СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ КАРДИОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И ГАЛОГЕНИДЫ 1,3-ДИЗАМЕЩЕННЫХ 2-АМИНОБЕНЗИМИДАЗОЛИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/5377 A61K31/4184 A61K31/4188 A61P9/10 

Изобретение относится к средствам, обладающим кардиопротекторным действием.

В основе генеза повреждения кардиомиоцитов целого ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы лежит закисление внутриклеточной среды и развитие «кальциевого парадокса». Эти изменения, обусловленные различными этиологическими факторами, приобретают важное патогенетическое значение и нередко являются определяющими для прогноза заболевания. В связи с этим, естественным является стремление оказать корригирующее влияние на нарушенный метаболизм кардиомиоцитов [Михин В.П., Савельева В.В. Роль кардиоцитопротекторов в терапии хронической сердечной недостаточности ишемического генеза. /Российский кардиологический журнал. - 2009. - №1 (75). Р.49-56].

В последние годы в качестве возможного физиологического и патофизиологического фактора в механизмах развития таких последствий ишемического и реперфузионного стресса, как аритмии, нарушения сократительной функции и гибель клетки, рассматривают сарколемный Na⁺/H⁺-обменник 1 изоформы (NHE-1) [Писаренко О.И. Ингибиторы Na⁺/H⁺обмена - новый класс кардиопротекторов. / Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - №9 (90). - С.1103-1110].

Его биологическая роль связана с такими процессами, как обмен ионов Na⁺ и H⁺; регуляция рН и объема клетки; рост, гипертрофия, дифференцировка; повреждение клетки при ишемии; в организации цитоскелета и клеточной миграции [Slepkov E.R., Rainey J.K., Sykes B.D., Fliegel L. Structural and functional analysis of the Na⁺/H⁺ exchanger. / Biochem. J. - 2007. - №401 (3). - Р.623-633].

Активация NHE1 происходит во время ишемии и реперфузии. При ишемии Na⁺/H⁺-обменник начинает выводить из саркоплазмы клетки ионы Н⁺, накапливающиеся там из-за активизации процесса гликолиза, в обмен на вход ионов Na⁺. Возрастание внутриклеточного содержания ионов Na⁺ в свою очередь активирует 3Na⁺/Са²⁺-реверсионный обмен (NCE-обменник) через сарколемму, инициируя вход ионов Са²⁺ в кардиомиоциты. Возникает «Са²⁺-перегрузка». Реперфузия усугубляет повреждение, возникшее во время ишемии. Во время реперфузии концентрация внеклеточных протонов быстро снижается, формируется большой градиент вне/внутриклеточных протонов, что ведет к росту уровня кальция. В результате, происходит ухудшение сократительной функции, развиваются тяжелые нарушения ритма, что в конечном итоге приводит к гибели кардиомиоцитов. Механизм действия ингибиторов NHE связан в конечном итоге в предотвращении этой кальциевой перегрузки [Fliegel L. Regulation of the Na(+)/H(+) exchanger in the healthy and diseased myocardium. Expert. Opin. Ther. Targets. - 2009. - №13 (1). - Р.55-68].

Основные положительные эффекты NHE ингибиторов на ишемизированный миокард в экспериментальных и клинических исследованиях связаны с улучшением восстановления сократительной функции левого желудочка после реперфузии; сокращением зоны ишемии и некроза; уменьшением выраженности нарушения ионного гомеостаза, сопровождающее ишемию/реперфузию; редуцированием апоптоза, уменьшением частоты возникновения и тяжести аритмий, вызванных ишемией/реперфузией.

Известно среди NHE ингибиторов средство, обладающее кардиопротекторным действием, Зонипорид (СР-597396) - [1-(хинолин-5-ил)-5-циклопропил-1Н-пиразол-4-карбонил] гуанидина гидрохлорид моногидрат [A Guzman-Perez et al. Discovery of zoniporide: A potent and selective sodium-hydrogen exchanger type 1 (NHE-1) inhibitor with high aqueous solubility./ Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2001. - №11(6). - Р.803-807]. В исследованиях in vitro на тромбоцитах кролика показано, что данный препарат подавляет NHE-1-зависимое набухание тромбоцитов (максимальное ингибирование 93%) [Tracey W.R. et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc. Drug Rev. - 2003. - №21. - Р.17-32]. В исследованиях на изолированном сердце по Лангендорфу зонипорид вызывает дозозависимое уменьшение размера инфаркта (ЕС₅₀=0,25 нМ). В дозе 50 нМ препарат сокращает размер инфаркта миокарда на 83%, чем в 2,5 раза превосходит энипорид или карипорид (ЕС₅₀ 0,69 и 5,11 нМ, соответственно). На модели ишемического повреждения миокарда in vivo показано, что зонипорид обладает кардиопротекторным эффектом [Knight D.R. et al. A novel sodium-hydrogen exchanger isoform-1 inhibitor, zoniporide, reduces ischemic myocardial injury in vitro and in vivo // J.PharmacoI.Exp.Ther. - 2001. - №297 (1). - P.254-259]. Зонипорид заметно снижал размер инфаркта без нарушений гемодинамики и сократительной функции сердца, ослаблял постреперфузионную сократительную дисфункции, а также снижал частоту и продолжительность желудочковых фибрилляций [Tracey WR et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc Drug Rev. - №21. - 2003. - Р.17-32]. При этом он существенно не влиял на коронарный кровоток, а основной эффект его был связан с изменениями метаболизма [Ayoub IM et al. Zoniporide preserves left ventricular compliance during ventricular fibrillation and minimizes postresuscitation myocardial dysfunction through benefits on energy metabolism // Crit Care Med. - 2007. - №35(10). - P. 2329-2336].

Клинические испытания препарата проводились фирмой «Pfazer" у больных с инфарктом миокарда, заболеваниями коронарных сосудов, атеросклерозом. Наиболее частыми побочными эффектами у пациентов, получающих зонипорид, были сонливость и ортостатическая гипотензия. Кроме того наблюдали тошноту, рвоту и головную боль [Dalvie D. et al. Cross-species comparison of the metabolism and excretion of zoniporide: contribution of aldehyde oxidase to interspecies differences/ Drug Metab. Dispos. 2010 - №38(4). - Р.641-654]. Поэтому было изучено нейротоксическое влияние зонипорида у крыс. Были выявлены как клинические, так и электрофизиологические и микроскопические свойства периферических сенсорных аксонопатий [Pettersen JC et al. Neurotoxic effects of zoniporide: a selective inhibitor of the Na⁺/H⁺ exchanger isoform 1 // Toxicol Pathol. - 2008. - №36(4). - P.608-619]. Риск повреждения периферической нервной системы может ограничивать дозу и продолжительность терапии сердечно-сосудистых заболеваний [Liu CN, Somps CJ 1Na⁺/H⁺ Exchanger-1 Inhibitors Reduce Neuronal Excitability and Alter Na⁺ Channel Inactivation Properties in Rat Primary Sensory Neurons./ TOXICOLOGICAL SCIENCES. - 2008. - №103(2). - P.346-353].

Техническим результатом является повышение эффективности кардиопротекторного действия.

Технический результат достигается применением в качестве кардиопротекторного средства трициклических производных имидазо[1,2-а]бензимидазола общей формулы I:

где Ar=C₆H₄OCH₃-р, C₆H₄OH-р

NR₂=N(CH₂CH₂)₂O,

в том числе

Ia Ar=C₆H₄OCH₃-р; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O

Iв Ar=C₆H₄OH-р; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O

или галогенидов 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолия общей формулы I:

где Ar=C₆H₄F-4, C₆H₃(O₂CH₂)-3,4

NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂CH₂)O; X=Cl, Br,

в том числе

IIa Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl

IIв Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br.

Соединения могут применяться, в том числе, для изготовления средств, обладающих кардиопротекторным действием, а также для восстановления и улучшения кардиопротекторных функций у живых организмов.

Соединение Ia известно как обладающее способностью ингибировать ФДЭ цАМФ и снижать возбудимость предсердий (В.А. Анисимова, А.А. Спасов, В.А. Косолапов, А.Ф. Кучерявенко, О.В. Островский, Н.П. Ларионов, Р.Е. Либинзон. Фармакологическая активность 2-метоксифенилзамещенных 9-диалкиламиноэтилимидазо[1,2-a]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 2005, т.39, №9, с.26-32), а также как проявляющее свойства антагониста пуриновых P₂Y₁-рецепторов и антитромботическую активность [патент РФ №2377990, МПК A61K 31/5377, 2006 г.).

Соединение Iв проявляет антиоксидантную и антиагрегантную активность, а также слабое антисеротониновое и антипуринергическое действие (В.А. Анисимова, А.А. Спасов, В.А. Косолапов, М.В. Черников, А.Ю. Стуковина, Л.В. Ельцова, Н.П. Ларионов, Р.Е. Либинзон, О.Е. Ватолкина. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)фенилимидазо[1,2-a]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 2006, т.40, №10, с.23-26).

Соединения IIa, IIв не описаны.

Техническим результатом являются также новые соединения в ряду югалогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия, обладающие кардиопротекторным действием.

Технический результат достигается галогенидами 1-диалкиламиноэтил-3-[замещенный(дизамещенный)фенацил]-2-аминобенз-имидазолия общей формулы II:

где IIа Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl

IIв Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br.

Ниже приведены примеры получения соединений IIа и IIв.

Пример 1. Синтез хлорида 1-морфолиноэтил-3-(4-фторфенацил)-2-аминобензимидазолия (IIа).

Смесь 1,23 г (5 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола, 0,87 г (5 ммоль) ω-хлор-4-фторацетофенона и 15 мл сухого ацетонитрила кипятят до полного протекания реакции кватернизации (~8-10 часов, контроль - ТСХ). Затем ацетонитрил упаривают до небольшого объема, осадок, который представляет собой искомый хлорид, отфильтровывают и промывают ацетоном. Выход 92,5%. Т.пл. 198-199°C.

Найдено, %: C 60,15; H 5,68; Cl 8,54; F 4,60; N 13,45. C₂₁H₂₄ClFN₄O₂.

Вычислено, %: C 60,21; H 5,77; Cl 8,46; F 4,54; N 13,37.

ИК-спектр, v, см^-1: 3206, 3168, 3022 (N⁺H₂), 1693 (C=O), 1663 (C=N), 1599 (C=C); 1226 (C-N), 1118 (C-O).

Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆), δ, м.д. (J, Гц): 2.40-2.60 м [4H, N(CH₂)₂], 2.67 т (2H, J=5.7 Гц, NCH₂), 3.48 т [4H, J=3.9 Гц, O(CH₂)₂], 4.39 т (2H, J=5.7 Гц, NCH₂), 6,05 с (2H, CH₂), 7.24-7.62 м (6H, H_Ar), 8.14-8.21 м (2H, H_Ar), 9.22 уш.с (2H, N⁺H₂).

Пример 2. Бромид 1-диэтиламиноэтил-2-амино-3-(3,4-метилендиоксифенацил)бензимидазолия (IIв).

В горячий раствор 1,16 г (5 ммоль) 1-диэтиламиноэтил-2-аминобензимидазола в ацетоне вносят 1,22 г (5 ммоль) 3,4-метилендиоксифенацилбромида, смесь перемешивают и оставляют на 3-4 часа при 20-25°C. Выпавший осадок бромида отделяют и промывают ацетоном. Выход 97,3%. Т.пл. 235-236°C (разложение).

ИК-спектр (твердое состояние), v, см^-1: 3310, 3236,3090, 1681, 1652, 1449, 1255, 1033,751.

Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 0.81 т (6H, J 6.9 Гц, 2CH₃); 2.73 т (2H, J 6.2 Гц, CH₂); 4.29 т (2H, J 6.2 Гц, CH₂); 5.88 с (2H, CH₂CO); 6.20 с (2H, OCH₂O); 7.15-7.40 м (3H, H_Ar), 7.48-7.65 м (3H, H_Ar), 7.75 д (1H, J 8.1 Гц, H_Ar), N⁺H₂ в обмене.

Ниже приведены результаты испытаний кардиопротекторных свойств соединений.

1. Материалы и методы.

1.1. Материалы.

Соединения I и II, зонипорид (SIGMA, США).

Реактивы: натрий хлористый «ХЧ» NaCl (ЗАО «НПО ЭКРОС», Россия), набор реактивов для иммуноферментного анализа Rat cardiac troponin I (cTn-I) (кат. номер CSB-E08420r) фирмы CUSABIO BIOTECH CO.,LTD. (Китай), голубой Эванс, трифенилтетразолий, синий Эванс (SIGMA, США), 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (SIGMA, США).

1.2. Животные.

В экспериментах были использованы 57 крыс-самок, весом 260-300 г, которых содержали в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ P 50258-92 [1993]. Исследования проводили в соответствии с применяемыми требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, ГОСТ P ИСО 5725-2002 и «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 №708н, с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes Official Journal L 276, 20.10.2010, p.33-79 (revising Directive 86/609/EEC)].

Животные были разделены на 11 групп:

1-3 контрольные:

1 - «контроль-ложнооперированные» - животным проводился весь комплекс операций, кроме перевязки левой коронарной артерии;

2 - «контроль-ишемия/реперфузия» - животным проводилась перевязка левой коронарной артерии с последующей реперфузией, вводился физиологический раствор;

3 - «контроль-зонипорид» - животным с перевязкой левой коронарной артерии вводился зонипорид за 10 минут до реперфузии.

4-7 опытные (животным с перевязкой левой коронарной артерии вводили изучаемые соединения за 10 минут до реперфузии):

4 - «IIа»; 5 - «Iа»; 6 - «IIв»; 7 - «Iв».

1.3. Методы.

Эксперименты выполнены на наркотизированных крысах-самках (хлоралгидрат, 400 мг/кг) в условиях искусственной вентиляции, торакотомии, перикардотомии. Ишемию/реперфузию моделировали путем 60-минутной перевязки левой коронарной артерии, с последующей 60-минутной реперфузией. Физиологический раствор, зонипорид, изучаемые соединения вводили внутривенно в эквивалентных объемах 1 мг/кг за 10 мин до реперфузии. Развитие ишемии миокарда контролировали по электрокардиограмме во II стандартном отведении (компьютерный электрокардиограф «Поли-Спектр-8/В», Россия); размерам анатомической зоны риска и некроза миокарда, миокардиальному маркеру повреждения - тропонину I крыс.

Оценку размеров анатомической зоны риска и зоны инфаркта производили с помощью методики двойного окрашивания голубым Эвансом и трифенилтетразолием с последующим обсчетом в программе Image J.

Содержание тропонина I в плазме крови крыс в качестве маркера повреждения миокарда определяли иммунохимически набором реактивов для иммуноферментного анализа Rat cardiac troponin I (cTn-I) фирмы CUSABIO BIOTECH CO., LTD. (Китай) на универсальном микропланшетном ридере ELX 800 производства фирмы Bio-Tek Instruments, Inc (США). Содержание тропонина I выражали в пкг/мл плазмы.

1.4. Методы статистической обработки

Все статистические расчеты проводили с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0, фирмы StatSoft, Inc. (США). Проводили попарное сравнение выборок с использованием U-критерия Манна-Уитни. Гипотезу о существовании различий между выборками принимали при уровне p<0,05.

2. Результаты исследования

При изучении влияния соединений на размеры зоны риска и инфаркта миокарда в условиях ишемии/реперфузии были показаны следующие результаты. У животных 2-7 группы при проведении перевязки левой коронарной артерии развивалось ишемическое повреждение миокарда левого желудочка, что подтверждено подъемом сегмента ST на ЭКГ во II стандартном отведении и при окрашивании голубым Эвансом. В контрольных и опытных срезах зона риска составила во всех группах в среднем 42-55% (таблица 1). Это подтверждает единообразие проведенных оперативных вмешательств.

При последующем окрашивании трифенилтетразолием в группе «контроль-ишемия/реперфузия» зона некроза составила 44,36%. При введении зонипорида, IIа, IIв, Iа, Iв, наблюдается достоверное уменьшение зоны инфаркта по сравнению с группой «контроль-ишемия/реперфузия». При этом изучаемые соединения превосходили зонипорид по свой активности (таблица 1). Соединение IIа статистически достоверно в 1,4 раза превосходит препарат сравнения.

При анализе изменения уровня тропонина I в плазме крови животных группы «контроль-ишемия/реперфузия» было показано достоверное увеличение по сравнению с ложнооперированными (таблица 1.). В опытных группах статистически достоверное снижение маркера повреждения по отношению к группе «контроль-ишемия/реперфузия» наблюдалось при введении зонипорида, соединений IIа, Iа, IIв, Iв в 2,1, 2,5; 1,7; 1,9 и 1,5 раза соответственно.

В таблице 1 приведены основные показатели кардиопротекторного действия соединений Iа, Iв и IIа, IIв на модели ишемии/репефузии при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг.

Таблица 1 Основные показатели кардиопротекторного действия на модели ишемии/репефузии при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг. № Группа n Размеры зоны риска (% по отношению к левому желудочку) Размеры зоны некроза (% по отношению к зоне риска) Уровень тропонина I (пкг/мл) 1. Контроль-ложнооперированные 6 0,00±0,00 0,00±0,00 136,65±38,03 2. Контроль-ишемия/реперфузия 7 53,20±4,99 44,36±3,79 528,32±81,32^# 3. Контроль-зонипорид 7 47,25±3,82 34,87±2,57^* 252,76±72,05^* 4. IIа 5 46,33±3,2 24,10±1,47^*$ 211,88±60,14^* 5. Iа 8 45,01±1,77 27,78±4,23^* 316,55±62,34^* 6. IIв 4 51,09±6,08 29,92±4,84^* 287,46±60,14^* 7. Iв 5 46,04±5,28 30,04±2,58^* 346,78±99,75^{* #} - значение статистически значимо по отношению к группе «контроль-ложнооперированные»; * - значение статистически значимо по отношению к группе «контроль-ишемия/реперфузия»; ^$ - значение статистически значимо по отношению к группе «контроль-зонипорид».

3. Выводы

Таким образом, в исследованиях in vivo на модели ишемии/реперфузии показано кардиопротекторное действие изучаемых производных бензимидазола соединений Iа, Iв и IIа, IIв.

Показано, что соединения Iа, Iв, IIв при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг статистически достоверно по отношению к группе «контроль-ишемия/реперфузия» снижают размеры зоны некроза миокарда и уровень тропонина I в крови на модели ишемии/реперфузии у крыс, оказывая эффект, подобный зонипориду.

Соединение IIа при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг статистически достоверно превосходит зонипорид по влиянию на размеры зоны некроза миокарда и в большей степени снижало уровень тропонина I в крови на модели ишемии/реперфузии у крыс.

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается применения трициклических производных имидазо[1,2-а]бензимидазола общей формулы I или галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия общей формулы II в качестве средства, обладающего кардиопротекторным действием с высокой эффективностью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Применение в качестве кардиопротекторного средства трициклических производных имидазо[1,2-а]бензимидазола общей формулы I:

где Ar=C₆H₄OCH₃-р, C₆H₄OH-р
NR₂=N(CH₂CH₂)₂O,
в том числе
Iа Ar=C₆H₄OCH₃-р; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O
Iв Ar=C₆H₄OH-р; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O
или галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия общей формулы II:

где Ar=C₆H₄F-p, C₆H₃(O₂CH₂)-3,4
NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂CH₂)O X=Cl, Br,
в том числе
IIа Ar=C₆H₄F-р, NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl
IIв Ar=С₆Н₃(O₂CH₂)-3,4, NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br.

2. Применение по п.1 для изготовления средств, обладающих кардиопротекторным действием, а также для восстановления и улучшения кардиопротекторных функций у живых организмов.

3. Галогениды 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия общей формулы II:

где Ar=C₆H₄F-р, С₆Н₃(O₂CH₂)-3,4
NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂CH₂)O X=Cl, Br,
в том числе
IIа Ar=C₆H₄F-p, NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl
IIв Ar=С₆Н₃(O₂CH₂)-3,4, NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br.