, значительно стабильнее, чем при связывании амидной связью. Альдегидная реакционно-способная группа селективно связывается с N-концом при низком рН, и может связываться с лизиновым остатком с образованием ковалентной связи при высоком рН, таком как рН 9,0. Конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению может предпочтительно представлять собой конъюгат, полученный специфичным связыванием непептидильного полимера с N-концом интерферона-альфа и связыванием непептидильного полимера с N-концевой аминогруппой или тиоловой группой интерферона-альфа. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что активность интерферона-альфа повышена при связывании непептидильного полимера с N-концом интерферона-альфа. Получение N-концевого специфичного конъюгата проводят коррекцией рН, и предпочтительным диапазоном рН является диапазон от 4,5 до 7,5.

При использовании в качестве непептидильного полимера полиэтиленгликоля, имеющего реакционно-способную гидроксигруппу на обоих его концах, гидроксигруппа может быть активирована с получением различных реакционно-способных групп известными химическими реакциями, или может быть использован полиэтиленгликоль, имеющий коммерчески доступную модифицированную реакционно-способную группу.

Конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению имеет форму конъюгата, полученного связыванием белка интерферона-альфа и константной области иммуноглобулина через непептидильный полимер, и эффективно поддерживает устойчивость и стабильность in vivo. Константная область иммуноглобулина достаточно стабильна для использования в качестве носителя лекарственного средства, поскольку она представляет собой биоразлагаемый полипептид, метаболизируемый in vivo. Кроме того, благодаря относительно небольшой молекулярной массе, константная область иммуноглобулина имеет преимущества по сравнению с полноразмерными молекулами иммуноглобулинов относительно получения, очистки и выхода конъюгата. Более того, поскольку она свободна от Fab, аминокислотная последовательность которого сильно варьирует от одного антитела к другому, она в значительной степени способствует однородности конъюгата и, предположительно, позволит уменьшить индукцию антигенности.

Конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению имеет увеличенный период полувыведения in vivo и высокую противораковую активность по сравнению с нативным интерфероном-альфа. При введении конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению связывается с рецептором интерферона-альфа, индуцируя апоптоз раковых клеток, приводя к уменьшению размера опухоли и ингибированию роста опухоли. Поэтому фармацевтическая композиция, содержащая интерферон-альфа или его конъюгат, может быть использована для предупреждения или лечения рака.

При использовании здесь термин «предупреждение» означает все действия, позволяющие ограничить или замедлить развитие рака путем введения композиции по настоящему изобретению, и термин «лечение» означает все действия, позволяющие облегчить или благоприятным образом изменить симптомы рака путем введения композиции по настоящему изобретению.

В одном конкретном воплощении настоящего изобретения, было проведено исследование антипролиферативной эффективности in vitro у клеточных линий лимфомы Ходжкина человека, клеток Дауди, и результат продемонстрировал, что конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению оказывает сильные ингибирующие эффекты на пролиферацию раковых клеток по сравнению с нативным интерфероном-альфа (Таблица 1, ФИГ. 1). В одном конкретном воплощении настоящего изобретения, конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению вводили бестимусной мыши, которой была проведена подкожная трансплантация клеточной линии рака яичника человека (SK-OV-3), после чего анализировали изменения размера опухоли. Результат продемонстрировал отсутствие изменений размера опухоли по сравнению с отрицательным контролем, нативным интерфероном-альфа и PEG-модифицированным интерфероном-альфа (Таблица 2, ФИГ. 2).

Кроме того, конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению может демонстрировать высокую противораковую активность при совместном введении с противораковым агентом, выбранным из ингибитора Ras, ингибитора Raf, ингибитора MEK и ингибитора MAPK, предпочтительно гемцитабина или сорафениба (ингибитора Raf).

«Ингибитор Ras» по настоящему изобретению относится к соединениям, оказывающим направленное воздействие, снижающим или ингибирующим онкогенную активность Ras (включая H-Ras, K-Ras или N-Ras), например, ингибитору фарнезилтрансферазы, например, L-744832, DK8G557 или R115777 (Zarnestra).

«Ингибитор Raf» по настоящему изобретению относится к соединениям, оказывающим направленное воздействие, снижающим или ингибирующим Raf-киназу, играющую важную роль в качестве внеклеточной сигнальной регуляторной киназы при дифференцировке, пролиферации и апоптозе клеток, и мишень ингибитора Raf может включать, без ограничения, RAF1. Например, он может включать 3-(3,5-дибром-4-гидроксибензилиден)-5-йод-1,3-дигидроиндол-2-он; и бензамид, 3-(диметиламино)-N-[3-[(4-гидроксибензоил)амино]-4-метилфенил]-(9Cl).

«Ингибитор MEK» по настоящему изобретению относится к соединениям, оказывающим направленное воздействие, снижающим или ингибирующим киназную активность МАР-киназы, MEK и мишень ингибитора MEK могут включать, без ограничения, ERK и циклин D1. Примеры ингибитора MEK могут включать, без ограничения, бутандинитрил, бис[амино[2-аминофенил)тио]метилен]-(9Cl).

«Ингибитор МАРК» по настоящему изобретению относится к соединениям, оказывающим направленное воздействие, снижающим или ингибирующим MAP. МАР-киназы (MAPK) являются группой белков сериновых/треониновых киназ, активируемых в ответ на множество внеклеточных стимулов и опосредующих трансдукцию сигнала с поверхности клетки в ядро. Они регулируют ряд физиологических и патологических клеточных феноменов, включая воспаление, апоптотическую гибель клеток, онкогенную трансформацию, инвазию опухолевых клеток и метастазирование. Примеры ингибитора MAPK могут включать, без ограничения, бензолсульфонамид, N-[2-[[[3-(4-хлорфенил)-2-профенил]метил]амино]метил]-фенил]-N-(2-гидроксиэтил)-4-метокси-(9Cl).

Гемцитабин по настоящему изобретению представляет собой соединение, имеющее общее название 2'-дезокси-2',2'-дифторцитидин, является вицинальным дифторзамещенным аналогом дезоксицитидина и может включать его моногидрохлорид и β-изомер. Гемцитабин активирует RKIP (белок, ингибирующий Raf-киназу) и действует как ингибитор Raf. Традиционно полагают, что гемцитабин является лекарственным средством, демонстрирующим наиболее высокую клиническую активность при лечении рака поджелудочной железы. Тем не менее, гемцитабин обладает токсичностью, возникающей из-за недостатка специфичности между раковыми клетками и быстро делящимися нормальными клетками и предсуществующей или приобретенной резистентности большинства опухолевых клеток, и поэтому он не приводит к существенному улучшению состояния при раке поджелудочной железы. Также были предприняты попытки комбинированной терапии гемцитабином/цисплатином, гемцитабином/капецитабином, гемцитабином/авастином и гемцитабином/интерфероном-альфа, но полученные терапевтические эффекты были неудовлетворительны.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что совместное введение конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению и противоракового агента (преодолевающего мутацию k-ras), выбранного из ингибитора Ras, ингибитора Raf-киназы, ингибитора MEK и ингибитора MAPK, в частности гемцитабина, продемонстрировало существенную противораковую активность. Активация метаболического пути трансдукции сигнала Ras -> Raf -> MEK -> MAPK стимулирует дифференцировку и рост клеток и ингибирует один из сигнальных путей интерферона-альфа, STAT, ингибируя противораковую активность (апоптоз) интерферона-альфа. Противораковый агент, выбранный из ингибитора Ras, ингибитора Raf-киназы, ингибитора MEK и ингибитора MAPK, продемонстрировал существенную противораковую активность при совместном введении с конъюгатом интерферона-альфа по настоящему изобретению, и, в частности, он продемонстрировал высокую противораковую активность в отношении клеточных линий рака поджелудочной железы с мутацией k-ras Panc1 и Miapaca2, в то время как эти клетки не отвечали на введение гемцитабина или интерферона самих по себе. Более того, существенная противораковая активность была связана с синергетическим эффектом, которого не было при совместном введении противоракового агента с нативным интерфероном-альфа или PEG-модифицированным интерфероном-альфа. Таким образом, было обнаружено, что совместное введение противоракового агента с конъюгатом интерферона-альфа по настоящему изобретению оказывает синергетический эффект, демонстрируя высокую противораковую активность.

В одном конкретном воплощении настоящего изобретения, бестимусным мышам осуществляли подкожную трансплантацию клеток рака поджелудочной железы человека (ВхРС-3) и введение конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению самого по себе или совместное введение гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению, после чего анализировали изменения размера опухоли. Результат продемонстрировал уменьшение размера опухоли относительно группы отрицательного контроля по сравнению с введением гемцитабина или PEG-модифицированного интерферона-альфа самих по себе (Таблица 3, ФИГ. 3).

В конкретном воплощении настоящего изобретения, бестимусным мышам осуществляли подкожную трансплантацию клеток рака поджелудочной железы человека (Panc-1) и совместное введение гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению, после чего анализировали изменения размера опухоли. Результат продемонстрировал уменьшение размера опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля, также был отмечен синергетический эффект гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (Таблица 4, ФИГ. 4 и 5). В конкретном воплощении настоящего изобретения бестимусным мышам проводили подкожную трансплантацию клеток рака поджелудочной железы человека (Miapaca-2) и совместное введение гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению, после чего анализировали изменения размера опухоли. Результат продемонстрировал уменьшение размера опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля, и совместное введение гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению продемонстрировало синергетический эффект по сравнению с совместным введением гемцитабина/PEG-модифицированного интерферона-альфа (Таблица 5, ФИГ. 6).

Противораковая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована для лечения рака с мутацией k-ras, предпочтительно для лечения рака поджелудочной железы, меланомы, рака почки или рака яичника, и более предпочтительно для лечения рака поджелудочной железы.

Противораковая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена любым из известных способов введения, при условии, что конъюгат интерферона-альфа может достигнуть желаемой ткани. Предусмотрено множество способов введения, включая внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, пероральный, местный, интраназальный, внутрилегочный и интратекальный, но настоящее изобретение не ограничено этими способами введения, приведенными в качестве примера. Тем не менее, ввиду расщепления белков при пероральном введении, активные ингредиенты композиции для перорального введения должны быть снабжены покрытием или изготовлены для защиты от расщепления в желудке. Предпочтительно, композиция может быть введена в инъекционной форме. Кроме того, фармацевтическая композиция может быть введена с использованием определенного устройства, способного переносить активные ингредиенты в клетку-мишень.

Противораковая фармацевтическая композиция, содержащая интерферон-альфа или его конъюгат по настоящему изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения фармацевтически приемлемый носитель может включать связывающий агент, смазывающий агент, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель и отдушку. Для инъекционных препаратов фармацевтически приемлемый носитель может включать буферный агент, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент и стабилизатор. Для препаратов для местного применения фармацевтически приемлемый носитель может включать основание, эксципиент, смазывающий агент и консервант. Противораковая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в виде различных лекарственных форм в комбинации с указанными выше фармацевтически приемлемыми носителями. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Для инъекционных препаратов фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме ампулы как лекарственная форма для однократного введения или в стандартной лекарственной форме, такой как контейнер на несколько доз. Композиция может также быть изготовлена в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул и длительнодействующих препаратов.

С другой стороны, примеры носителя, эксципиента и разбавителя, подходящие для композиций, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, они могут дополнительно включать наполнители, противосвертывающие агенты, смазывающие агенты, увлажняющие агенты, отдушки и антисептики.

Введение дозы противораковой фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть определено несколькими родственными факторами, включая типы ракового заболевания, подлежащего лечению, пути введения, возраст пол и массу тела пациента и тяжесть заболевания, а также типами противоракового агента. Поскольку противораковая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет длительный период полувыведения in vivo и высокую противораковую активность, она позволяет существенно снизить частоту введения и дозу. При совместном введении с противораковым агентом она позволяет снизить вводимую дозу совместно вводимого противоракового агента, уменьшая посредством этого побочные эффекты противоракового агента и улучшая соблюдение пациентом режима лечения.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака, включающий введение субъекту противораковой фармацевтической композиции, содержащей интерферон-альфа или его конъюгат.

Описания интерферона-альфа, фармацевтической композиции и рака соответствуют приведенным выше.

Подробно терапевтический способ по настоящему изобретению включает стадию введения фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, у которого подозревают наличие рака. «Субъект» означает «все млекопитающие», включая собаку, корову, лошадь, кролика, мышь, крысу, курицу и человека, но млекопитающее по настоящему изобретению не ограничено этими примерами. Фармацевтическая композиция может быть введена парентеральным, подкожным, интраперитонеальным, внутрилегочным и интраназальным способами введения. Для местного лечения, по необходимости, она может быть введена подходящим способом, включая внутриочаговую инъекцию. Парентеральная инъекция включает внутримышечные, внутривенные, внутриартериальные, внутрибрюшинные и подкожные инъекции. Предпочтительной композицией является препарат для внутривенной, подкожной, внутрикожной, внутримышечной или капельной инъекции. Предпочтительная вводимая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от состояния и массы тела субъекта, тяжести заболевания, типа лекарственного средства, пути и периода введения, и может быть легко определена специалистом в данной области техники.

ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях и подразумевают, что изобретение не ограничено этими Примерами.

Пример 1. Получение конъюгата интерферона-альфа

Интерферон-альфа, использованный в следующих экспериментах, был получен способом, описанным в патенте Кореи №10-0360594. Конъюгат интерферона-альфа был получен с использованием полученного интерферона-альфа способом, описанным в патенте Кореи №10-0725315. Репрезентативные и подробные способы описаны далее.

Пример 1-1. Получение I конъюгата «IFNα-PEG-Fc-фрагмент иммуноглобулина»

<Стадия 1> Получение Fc-фрагмента иммуноглобулина с использованием иммуноглобулина

Fc-фрагмент иммуноглобулина получали следующим образом. 200 мг 150 кДа иммуноглобулина G (IgG) (Green Cross, Korea), растворенного в 10 мМ фосфатном буфере, обрабатывали 2 мг протеолитического фермента папаина (Sigma) при 37°С в течение 2 часов с осторожным перемешиванием. После ферментативной реакции Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный таким образом, подвергали хроматографии для очистки с использованием, последовательно, колонки Superdex, колонки с белком А и катионообменной колонки. Подробно, реакционный раствор наносили на колонку Superdex 200 (Pharmacia), проводили уравновешивание с использованием 10 мМ буфера с фосфатом натрия (PBS, рН 7,3), и содержимое колонки элюировали тем же буфером при скорости потока 1 мл/мин. Непровзаимодействовавшие молекулы иммуноглобулинов (IgG) и F(ab')2, имеющие относительно большую молекулярную массу по сравнению с Fc-фрагментом иммуноглобулина, удаляли, используя их свойство более раннего элюирования по сравнению с Fc-фрагментом Ig. Fab-фрагменты, имеющие молекулярную массу, сходную с Fc-фрагментом Ig, удаляли хроматографией на колонке с белком А. Полученные фракции, содержащие Fc-фрагмент Ig, элюированные из колонки Superdex 200, наносили при скорости потока 5 мл/мин на колонку с белком А (Pharmacia), проводили уравновешивание с использованием 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,0) и колонку промывали тем же буфером для удаления белков, не связанных с колонкой. Затем содержимое колонки с белком А элюировали 100 мМ буфером с цитратом натрия (рН 3,0) с получением высокоочищенного Fc-фрагмента иммуноглобулина. В завершение, проводили очистку Fc-фракций, полученных из колонки с белком А, с использованием катионообменной колонки (polyCAT, PolyLC Company), при этом содержимое этой колонки, на которую были нанесены Fc-фракции, элюировали с линейным градиентом 0,15-0,4 М NaCl в 10 ацетатный буфер (рН 4,5) с получением посредством этого высокоочищенных Fc-фракций. Высокоочищенные Fc-фракции анализировали с применением 12% SDS-PAGE.

<Стадия 2> Получение комплекса IFNα-PEG

3,4 кДа полиэтиленгликоль, имеющий альдегидные реакционно-способные группы на обоих концах, ALD-PEG-ALD (Shearwater) смешивали с человеческим интерфероном-альфа-2b (hIFNα-2b, MW: 20 кДа), растворенным в 100 мМ фосфатном буфере в количестве 5 мг/мл, при молярном отношении IFNα:PEG 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 и 1:20. В эту смесь вносили восстанавливающий агент цианборгидрид натрия (NaCNBH3, Sigma) в конечной концентрации 20 мМ и давали провзаимодействовать при 4°С в течение 3 часов при осторожном перемешивании, чтобы дать PEG связаться с N-концом интерферона-альфа. Для получения 1:1 комплекса PEG и интерферона-альфа реакционную смесь подвергали гель-хроматографии с использованием колонки SuperdexR (Pharmacia). Комплекс IFNα-PEG элюировали из колонки с использованием 10 мМ буфера с фосфатом калия (рН 6,0) в качестве элюирующего буфера и интерферон-альфа, не связанный с PEG, непровзаимодействовавший PEG и димерные побочные продукты, в которых PEG был связан с двумя молекулами интерферона-альфа, удаляли. Очищенный комплекс IFNα-PEG концентрировали до 5 мг/мл. В этом эксперименте было определено, что оптимальное реакционное молярное отношение IFNα к PEG, обеспечивавшее наибольшую реакционную способность и получение наименьшего количества побочных продуктов, таких какдимеры, составляло от 1:2,5 до 1:5.

<Стадия 3> Получение конъюгата IFNα-PEG-Fc

Для связывания комплекса IFNα-PEG, очищенного на стадии 2 выше, с N-концом Fc-фрагмента иммуноглобулина Fc-фрагмент иммуноглобулина (приблизительно 53 кДа), полученный на стадии 1 выше, растворяли в 10 мМ фосфатном буфере и смешивали с комплексом IFNα-PEG при молярном отношении «комплекс IFNα-PEG:Fc» 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. После доведения концентрации фосфатного буфера в реакционном растворе до 100 мМ в реакционный раствор вносили восстанавливающий агент NaCNBH₃ в конечной концентрации 20 мМ и давали провзаимодействовать при 4°С в течение 20 часов при осторожном перемешивании. В этом эксперименте было определено, что оптимальное реакционное молярное отношение комплекса IFNα-PEG к Fc, обеспечивавшее наибольшую реакционную способность и получение наименьшего количества побочных продуктов, таких как димеры, составляло 1:2.

<Стадия 4> Выделение и очистка конъюгата IFNα-PEG-Fc

После взаимодействия на стадии 3 выше реакционную смесь подвергали гель-хроматографии Superdex для удаления непровзаимодействовавших веществ и побочных продуктов и очистки полученного белкового конъюгата IFNα-PEG-Fc. После концентрирования реакционной смеси и ее нанесения на колонку Superdex 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,3) пропускали через колонку при скорости потока 2,5 мл/мин для удаления несвязанного Fc и непровзаимодействовавших веществ с последующим элюированием содержимого колонки для получения фракций белкового конъюгата IFNα-PEG-Fc. Поскольку полученные фракции белкового конъюгата IFNα-PEG-Fc содержали небольшое количество примесей, непровзаимодействовавшего Fc и димеров интерферона-альфа, проводили катионообменную хроматографию для удаления этих примесей. Фракции белкового конъюгата IFNα-PEG-Fc наносили на колонку PolyCAT LP (PolyLC), проводили уравновешивание 10 мМ ацетатом натрия (рН 4,5) и содержимое колонки элюировали с линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в 10 мМ буфер с ацетатом натрия (рН 4,5) с использованием 1 М NaCl. В завершение, белковый конъюгат IFNα-PEG-Fc очищали с использованием анионообменной колонки. Фракции белкового конъюгата IFNα-PEG-Fc наносили на колонку PolyWAX LP (PolyLC), проводили уравновешивание 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) и содержимое колонки затем элюировали с линейным градиентом 0-0,3 М NaCl в 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) с использованием 1 М NaCl, выделяя посредством этого белковый конъюгат IFNα-PEG-Fc в высокоочищенной форме.

Пример 1-2: Получение II белкового конъюгата IFNα-PEG-Fc

<Стадия 1> Получение комплекса Fc-PEG

3,4 кДа полиэтиленгликоль, имеющий альдегидные реакционно-способные группы на обоих концах, ALD-PEG-ALD (Shearwater) смешивали с Fc-фрагментом иммуноглобулина, полученным на стадии 1 Примера 1-1, при молярном отношении Fc:PEG 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 и 1:20, где Fc-фрагмент Ig был растворен в 100 мМ фосфатном буфере в количестве 15 мг/мл. В эту смесь вносили восстанавливающий агент NaCNBH₃ (Sigma) в конечной концентрации 20 мМ и давали провзаимодействовать при 4°С в течение 3 часов при осторожном перемешивании. Для получения 1:1 комплекса PEG и Fc реакционную смесь подвергали гель-хроматографии с использованием колонки SuperdexK (Pharmacia). Комплекс Fc-PEG элюировали из колонки с использованием 10 мМ буфера с фосфатом калия (рН 6,0) в качестве элюирующего буфера и Fc-фрагмент иммуноглобулина, не связанный с PEG, непровзаимодействовавший PEG и димерные побочные продукты, в которых PEG был связан с двумя молекулами Fc-фрагментов иммуноглобулина, удаляли. Очищенный комплекс Fc-PEG концентрировали до приблизительно 15 мг/мл. В этом эксперименте было определено, что оптимальное реакционное молярное отношение Fc к PEG, обеспечивавшее наибольшую реакционную способность и получение наименьшего количества побочных продуктов, таких какдимеры, составляло от 1:3 до 1:10.

<Стадия 2> Образование и очистка конъюгата комплекса Fc-PEG и интерферона-альфа

Для связывания комплекса Fc-PEG, очищенного на стадии 1 выше, с N-концом IFNα комплекс Fc-PEG смешивали с IFNa, растворенным в 10 мМ фосфатном буфере, при молярном соотношении «комплекс Fc-PEG:IFNα» 1:1, 1:1.5, 1:3 и 1:6. После доведения концентрации фосфатного буфера в реакционном растворе до 100 мМ в реакционный раствор вносили восстанавливающий агент NaCNBH₃ в конечной концентрации 20 мМ и давали провзаимодействовать при 4°С в течение 20 часов при осторожном перемешивании. По завершении реакции непровзаимодействовавшие вещества и побочные продукты удаляли тем же способом очистки, что и на стадии 4 Примера 1-1, выделяя посредством этого белковый конъюгат Fc-PEG-IFNα в высокоочищенной форме.

Пример 2. Исследование антипролиферативной эффективности конъюгата интерферона-альфа in vitro у клеток Дауди

Использовали клетки Дауди и RPMI1640, дополненную 10% FBS и 10% PS, использовали в качестве культуральной среды и экспериментальной среды. Интерферон-альфа и конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению разводили в 4 раза экспериментальной средой для получения 10 концентраций в 96-луночных планшетах с круглым дном. Каждые 50 мкл разведенной экспериментальной среды переносили в 96-луночные планшеты с плоским дном. Клетки Дауди центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут и затем отмывали с использованием 50 мл PBS в конической пробирке. Клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут и добавляли к ним экспериментальную среду с последующим подсчетом числа клеток. Клетки Дауди разводили до концентрации 5×10⁵ клеток/мл и затем вносили по 100 мкл в каждую лунку с последующей инкубацией при 37°С в течение 72 часов. Затем в каждую лунку вносили 20 мкл CCK-8 и через 3 часа измеряли оптическую плотность при 450 нм.

Ингибирующие эффекты интерферона-альфа и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (длительнодействующего конъюгата интерферона-альфа) на пролиферацию раковых клеток in vitro оценивали по ЕС50 (Таблица 1, ФИГ. 1). В результате, конъюгат интерферона-альфа по настоящему изобретению продемонстрировал сильные ингибирующие эффекты на пролиферацию раковых клеток по сравнению с интерфероном-альфа.

Таблица 1 Анализируемая группа ЕС50 (пг/мл) Интерферон-альфа 21,7 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 229,7

Пример 3. Исследование противоракового эффекта введения конъюгата интерферона-альфа самого по себе in vivo у мышей, которым была проведена трансплантация клеток рака яичника человека

Для оценки противоракового эффекта конъюгата интерферона-альфа, полученного в Примере 1, in vivo анализировали изменения размера опухоли у мышей, которым была проведена подкожная трансплантация клеток рака яичника человека (SK-OV-3).

5-недельным бестимусным мышам BALB/c проводили подкожную инъекцию 1×10⁸/4 мл клеток SK-OV-3, культивированных in vitro, и продолжали культивирование. После этого мышам проводили подкожную трансплантацию солидного рака, имеющего размер 30 мм². Затем мышей разделяли на 4 группы (G1, G2, G3, G4) по пять мышей в каждой, в зависимости от размера подкожно трансплантированного рака.

Проводили введение веществ самих по себе в группах контроля (наполнитель), интерферона-альфа (30 мкг/кг, Q1D × 5 раз × 4 недели, подкожная инъекция), PEG-модифицированного интерферона-альфа (150 мкг/кг, QW × 4 недели, подкожная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (150 мкг/кг, QW × 4 недели, подкожная инъекция). После введения экспериментальных веществ в каждой группе измеряли изменения размера опухоли в течение 4 недель и определяли показатель ингибирования опухоли относительно контрольной группы (Таблица 2).

В результате, в группе введения конъюгата интерферона-альфа не наблюдали увеличения размера опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля (наполнителя), нативного интерферона-альфа и PEG-модифицированного интерферона-альфа (ФИГ. 2).

Таблица 2 Группа введения Доза (мкг/кг) Показатель ингибирования опухоли (%, относительно наполнителя) Интерферон-альфа 30 (Q1D*5)*4 недели 63,84 PEG интерферон-альфа 150×4 недели 55,49 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 150×4 недели 93,37

Пример 4. Исследование in vivo противоракового эффекта введения конъюгата интерферона-альфа самого по себе у мышей, которым была проведена трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека

Для оценки противоракового эффекта конъюгата интерферона-альфа, полученного в Примере 1, in vivo анализировали изменения размера опухоли у мышей, которым была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (ВхРС3).

5-недельным бестимусным мышам BALB/c проводили подкожную инъекцию 1×10⁸/4 мл клеток ВхРС3, культивированных in vitro, и продолжали культивирование. После этого мышам проводили подкожную трансплантацию солидного рака, имеющего размер 30 мм². Затем мышей разделяли на 5 групп (G1, G2, G3, G4, G5) по шесть мышей в каждой, в зависимости от размера подкожно трансплантированного рака.

Проводили введение веществ самих по себе в группах контроля (наполнитель), гемцитабина (30 мг/кг, Q3D, 4 недели, внутривенная инъекция), PEG-модифицированного интерферона-альфа (30 мкг/кг, QW × 4 недели, подкожная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (30 мкг/кг, QW × 4 недели, подкожная инъекция) и совместное введение гемцитабина (30 мг/кг, Q3D, 4 недели, внутривенная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (30 мкг/кг, QW, 4 недели, подкожная инъекция). После введения экспериментальных веществ в каждой группе измеряли изменения размера опухоли в течение 4 недель и определяли показатель ингибирования опухоли относительно контрольной группы (Таблица 3).

В результате, уменьшение размера опухоли относительно группы отрицательного контроля (наполнителя) наблюдали в группе введения конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению и совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению по сравнению с группами введения гемцитабина и PEG-модифицированного интерферона-альфа самих по себе (ФИГ. 3).

Таблица 3 Группа введения Доза (м кг/кг) Показатель ингибирования опухоли (%, относительно наполнителя) Гемцитабин 30 мг/кг, Q3D × 4 недели 20 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 30 мкг/кг, QW × 4 недели 57 Гемцитабин + длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 30 мг/кг, Q3D × 4 недели + 30 мкг/кг, QW × 4 недели 64 PEG интерферон-альфа 30 мкг/кг, QW × 4 недели 22

Пример 5. Исследование in vivo противоракового эффекта введения конъюгата интерферона-альфа самого по себе у мышей, которым была проведена трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека

Для оценки противоракового эффекта конъюгата интерферона-альфа, полученного в Примере 1, in vivo анализировали изменения размера опухоли у мышей, которым была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (Panc-1).

5-недельным бестимусным мышам BALB/c проводили подкожную инъекцию 1×10⁸/4 мл клеток Panc-1, культивированных in vitro, и продолжали культивирование. После этого мышам проводили подкожную трансплантацию солидного рака, имеющего размер 30 мм². Затем мышей разделяли на 5 групп (G1, G2, G3, G4, G5) по шесть мышей в каждой, в зависимости от размера подкожно трансплантированного рака.

Проводили введение веществ самих по себе в группе контроля (наполнитель), гемцитабина (40 мг/кг, Q3D, 3 недели, внутривенная инъекция), PEG-модифицированного интерферона-альфа (30 мкг/кг, QW × 3 недели, подкожная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (30 мкг/кг, QW, 3 недели, подкожная инъекция) и совместное введение гемцитабина (40 мг/кг, Q3D, 3 недели, внутривенная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (30 мкг/кг, QW, 3 недели, подкожная инъекция). После введения экспериментальных веществ в течение 3 недель в каждой группе измеряли изменения размера опухоли в течение 4 недель и определяли показатель ингибирования опухоли относительно контрольной группы (Таблица 4).

В результате, уменьшение размера опухоли относительно контрольной группы (наполнителя) наблюдали в группе совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению, при этом наблюдали синергетический эффект гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (ФИГ. 4 и 5).

Таблица 4 Группа введения Доза (м кг/кг) Показатель ингибирования опухоли (%, относительно наполнителя) Гемцитабин 40 мг/кг, Q3D × 3 недели 60 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 30 м кг/кг, QW × 3 недели 14 Гемцитабин + Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 40 мг/кг, Q3D × 3 недели + 30 м кг/кг, QW × 3 недели 98 PEG интерферон-альфа 30 м кг/кг, QW × 3 недели -23

Пример 6. Исследование in vivo противоракового эффекта введения конъюгата интерферона-альфа самого по себе у мышей, которым была проведена трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека

Для оценки противоракового эффекта конъюгата интерферона-альфа, полученного в Примере 1, in vivo анализировали изменения размера опухоли у мышей, которым была проведена подкожная трансплантация клеток рака поджелудочной железы человека (Miapaca-2).

5-недельным бестимусным мышам BALB/c проводили подкожную инъекцию 1×10⁸/4 мл клеток Miapaca-2, культивированных in vitro, и продолжали культивирование. После этого мышам проводили подкожную трансплантацию солидного рака, имеющего размер 30 мм². Затем мышей разделяли на 5 групп (G1, G2, G3, G4, G5) по семь мышей в каждой, в зависимости от размера подкожно трансплантированного рака.

Проводили введение веществ самих по себе в группе контроля (наполнитель), гемцитабина (40 мг/кг, Q3D, 3 недели, внутривенная инъекция), PEG-модифицированного интерферона-альфа (30 мкг/кг, QW × 4 недели, подкожная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (30 мкг/кг, QW, 4 недели, подкожная инъекция) и совместное введение гемцитабина (40 мг/кг, Q3D, 4 недели, внутривенная инъекция) и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению (30 мкг/кг, QW × 4 недели, подкожная инъекция). После введения экспериментальных веществ в течение 3 недель в каждой группе измеряли изменения размера опухоли в течение 4 недель и определяли показатель ингибирования опухоли относительно контрольной группы (Таблица 5).

В результате, уменьшение размера опухоли относительно группы отрицательного контроля (наполнителя) наблюдали в группе совместного введения гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению, при этом наблюдали синергетический эффект гемцитабина и конъюгата интерферона-альфа по настоящему изобретению по сравнению с совместным введением гемцитабина/РЕС-модифицированного интерферона-альфа (ФИГ. 6).

Таблица 5 Группа введения Доза (мкг/кг) Показатель ингибирования опухоли (%, относительно наполнителя) Гемцитабин 40 мг/кг, Q3D × 4 недели 17 Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 30 мкг/кг, QW × 4 недели 19 Гемцитабин + Длительнодействующий конъюгат интерферона-альфа 40 мг/кг, Q3D × 4 недели + 30 мкг/кг, QW × 4 недели 75 PEG интерферон-альфа 30 мкг/кг, QW × 4 недели 19 Гемцитабин+PEG интерферон-альфа 40 мг/кг, Q3D × 4 недели + 30 мкг/кг, QW × 4 недели 36

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат интерферона-альфа с полимером и ингибитор Raf, и может быть использовано в медицине. Полученную фармацевтическую композицию применяют для лечения рака с мутацией k-ras. Изобретение позволяет получить фармацевтическую композицию, обладающую более продолжительным периодом полувыведения in vivo и более высокой противораковой активностью, чем интерферон-альфа, что позволяет снизить вводимую дозу противоракового агента, уменьшая его побочные эффекты. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака с мутацией k-ras, содержащая эффективное количество конъюгата интерферона-альфа и эффективное количество ингибитора Raf;

где конъюгат интерферона-альфа представляет собой интерферон-альфа, связанный с константной областью иммуноглобулина через непептидильный полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля-пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, полимолочной кислоты, полимолочной-гликолевой кислоты, липополимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

2. Композиция по п. 1, где интерферон-альфа представляет собой вещество, связывающееся с рецептором in vivo, демонстрируя биологическую активность, идентичную или соответствующую биологической активности нативного интерферона-альфа, и нативный интерферон-альфа, его производные, варианты или фрагменты.

3. Композиция по п. 1, где ингибитор Raf представляет собой гемцитабин или сорафениб.

4. Композиция по п. 1, где рак с мутацией k-ras представляет собой рак поджелудочной железы, меланому, рак почки или рак яичника.

5. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина представляет собой Fc-область иммуноглобулина.

6. Композиция по п. 1, где интерферон-альфа представляет собой интерферон-альфа-2а или интерферон-альфа-2b.

7. Композиция по п. 1, где непептидильный полимер связан с N-концом интерферона-альфа в конъюгате.

8. Композиция по п. 1, где непептидильный полимер связан с N-концевой аминогруппой или тиоловой группой интерферона-альфа в конъюгате.

9. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина является агликозилированной.

10. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина состоит из 1-4 доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4.

11. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина состоит из димера константной области легкой цепи и константной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из доменов C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4.

12. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина содержит шарнирную область.

13. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина получена из IgG.

14. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина представляет собой димер, состоящий из одноцепочечных иммуноглобулинов, состоящих из доменов одинакового происхождения.

15. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина представляет собой Fc-область lgG4.

16. Композиция по п. 1, где константная область иммуноглобулина представляет собой человеческую агликозилированную Fc-область IgG4.

17. Композиция по п. 1, где непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 кДа до 100 кДа.

18. Композиция по п. 1, где реакционно-способная группа непептидильного полимера выбрана из группы, состоящей из альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного.

19. Композиция по п. 18, где сукцинимидное производное представляет собой сукцинимидилпропионат, сукцинимидилкарбоксиметил, гидроксисукцинимидил или сукцинимидилкарбонат.

20. Композиция по п. 1, где непептидильный полимер имеет реакционно-способные альдегидные группы на обоих концах.

21. Композиция по п. 1, где

ингибитор Raf представляет собой гемцитабин; и

рак с мутацией k-ras представляет собой рак поджелудочной железы или рак яичника.

22. Композиция по п. 21, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.

23. Способ лечения рака с мутацией k-ras, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по любому из пп. 1-22.