УСТОЙЧИВЫЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ХЛОРИДА DOTAP Российский патент 2017 года по МПК C07C219/08 A61K47/18 A61K9/127 

Описание патента на изобретение RU2627354C2

Настоящее изобретение относится к кристаллическим модификациям рацемического и энантиомерно чистого хлорида DOTAP, к способу его изготовления и к его применению для изготовления фармацевтических композиций.

Кристаллические формы хлорида DOTAP и соответствующие фармацевтические композиции имеют то же самое хорошо известное применение как и некристаллические формы хлорида DOTAP.

Хлорид DOTAP выше и ниже обозначает рацемические (2R,S)- или изомерно чистые (2R)- и/или (2S)-формы N,N,N-триметил-2,3-бис[[(9Z)-1-оксо-9-октадеценил]окси]-1-пропанаминийхлорид, также известный как (Z,Z)-N,N,N-триметил-2,3-бис[(1-оксо-9-октадеценил)окси]-1-пропанаминийхлорид или 1,2-диолоилокси-3-триметиламмонийпропанхлорид, а также его гидраты.

номера CAS: 132172-61-3 и 477274-39-8 (рацемат),

197974-73-58 (рацемат, моногидрат)

428506-51-8 (форма 2S), 328250-28-8 (форма 2R)

DOTAP может, в частности, образовывать липосомы и другие липидные пузырчатые агрегаты. Липосомы представляют собой синтетические многослойные везикулы (сферически автономные мембраны), содержащие амбифильные вещества, обычно природные липиды, в которые могут быть инкапсулированы гидрофильные вещества в водной внутренней части, а также во внутреннюю часть липидной мембраны могут быть включены липофильные вещества.

Их применяют, в частности, в косметике и в медицине, особенно в дерматологии. При этом в них в частности заключены витамины, коэнзимы, вещества для ухода за кожей и солнцезащитные вещества. Липосомы, как правило, применяют наружно.

Кроме того, липосомы становятся все более и более значимыми в фармацевтической технологии, так как парентеральное применение липосом позволяет достигать более точной доставки активных соединений в органы, чем в случае применения активных соединений в свободном растворенном виде. В случае если в липосомы и другие липидные пузырчатые агрегаты включены ДНК, РНК или белки, то получают липоплексы.

Добавление масел и применение гомогенизаторов высокого давления делает возможным образование так называемых наноразмерных частиц (наночастиц), которые могут быть получены из липосом. Они представляют собой частицы с приблизительно тем же размером, что и липосомы, но у которых нет водной фазы, а вместо этого во внутренней части они содержат масляную фазу. Они являются особенно подходящими для инкапсулирования липофильных веществ.

Микроэмульсии представляют собой коллоидно-дисперсные, однофазные системы, содержащие водные, липидоподобные и поверхностно-активные компоненты. Они имеют размер частиц, составляющий 1-500 нм, и ведут себя подобно жидкостям.

В частности, что касается пептидых активных соединений, нуклеотидов, вакцин и других биофармацевтических препаратов, которые в обычном состоянии имеют низкую растворимость, то солюбилизирующий эффект имеет очень большое значение в случае применений, описанных выше.

Более того, расщепление активных соединений в организме может быть замедлено, и таким образом получают эффект пролонгированного высвобождения.

Хлорид DOTAP относится к классу катионных липидов. В отличие от фосфолипидов природного происхождения, указанные липиды не имеют цвитер-ионных свойств. Липосомы, содержащие катионные липиды, отдельно или в комбинации с фосфолипидами или другими липидоподобными соединениями, имеют положительно заряженную поверхность. Это приводит к высокому сродству к клеткам, которые имеют отрицательно заряженную поверхность снаружи, например, к клеткам эндотелия.

Особенно важной, при этом, является способность липосом на основе DOTAP и других катионных липосом и липоплексов проникать в клетки и, таким образом, переносить активные соединения, которые заключены в них, во внутрь клетки (трансфекция).

Все эти свойства делают хлорид DOTAP очень интересным также для терапии злокачественных новообразований. Указанные свойства приводят к возможности применения традиционных цитостатических агентов, заключенных в липосомы катионного DOTAP.

Трансфекционные свойства хлорида DOTAP и других солей DOTAP, таких как, например, ацетат, бромид, дигидрогенфосфат, гидрогенсульфат, йодид, мезилат, метилсульфат, трифторацетат, сульфат или дисульфат и трифлат, достаточно известны из литературы.

В некоторых опытах in vitro, другие соли, такие как, например, метилсульфат DOTAP, достигали лучших уровней трансфекции, чем хлорид DOTAP.

Когда применяли in vivo, то при этом анионный обмен на поверхности липосомы происходит в живом организме, что означает, что преимущества других солей здесь не возникают. Особенно при медицинском применении у людей, в частности в случае парентерального применения, соли DOTAP с физиологически подходящими анионами, такими как, например, соответствующий хлорид или ацетат, являются предпочтительными по этой причине.

Медицинское, в частности парентеральное применение выдвигает самые высокие требования к качеству и чистоте применяемых активных соединений и вспомогательных веществ. По этой причине существуют очень строгие правила регуляторных органов в отношении изготовления, воспроизводимости изготовления и профиля побочных продуктов указанных соединений. Более того, в случае веществ, которые применяют парентерально, микробиологическое инфицирование патогенными микроорганизмами и эндотоксинами должно быть строго предупреждено и контролируемо.

Доступные в настоящее время аморфные формы хлорида DOTAP и других солей DOTAP являются чрезвычайно неустойчивыми и по этой причине их трудно изготовить в чистом виде с подходящей чистотой так, чтобы они подходили для применения в изготовлении лекарственного препарата.

Подобно всем липидам, которые обладают радикалами олеиновой кислоты, таким как, например, природные фосфолипиды DOPC и DOPE, все соли DOTAP являются очень чувствительными к окислению и при этом продукты окисления производных ненасыщенных жирных кислот имеют, как правило, высокую токсичность.

Здесь необходимы подходящие способы изготовления, очистки и обеспечение устойчивости. Например, ацетат DOTAP, который находится в виде масла с высокой температурой кипения, по этой причине, в промышленном отношении, в соответствующем качестве, может быть получен только с большими трудностями.

Традиционные способы преодоления неустойчивости, такие как, например, добавление антиоксидантов в виде аскорбиновой кислоты или восстановленного L-глутатиона, значительно ограничивают общую применимость хлорида DOTAP, так как взаимодействия с включенными активными соединениями не могут быть исключены. Полное исключение кислорода во время изготовления, хранения и применения практически невозможно или может быть обеспечено только с очень большими усилиями.

Хлорид DOTAP является коммерчески доступным в качестве раствора в хлороформе или в качестве аморфного вещества.

Дополнительно к его окислительной чувствительности, аморфный хлорид DOTAP также является чрезвычайно гигроскопичным и интенсивно поглощает влагу в течение чрезвычайно короткого времени при нормальных уровнях атмосферной влажности, что приводит к образованию масляной пленки. Это делает обработку указанного соединения намного сложнее.

Технически, по этой причине, любая обработка доступных в настоящее время аморфных форм хлорида DOTAP является возможной только при серьезных мерах защиты. Таким образом, изготовитель аморфного хлорида DOTAP, как правило, рекомендует хранение в условиях защитного газа при температуре -20°С и гарантирует только срок годности, составляющий приблизительно 6 месяцев.

Eibel и Unger, РЕ 4013632 А1, кратко описывают синтез хлорида (2R,S)-DOTAP из бромида DOTAP с помощью ионного обмена в смеси растворителей хлороформ/метанол/водная HCl, с последующей очисткой с использованием хроматографии. Бромид DOTAP получают заранее in situ из 1-бром-2,3-диолоилоксипропана.

Leventis и Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132, сообщают о синтезе хлорида (2R,S)-DOTAP из йодида DOTAP с помощью ионного обмена в двухфазной смеси растворов растворитель/NaCl. Йодид DOTAP получают заранее с помощью метилирования соответствующего диметиламино соединения с использованием метилйодида.

Nantz и др., Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283, J. Med. Chem. 40 (1997) 4069-4078, описывают синтез хлорида (2R,S)- DOTAP с помощью использования безводной ионнообменой хроматографии. Желательное соединение получают с помощью испарения элюата.

Felgner и др., US 5264618, проводят метилирование соответствующего диметиламино соединения непосредственно до получения хлорида (2R,S)-DOTAP с использованием метилхлорида. Они очевидно получили желтый воск с помощью кристаллизации из ацетонитрила при температуре -20°С. При этом хлорид (2R,S)-DOTAP является практически нерастворимым в ацетонитриле при комнатной температуре. Попытки воспроизвести эту так называемую кристаллизацию дали только аморфный материал в результате затвердевания маслянистого вещества, полученного из горячего раствора в результате охлаждения. Тот факт, что это не кристаллизация является также очевидным, исходя из того, что авторы по-видимому не достигли эффекта очистки и должны были очищать вещество с помощью хроматографии. Смотри также сравнительные примеры, которые демонстрируют, что Felgner и др. не получили кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP.

В частности, если соединения предназначены для парентерального применения, то изготовление, которое включает обработку с использованием ионообменной смолы, является чрезвычайно проблематичным в свете возможного микробиологического инфицирования, так как соответствующие смолы являются идеальными питательными средами для бактерий, и даже после того, как бактерии были уничтожены, риск инфицирования эндотоксинами все еще остается.

WO 2006/056312 А1 описывает энантиомерно чистый хлорид DOTAP. При этом подробный способ кристаллизации не раскрыт.

По этой причине задачей настоящего изобретения является обеспечение кристаллических хлористых солей и гидратов DOTAP при высокой чистоте и с подходящей химической и физической устойчивостью. Дополнительной задачей настоящего изобретения является обеспечение указанных кристаллических солей с длительным сроком годности, что дает возможность применять их для изготовления фармацевтических препаратов. При этом продолжает существовать большая потребность в воспроизводимом способе изготовления устойчивых форм хлористых солей и гидратов DOTAP, который может осуществляться в промышленном масштабе.

Энантиомерно чистый хлорид DOTAP может быть получен из энантиомерно чистых исходных материалов, по аналогии со способом, описанным для рацемата, т.е. посредством (R)- или (S)-1-хлор-2,3-диолоилоксипропана, посредством (R)- или (S)-1-LG-2,3-диолоилоксипропана и ионного обмена (LG = уходящая группа) или посредством (R)- или (S)-1-диметиламино-2,3-диолоилоксипропана. Смотри WO 2006/056312.

Дополнительным способом изготовления, который может быть упомянут, является оптическое разделение рацематов рацемического хлорида DOTAP. Посредством опытов, в настоящее время было обнаружено, неожиданно, что как рацемический, так и энантиомерно чистый, кристаллический хлорид DOTAP может быть получен простым способом, с высокой химической чистотой, превосходной устойчивостью и подходящей пригодностью к обработке, что дает возможность обрабатывать указанные соединения в большем промышленном масштабе. Кристаллические продукты, полученные таким образом, имеют практически неограниченную устойчивость при комнатной температуре в условиях защитного газа. Вследствие этого, они являются подходящими в качестве составляющего или в качестве исходного материала для изготовления лекарственных форм.

Соответственно, настоящее изобретение относится к устойчивым кристаллическим модификациям рацемического и энантиомерно чистого хлорида DOTAP.

Устойчивые кристаллические модификации могут существовать в кристаллической и частично кристаллической форме. Они имеют никогда до этого времени не достигаемую чистоту, которая составляет по меньшей мере приблизительно 95%, предпочтительно >98%. К тому же, было обнаружено, что хлорид (2R,S)-DOTAP обладает никогда до этого времени не достигаемой устойчивостью, составляющей выше 99 масс.% и % площади пика, определенными с помощью ВЭЖХ по отношению к исходному значению, когда его хранят при температуре 25°С на протяжении 36 месяцев или при температуре 40°С на протяжении 12 месяцев (смотри в этом отношении Таблицу 1 и Таблицу 1а).

Специалист в данной области техники может легко подобрать подходящий метод ВЭЖХ для того, чтобы определить чистоту и содержание хлорида DOTAP. Например, в качестве оборудования может быть применен ВЭЖХ хроматограф Agilent 1200 с колонкой Inertsil ODS-3 (150×3 мм, 3 мкм) (компания Gl Sciences). Типичные элюенты представляют собой 10 мМ натриевой соли пентансульфоновой кислоты в водной H3PO4 (0,085%) (элюент А) и 3,85 мМ натриевой соли пентансульфоновой кислоты в 94% ацетонитрила, содержащего водную H3PO4 (0,085%) (элюент В). Подходящий градиент является следующим (время регистрации хроматограммы 25 мин, время после начала 5 мин; скорость потока: 1,5 мл/мин; 220 бар; 50°С, объем вводимой пробы 10 мкл):

Кристаллические модификации хлорида DOTAP содержат менее 1 эквивалента воды или растворителя кристаллизации на эквивалент хлорида DOTAP.

Кристаллические (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP демонстрируют превосходную и крайне желательную пригодность к обработке, такую как исключительно сниженная гигроскопичность и очень хорошие способности к сыпучести.

Кристаллические (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP имеют температуру плавления, которая составляет выше 160°С, в частности, находящуюся в пределах между 183 и 185°С, и энтальпию плавления, которая составляет по меньшей мере -130 Дж/г, предпочтительно выше -140Дж/г, в частности находится в пределах между -143 и -159 Дж/г (смотри в этом отношении Таблицу 3).

Рацемические кристаллические модификации хлорида (2R,S)-DOTAP демонстрируют умеренно острые полосы при анализе рентгеновской порошковой дифракции (смотри в этом отношении Фиг.1 и Таблицу 2). Значения 2 Тета кристаллической модификации составляют приблизительно 6,5, 12,6, 13,4, 19,5, 20,2, 21,5, 25,2 и 29,8, где выбранные значения 2 тета составляют приблизительно 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 и 25,2. Кристаллические формы хлорида (2R,S)-DOTAP, соответствующие рентгеновской порошковой дифрактограмме, изображенной на Фиг.1, находятся в пределах объема изобретения.

Энантиомерно чистые хлориды (2S)-DOTAP также получают в кристаллической форме. Значения 2 Тета кристаллической модификации составляют приблизительно 6,5, 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, 20,7, 21,6 и 25,3, где выбранные значения 2 тета составляют приблизительно 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, и 21,6 (смотри Фиг.2 и Таблицу 2). Кристаллические формы хлорида (2S)-DOTAP, соответствующие рентгеновской порошковой дифрактограмме, изображенной на Фиг.2, находятся в пределах объема изобретения.

Энантиомерно чистые хлориды (2R)-DOTAP также получают в кристаллической форме. Значения 2 Тета кристаллической модификации составляют приблизительно 6,6, 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, 20,8, 21,6 и 25,3, где выбранные значения 2 тета составляют приблизительно 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, и 21,6 (смотри Фиг.3 и Таблицу 2). Кристаллические формы хлорида (2R)-DOTAP, соответствующие рентгеновской порошковой дифрактограмме, изображенной на Фиг.3, находятся в пределах объема изобретения.

Изобретение к тому же относится к способу изготовления кристаллических модификаций хлорида (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP, который отличается тем, что хлорид (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP кристаллизуется из апротонной среды. Апротонная среда, которую применяют для этой цели, может представлять собой апротонный растворитель, или смесь апротонных растворителей, или смесь одного или более апротонных растворителей с протонным растворителем или смесью протонных растворителей.

Подходящие апротонные растворители представляют собой апротонные, содержащие кислород растворители, в частности, простые эфиры, такие как, например, тетрагидрофуран, метилтетрагидрофуран, диоксан, простой диэтиловый эфир, простой дипропиловый эфир, простой диизопропиловый эфир и простой метилтрет-бутиловый эфир, кетоны, такие как, например, ацетон и 2-бутанон, метилизобутилкетон, метилизопропилкетон, и сложные эфиры, такие как, например, этилформиат, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, изопропилацетат, бутилацетат, изобутилацетат, диметилкарбонат, диэтилкарбонат и 1,3-диоксолидин-2-он.

Предпочтительные апротонные растворители представляют собой кетоны.

Подходящие протонные растворители представляют собой, в частности, спирты, такие как, например, метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, 2-бутанол, трет-бутанол, 3-метил-1-бутанол и этиленгликоль, метоксиэтанол, этоксиэтанол.

Если апротонная среда представляет собой смесь одного или более апротонных растворителей с протонным растворителем, тогда апротонный растворитель может представлять собой апротонный, содержащий кислород растворитель, как определено выше, или нитрил, такой как, например, ацетонитрил.

Растворители могут в каждом случае применяться в чистом виде или в виде смеси, т.е. является возможным как применять различные апротонные растворители в группе в виде смеси, так и применять типы апротонных растворителей в виде смеси друг с другом.

Если апротонная среда представляет собой смесь одного или более апротонных растворителей с протонным растворителем, тогда протонные растворители могут быть представлены от более чем 0 масс.% до 40 масс.%, предпочтительно от 10 масс.% до 20 масс.%, в зависимости от применяемых условий, чистоты исходных материалов и от цели способа (выход, чистота продукта, степень кристалличности). Предпочтительно, необходимо применять апротонную среду, содержащую очень небольшое количество воды. В особенно предпочтительном варианте осуществления, вода исключена.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, в качестве апротонной среды применяют ацетон или 2-пропанол. В очень предпочтительном варианте осуществления, применяют смесь ацетона и 2-пропанола. Как правило, смесь 2-пропанола и ацетона содержит 0-25% 2-пропанола.

Кристаллизация хлоридов DOTAP может осуществляться при этом непосредственно из реакционного раствора без предварительной очистки. Подобным образом, кристаллический хлорид DOTAP может быть получен посредством вторичной кристаллизации аморфного, частично кристаллического или кристаллического материала.

В предпочтительном варианте осуществления, хлориды DOTAP, которые применяют для изготовления их кристаллических форм, представлены в высокой химической и оптической чистоте, предпочтительно при чистоте, составляющей приблизительно ≥95% или выше, более предпочтительно приблизительно 98% или выше, даже более предпочтительно приблизительно 99% или выше. В этом отношении, при этом при изготовлении кристаллических хлоридов DOTAP в качестве реагента применяют очень чистую олеиновую кислоту, что приводит к в высшей степени чистым хлоридам DOTAP, которые кристаллизуются более легко, чем хлориды DOTAP, доступные ранее, имеющие меньшую чистоту. Основные примеси, типичные для хлоридов DOTAP, доступных в настоящее время, включают, но не ограничиваются ими, другие липиды или их производные. Фактически существующая чистота олеиновой кислоты в соответствии с Европейской Фармакопеей (которая по этой причине является "фармацевтическим качеством") в настоящее время все еще составляет лишь приблизительно 65-88%. По причине очень чистой олеиновой кислоты, здесь подразумевается качество сверхвысокой чистоты, которая составляет приблизительно 95% или выше, предпочтительно приблизительно 99% или выше. Подходящая очень чистая олеиновая кислота может, например, быть коммерчески доступной от компании RCA (серия ОА 11.G.01.2007) или от компании Acme Synthetic Chemicals (серия 060528).

Энантиомерная чистота, например, может быть установлена с помощью определения угла оптического вращения.

В предпочтительном варианте осуществления, хлориды ООТАР которые применяют для изготовления их кристаллических форм, кристаллизуются или повторно кристаллизуются из смесей с подходящими растворителями в пределах концентраций от 1 части хлорида ООТАР к 4 частям растворителя вплоть до 1 части хлорида DOTAP к 100 частям растворителя, наиболее предпочтительно в пределах концентраций от 1 части хлорида DOTAP к 4 частям растворителя вплоть до 1 части хлорида DOTAP к 10 частям растворителя.

Кристаллизации модификаций хлорида DOTAP, как правило, достигают в частности с помощью медленного охлаждения приготовленного раствора ниже температур, составляющих 30°С, например, посредством охлаждения со скоростью, которая составляет 0,001°С-0,1°С в минуту, например, 0,05°С в минуту или 0,004°С в минуту, что приводит к времени охлаждения, составляющего приблизительно 5-200 часов, например, приблизительно 10 часов-50 часов. Определенные варианты представляют собой нагрев раствора до 35°С и после этого медленное охлаждение до -12°С на протяжении периода, составляющего 12 часов, или нагрев раствора до более низкой температуры, например, до 25°С, или начиная от комнатной температуры без нагрева, и после этого медленное охлаждение, например, на протяжении от 10 до 50 часов, предпочтительно до -12°С. Образование кристаллов проводят либо самопроизвольно, либо посредством затравки с помощью соответствующей кристаллической модификацией хлорида DOTAP. Медленное охлаждение может быть осуществлено посредством любого способа, известного специалисту в данной области техники. Как правило, применяют криостат.

Как упомянуто ранее, все соли DOTAP являются очень чувствительными к окислению и, таким образом, исключение кислорода во время способов изготовления, раскрытых здесь, является предпочтительным, например, посредством применения инертной атмосферы, например, атмосферы азота и/или применяя растворители с низким содержанием кислорода и пероксида.

Применение аморфного или частично кристаллического хлорида DOTAP в качестве исходного материала для вторичной кристаллизации дает, в соответствии с описанным способом, по сути, кристаллические хлориды DOTAP, никогда до этого времени не достигаемой чистоты, вместе с никогда до этого времени не достигаемой устойчивостью.

Изобретение также относится к применению кристаллических хлоридов (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP для изготовления лекарственных препаратов, так как кристаллические хлориды (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP имеют превосходную устойчивость в твердом виде в устоявшихся условиях и имеют постоянное и очень хорошее качество на протяжении практически неограниченного времени. Следовательно, изобретение, кроме того, также относится к фармацевтическим композициям, полученным в результате применения указанных в формуле изобретения форм кристаллического хлорида (2R)-, (2S)- и (2R,S)-DOTAP.

Фармацевтические композиции указанного типа могут содержать кристаллические модификации хлорида (2R,S)-, (2S)- и (2R)-DOTAP вместе с другими фармацевтическими активными соединениями и известными вспомогательными веществами, которые обычно применяют в изготовлении лекарственных средств, также с одним или более растворителями. Указанные фармацевтические композиции могут, например, быть представлены в виде липосом, липоплексов, микроэмульсий и наноразмерных частиц и включают, например, активное соединение из группы пептидов, нуклеотидов, вакцин или цитостатических агентов. Настоящее описание позволяет специалисту в данной области техники всесторонне применять изобретение. Кроме того, следующие примеры служат для лучшего понимания и для иллюстрирования возможных вариантов изобретения. По этой причине, указанные примеры никоим образом не следует рассматривать как ограничительные.

Все температуры, упомянутые в следующих примерах, определены в градусах Цельсия. До тех пор, пока не указано иное, данные в отношении содержания представлены в масс.%.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 иллюстрирует рентгеновские спектры кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP,

Фиг. 2 иллюстрирует рентгеновские спектры кристаллического хлорида (2S)-DOTAP,

Фиг. 3 иллюстрирует рентгеновские спектры кристаллического хлорида (2R)-DOTAP,

Фиг. 4 иллюстрирует рентгеновские спектры аморфного хлорида (2R,S)-DOTAP,

Фиг. 5 иллюстрирует рентгеновские спектры кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP (а), кристаллического хлорида (2R)-DOTAP (b) и кристаллического хлорида (2S)-DOTAP (с) в сравнении с коммерчески доступным образцом хлорида (2R,S)-DOTAP (от компании Avanti Polar Lipids) (d),

Фиг. 6 иллюстрирует эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0318-Е) в ацетонитриле, когда охлаждение проводят, как в Felgner и др.

Фиг. 7 иллюстрирует эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0318-Е) в ацетонитриле после ее охлаждения до -20°С, как в Felgner и др.

Фиг. 8 иллюстрирует эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0364-Е) в ацетонитриле перед ее охлаждением, как в Felgner и др.

Фиг. 9 иллюстрирует эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0364-Е) в ацетонитриле после ее охлаждения до -20°С, как в Felgner и др.

Фиг. 10 иллюстрирует рацемический кристаллический хлорид (2R,S)-DOTAP.

Фиг. 11 иллюстрирует температуры фазового перехода и температуры плавления чистого кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP и чистого кристаллического хлорида (2R)-DOTAP, также как и двух смесей обоих кристаллических форм.

Фиг. 12 иллюстрирует кривые ДСП хлорида (2R,S)-DOTAP (сверху) и хлорида (2R)-DOTAP (снизу): аморфных форм: диаграммы справа; кристаллических форм (диаграммы слева) (смотри Характеристический Пример 5).

Примеры, иллюстрирующие изобретение

Общие положения условий опыта:

Является важным во время кристаллизации и вторичной кристаллизации очень медленно проводить охлаждение для того, чтобы оптимизировать осаждение кристаллического материала.

Все реагенты и растворители имеют очень низкое содержание воды.

Все действия проводят в закрытом оборудовании в атмосфере азота.

Применяют очень чистую олеиновую кислоту, имеющую чистоту, составляющую более чем 95%, предпочтительно более чем 98%, даже более предпочтительно более чем 99%.

Параметры измерений рентгеновской порошковой дифрактометрии являются следующими:

Рентгеновская порошковая дифрактометрия на дифрактометре STOE

Дифракция: просвечивание

Монохроматор: германиевый изогнутый (111)

Длина волны излучения: 1,54060 Cu

Детектор: линейный позиционно-чувствительный детектор

Режим сканирования: чувствительный детектор Дебая-Шеррера / подвижный позиционно-чувствительный детектор / фиксированный Omega

При анализе рентгеновской порошковой дифракции является обычным, когда могут возникать небольшие отличия между отдельными полосами, если используют разное оборудование или способы регистрации, такие как отражение или просвечивание, или капиллярное или окнообразное, или когда доминируют разные условия регистрации (например, атмосферная влажность или температура). Средний специалист в данной области техники хорошо знаком с такими небольшими отличиями и способен легко идентифицировать предоставленный материал с наибольшим соответствием представленной рентгеновской порошковой дифрактограмме, с учетом используемой методологии.

Пример изготовления 1:

Изготовление кристаллического рацемического хлорида (2R,S)-DOTAP [(R,S)-1,2-диолоил-3-пропилтриметиламмоний хлорида]:

Исходные материалы

Применяли следующие химические вещества:

N,N'-карбонилдиимидазол от компании SIGMA-ALDRICH, серия 1252812 Олеиновую кислоту от компании RCA, серия ОА 11.С.01.2007, 99,1% площади пика (ВЭЖХ), где содержание по данным анализа может составлять 99,5% или даже выше, поскольку линолевая кислота (основная примесь) демонстрирует гораздо более высокие отклики в УФ, чем олеиновая кислота.

(R,S)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиол, от компании MERCK EPROVA, серия MSCH-103-А,

0,11% воды, 99,4% (ГХ)

1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ен от компании SIGMA ALDRICH, серия 1076841, 99,7% (ГХ)

Метилхлорид от компании LINDE, серия 61448

Йодид натрия от компании SIGMA ALDRICH, серия 1336385, 0,27% воды

Оксид алюминия от компании SIGMA ALDRICH, серия 1336643

Ацетонитрил от компании ICC, серия 0000426130, 100,0% (ГХ), <0,015% воды

н-Гептан от компании BRENNTAG SCHWEIZERHALL серия 0000278245, 96,4% (ГХ)

2-Пропанол от компании THOMMEN FURLER, серия 070920211487, 99,96% (ГХ), 0,03% воды

Ацетон от компании THOMMEN FURLER, серия 080609324212, 99,98% (ГХ), 0,16% воды

Синтез (2R,S)-DODAP[(R,S)-1,2-диолоил-3-диметиламмоний пропана] 2,41 кг N,N'-карбонилдиимидазола растворяли при комнатной температуре в 6,33 кг обезвоженного ацетонитрила. Полученный раствор нагревали до 25°С. Затем 4,0 кг олеиновой кислоты закачивали в раствор на протяжении периода времени, составляющего 60 минут, при этом температуру реакции поддерживали ниже 35°С посредством варьирования скорости подачи олеиновой кислоты (образование газообразного диоксида углерода). После того, как подача завершена, реакционный раствор перемешивали на протяжении дополнительных 90 минут при температуре 30°С (до завершения выделения газа). Затем добавляли 11 г 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ена, с последующим растворением 0,83 кг рацемического (R,S)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиола в 0,37 кг обезвоженного ацетонитрила. Перемешивание при температуре 30°С продолжали на протяжении 21 часа. Полученную эмульсию охлаждали до 25°С и перемешивание останавливали. Появлялось два слоя. Нижний слой отделяли, дегазировали при 1 мбар/25°С на протяжении 200 минут и окончательно разбавляли с использованием 11,7 кг н-гептана. К раствору добавляли 1,21 кг основного оксида алюминия и суспензию перемешивали на протяжении 3 часов при температуре 0°С. Суспензию фильтровали, и остаток на фильтре промывали с использованием 1,5 кг н-гептана, предварительно охлажденного до температуры 0°С. Объединенные фильтраты гомогенизировали до получения 15,9 кг раствора, содержащего 4,08 кг чистого (2R,S)-DODAP в н-гептане (серия № МВА-116, содержание по данным анализа: 25,7%, выход: 88,9%).

Другую партию синтезировали таким же образом, при этом получали 16,6 кг раствора, содержащего 3,52 кг чистого (2R,S)-DODAP в н-гептане (серия № МВА-117, содержание поданным анализа: 21,2%, выход: 88,6%).

Синтез хлорида (2R,S)-DOTAP

23,4 кг раствора, содержащего 3,52 кг чистого (2R,S)-DODAP в н-гептане (15,9 кг серии № МВА-116 и 7,5 кг серии № МВА-117) загружали в реактор, и н-гептан отгоняли при температуре кожуха, составляющей 60°С, и пониженном давлении. При достижении стабильного вакуума при давлении 8 мбар, температуру кожуха доводили до 25°С. Затем добавляли 7,0 кг 2-пропанола и 3,1 г йодида натрия. Затем температуру реакции доводили до 30°С и атмосферу азота заменяли на атмосферу метилхлорида при постоянном абсолютном давлении, составляющим 1200 мбар. Реакционную смесь перемешивали при указанных условиях на протяжении 137 часов до завершения реакции метилирования (2R,S)-DODAP до получения хлорида (2R,S)-ООТАР (конверсия 96%). Потребление метилхлорида составило 1,39 кг.

Кристаллизация хлорида (2R,S)-DOTAP

Раствор хлорида (2R,S)-DOTAP в 2-пропаноле, приготовленный, как описано выше, разбавляли с использованием 35,8 кг обезвоженного ацетона при температуре 25°С. Количество 2-пропанола, как указано выше, составило 7 кг и количество хлорида DOTAP на основании расчетов составило 3,64 кг в растворе. Прозрачный раствор медленно охлаждали до температуры -12°С со скоростью охлаждения, составляющей 0,05°С в минуту, т.е., охлаждение происходило на протяжении периода времени, составляющего 12 1/3 часа. Полученную суспензию выдерживали при температуре -12°С на протяжении дополнительных 14 часов и затем фильтровали через предварительно охлажденный фильтр (-15°С). Неочищенный хлорид (2R,8S)-DOTAP промывали дважды с использованием 6,0 кг холодного обезвоженного ацетона (-18°С).

Полученную кристаллическую модификацию на данном этапе в этом конкретном опыте не проверяли; однако, из более ранних соответствующих опытов, где исходный продукт отделяли на данном этапе, известно, что кристаллическая модификация представляет собой кристаллический (2R,S)-DOTAP.

Для достижения еще более чистого продукта, т.е. для того, чтобы удалить некоторые незначительные примеси, выполняли стадию вторичной кристаллизации.

Вторичная кристаллизация хлорида (2R,S)-DOTAP

Влажный неочищенный хлорид (2R,S)-DOTAP растворяли в закрытом фильтре в смеси 44,1 кг обезвоженного ацетона и 3,5 кг 2-пропанола при температуре 35°С. Раствор переносили в реактор и доводили до 0°С. Раствор медленно охлаждали до температуры -12°С со скоростью охлаждения, составляющей 0,004°С в минуту, т.е., охлаждение происходило на протяжении периода времени, составляющего 50 часов. Полученную в результате суспензию выдерживали при температуре -12°С на протяжении дополнительных 16 часов и затем фильтровали с использованием охлажденного фильтра-осушителя (-15°С). Остаток на фильтре промывали дважды с использованием 0,8 кг холодного обезвоженного ацетона (-18°С) и сушили с использованием вакуума. Во время сушки фильтру-осушителю давали нагреться до комнатной температуры. Сушку завершали, когда достигали устойчивого вакуума при давлении 7,9 мбар. Выход: 3,46 кг кристаллического рацемического хлорида (2R,S)-DOTAP (кристаллический (2R,S)-DOTAP, серия № МВА-118, содержание по данным анализа: 100,0%, выход: 37,8% в расчете на (R,S)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиол, чистота по ВЭЖХ: 99,9% площади пика).

Изображение кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP можно найти на Фигуре 10.

Пример изготовления 2:

Изготовление кристаллического энантиомерно чистого Хлорида (2R)-DOTAP [(R)-1,2-диолоил-3-пропилтриметиламмоний хлорида]:

Исходные материалы

Применяли следующие химические вещества:

N,N'-карбонилдиимидазол от компании SIGMA-ALDRICH, серия 1252812 Олеиновую кислоту от компании АСМЕ SYNTHETIC CHEMICALS, серия 060528, 97,8% (ВЭЖХ)

(R)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиол от компании DAISO, серия RMA062151, 0,11% воды, 99,6% (ГХ)

1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ен от компании SIGMA-ALDRICH, серия 1076841, 99,7% (ГХ)

Метилхлорид от компании LINDE, серия 61448

Йодид натрия от компании SIGMA-ALDRICH, серия 1336385, 0,27% воды Ацетонитрил от компании SIGMA-ALDRICH, серия 7219К, 100,0% (ГХ), 0,005% воды

н-Гептан от компании BRENNTAG SCHWEIZERHALL, серия 0000278245, 96,4% (ГХ)

2-Пропанол от компании THOMMEN FURLER, серия 070629176434, 99,96% (ГХ), 0,016% воды

Ацетон от компании THOMMEN FURLER, серия 061201101946, 99,98% (ГХ), 0,10% воды

Синтез (2R)-DODAP [(R)-1,2-диолоил-3-диметиламмоний пропана] 1,63 кг N,N'-карбонилдиимидазола растворяли при комнатной температуре в 4,3 кг обезвоженного ацетонитрила. Раствор нагревали до 25°С. Затем 2,7 кг олеиновой кислоты закачивали в раствор на протяжении периода времени, составляющего 60 минут, при этом температуру реакции поддерживали ниже 35°С посредством варьирования скорости подачи олеиновой кислоты (образование газообразного диоксида углерода). После завершения подачи, реакционный раствор перемешивали на протяжении дополнительных 105 минут при температуре 30°С (до завершения выделения газа). Затем добавляли 7,5 г 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ена, с последующим растворением 0,56 кг энантиомерно чистого (R)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиола в 0,25 кг обезвоженного ацетонитрила. Перемешивание при 30°С продолжали на протяжении 19 часов. Полученную эмульсию охлаждали до 10°С и перемешивание останавливали. Появлялось два слоя. Нижний слой отделяли, дегазировали при давлении 0,1 мбар/20°С на протяжении 30 минут и окончательно разбавляли с использованием 9,7 кг н-гептана. Суспензию перемешивали на протяжении 1,5 часа при температуре 0°С и фильтровали до получения 12,3 кг раствора, содержащего 2,66 кг чистого (2R)-DODAP в н-гептане (серия № МВР-001, содержание по данным анализа: 21,6%, выход: 88,4%).

Синтез хлорида (2R)-DOTAP

12,2 кг раствора, содержащего 2,66 кг чистого (2R)-DODAP в н-гептане (серия № МВР-001), загружали в реактор, и н-гептан отгоняли при температуре кожуха, составляющей 60°С, и пониженном давлении. При достижении стабильного вакуума при давлении 1 мбар, температуру кожуха доводили до 20°С. Затем добавляли 3,26 кг 2-пропанола и 1,4 г йодида натрия. Затем температуру реакции доводили до 30°С и атмосферу азота заменяли на атмосферу метилхлорида при постоянном абсолютном давлении, составляющем 1250 мбар. Реакционную смесь перемешивали при указанных условиях на протяжении 330 часов до завершения реакции метилирования (2R)-DODAP до получения хлорида (2R)-DOTAP (конверсия 97%). Потребление метилхлорида составляло 0,58 кг.

Кристаллизация хлорида (2R)-DOTAP

Раствор хлорида (2R)-DOTAP в 2-пропаноле, приготовленный, как описано выше, разбавляли с использованием 16,2 кг обезвоженного ацетона при температуре 25°С. Количество 2-пропанола, как указано выше, составляло 3,26 кг и количество хлорида DOTAP на основании расчетов составляло 2,78 кг в растворе. Прозрачный раствор медленно охлаждали до температуры -12°С со скоростью охлаждения, составляющей 0,05°С в минуту, т.е. охлаждение осуществлялось на протяжении периода времени, составляющего 12 1/3 часа. Полученную в результате суспензию выдерживали при температуре -12°С на протяжении дополнительного часа и затем фильтровали через предварительно охлажденный фильтр (-12°С). Неочищенный хлорид (2R)-DOTAP промывали дважды с использованием 3,2 кг холодного обезвоженного ацетона (-18°С). Кристаллический продукт представлял собой кристаллический (2R)-DOTAP.

Полученную кристаллическую модификацию на данном этапе в этом конкретном опыт не проверяли; однако, из более ранних соответствующих опытов, где исходный продукт отделяли на данном этапе, известно, что кристаллическая модификация представляет собой кристаллический (2R)-DOTAP.

Для достижения еще более чистого продукта, т.е. для того, чтобы удалить некоторые незначительные примеси, выполняли стадию вторичной кристаллизации.

Вторичная кристаллизация хлорида (2R)-DOTAP

Влажный неочищенный хлорид (2R)-DOTAP растворяли в закрытом фильтре в смеси 20,5 кг обезвоженного ацетона и 1,63 кг 2-пропанола при температуре 35°С. Раствор переносили в реактор и доводили до температуры 25°С. Раствор медленно охлаждали до температуры -12°С со скоростью охлаждения, составляющей 0,05°С в минуту, т.е., охлаждение происходило на протяжении периода времени, составляющего 12 1/3 часа. Полученную в результате суспензию выдерживали при температуре -12°С на протяжении дополнительных 9 часов и затем фильтровали с использованием охлажденного фильтра-осушителя (-12°С). Остаток на фильтре промывали дважды с использованием 3,2 кг холодного обезвоженного ацетона (-18°С) и сушили с использованием вакуума. Во время сушки фильтру-осушителю давали нагреться до комнатной температуры. Сушку завершали, когда появлялся устойчивый вакуум при давлении 0,6 мбар. Выход: 1,47 кг кристаллического энантиомерно чистого хлорида (2R)-DOTAP (серия № МВР-002, содержание по данным анализа: 99,7%, выход: 44,7% в расчете на (R)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиол, чистота по ВЭЖХ: 99,9% площади пика).

Пример изготовления 3:

Изготовление кристаллического энантиомерно чистого хлорида (2S)-DOTAP [(S)-1,2-диолоил-3-пропилтриметиламмоний хлорида]:

Хлорид (2S)-DOTAP [(S)-1,2-диолоил-3-пропилтриметиламмоний хлорид] изготавливали тем же способом, что и хлорид (R)-DOTAP (смотри выше), только с использованием энантиомерно чистого исходного материала (S)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиола (серия SMA062281 от компании DAISO, 0,14% воды, ГХ: 99,8%; все другие химические вещества являются идентичными) и при выходе 1,67 кг кристаллического энантиомерно чистого хлорида (2S)-DOTAP (серия № МВ8-002, содержание по данным анализа: 99,6%, выход: 50,4% в расчете на (S)-3-(диметиламино)-1,2-пропандиол, чистота по ВЭЖХ: 100,0% площади пика).

Характеристический Пример 1

Устойчивость

Для того чтобы определить устойчивость кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP, вещество хранили при температуре 25°С и 60% относительной влажности (таблица 1) или при температуре 40°С и 75% относительной влажности (таблица 1а) без доступа воздуха. Остаточное содержание хлорида (2R,S)-DOTAP устанавливали через периодические промежутки времени и анализировали в сравнении с начальным значением.

Чистоту и содержание хлорида РОТАР определяли с использованием ВЭЖХ, применяя следующий метод:

Оборудование ВЭЖХ:

ВЭЖХ Agilent 1200

колонка:

ODS-3: 150×3 мм, 3 мкм. Gl Sciences:

Inertsil 10 мМ натриевой соли пентансульфоновой кислоты в 0,085% водной H3PO4

3,85 мМ натриевой соли пентансульфоновой кислоты в 94% ацетонитрила, содержащего 0,085% водной H3PO4

градиент: 0 мин 75% В 1 мин 75% В 6 мин 90% В 7 мин 100% В 20 мин 100% В 25 мин 75% В время после начала: 5 мин 75% В время регистрации: 25 мин скорость потока: 1,5 мл/мин давление: прибл. 220 бар температура колонки: 50°С объем вводимой пробы: 10 мкл

При этом были выявлены следующие значения:

Определение устойчивости можно повторять по состоянии на любое желательное время, значения, указанные в Таблицах 1 и 1а, являются воспроизводимыми.

Приведенные выше данные относительно устойчивости подтверждают, что кристаллический хлорид DOTAP представляет собой устойчивое вещество. В случае образцов, которые хранились при температуре 25±2°С, значительного распада не наблюдалось даже по истечении 36 месяцев.

Приведенные выше данные относительно устойчивости подтверждают, что кристаллический хлорид DOTAP представляет собой устойчивое вещество. В случае образцов, которые хранились при температуре 40±2°С, даже в условиях ускоренной деградации по истечении 12 месяцев значительного распада не наблюдалось.

Кристаллические хлориды (2R)- и (2S)-DOTAP демонстрируют сопоставимые значения устойчивости.

Характеристический Пример 2

Рентгеновские порошковые диаграммы

Для характеристики структурообразующих свойств (кристаллических модификаций) кристаллических хлоридов DOTAP, регистрировали порошковые рентгенограммы (дифракционные спектры) указанных веществ.

Кристаллические хлориды (2R,S)-, (2R)- и (2S)-DOTAP дают спектры с умеренно острыми полосами, которые имеют относительно хорошую степень разделения пиков для липидов. Спектры свидетельствуют о высоком содержании кристаллического вещества. В поляризационный микроскоп аморфные фракции не видны.

Примеры спектров показаны на Фиг. 1, Фиг. 2 и Фиг. 3.

Для сравнения, спектр коммерчески доступного, аморфного образца показан на Фиг. 4 (аморфный). Фиг. 5 показывает сравнение рентгеновских спектров кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP (а), кристаллического хлорида (2R)-DOTAP (b) и кристаллического хлорида (2S)-DOTAP (с), в сравнении с коммерчески доступным образцом хлорида (2R,S)-DOTAP (компания Avanti Polar Lipids) (d).

В Таблице 2 перечислены выбранные значения 2 тета для различных кристаллических модификаций рацемических и энантиомерно чистых хлоридов DOTAP:

Характеристический Пример 3

Температура плавления и энтальпия плавления

Температуру плавления и энтальпию плавления кристаллических хлоридов DOTAP определяли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (30-350°С, 5,0°С/мин, N2 80 мл/мин).

Полученные в результате температуры плавления и энтальпии плавления для рацемических (2R,S)- и энантиомерно чистых (2R)- и/или (2S)-DOTAP хлоридов перечислены в Таблице 3.

Характеристический Пример 4

Температуры фазового перехода и энтальпии

Температуры фазового перехода и энтальпию кристаллических хлоридов DOTAP определяли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (30-350°С, 5,0°С/мин, N2 80 мл/мин).

Дополнительно к температурам плавления (смотри Характеристический Пример 3) наблюдали несколько точек перехода в кристаллические и/или жидкокристаллические фазы. Соответствующие температуры фазового перехода и энтальпии для рацемических (2R,S)- и энантиомерно чистых (2R)- и/или (2S)-DOTAP хлоридов перечислены в Таблице 4.

Когда опыт ДСК проводили на смеси чистого кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP и чистого кристаллического хлорида (2R)-DOTAP, то наблюдали все температуры фазового перехода обоих, рацемата и энантиомера. Фиг. 11 иллюстрирует температуры фазового перехода и температуры плавления чистого кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP и чистого кристаллического хлорида (2R)-DOTAP, также как и смесей обоих кристаллических форм в соотношении, составляющем 100:50 и 63:100. Указанные соотношения соответствуют содержанию 33,3 мол. % и/или 19,3 мол. % хлорида (2S)-DOTAP в смеси.

Заключение:

Кристаллические модификации кристаллического энантиомерно чистого хлорида DOTAP и кристаллического рацемического хлорида DOTAP отличаются.

Характеристический Пример 5

Поглощение воды в зависимости от относительной влажности

Поглощение воды хлоридом DOTAP определяли посредством динамической сорбции паров (ДСП), применяя анализатор сорбции паров воды Projekt Messtechnik SPS 11-100n. Образцы помещали в алюминиевые тигли на верх микровесов и давали отстояться при температуре 25°С и 0% о.в. (относительной влажности) на протяжении ночи перед тем, как подвергнуть их двум циклам увлажнения/сушки при температуре 25°С со скоростью сканирования, составляющей Δ о.в.=5% ч-1, и периодами уравновешивания 'изотермической влажности' при экстремальных значениях.

Исследовали образцы кристаллического хлорида (2R,S)-DOTAP, кристаллического хлорида (2R)-DOTAP, аморфного хлорида (2R,S)-DOTAP и аморфного хлорида (2R)-DOTAP.

Результаты:

Сравнение кривых ДСП (смотри Фигуру 12: сплошная линия первого цикла, пунктирная линия второго цикла) указывают характерные отличия между кристаллическими и аморфными образцами: Кристаллические образцы (левые диаграммы Фигуры 12) демонстрируют стабильную массу при низкой о.в., в то время как масса аморфных образцов (правые диаграммы Фигуры 12) повышается уже сразу от значения, выше 0% о.в. Кроме того, для образцов, которые были кристаллическими сначала, в обоих циклах наблюдался значительно больший гистерезис.

Отличие может также наблюдаться между рацемическими (верхние диаграммы Фигуры 12) и энантиомерно чистыми (нижние диаграммы Фигуры 12) образцами: Рацемические образцы демонстрируют резкое повышение содержания воды при прибл. 10-15% о.в., в то время как изомерно чистые образцы демонстрируют указанную стадию при прибл. 20-25% о.в.

Сравнительный Пример 1

В воспроизведенном здесь опыте Felgner и др., все условия опыта были выбраны таким образом, чтобы точно соответствовать US 5264618 (Felgner и др.), Пример 5, страница 27, строки 15-47.

31,5 г олеоилхлорида (компания FLUKA, 0733IAH), растворенного в 125 мл хлороформа, при температуре 4°С, при охлаждении, добавляли капля по капле к 5,0 г 3-(диметиламино)-1,2-пропандиолу, растворенному в 37,5 мл хлороформа и 25 мл пиридина, на протяжении периода, составляющего 1½ часа. Желтый раствор перемешивали на протяжении ночи. Затем добавляли 125 мл холодной воды и 125 мл простого диэтилового эфира. Органические фазы промывали дважды с использованием 100 мл 0,5 N HCL и также дважды с использованием 100 мл 0,5 N раствора бикарбоната натрия. Добавляли 39 г безводного сульфата натрия и полученную таким образом суспензию фильтровали и промывали с использованием 100 мл хлороформа. Затем фильтрат упаривали при пониженном давлении при температуре 40°С. Получали 40,1 г коричневой жидкости (SM-0318-А), которая содержала 24,3 масс.% (2R,S)-DODAP, что было установлено посредством ВЭЖХ. Последующая сушка при пониженном давлении при 60°С приводила к снижению массы до 31,2 г.

31,0 г указанного материала очищали с помощью хроматографии на колонке с кремниевой кислотой следующим образом:

Силикагель: 129 г (количество силикагеля было рассчитано по отношению к количеству (2R,S)-DODAP) Merck 60 F 63-200 um

Колонка: диаметр 4 см, высота 60 см

Скорость потока: приблизительно 8 мл/мин

В качестве подвижной фазы вначале применяли 1 500 мл метиленхлорида (фракции 1-27), затем 1000 мл метиленхлорида/метанола 95:5 (фракции 28-47) и в конце 1000 мл метанола. Фракции собирали и объединяли в соответствии с их анализом ТСХ. Так фракции 4-33 упаривали вместе при пониженном давлении. Получали 10,8 г коричневого масла (SM-0318-В), которое содержало 65,6 масс.% (2R,S)-DODAP, что было установлено посредством ВЭЖХ. И из фракций 34-42 получали 12,6 г коричневого масла (SM 0318-0), которое содержало 54,2 масс.% (2R,S)-DODAP, что было установлено посредством ВЭЖХ.

10,4 г Метиленхлорида добавляли к 9,6 г соединению, полученному из фракций 4-33 (SM-0318-В), в стеклянную пробирку для высокого давления. Стеклянную пробирку затем закрывали, и коричневатый раствор нагревали на протяжении ночи при температуре 50°С до образования эмульсии. Затем пробирку открывали, и оставшийся метиленхлорид удаляли с помощью выпаривания. Получали 8,0 г желтого воска (SM-0318-Е), который содержал 65,0 масс.% хлорида (2R,S)-DOTAP и 1,3 масс.% (2R,S)-DODAP, что для обоих случаев было установлено посредством ВЭЖХ.

К указанному воску (SM-0318-Е) добавляли 14,0 г ацетонитрила. Полученную таким образом эмульсию с 80 мл ацетонитрила (для того, чтобы получить соотношение твердого вещества к растворителю, составляющее приблизительно 1:12) переносили в колбу и охлаждали до температуры 20°С. Никакой кристаллизации не наблюдали. При температуре 20°С получали затвердевший, похожий на мед, желто-коричневатый материал, который даже лишь при небольшом подогреве превращался в липкий вязкий коричневатый материал.

Заключение

Данные демонстрируют, что 1,2-диолоил-3-пропилтриметиламмоний хлорид (хлорид (2R,S)-DOTAP), изготовленный в соответствии с приведенным выше способом, который соответствует US 5264618 (Ре1дпег и др.), Пример 5, страница 27, строки 15-47, не может быть получен в кристаллической форме.

Смотри также Фигуры 6 и 7, иллюстрирующие эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0318-Е) в ацетонитриле, при охлаждении, и эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0318-Е) в ацетонитриле после охлаждения до -20°С, соответственно.

Сравнительный Пример 2

Было подготовлено последующее воспроизведение опыта Felgner и др., которое подтверждает то же, что сказано выше.

Все условия опыта были выбраны таким образом, чтобы по возможности наиболее точно соответствовать условиям в отношении изготовления/выделения хлорида (2R,S)-DOTAP, как раскрыто в US 5264618 (Felgner и др.) Пример 5, страница 27, строки 15-47.

В этом опыте, особое внимание было направлено на ряд реагентов, на применение безводного пиридина, на время метилирования и температуру трубки.

В US 5264618 (Felgner и др.), Пример 5, достоверных данных в отношении применения исходного материала не было обнаружено. Для повторной обработки применяли олеоилхлорид от компании SIGMA-ALDRICH (№ тов. 367850, № сер. 07331АН) и 3-(диметиламино)-1,2-пропандиол от компании TCl (№ тов. D2072, № сер. FGC01EF). При этом простой диэтиловый эфир (№ тов. 8.22270.1000, № сер. К33237470), сульфат натрия (№ тов. 8.22286.5000, № сер. ТА603386), морской песок (№ тов. 1.07711.5000, № сер. ТА1417811), силикагель 60 F 63-200 мкм (№ тов. 1.07734.9025, № сер. ТА1570234) и ацетонитрил (№ тов. 1.15500.1000, № сер. К38172000) все были поставлены от компании Merck KGaA. Хлороформ (№ тов. 34854, № сер. 8178С) и пиридин над молекулярным ситом, H2O≤0,005% (№ тов. 82704, № сер. 1166921) были поставлены от компании Fluka.

5,0 г 3-(диметиламино)-1,2-пропандиола растворяли при комнатной температуре в 25 мл безводного пиридина и 37,5 мл свежедистиллированного хлороформа. Раствор охлаждали до температуры 4°С. 31,5 г Олеоилхлорида растворяли в 125 мл дистиллированного хлороформа. Раствор олеоилхлорида капля по капле добавляли к холодному раствору 3-(диметиламино)-1,2-пропандиола на протяжении периода в один час. Желтый раствор перемешивали на протяжении ночи. Затем добавляли 125 мл холодной воды и 125 мл простого диэтилового эфира. Органические фазы промывали дважды с использованием 100 мл 0,5 N HCl, и затем также промывали дважды с использованием 100 мл 0,5 N раствора бикарбоната натрия. Затем добавляли 39 г безводного сульфата натрия. Полученную таким образом суспензию фильтровали, и оставшееся твердое вещество промывали с использованием 20 мл хлороформа. Затем фильтрат упаривали при пониженном давлении. Получали 31,5 г коричневой жидкости (SM 0364 А), которая содержала 62,2 масс.% 1,2-диолоил-3-диметиламмоний пропана (DODAP), что было установлено посредством ВЭЖХ.

Силикагелевую колонку подготавливали следующим образом:

Колонка: диаметр 4 см, высота 60 см

Силикагель: 200 г силикагеля и 42,6 г морского песка (рассчитано по отношению к количеству DODAP)

Скорость потока: приблизительно 7 мл/мин

15 г материала, приготовленного выше (SM 0364 А), капля по капле добавляли к силикагелевой колонке и прополаскивали с использованием 50 мл хлороформа. Колонку вначале элюировали с использованием 1000 мл хлороформа, затем 1000 мл хлороформа/метанола 95/5, затем 1250 мл хлороформа/метанола 90/10 и в конце с использованием 2500 мл метанола. Фракции собирали и объединяли в соответствии с их анализом тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинках (Merck 60 F254), доводили с использованием хлороформа/ацетона/метанола/уксусной кислоты/воды в соотношении 50/15/5/5/2 от объема, проводили детектирование с использованием йода. После упаривания при пониженном давлении, из объединенных фракций 11-17 получали 4,88 г (SM 0364 В), содержащие 73,2 масс.% DODAP, из фракций 18-27 получали 7,24 г (SM 0364 С), содержащие 68,2 масс.% DODAP, и из фракций 28-31 получали 1,9 г (SM 0364 D), содержащие 40,4 масс.% DODAP, что было установлено посредством ВЭЖХ. В общем, получали массовый баланс, который составлял 93,5%.

1,0 г соединения, полученного из наиболее чистых фракций 11-17 (SM-0364-В), добавляли в выдерживающую высокое давление, толстостенную пробирку из боросиликатного стекла (Sigma Aldrich 2181072-1ЕА). Затем в стеклянной пробирке конденсировали 10 мл метилхлорида. Затем стеклянную пробирку плотно закрывали и выдерживали при 70°С на протяжении 72 часов. Затем пробирку охлаждали до температуры 0°С, открывали и оставшийся метилхлорид удаляли посредством выпаривания. В результате этого получали 1,11 г желто-коричневатого воска (SM 0364 Е), который содержал 69,3 масс.% хлорида (2R,S)-DOTAP, и при этом показывал содержание DODAP, которое составляло 1,8 масс.%, а также содержание олеиновой кислоты, которое составляло 2,7 масс.% (все данные были установлены посредством ВЭЖХ).

К 1,08 г соединения, полученного, как описано выше (SM 0364 Е), добавляли 10 мл ацетонитрила и нагревали до 50°С. Полученную таким образом эмульсию охлаждали до температуры -20°С. Никакой кристаллизации не наблюдали. При температуре -20°С получали желто-коричневатый воск.

Заключение:

Как продемонстрировано выше, при повторной обработке наиболее близкого варианта(ов) осуществления US 5264618 (Felgner и др.) может быть получен только аморфный хлорид (2R,S)-DOTAP.

Смотри также Фигуры 8 и 9, иллюстрирующие эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0364-Е) в ацетонитриле перед ее охлаждением, и эмульсию хлорида (2R,S)-DOTAP (SM-0364-Е) в ацетонитриле после ее охлаждения до температуры -20°С, соответственно.

Без дальнейших уточнений, считается, что специалист в данной области техники может посредством применения вышеизложенного описания, использовать настоящее изобретение в его полном объеме. По этой причине, выше изложенные предпочтительные конкретные варианты осуществления следует рассматривать только как иллюстративные, а не ограничивающие упомянутое раскрытие каким-либо образом.

Выше изложенные примеры могут быть повторены с таким же успехом, при этом, заменяя описанные в общем или конкретно реагенты и/или рабочие условия указанного изобретения, которые применяли в изложенных выше примерах.

Из приведенного выше описания, специалист в данной области техники может легко установить существенные характеристики указанного изобретения и, не выходя за пределы сущности и объема изобретения, может осуществить различные изменения и модификации изобретения для того, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям.

Похожие патенты RU2627354C2

название год авторы номер документа
УСТОЙЧИВЫЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ХЛОРИДА DOTAP 2005
  • Плачер Михаэль
  • Хедингер Альфред
RU2463291C2
ТВЕРДЫЕ ФОРМЫ ПЛАДИЕНОЛИДПИРИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 2016
  • Кини, Грегг Ф.
  • Ван, Джон
  • Джерард, Бодуан
  • Араи, Кендзо
  • Лю, Сян
  • Чжэн, Го Чжу
  • Кира, Казунобу
  • Тивитмахаисоон, Паршари
  • Праджапати, Судип
  • Гирхарт, Николас С.
  • Котаке, Йосихико
  • Нагао, Сатоси
  • Канада Сонабе, Реджина Мики
  • Мияно, Масаюки
  • Мураи, Норио
  • Буонамичи, Сильвия
  • Юй, Лихуа
  • Парк, Юнис Сун
  • Чан, Бетти
  • Смит, Питер Г.
  • Томас, Майкл П.
  • Пацолли, Эрмира
  • Лим, Киан Хуат
  • Чанда, Арани
  • Эндо, Ацуси
RU2743349C2
НОВЫЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ N-[-2[[(2,3-ДИФТОРФЕНИЛ)МЕТИЛ]ТИО]-6-{[(1R, 2S)-2,3-ДИГИДРОКСИ-1-МЕТИЛПРОПИЛ]ОКСИ}-4-ПИРИМИДИНИЛ]-1-АЗЕТИДИН-СУЛЬФОНАМИДА 2011
  • Гулльберг Бритт Анне Инджела
  • Ларссон Петер Томас
  • Стоунхаус Джеффри Пол
RU2548044C2
Замещенные производные бисфенилового эфира масляной кислоты в качестве ингибиторов NEP 2019
  • Годтфредсен, Свен Эрик
  • Каган, Марк
  • Лю, Юйган
  • Прашад, Махавир
  • Ван, Чжаоинь
  • Чжу, Сайцзе
  • Цай, Юншуай
RU2784522C2
ХРОМЕНОНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ РI3-КИНАЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА 2012
  • Барлаам Бернар Кристоф
  • Дежорс Себастьян Луи
  • Ламбер-Ван Де Бремп Кристин Мари Поль
  • Ломанн Жан-Жак Марсель
  • Пли Патрик
RU2598028C2
Способ получения соединения 2,2-дифтор-N-((1R,2S)-3-фтор-1-гидрокси-1-(4-(6-(S-метилсульфонимидоил)пиридин-3-ил)фенил)пропан-2-ил)ацетамида 2019
  • Дежонг Рэндолл Ли
  • Каррик Грегори Ли
  • Стак Тимоти Ли
RU2765144C1
СОЛИ И КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ 2014
  • Окумура Йосиюки
  • Ивата Ясухиро
  • Нумата Тойохару
  • Судо Масаки
  • Окумура Такако
RU2654855C2
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГИДРОХЛОРИДА (-)-(1R,2R)-3-(3-ДИМЕТИЛАМИНО-1-ЭТИЛ-2-МЕТИЛПРОПИЛ)ФЕНОЛА 2005
  • Фишер Андреас
  • Бушманн Хельмут
  • Грусс Михаэль
  • Лишке Дагмар
RU2423345C2
ПОЛИМОРФНЫЕ И ПСЕВДОПОЛИМОРФНЫЕ ФОРМЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ 2010
  • Бхаттачаря Сисир
  • Бонне Ален
  • Дедхия Махендра Дж.
  • Дюканда Вероник
  • Жьюльяни Александр
  • Приур Ален
  • Раво Валери
  • Спарго Питер
RU2575173C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИАЗОЛОВ, КОНЕЧНЫЕ И ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ СПОСОБА 1996
  • Майкл Баттерс
  • Джули Энн Харрисон
  • Алан Джон Петтман
RU2156760C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 627 354 C2

Реферат патента 2017 года УСТОЙЧИВЫЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ХЛОРИДА DOTAP

Изобретение относится к способу изготовления кристаллической формы хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP (N,N,N-триметил-2,3-бис[[(9Z)-1-оксо-9-октадеценил]окси]-1-пропанаминийхлорид). Способ содержит кристаллизацию хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP из одного или более апротонных растворителей, причем кристаллизация происходит посредством медленного охлаждения от 35°С до -12°С на протяжении периода времени, составляющего 12 ч, или посредством медленного охлаждения от температуры ниже чем 35°С на протяжении периода времени, составляющего от 10 до 50 ч. Кристаллический хлорид (2R,S)-DOTAP имеет одну из следующих характеристик: значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 и 25,2; или значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 6,5, 12,6, 13,4, 19,5, 20,2, 21,5, 25,2 и 29,8; или рентгеновскую порошковую дифрактограмму, соответствующую дифрактограмме, изображенной на фиг. 1. Кристаллический хлорид (2S)-DOTAP имеет одну из следующих характеристик: значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 12,8, 19,5, 19,8, 20,2 и 21,6; значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 6,5, 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, 20,7, 21,6 и 25,3; или рентгеновскую порошковую дифрактограмму, соответствующую дифрактограмме, изображенной на фиг. 2. Кристаллический хлорид (2R)-DOTAP имеет одну из следующих характеристик: значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 12,8, 19,5, 19,8, 20,3 и 21,6; значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 6,6, 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, 20,8, 21,6 и 25,3; или рентгеновскую порошковую дифрактограмму, соответствующую дифрактограмме, изображенной на фиг. 3. Рентгеновскую порошковую дифрактометрию осуществляли с использованием Cu в качестве источника излучения. Предлагаемый способ позволяет получать кристаллические формы хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP с повышенной устойчивостью и чистотой. 7 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 627 354 C2

1. Способ изготовления кристаллической формы хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP (N,N,N-триметил-2,3-бис[[(9Z)-1-оксо-9-октадеценил]окси]-1-пропанаминийхлорид), содержащий кристаллизацию хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP из одного или более апротонных растворителей, в котором кристаллический хлорид (2R,S)-DOTAP имеет одну из следующих характеристик:

значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 и 25,2; или

значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 6,5, 12,6, 13,4, 19,5, 20,2, 21,5, 25,2 и 29,8; или

рентгеновскую порошковую дифрактограмму, соответствующую дифрактограмме, изображенной на фиг. 1;

или

кристаллический хлорид (2S)-DOTAP имеет одну из следующих характеристик:

значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 12,8, 19,5, 19,8, 20,2 и 21,6;

значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 6,5, 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, 20,7, 21,6 и 25,3; или

рентгеновскую порошковую дифрактограмму, соответствующую дифрактограмме, изображенной на фиг. 2;

или

кристаллический хлорид (2R)-DOTAP имеет одну из следующих характеристик:

значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 12,8, 19,5, 19,8, 20,3 и 21,6;

значения 2 тета, включающие по меньшей мере значения, составляющие 6,6, 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, 20,8, 21,6 и 25,3; или

рентгеновскую порошковую дифрактограмму, соответствующую дифрактограмме, изображенной на фиг. 3,

где рентгеновскую порошковую дифрактометрию осуществляли с использованием Cu в качестве источника излучения, и

кристаллизация происходит посредством медленного охлаждения от 35°С до -12°С на протяжении периода времени, составляющего 12 ч, или посредством медленного охлаждения от температуры ниже чем 35°С на протяжении периода времени, составляющего от 10 до 50 ч.

2. Способ в соответствии с п.1, где один или более апротонных растворителей содержит один или более протонных растворителей.

3. Способ в соответствии с п.1 или 2, где кристаллизация происходит в инертной атмосфере.

4. Способ в соответствии с п.1 или 2, где кристаллизацию проводят непосредственно из реакционного раствора без предварительной очистки, где реакционный раствор является раствором из способа изготовления хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP.

5. Способ в соответствии с п.1 или 2, который дополнительно содержит вторичную кристаллизацию кристаллического хлорида (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP.

6. Способ в соответствии с п.1 или 2, где кристаллический хлорид (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP имеет устойчивость, которая составляет выше чем 99 мас.%, и % площади пика, определенные посредством ВЭЖХ, когда его хранят при температуре 25°С на протяжении 36 месяцев или при температуре 40°С на протяжении 12 месяцев.

7. Способ в соответствии с п.1 или 2, где кристаллический хлорид (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP имеет химическую чистоту, которая составляет по меньшей мере приблизительно 95%, определенную посредством ВЭЖХ.

8. Способ в соответствии с п.1 или 2, где кристаллический хлорид (2R,S)-, (2S)- или (2R)-DOTAP имеет температуру плавления, которая составляет выше чем 160°С, и энтальпию плавления, которая составляет более чем -130 Дж/г.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2627354C2

Пломбировальные щипцы 1923
  • Громов И.С.
SU2006A1
US 5264618 A, 23.11.1993
Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор 1923
  • Петров Г.С.
SU2005A1
НОВЫЕ КАТИОННЫЕ И ПОЛИКАТИОННЫЕ АМФИФИЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ РЕАГЕНТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 1996
  • Эрхард Фернхольц
  • Херберт Фон Дер Эльтц
  • Маттиас Хинцпетер
RU2179549C2

RU 2 627 354 C2

Авторы

Плачер Михаэль Вильхельм

Хедингер Альфред

Даты

2017-08-07Публикация

2012-05-02Подача