Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 - продуцент кортизола Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402 может быть использован для получения кортизола.

Кортизол относится к группе глюкокортикоидов. В основном их получают синтетическим и полусентетическим путем (Лавин Н. Эндокринология. Практическое руководство Москва. - "Практика". - 1999. - 1128 с. Перевод с английского: В.И. Кандрор, Э.А. Антух, Т.Г. Горлина.).

Известны микробиологические способы получения кортизола с использованием гриба Tieghemella orchidie шт. 233 (Патент №370229), Mycobaterium globiforme 193 (Патент № SU(11)376440), Arthrobacter globiformis 193 (Патент №2156302), Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces и др. (Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York. 1967, pp. 236-261), Nocardioides simplex В KM Ас-2033Д (Патент №RU 2447154), а также Bacillus cereus 9-08-CH9 №-12401 (Патент №RU 2732611).

Во всех приведенных выше патентах получение конечного глюкокортикоида достигается микробиологической биотрансформацией стероидов, введенных в питательную среду различных микроорганизмов. По завершению процесса биотрансформации конечный продукт выделяют различными биохимическими методами. Сами микроорганизмы, используемые для биотрансформации стероидов, осуществляют дегидрирование стероидов и не являются продуцентами глюкокортикостероидов. Недостатками выше указанных способов является сложность их технического выполнения, высокая себестоимость и большая трудоемкость.

Задачей технического решения является совершенствование способа производства кортизола путем использования штамма микроорганизма для его получения биотехнологическим способом.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в качестве продуцента кортизола используется выделенный из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1.

Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика за № В-12402 (копия справки о депонировании прилагается). Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 выделен из многолетнемерзлых пород (отторфованная глина), отобранных из бурового керна с глубины 10 м при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область). Координаты скважины N 65.02.489, Е 77.29.998.

Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006)) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 18-24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402: каталаза+, оксидаза+, рост на среде ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, рост на кровяном агаре+, гемолиз+, рост на среде МПБ+, рост на среде МПА+, рост на среде Сабуро-, анаэробный рост-, рост на цитратной среде+, глюкоза К+, манит К+, арабиноза КГ+, ксилоза К+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.

Чувствительность к антибиотикам: штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, налидиксовой кислоте, стрептомицину и условно чувствителен к эритромицину и линкомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402 в холодильнике (2°С - 5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1, № В-12402 был проверен на способность продуцировать кортизол.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в пробирки на скошенный, приготовленный стандартным методом, питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°С. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3×10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию бактериальных клеток в дистиллированной воде инкубировали в термостате при t=26°С. в течение 3х суток, после чего ее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант использовали в реакции иммуноферментного анализа.

Определение кортизола осуществляли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). По данным С.Д. Зайко, ведущего специалиста по продукции ЗАО «АНАЛИТИКА», сравнительные исследования показывают высокую степень корреляции результатов ИФА с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии (Определение биогенных аминов в лабораторной практике. С.Д. Зайко/ Клинико-лабораторный консилиум, 2009, том 4 (29), с. 54-60.)

Для определения кортизола использовали «Набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации кортизола в сыворотке крови», КОРТИЗОЛ-ИФА-БЕСТ, набор реагентов Х-3964, производства АО «ВЕКТОР-БЕСТ», г. Новосибирск. Инструкция по применению утверждена 03.03.2011, Приказом Росздравнадзора №960-Пр/11.

Определение концентрации кортизола в супернатанте клеток бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 производилась в четырех независимых пробах.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS ver. 11.5. for Windows».

Результаты измерений концентрации кортизола приведены в таблице 1.

Референтное значение содержания кортизола в сыворотке крови здорового человека 160-670 нмоль/л.

Результаты определения концентрации кортизола в супернатанте клеток бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS 1 показали, что они находятся на уровне референтных значений концентраций данных веществ в биологических жидкостях здорового человека.

Заявленное изобретение позволяет использовать штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 в разработке биотехнологических процессов в качестве продуцента кортизола и для создания биопрепаратов на его основе с направленным действием.

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штамму микроорганизмов Bacillus megaterium 2-06-TS1 в качестве продуцента кортизола. Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 выделен из многолетнемерзлых пород (отторфованная глина), отобранных из бурового керна с глубины 10 м при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область). Координаты скважины N 65.02.489, Е 77.29.998. Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика за № В-12402. 1 табл.

Применение штамма микроорганизма Bacillus megaterium 2-06-TS1, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за № В-12402, в качестве продуцента кортизола.