СРЕДСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ Na+/H+-ОБМЕН, И ГАЛОГЕНИДЫ 1-ДИАЛКИЛАМИНОЭТИЛ-3-[ЗАМЕЩЕННЫЙ(ДИЗАМЕЩЕННЫЙ) ФЕНАЦИЛ]-2-АМИНОБЕНЗИМИДАЗОЛИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/4164 A61K31/14 A61P43/00 

Изобретение относится к средствам, обладающим способностью ингибировать Na⁺/H⁺-обмен (ингибиторы NHE).

Na⁺/H⁺ обменники (NHE) составляют группу интегральных мембранных белков, экспрессируемых во всех тканях организма, которые осуществляют трансмембранный обмен ионов Na⁺ на ионы H⁺. В настоящее время девять различных типов Na⁺/H⁺ белков-обменников были клонированы из тканей млекопитающих, и эти изоформы обычно обозначают как NHE-1,2,3,4,5,6,7,8,9 соответственно. Они различаются по аминокислотному составу, тканевой специфичности, механизмам внутриклеточной регуляции. NHE-обменники вовлечены во множество сложных физиологических и патологических процессов, включающих регуляцию клеточного рН, клеточную миграцию, апоптоз, гипертрофию повреждений, связанных с ишемией и реперфузией, защиту клетки от закисления цитоплазмы, контроль клеточного объема [Malo ME, Fliegel L Physiological role and regulation of the Na⁺/H⁺ exchanger./ Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2006. - №84 (11). - p.1081-1095.], эндотелиальную дисфункцию, а также таких заболеваний, как сахарный диабет и его осложнения, сердечная недостаточность, нарушение мозгового кровообращения, развитие злокачественных опухолей [Fliegel L. Regulation of the Na(⁺)/H(⁺) exchanger in the healthy and diseased myocardium. / Expert. Opin. Ther. Targets. - 2009. - №13 (1). - p.55-68.; Karmazyn M, Kilic A., Javadov S. The role of NHE-1 in myocardial hypertrophy and remodeling. / J. Mol. Cell Cardiol. - 2008. - №44. - p.647-653.; Provost JJ, Wallert MA. Inside Out: Targeting NHE1 as an Intracellular and Extracellular Regulator of Cancer Progression. // Chem Biol Drug Des. - 2013. - №81(1). - p.85-101.].

Известны различные группы ингибиторов NHE: амилорид и его производные (DMA, EIPA, MIBA и НМА), бензоилгуанидиновые производные, такие как НОЕ-642 (карипорид), его производное НОЕ-694 и энипорид (EMD-85131), сабипорид (BIIB-722), бициклические производные гуанидина, содержащие хинолин (MS 31038), индол (SM 20220, SM 20550, SMP-300), бензоксазинон (КБ-R9032), дигидробензофуран (BMS 284640), тетрагидронафтален (Т-162559), циклогептапиридин (TY-12533) и другие [Masereel В., Pochet L., Laeckmann D. An overview of inhibitors of Na+/H+ exchanger. // Eur. J. Med. Chem. - 2003. - №38. - P.547-554].

Известны производные бензимидазола, содержащие нециклическую гуанидиновую группу (бензимидазол-2-ил и бензимидазол-2-илтиометил бензоилгуанидин), способные ингибировать Na⁺/H⁺ обмен [Zhang R et al. Benzimidazol-2-yl or benzimidazol-2-ylthiomethyl benzoylguanidines as novel Na⁺/H⁺ exchanger inhibitors, synthesis and protection against ischemic-reperfusion injury. / Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2007. - №17. - p.2430-2433.].

Наиболее близким по достигаемому результату является Зонипорид (СР-597396)-[1-(хинолин-5-ил)-5-циклопропил-1Н-пиразол-4-карбонил] гуанидина гидрохлорид моногидрат [A Guzman-Perez et al. Discovery of zoniporide: A potent and selective sodium-hydrogen exchanger type 1 (NHE-1) inhibitor with high aqueous solubility. / Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2001. - №11(6). - p.803-807]. В исследованиях in vitro на тромбоцитах кролика было показано, что данный препарат подавляет NHE-1 - зависимое набухание тромбоцитов (ЕС₅₀=56 нМ) [Tracey WR et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc Drug Rev. - 2003. - №21. - p.17-32].

Однако его свойства как ингибитора NHE остаются недостаточно эффективными.

Техническим результатом является повышение эффективности ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена (ингибиторы NHE).

Технический результат достигается применением в качестве ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена галогенидов 1,3-дизамещенных 2-амино-бензимидазолия, общей формулы I:

Ar=C₆H₄F-4, C₆H₃(O₂CH₂)-3,4

NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂)₅, N(CH₂CH₂)₂O

X=Cl, Br

в том числе,

Ia Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂)₅, X=Br

Ib Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Br

Ic Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl

Id Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br

Соединения могут применяться в том числе для изготовления средств, обладающих способностью ингибировать Na⁺/H⁺-обмен, а также для ингибирования Na⁺/H⁺-обмена в живых организмах.

Соединение Ia известно как обладающее геморологическими свойствами (патент РФ №2290404, МПК C07D 487/04, 2006 г.).

Соединение Ib известно как промежуточный продукт в синтезе соединения, проявляющего обезболивающее действие (патент РФ №2412187, МПК C07D 487/04, 2011 г.).

Соединения Ic и Id не описаны.

Техническим результатом являются также новые соединения в ряду галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия, обладающие свойством ингибировать Na⁺/H⁺-обмен.

Технический результат достигается галогенидами 1-диалкиламиноэтил-3-[замещенный(дизамещенный) фенацил]-2-аминобенз-имидазолия общей формулы Ic, d:

Ar=C₆H₄F-4, C₆H₃(O₂CH₂)-3,

NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂CH₂)₂O

X=Cl, Br, в том числе

Ic Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl

Id Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br

Ниже приведены примеры получения соединений Ic и Id.

Пример 1. Синтез хлорида 1-морфолиноэтил-3-(4-фторфенацил)-2-аминобензимидазолия (Ic).

Смесь 1,23 г (5 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола, 0,87 г (5 ммоль) ω-хлор-4-фторацетофенона и 15 мл сухого ацетонитрила кипятят до полного протекания реакции кватернизации (~8-10 часов, контроль - ТСХ). Затем ацетонитрил упаривают до небольшого объема, осадок которого представляет собой искомый хлорид, отфильтровывают и промывают ацетоном. Выход 92,5%. Т.пл. 198-199°C.

Найдено, %: С 60,15; Н 5,68; Cl 8,54; F 4,60; N 13,45. C₂₁H₂₄ClFN₄O₂.

Вычислено, %: С 60,21; Н 5,77; Cl 8,46; F 4,54; N 13,37.

ИК спектр, ν, см^-1: 3206, 3168, 3022 (N⁺H₂), 1693 (C=O), 1663 (C=N), 1599 (C=C); 1226 (C-N), 1118 (C-O).

Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д. (J, Гц): 2.40-2.60 м [4Н, N(CH₂)₂], 2.67 т (2Н, J=5.7 Гц, NCH₂), 3.48 т [4Н, J=3.9 Гц, O(СН₂)₂], 4.39 т (2Н, J=5.7 Гц, NCH₂), 6,05 с (2Н, СН₂), 7.24-7.62 м (6Н, H_Ar), 8.14-8.21 м (2Н, H_Ar), 9.22 уш.с (2Н, N⁺H₂).

Пример 2. Бромид 1-диэтиламиноэтил-2-амино-3-(3,4-метиленди-оксифенацил)бензимидазолия (Id).

В горячий раствор 1,16 г (5 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола в ацетоне вносят 1,22 г (5 ммоль) 4-фторфенацилбромида, смесь перемешивают и оставляют на 3-4 часа при 20-25°C. Выпавший осадок бромида отделяют и промывают ацетоном. Выход 97,3%. Т.пл. 235-236°C (разложение).

ИК спектр (твердое состояние), ν, см^-1: 3310, 3236, 3090, 1681, 1652, 1449, 1255, 1033,751.

Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 0.81 т (6Н, J 6.9 Гц, 2СН₃); 2.73 т (2Н, J 6.2 Гц, СН₂); 4.29 т (2Н, J 6.2 Гц, CH₂); 5.88 с (2Н, СН₂СО); 6.20 с (2Н, OCH₂O); 7.15-7.40 м (3Н, H_Ar), 7.48-7.65 м (3Н, H_Ar), 7.75 д (1Н, J 8.1 Гц, H_Ar), N⁺H₂ в обмене.

Ниже приведены результаты испытаний свойств соединений I как ингибиторов Na⁺/H⁺ обмена.

1. Материалы и методы.

1.1. Схема исследования.

1 этап - изучение влияния соединений на активность Na⁺/H⁺-обменника тромбоцитов кролика. Расчет IC₅₀.

2 этап - изучение острой токсичности.

1.2. Материалы.

Соединения Ia-d, зонипорид (SIGMA, США).

Реактивы: натрия пропионат (МР Biomedicals, Inc., Франция), HEPES (GERBU, Германия), кальций хлористый 2-водный (дигидрат) CaCI₂·2H₂O (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), магний хлористый 6-водный «ч» MgCI₂·6H₂O (ЗАО «УНИХИМ», Россия), D-глюкоза (безводная) кристаллическая «ч» C₆H₁₂O₆ (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), натрий хлористый «ХЧ» NaCl (ЗАО «НПО ЭКРОС», Россия), калий хлористый «ЧДА» KCl (ООО «РЕАХИМ», Россия), калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄ «ЧДА» (ОАО «Петербургский Красный химик», Россия), магний сернистокислый 7-водный MgSO₄·7H₂O (000 «РЕАХИМ», Россия), гидрокарбонат натрия NaHCO₃ (ООО «РЕАХИМ», Россия), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (МР Biomedicals, Inc., Франция).

1.3. Животные.

В экспериментах были использованы кролики-самцы, весом 2,5-3,5 кг, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ Р 50258-92 [1993]. Исследование проводили в соответствии с применимыми требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, ГОСТ Р ИСО 5725-2002 и «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 №708н, с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes Official Journal L 276, 20.10.2010 p.33-79 (revising Directive 86/609/EEC)].

Методы.

Изучение влияния соединений на активность Na⁺/H⁺-обменника тромбоцитов кролика проведено in vitro на тромбоцитах кролика (по методу Rosskopf D. et. al. Rapid determination of the elevated Na⁺/H⁺ exchanger in platelets of patients with essential hypertension using an optical swelling assay // Journal of Hypertension. - 1991. - №9. - p.231-238; Kusumoto К. et al.. In vitro and in vivo pharmacology of a structurally novel Na⁺/H⁺ exchanger inhibitor, T-162559 // British Journal of Pharmacology. - 2002. - №135. - p.1995-2003).

В качестве материала исследования выбраны тромбоциты кролика, на мембране которых активно экспрессируют NHE-1. В основу метода были положены подходы, основанные на изменении светопропускания при изменении формы тромбоцита.

Образцы крови забирали из краевой вены уха кролика в пробирку, содержащую 3,8% цитрата натрия, в соотношении 1:10. Для получения плазмы богатой тромбоцитами (ПБогТ) кровь центрифугировали при 1000 оборотах/минуту в течение 12 минут.

Для проведения калибровки использовали ПБогТ с ЭДТА и раствор Кребса (NaCl - 120 мМ, KCl - 4,8 мМ, КН₂РО₄ - 1,2 мМ, MgSO₄ - 2,5 мМ, NaHCO₃ - 25 мМ, CaCl₂ - 2,6 мМ, глюкоза - 5,4 мМ, рН 7,4).

В контрольной серии экспериментов к 200 мкл ПБогТ для снижения внутриклеточного рН добавляли 600 мкл раствора пропионата натрия (в ммоль/л: Na пропионат 135, HEPES 20, CaCl₂ 1, MgCl₂ 1, глюкоза 10; рН 6.7; t=37°C). При этом происходила активация Na⁺/H⁺-обменника, увеличение притока натрия, связанное с выделением цитозольного H⁺, ведущее к отеку (сферуляции) тромбоцита в результате аккумуляции воды в цитоплазме. При этом наблюдалось облегчение светопропускания. Для контроля изменения светопропускания в условиях физиологических рН использовали раствор Кребса.

Изменения формы тромбоцитов регистрировали по изменению уровня светопропускания с помощью лазерного агрегометра «БИОЛА-220 ЛА», Россия.

При изучении новых соединений и препарата сравнения зонипорида (10 мкл) вещества добавляли в кювету с ПБогТ (200 мкл) за 3-5 минут до добавления раствора пропионата натрия, инкубировали при температуре 37°C и постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (1000 оборотов в минуту).

Исследования проводились в диапазоне концентраций 10^-10-10^-5 М.

Рассчитывали IC₅₀ - концентрацию соединения, блокирующую Na⁺/H⁺-обменник тромбоцитов кролика на 50%.

1.4. Изучение острой токсичности

Для вычисления широты терапевтического действия соединения определяли острую токсичность на 50 мышах-самцах при внутрибрюшинном введении. Расчет величины ЛД₅₀ проводили графически по Миллеру и Тейтнеру [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1963. - 152 с.].

1.5. Методы статистической обработки

Для исследуемого препарата и препарата сравнения экспериментально определены величины IC₅₀ с использованием метода регрессионного анализа зависимости между lg концентрации и процентом ингибирования активности обменника в программе Microsoft Excel (пакет Office XP, Microsoft, США).

2. Результаты исследования

При изучении влияния новых соединений и зонипорида на активность Na⁺/H⁺-обменника кролика было показано дозозависимое увеличение ингибирующего эффекта. Рассчитаны IC₅₀, которые представлены в таблице 1.

При изучении острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам рассчитана ЛД₅₀. Для оценки широты терапевтического действия на изолированных органах рассчитан терапевтический индекс (таблица 1).

Показано, что по NHE-ингибирующему эффекту соединения Ic, Ia, Ib оказались активнее зонипорида и превосходили его как по величине IC₅₀ в 50, 41, 6 раз, так и по терапевтическому индексу в 52; 46; 10,5 раза соответственно. Соединение РУ-1183 оказалось активнее зонипорида по величине IC₅₀ в 1,5 раза при одинаковых терапевтических индексах.

Таблица 1 Расчет терапевтического индекса наиболее активных ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена среди 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия     Ингибирование NHE     Вещество   ED₅₀, мг/л (кг) ЛД₅₀, мг/кг Терапевтический индекс   IC₅₀, М         Ic 5,42×10^-10 0,0002 342,7 1509400,39   Ia 6,56×10¹⁰ 0,0003 401,8 1327769,35   Ib 4,56×10^-9 0,002 643,3 304499,38   Id 1,76×10^-8 0,008 240,0 28690,01   Зонипорид 2,7×l0^-8 0,009 250,0 28903,57

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается применения галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия, общей формулы I в качестве ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена, а также новых галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия. Техническим результатом является повышение эффективности ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Применение в качестве ингибиторов Na⁺/H⁺-обмена галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия, общей формулы I:

где Ar=C₆H₄F-4, C₆H₃(O₂CH₂)-3,4
NR₂=N(C₂H₅)₂, N(CH₂)₅, N(CH₂CH₂)₂O
X=Cl, Br
в том числе,
Ia Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂)₅, X=Br
Ib Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Br
Ic Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl
Id Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br

2. Применение по п.1 для изготовления средств, обладающих способностью ингибировать Na⁺/H⁺-обмен, а также для ингибирования Na⁺/H⁺-обмена в живых организмах.

3. Галогениды 1-диалкиламиноэтил-3-[замещенный(дизамещенный) фенацил]-2-аминобензимидазолия, общей формулы Ic, d:

Ic Ar=C₆H₄F-4; NR₂=N(CH₂CH₂)₂O, X=Cl
Id Ar=C₆H₃(O₂CH₂)-3,4; NR₂=N(C₂H₅)₂, X=Br