9-Бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол и его фармацевтически приемлемые соли, проявляющие свойства разрушителей поперечных сшивок гликированных белков Российский патент 2017 года по МПК C07D487/04 A61K31/4188 A61P9/00 A61P43/00 

Изобретение относится к новым соединениям в ряду производных 2,9-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола, а именно к ранее неописанному 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I

и его фармацевтически приемлемым солям.

Соединение проявляет свойство разрушителя поперечных сшивок гликированных белков и может быть использовано, в первую очередь, в комплексной терапии сахарного диабета и его осложнений. Протекающие при сахарном диабете патологические процессы в качестве одной из важнейших компонент включают чрезвычайно деструктивную по своим последствиям неферментативную реакциюгликирования протеинов, в ходе которой происходит накопление гликопротеинов, в том числе поперечное сшивание гликопротеиновых макромолекул, приводящее к ухудшению их функциональных свойств, в частности, вследствие потери их эластичности. Это в полной мере относится, например, к эритроцитам и является причиной весьма серьезных осложнений диабета, в том числе офтальмологических, неврологических и сердечно-сосудистых [1, 2, 3]. Гликирование белков также повышает риск развития онкологических заболеваний [4]. Следует отметить, что достичь обратимости инициированых гликированием процессов путем использования ингибиторов гликирования принципиально невозможно. Для этого необходимы соединения с потенциалом разрывателей поперечных сшивок в конечных продуктах гликирования (КПГ), применение которых может привести к восстановлению эластичности коллагенового каркаса сердечно-сосудистой системы и, как следствие, эффективному лечению отдаленных осложнений сахарного диабета.

Известно нормализующее действие на пораженное гликированием русло сердечнососудистой системы четвертичных азолиевых солей, в том числе хлоридаN-фенацил-4,5-диметилтиазолия (препарат ALT-711, алагебриум), который снижает уровень КПГ в кровеносных сосудах [3]. В ходе клинических испытаний алгебриума было показано, что препарат обладает хорошей переносимостью и вызывает увеличение эластичности сосудов у 93% пациентов старше 50 лет [5].

В ряду производных 2,9-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола известны

- гидрохлорид 9-бензил-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющий антиоксидантные свойства [6];

- динитрат 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола - средство для подавления геликобактероподобных эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка [7];

- соли 9-(2-диалкиламиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющие обезболивающее действие, обусловленное каппа-опиоидной агонистической активностью, а также местно анестезирующее действие [8, 9, 10].

Наиболее близким по структуре является гидробромид 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющий свойства антагониста серотониновых 5-НТ₃-рецепторов [11].

В ряду 2,9-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола не известны соединения, проявляющие свойство разрушителей поперечных сшивок гликированных белков.

Техническим результатом изобретения являются новые соединения в ряду 2,9-дизамещенных имидазо[1,2-a]бензимидазола, проявляющие новое для данного ряда свойство разрушителей поперечных сшивок гликированных белков.

Технический результат достигается соединением формулы I и его фармацевтически приемлемыми солями.

В качестве фармацевтически приемлемых солей могут быть использованы, например, гидрохлориды, гидробромиды, гидроиодиды, нитраты, сульфаты, соли органических кислот.

Соединение I синтезируют по нижеприведенной двухстадийной схеме исходя из 2-амино-1-бензилбензимидазола и 4-фенилфенацилбромида, которые на первой стадии процесса вступают в реакцию с образованием четвертичной соли, бромида 1-бензил-3-фенилфенацил-2-аминобензимидазолия (II). На второй стадии соединение II подвергают циклизации путем нагревания в водно-спиртовой растворе карбоната натрия. При этом получают основание конечного продукта I, которое обработкой соответствующими кислотами переводят в соли.

Методики синтеза полупродукта II, соединения I, а также данные исследований биологической активности гидрохлорида соединения I приведены ниже.

Пример 1. Стадия 1. Бромид 2-амино-3-[(2-бифенил)-2-оксоэтил)]-1-бензилбензимидазолия (II). В горячий раствор 2,23 г (10 ммоль) 2-амино-1-бензилбензимидазола в 65 мл ацетонитрила вносят 2,75 г (10 ммоль) 4-фенилфенацилбромида. Смесь перемешивают до растворения кватернизующего агента, затем нагревают до начала выпадения осадка и выдерживают 6-8 ч при комнатной температуре, после чего осадок соли II отфильтровывают и тщательно промывают ацетоном. Выход 94%, T_пл 254-256°С. ИК-спектр, ν_max, см^-1: 3207, 3240 (NH₂), 1687 (С=O). Найдено: С 67,47; Н 4.85; Br 16,03; N 8,43%. C₂₈H₂₄BrN₃O. Вычислено: С 67,45; Н 4,88; Br 16,00; N 8,39%. Спектр ЯМР ¹Н (600 МГц), δ, м.д.: 5,56 (2Н, с, СН₂СО), 6,06 (2Н, с, СН₂), 7,29-7,33 (5Н, м, 7,34-7,47 (т, 3Н, H_Ar), 7,51-7,55 (м, 3Н, H_Ar), 7,66-7,68 (к, 1H, H_Ar), 7,80-7,82 (т, 2Н, H_Ar), 7,96-7,98 (д, 2Н, H_Ar), 8,18-8,19 (д, 2Н, H_Ar), 9,06 (с, 2 Н=N⁺H₂).

Стадия 2. 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол (I)

Смесь 2 г (4,2 ммоль) бромида II, 0,89 г мелко растертого Na₂CO₃, 40 мл EtOH и 9 мл воды кипятят до завершения реакции (20-25 ч). Затем из реакционной массы отгоняют спирт, добавляют 25-30 мл воды, осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Полученное основание очищают хроматографированием на колонке с Al₂O₃, элюент - хлороформ, отбирая фракцию с R_f0,9. Хлороформ упаривают, полученное вещество кристаллизуют из диметилформамида. Выход 1,3 г (81,3%). T_пл 228-229°С. ИК-спектр, ν_max, см^-1: 1513, 1616 (С=С), 1663 (С=N). Найдено: С 84,15; Н 5,31; N 10,49%. C₂₈H₂₁N₃. Вычислено:

С 84,1; Н 5,30; N 10,52%. Спектр ЯМР - ¹Н (600 МГц), δ, м.д.: 5,77 (с, 2Н, СН₂), 7,29-7,53 (м, 10Н, H_Ar), 7,64-7,66 (д, 1H, H_Ar), 7,74-7,76 (т, 2Н, H_Ar), 7,82-7,84 (д, 2Н, H_Ar), 7.96-7,97 (д, 1H, H_Ar), 8,03 (д, 2Н, H_Ar), 8.64 (s, 1H, 3-Н).

Гидрохлорид 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазола

9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол (I) переводят в гидрохлорид, обрабатывая конц. HCl. Выход 93%, T_пл 237-238°С. ИК-спектр, ν_max, см^-1: 1512, 1614 (С=С), 1663 (C=N). Найдено: С 77,11; Н 5,13; Cl 8.08; N 9,58; %. C₂₈H₂₁N₃ HCl. Вычислено: С 77,14; Н 5,09; Cl 8,13; N 9,64%.

Исследование свойств разрушителя поперечных сшивок гликированных белков

Получение коллагена

Нормальные крысы Вистар (масса тела 200±20 г) умерщвлялись, после чего иссекали хвосты и получали коллаген при температуре 4°С следующим образом: вынимали коллагеновые волокна сухожилия хвоста, промывали физиологическим солевым раствором, удаляли ткани неколлагеновых волокон, трижды промывали дистиллированной деионизованной водой, разрезали на куски и погружали в 0,1% уксусную кислоту при 4°С на одну неделю, в течение которой иммерсионную жидкость часто взбалтывали. Иммерсионную жидкость подвергали обработке на центрифуге при 8000g в течение 30 минут и собирали супернатантный раствор коллагена. После разбавления измеряли содержание протеина. 96-Луночный микропланшет (Gostar) тщательно покрывали раствором коллагена в количестве 70 мкг/лунку при 4°С в течение 24 часов, затем пленкообразующий раствор удаляли. Пластины высушивали на воздухе, покрывали пленкой для сохранения свежести и хранили при 4°С до использования.

Получение конечных продуктов гликирования (гликированного бычьего сывороточного альбумина)

Раствор, содержащий 50 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BAS) (V) (Roch) и 0,5 М глюкозы в 0,2 М забуференном фосфатом физиологическом растворе (фосфатный буферный раствор) (рН 7,4), инкубировали при 37°С в стерильных условиях в течение 3-4 месяцев для образования, таким образом, гликозилированного БЦА. В то же время готовили негликозилированный БЦА со свободным от глюкозы БЦА. Затем БЦА-AGE раствор диализировали против 0,01 М фосфатный буферный раствор (рН 7,4) для удаления непрореагировавшей глюкозы. Использовали флуоресцентное сканирование (Exi/Em (395/460 нм)).

Исследование активности гидрохлорида соединения I

Покрытый коллагеном из хвоста 96-луночный микропланшет тщательно обрабатывали фосфатным буферным раствором (рН 7,4) в течение 1 часа для нейтрализации кислого коллагена. Планшет блокировали Superblock (PIERCE) при 37°С в течение 1 часа и промывали фосфатным буферным раствором с Tween-20, трижды встряхивая в течение 1 минуты при каждом промывании. 100 мкл раствора гликированного белка добавляли в лунки в ряды 96-луночного планшета, маркированные как А, В, С и D, и раствор БЦА такой же концентрации добавляли в лунки в ряды, маркированные как Е, F, G и Н. Лунки инкубировали при 37°С в течение 4 часов, чтобы обеспечить сшивание коллагена, и промывали фосфатным буферным раствором с Tween-20 четыре раза при встряхивании в течение 1 минуты при каждом промывании. Испытываемое соединение добавляли к выполненным в четырех экземплярах лункам с гликированным белком и к выполненным в четырех экземплярах лункам с БЦА в количестве 100 мкл/лунку. В первые три лунки в каждом ряду вместо вещества добавляли 100 мкл/лунку фосфатный буферный раствор или другой растворитель (например, ДМСО). Лунки инкубировали при 37°С в течение 16 часов и промывали фосфатным буферным раствором с tween-20, встряхивая в течение 1 минуты во время каждого промывания. В лунки добавляли антитела кролика против-БЦА (1:500) 80 мкл/лунку и планшет инкубировали при 37°С в течение 50 минут. Далее в лунки добавляли 80 мкл/лунку меченных пероксидазой хрена козьих IgG против кроличьих (1:1000). Лунки инкубировали при 37°С в течение 50 минут. После добавляли субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут. Для прекращения реакции использовали 2 М H₂SO₄. В течение 10 минут после реакции регистрировали оптическую плотность при 450 нм на планшет-ридереTECANM200Pro.

Для каждого определения вычисляли среднюю оптическую плотность (ОП).

Корректированная ОП = средняя ОП лунки с гликированным белком - средняя ОП лунки БЦА.

Процент разрушения выражали в виде относительного уменьшения ОП:

[(средняя ОП лунки фосфатный буферный раствор - средняя ОП лунки исследуемого соединения)/средняя ОП

лунки фосфатный буферный раствор]×100%.

Обработка результатов выполняется в программе MicrosoftExcel (Microsoft, США) с расчетом базовых статистических показателей: среднего арифметического М, стандартного отклонения s, стандартной ошибки среднего арифметического m. Статистическая обработка с применением парного t-критерия Стьюдента в программе Statistika 10.0 (StatSoft, США).

Результаты исследования

На фиг. 1 представлена зависимость разрывающей активности гидрохлорида соединения I от его концентрации. По оси абсцисс - концентрация гидрохлорида соединения I, мМ; по оси ординат - ингибирование флюоресценции, Δ %. (n=5). IC₅₀=0.31 мМоль/л.

На фиг. 2. представлена зависимость разрывающей активности соединения ALT-711 от его концентрации. По оси абсцисс - концентрация соединения ALT-711, мМоль/л; по оси ординат - ингибирование флюоресценции, Δ %. (n=5). IC₅₀=1,89 мМоль/л.

В табл. 1 представлена IC₅₀ (концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50% от исходной) изучаемого гидрохлрида соединения I в сравнении с референсным препаратом алагебриумом.

Результаты проведенных исследований in vitro показывают, что гидрохлорид соединения I обладает способностью к разрыву поперечных сшивок в гликированных белках, превосходя в этом отношении препарат сравнения алагебриум. Для гидрохлорида соединения I соответствующее значение IC₅₀=0,31 мМоль/л, тогда как для алагебриума аналогичная величина значительно выше (1,89 мМоль/л) (по литературным данным 1,67 мМ [3].

Таким образом, по результатам проведенных исследований можно заключить, что данное производное имидазо[1,2-а]бензимидазола способно функционировать в качестве разрывателя поперечных сшивок в гликированных белках.

Список литературы

1. Щеглова Т., Маккер С.П., Трамонтано А. // ActaNaturae (русскоязычная версия). - 2009. - Т. 1. - №. 2.

2. Ahmed N. // Diabetes research and clinical practice. - 2005. - Т. 67. - №1. - С. 3-21.

3. Kim J. et al. // European journal of pharmacology. - 2015. - Т. 748 - С. 108-114.

4. Ансари Н.А., Рашид З. // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56. - №2 - С. 168-178.

5. Vasan S., Foiles P., Founds H. // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - T. 419. - №1. - C. 89-96.

6. Анисимова В.А., Спасов А.А., Толпыгин И.Е. и др. // ХФЖ. 2010. - Т. 44 - №7. - С. 7-13.

7. В.А. Анисимова, В.И. Минкин, В.И. Петров, А.А. Спасов и др.; Патент РФ №2395282, МПК A61K 31/4184, 2010 г.

8. В.А. Анисимова, А.А. Спасов, О.Ю. Гречко и др.; Патент РФ №2412187, МПК С07D 487/04, 2011 г.

9. А.А. Спасов, В.А. Анисимова, П.М. Васильев и др.; Патент РФ №2413512, МПК A61K 31/4188, 2009 г.

10. А.А. Спасов, А.И. Ращенко, // Вестник ВолгГМУ. - 2016. - Т. 57. - №1. - С. 12-15

11. В.А. Анисимова, А.А. Спасов, Черников М.В, В.И. Петров, В.И. Минкин; Патент РФ 2285006, МПК С07D 487/04, 2010 г.

Изобретение относится к новому 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазолу (I) и его фармацевтически приемлемым солям. Технический результат: получены производные имидазобензимидазола, обладающие свойством разрушителей поперечных сшивок гликированных белков. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 1 пр.

1. 9-Бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол, формулы

и его фармацевтически приемлемые соли.

2. 9-Бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол по п.1, где фармацевтически приемлемой солью является или гидробромид, или гидроиодид, или нитрат, или сульфат, или соли органических кислот.

3. 9-Бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол по п.1, где фармацевтически приемлемой солью является гидрохлорид.