Применение штамма микроорганизма Bacillus megaterium 2-06-TS1 в качестве продуцента серотонина Российский патент 2025 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 №В - 12402 может быть использован для получения серотонина.

Серотонин - это один из основных нейромедиаторов. Серотонин относится к моноаминам, как и норадреналин, дофамин и гистамин. Моноамины не только поддерживают гомеостаз, но и регулируют поведение организма. По химическому строению серотонин относится к биогенным аминам, классу триптаминов.

Известен способ получения серотонина и его водорастворимых фармакологически приемлемых солей, включающий стадию каталитического восстановления в токе водорода при повышенном давлении бензилоксипроизводных индола в присутствии палладиевого катализатора и спиртового растворителя, с последующим выделением полученного основания и при необходимости переводом его в фармакологически приемлемую соль, отличающийся тем, что в качестве бензилоксипроизводных индола используют 5-бензилокситриитамин или 5-бензилокси-3-(2-нитроэтил)индол, в качестве катализатора используют 10% палладий на активированном угле и процесс ведут при давлении 20-30 атм (патент РФ RU 2227140 С1).

Недостатками выше указанного способа является сложность его технического выполнения, высокая себестоимость и большая трудоемкость.

Задачей технического решения является совершенствование способа производства серотонина путем использования штамма микроорганизма для его получения биотехнологическим способом.

Поставленная задача решается благодаря тому, что применяется штамм микроорганизма Bacillus megaterium 2-06-TS1, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за №В-12402, в качестве продуцента серотонина.

Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за №В-12402 (копия справки о депонировании прилагается). Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 выделен из многолетнемерзлых пород (отгорфованая глина), отобранных из бурового керна с глубины 10 м при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область). Координаты скважины N 65.02.489, Е 77.29.998.

Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006)) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 18-24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 №В-12402: каталаза +, оксидаза +, рост на среде ЖСА +, лецитиназа-, желатиназа-, рост на кровяном агаре +, гемолиз +, рост на среде МПБ +, рост на среде МПА +, рост на среде Сабуро -, анаэробный рост -, рост на цитратной среде +, глюкоза К +, манит К +, арабиноза КГ +, ксилоза К +, крахмал -, казеин +, восстановление нитратов +, сероводород -, индол -.

Чувствительность к антибиотикам: штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 №В-12402. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, налидиксовой кислоте, стрептомицину и условно чувствителен к эритромицину и линкомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 №В-12402 в холодильнике (2-5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 №В-12402 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1, №В-12402 был проверен на способность продуцировать серотонин.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus megaterium 2-6-TS1 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в пробирки на скошенный, приготовленный стандартным методом, питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°С. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной водой. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3×10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию бактериальных клеток в дистиллированной воде инкубировали в термостате при t=26°С в течение 3 суток, после чего ее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант использовали в реакции иммуноферментного анализа.

Определение серотонина осуществляли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). По данным С.Д. Зайко, ведущего специалиста по продукции ЗАО «АНАЛИТИКА», сравнительные исследования показывают высокую степень корреляции результатов ИФА с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии (Определение биогенных аминов в лабораторной практике. С.Д. Зайко / Клинико-лабораторный консилиум, 2009, том 4 (29), с. 54-60.)

Для определения серотонина использовали «Набор реагентов для определения серотонина в сыворотке крови и тромбоцитах (Strotonin ELISA Fast Тгаск)»; номер по каталогу: ВАЕ-8900; производитель Labor Diagnostika nord GmbH & Co.Kg, Германия.

Определение концентрации серотонина в супернатанте клеток бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 производилась в четырех независимых пробах.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS vcr. 11.5. for Windows».

Результаты измерений концентрации серотонина приведены в таблице 1.

Референтное значение содержания серотонина в сыворотке крови здорового человека 50-270 нг/мл.

Результаты определения концентрации серотонина в супернатанте клеток бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 показали, что они находятся на уровне референтных значений концентраций данных веществ в биологических жидкостях здорового человека.

Заявленное изобретение позволяет использовать штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 в разработке биотехнологических процессов в качестве продуцента серотонина и для создания биопрепаратов на его основе с направленным действием.

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к применению штамма микроорганизма Bacillus megaterium 2-06-TS1. Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 выделен из многолетнемерзлых пород (оторфованная глина), отобранных из бурового керна с глубины 10 м при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область). Координаты скважины N 65.02.489, Е 77.29.998. Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за № В-12402. Штамм применяется в качестве продуцента серотонина. 1 табл.

Применение штамма микроорганизма Bacillus megaterium 2-06-TS1, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за № В-12402, в качестве продуцента серотонина.