МЕТОДОЛОГИЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ IN VITRO ВРЕМЕНИ АБСОРБЦИИ IN VIVO БИОЛОГИЧЕСКИ АБСОРБИРУЕМЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ИМПЛАНТАТОВ И УСТРОЙСТВ Российский патент 2017 года по МПК A61F2/02 G01N33/44 

Перекрестные ссылки на смежные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент № 61/565856, поданной 1 декабря 2011 г.

Область техники

Область, к которой относится настоящая заявка на патент, относится к способам прогнозирования времени абсорбции in vivo биологически абсорбируемых полимерных имплантатов и медицинских устройств, более конкретно - к способам испытаний in vitro, предназначенным для прогнозирования времени абсорбции in vivo биологически абсорбируемых полимерных имплантатов и медицинских устройств у человека и млекопитающих.

Предпосылки создания изобретения

Известно, что биологически абсорбируемые полимеры широко применяются в медицине. Они особенно подходят для применения в качестве хирургических имплантатов и медицинских устройств. Биологически абсорбируемые полимерные материалы выполнены с возможностью придания соответствующей прочности и сохранения механических свойств in vivo, что способствует выполнению функции имплантата или медицинского устройства в процессе заживления при одновременном разложении с контролируемой и желательной скоростью таким образом, что устройство по существу удаляется из тела пациента после естественного заживления, когда имплантат или устройство больше не требуется. Хирургические имплантаты и медицинские устройства, полученные из биологически абсорбируемых полимеров, часто обеспечивают наилучший исход заболевания у пациента.

Синтетические абсорбируемые полимеры являются важным классом материалов, применяемых в составе различных имплантируемых медицинских устройств. Многие из данных устройств, такие как хирургический шовный материал и хирургические сетки, используют для закрытия мягких тканей раны. Кроме того, такие полимеры применяют в ортопедии для твердых тканей (например, костной ткани), включая устройства фиксации, такие как штифты, винты, пластины, шовные фиксаторы и шовные материалы с более длительным периодом эксплуатации.

Медицинские устройства, полученные из синтетических абсорбируемых полимеров, можно разделить на волокнистые и неволокнистые продукты. Волокнистые продукты включают шовные материалы (как в монофиламентной форме, так и в мультифиламентной форме) и продукты из сетки (на основе трикотажных, тканых и нетканых структур). В таблице 1 (представленной ниже в настоящем документе) перечислены некоторые из разнообразных продуктов на основе волокна, полученные из синтетических абсорбируемых полимеров. Данные волокна по существу получены способами стандартной экструзии расплава и ориентации.

Другой класс (неволокнистые продукты) часто получают способом литья под давлением. В таблице 2 (представленной ниже в настоящем документе) перечислены многие из данных типов неволокнистых устройств. Они включают шовные фиксаторы, костные штифты и пластины, легирующие скобы и заклепки. В дополнение к устройствам, ценность которых заключается в высоких механических свойствах, существуют устройства, ценность которых основана на характеристиках диффузии, такие как носители и защитные слои, применяемые в устройствах контролируемой доставки лекарственного средства, часто в качестве покрытий, микросфер или микрокапсул.

Мировой рынок медицинских устройств, в основе которых лежит данный класс полимеров, огромен и продолжает расширяться, что сопровождается появлением новых перспективных сфер применения, отвечающих неудовлетворенным потребностям пациентов. Данные новые сферы могут включать применение указанных материалов в качестве каркасов для клеточной трансплантации и культивирования тканей в регенеративной медицине. Существующие материалы могут не отвечать всем требованиям, которые будут возникать перед данной областью в будущем. Ученые-материаловеды продолжают работать над улучшением эксплуатационных характеристик данных биологически абсорбируемых материалов и устройств и стремятся придать им более эффективные механические свойства, такие как усиленная прочность и/или жесткость, или обеспечить более длительное сохранение данных механических свойств и срок эксплуатации in vivo.

По ряду причин важно уметь прогнозировать время абсорбции in vivo биологически разлагаемых полимерных имплантатов и медицинских устройств. Между периодом времени, в течение которого имплантаты могут сохранять свою прочность и механические свойства in vivo, и периодом времени, в течение которого процесс заживления достигает состояния, когда ткань способна восстановить свое нормальное функционирование, должна существовать определенная степень корреляции. Преждевременная абсорбция и утрата механической прочности и других механических свойств может привести к катастрофическим последствиям, которые повлекут за собой причинение вреда здоровью пациента или возникновение опасного для жизни последствия, что потребует немедленного медицинского вмешательства. Кроме того, целесообразно разработать имплантат или устройство, имеющее минимальную массу, необходимую для корректного функционирования в процессе заживления.

При разработке новых абсорбируемых полимеров для медицинских устройств и имплантатов ключевым вопросом является продолжительность периода времени, необходимого для того, чтобы материал исчез в теле пациента, т. е. абсорбировался. С решением данного вопроса связано стремление к созданию медицинских устройств и имплантатов из биологически абсорбируемых полимеров, которые имеют желательные характеристики абсорбции in vivo. Окончательный ответ на данный вопрос обычно дают доклинические исследования с использованием материалов, меченных радиоактивным изотопом, которые позволяют отследить абсорбцию, распределение, метаболизм и экскрецию данных материалов и продуктов разложения. Побочные продукты гидролиза могут превращаться в CO₂ и выдыхаться, либо выводиться с мочой или фекалиями. Материалы, меченные радиоактивным изотопом, также можно использовать для определения метаболических путей или расположения материалов, т. е. выявления того, действительно ли побочные продукты выводятся или секвестрируются в органах-мишенях. Другие важные средства исследования биологической абсорбции включают гистологические исследования, в ходе которых выполняют измерение площади сечения имплантата в зависимости от времени. Конечно, гистологические исследования также дают важную информацию о реакции ткани, которую вызывает имплантат.

Традиционные способы оценки скорости биологической абсорбции in vivo являются дорогими, занимают много времени и определенно требуют использования лабораторных животных. Для получения одобрения регулирующих органов, а также для демонстрации безопасности и эффективности может быть достаточно доклинических испытаний; однако возможны случаи, когда потребуются клинические исследования с участием человека. В случае исследований с применением радиоактивных меток, как правило, необходимо синтезировать и тщательно очистить мономер C₁₄, меченный соответствующим образом. Затем мономер следует подвергнуть безопасной полимеризации, а полученный радиоактивный полимер превратить в образец для испытания, обладающий соответствующими механическими свойствами. В случае шовного материала потребуется, как правило, прочное, правильно ориентированное волокно.

В целом, принимая во внимание гуманистический аспект, испытания in vitro являются более предпочтительными, чем исследования на животных, при условии получения подходящих достоверных данных. Кроме того, хотя данные, полученные при испытаниях in vitro, могут быть собраны в условиях, имитирующих физиологические, также желательно получать такие данные ускоренным образом. В некоторых случаях испытания можно ускорить посредством изменения температуры, pH, других параметров или их комбинаций для более быстрого получения данных, чем при испытаниях в режиме реального времени. Продолжительность цикла разработки продукта потенциально можно сократить, получив ранние сведения об эксплуатационных характеристиках независимо от того, касаются они композиции полимера или производственных условий, в которых осуществляется получение продукта.

Очевидно, возможность оценить скорость разложения нового биологически абсорбируемого материала, будь то иной химический состав или измененная морфология полимера, без необходимости применения радиоактивных меток или гистологических исследований является преимущественной. Известно, что биологическое разложение абсорбируемых сложных полиэфиров, используемых в медицинских устройствах, происходит путем гидролиза сложноэфирных связей с образованием побочного продукта в виде кислоты. Образование кислотных групп может быть безвредным для окружающей ткани, если биологические механизмы организма способны соответствующим образом нейтрализовать их по мере их образования. Однако если материал подвергают слишком быстрому гидролизу, ткани в месте расположения имплантата могут не справляться с поддержанием соответствующего pH, таким образом вызывая чрезмерное воспаление (1).

Как отмечено выше, химический состав и морфология полимера влияют на эксплуатационные характеристики устройства. Важно отметить, что клинически значимые характеристики включают стабильность размеров, механические свойства, скорость утраты механических свойств после имплантации и скорость абсорбции. Химический состав играет определяющую роль в определении скорости гидролиза; в свою очередь скорость гидролиза существенно влияет на характеристики абсорбции ткани и биологическую совместимость.

Однако химический состав не является единственным фактором, который влияет на эксплуатационные характеристики. Образцы одного и того же полимера, неразличимые по всем своим химическим свойствам, с одинаковым распределением молекулярной массы могут вести себя совершенно по-разному с точки зрения биологических и механических характеристик, если они имеют разную морфологию полимера. Морфология полимера относится к форме или характеру сборки макромолекулярных цепей; в очень упрощенном варианте под морфологией может пониматься степень кристалличности. Однако в дополнение к относительному количеству кристаллической и аморфной фаз морфологическая характеристика полукристаллического полимера включает величину имеющейся молекулярной ориентации (как кристаллической, так и аморфной), характер кристаллической структуры и распределение кристаллов по размеру. На данные характеристики обычно влияют термические, механические условия или напряжение, которым подвергался полимер при обработке и производстве устройства.

Следует признать, что описанные взаимосвязи являются сложными: химический состав и обработка влияют на морфологию; химический состав и морфология влияют на скорость гидролиза, а скорость гидролиза влияет на биологическую эффективность. Таким образом, очень важно в полной мере охарактеризовать абсорбируемое медицинское устройство или имплантат в отношении композиции и морфологии и выяснить влияние данных факторов на время абсорбции in vivo.

На протяжении многих лет для отслеживания разложения абсорбируемых сложных полиэфиров использовали различные стандартные методики. Некоторые исследования in vivo были направлены на изучение утраты механических свойств с течением времени после имплантации. Особое значение в отношении шовного материала имели исследования утраты прочности на разрыв с течением времени; их часто упоминают как исследования сохранения прочности на разрыв (BSR). Кроме исследований BSR in vivo описаны и известны испытания в режиме реального времени (а также проводимые ускоренным образом) in vitro. Однако с помощью данных способов невозможно прогнозировать время абсорбции in vivo. Для изучения вопросов абсорбции посредством методологий in vitro ученые проводили исследования потери массы. Недостатком данного подхода является снижение точности в случаях, когда материал утрачивает механическую целостность и начинает рассасываться на все более мелкие фрагменты, что приводит к сложностям оценки фильтрования и массы. Другие используемые способы включают отслеживание изменений молекулярной массы в зависимости от времени (2). Однако применение данного подхода на постоянной основе является обременительным. Авторы Sawhney и Hubble (3) описали способ, специфичный в отношении растворимых продуктов разложения молочной кислоты.

Хорошо известно, что отлеживать сложноэфирный гидролиз органических соединений можно путем титрования в водной среде (4-11). Также титрование используют для получения информации о гидролизе ряда полифосфатов (12). Tunc и соавторы (13) описали применение ускоренного титрования рН-статом in vitro для оценки времени абсорбции альфа-гидроксиэфирных полимеров in vivo. Однако их методология не позволяла сравнивать результаты испытаний in vitro с абсорбцией in vivo разнообразных абсорбируемых материалов. Они исследовали только полимеры и сополимеры лактида и гликолида. В отсутствие пластификатора температуры стеклования полимеров и сополимеров лактида и гликолида (включая остаточный мономер) находятся в диапазоне от приблизительно 40°C до 65°C, что существенно превышает температуру тела. Авторы ограничили свой способ испытаний температурами ниже температуры стеклования исследованных полимеров. Данное ограничение температуры испытаний до низких значений существенно снижает возможность ускоренного сбора данных. Чтобы компенсировать данный недостаток, Tunc и соавторы использовали линейную экстраполяцию данных, соответствующих начальному времени гидролиза, для уменьшения продолжительности испытаний. Сбор данных только на раннем этапе гидролиза может оказаться неприемлемым для абсорбируемых материалов, имеющих сложную морфологию, когда желательно спрогнозировать общее время абсорбции. Другая проблема, связанная с использованием только тех данных, которые были собраны на ранних этапах гидролиза, возникает, когда образец для испытания содержит полимер со сложным распределением последовательностей. Для примера можно рассмотреть блок-сополимер A-B эпсилон-капролактона и гликолида в соотношении 80/20 (% мол.). В данном случае связаны все последовательности капролактона, а также последовательности гликолида. Оценка времени абсорбции способом, предложенным Tunc, привела бы к существенному преуменьшению количества времени, необходимого для полной абсорбции in vivo. Это происходит из-за того, что последовательности гликолида подверглись бы гидролизу значительно раньше последовательностей эпсилон-капролактона, оставив массу поли(эпсилон-капролактона) относительно целой.

Ограничение условий испытания температурами ниже температуры стеклования (Tg) полимеров было бы затруднительным в случае абсорбируемых полимеров с низкими температурами стеклования, такими как поли-п-диоксанон. Поскольку все монофиламентные шовные материалы имеют температуры стеклования ниже комнатной температуры, данный важный класс продуктов невозможно было бы испытать способом, предложенным Tunc, с учетом его ограничений.

Другую известную методику титрования используют для исследования ферментативного расщепления полигидроксибутиратов (14), а также для исследования гидролиза сложных полиэфиров с короткими цепями (15).

Хотя стандартные способы испытаний in vitro используют для приблизительного предсказания биологической абсорбции материала in vivo, существуют различия, связанные с их применением. С помощью некоторых существующих способов невозможно ускоренно собрать данные. Это особенно затруднительно в отношении полимеров, имеющих длительное время абсорбции. Примером данного класса материалов являются продукты на основе полимеризованного лактида; соответствующие устройства часто применяют в ортопедии. Готовый способ оценки времени абсорбции ускоренным образом сокращает время разработки и способствует оптимизации продукта. Очевидно, что с точки зрения гуманности испытания in vitro являются более предпочтительными, чем испытания in vivo, так как существенно уменьшают или даже устраняют необходимость использования животных. Затраты, связанные с испытаниями in vivo, значительно больше затрат, связанных с испытаниями in vitro. Как указано выше, существующие способы испытаний in vitro чреваты возникновением сложностей при проведении экспериментов и характеризуются низкой точностью.

Соответственно, в данной области существует потребность в новых способах испытаний in vitro биологически абсорбируемых имплантатов и медицинских устройств, которые быстро, гуманно, экономично, точно и воспроизводимо прогнозируют время биологической абсорбции in vivo.

Изложение сущности изобретения

В настоящем документе описана новая методология in vitro прогнозирования времени абсорбции in vivo биологически абсорбируемых полимерных имплантатов и медицинских устройств. Способ обеспечивает прогнозирование времени абсорбции in vivo синтетических абсорбируемых полимеров, образованных из них имплантатов и медицинских устройств, которые содержат гидролизуемые связи в полимерной цепи, на основании исследования in vitro. Способ включает следующие стадии:

(a) проведение гидролиза известного количества образца для испытания при известном времени абсорбции in vivo, при по существу постоянном значении pH и по существу постоянной температуре испытаний, которая равна или больше температуры тела, с использованием известной концентрации титрующего основания, и регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени;

(b) регистрация времени, необходимого для достижения постоянного уровня степени гидролиза образца для испытания, где указанная степень гидролиза составляет 70 процентов или более;

(c) повторение стадий (a) и (b) при условиях испытания, выбранных для стадий (a) и (b), с использованием по меньшей мере одного отличного образца для испытания с другим известным временем абсорбции in vivo;

(d) построение корреляционной кривой in vivo - in vitro, отражающей зависимость времени абсорбции in vivo от времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (b);

(e) проведение гидролиза известного количества образца для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo при условиях испытания, выбранных для стадий (a) и (b), с использованием известной концентрации титрующего основания, и регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени; и

(f) прогнозирование времени абсорбции in vivo по корреляционной кривой, построенной на стадии (d), и времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (e).

Другим аспектом настоящего изобретения является новая методология in vitro прогнозирования времени абсорбции in vivo биологически абсорбируемых полимерных имплантатов и медицинских устройств. Способ обеспечивает прогнозирование времени абсорбции in vivo синтетических абсорбируемых полимеров, образованных из них имплантатов и медицинских устройств, которые содержат гидролизуемые связи в полимерной цепи, на основании исследования in vitro. Способ включает следующие стадии:

(a) проведение гидролиза известного количества образца для испытания при известном времени абсорбции in vivo, при по существу постоянном значении pH и по существу постоянной температуре испытаний, которая равна или больше температуры тела, с использованием известной концентрации титрующего основания, и регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени;

(b) регистрация времени, необходимого для достижения постоянного уровня степени гидролиза образца для испытания, где указанная степень гидролиза составляет 70 процентов или более;

(c) построение корреляционной кривой in vivo - in vitro, отражающей зависимость времени абсорбции in vivo от времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (b);

(d) проведение гидролиза известного количества образца для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo при условиях испытания, выбранных для стадии (a) и (b), с использованием известной концентрации титрующего основания, и регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени; и

(e) прогнозирование времени абсорбции in vivo по корреляционной кривой, построенной на стадии (c), и времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (d).

Данные и другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут более понятными после изучения следующего описания и прилагаемых чкртежей.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен график точности определения профиля гидролиза: шесть повторов гидролиза 80 мг мономера гликолида. Экспериментальные условия: pH 7,27, 75 мл воды, 0,05 N NaOH и 75°C. График динамики титрования, или «профиль гидролиза».

На фиг. 2 представлены профили гидролиза 100 мг гликолида в 75 мл воды при pH 7,27 с 0,05 N NaOH и выбранных температурах.

На фиг. 3 представлен график кинетики гидролиза гликолида при pH 7,27 и выбранных температурах.

На фиг. 4 представлен график Аррениуса константы скорости гидролиза линейных димеров гликолевой кислоты.

На фиг. 5 представлены профили гидролиза мономеров гликолида и лактида при pH 7,27 и температуре 75°C.

На фиг. 6 представлен график, отражающий температурную зависимость полупериода гидролиза шовных материалов VICRYL™ и VICRYL RAPIDE™.

На фиг. 7 представлены профили гидролиза выбранных шовных материалов ETHICON (100 мг каждого шовного материала).

На фиг. 8 представлена корреляция между временем абсорбции in vivo и in vitro для выбранных шовных материалов ETHICON.

На фиг. 9 представлена зависимость времени гидролиза шовного материала при температуре 75°C от диаметра волокна монофиламентного шовного материала MONOCRYL.

На фиг. 10 представлен график зависимости сохранения прочности на разрыв (BSR) шовного материала от степени образования группы карбоновой кислоты.

Подробное описание изобретения

Следует отметить, что в настоящем документе термины «абсорбируемый» и «биологически абсорбируемый» применительно к синтетическим полимерам являются взаимозаменяемыми. Способ получения профиля гидролиза предполагает регистрацию количества основания, необходимого для поддержания водной среды при выбранном значении pH, в зависимости от времени в ходе сложноэфирного гидролиза. Таким образом, его можно использовать для определения времени, необходимого для получения относительной доли гидролиза, включая полный гидролиз. Специалистам в данной области будет понятно, что для осуществления способа, составляющего предмет настоящего изобретения, можно использовать стандартное оборудование. Оборудование может включать, например, pH-зонд, стеклянные сосуды с регулируемой температурой, автоматические дозирующие системы, возможность регистрации данных и удаленного управления приборами и т. п., а также их эквиваленты. Управление, сбор данных, а также анализ и презентацию можно осуществлять с помощью стандартных и/или персонализированных компьютеров и стандартного и/или персонализированного программного обеспечения и их эквивалентов.

Способ заключается в гидролитическом разложении образца для испытания при поддержании значения pH. Этого достигают путем титрования стандартным основанием и измерения количества использованного основания в зависимости от времени. Измерение и титрование автоматизированы для удобства пользователя.

В рамках нового способа, составляющего предмет настоящего изобретения, манипуляции in vitro проводят для полного гидролиза абсорбируемого сложнополиэфирного хирургического имплантируемого устройства, такого как шовный материал, при постоянном значении pH и повышенной температуре. Также необходимо признать, что проведение полного гидролиза не всегда необходимо, однако предпочтительными являются степени гидролиза более приблизительно 90%. Этого можно достичь с использованием стандартной круглодонной колбы с несколькими горловинами, оборудованной pH-зондом, регулятором температуры и управляемым устройством подачи разбавленного раствора гидроксида натрия через трубку Teflon^®. В данный реактор, первоначально содержащий только дистиллированную воду, добавляют абсорбируемый сложнополиэфирный хирургический шовный материал (или другой абсорбируемый образец для испытания). Данные можно регистрировать вручную или с помощью компьютера. В предпочтительном варианте осуществления установка включает электронный регулятор, который принимает сигнал от измерителя pH и заставляет клапан с тефлоновым покрытием магистрали Teflon^® открываться для титрования реакции с сохранением постоянного, заранее определенного значения pH. В ходе гидролиза абсорбируемого сложнополиэфирного шовного материала (или биологически абсорбируемого полимерного образца для испытания) образуются кислотные группы, поступательно снижающие значение pH, что отражено в показаниях pH-зонда. Затем регулятор открывает электронно-управляемый клапан с тефлоновым покрытием, обеспечивая подачу основания для титрования смеси, что приводит к восстановлению заданного значения pH. Контейнер с разбавленным раствором гидроксида натрия устанавливают на электронных весах с возможностью мониторинга снижения массы по мере поглощения раствора NaOH во время гидролиза. Таким образом, посредством наблюдений и ручной регистрации данных можно отслеживать степень гидролиза в зависимости от времени. Благодаря применению компьютерного управления основная методология была усовершенствована для удобства пользователя, а также точности и стандартизации. Специалистам в данной области будет понятно, что при желании процедуру можно выполнять вручную без автоматических регуляторов, хотя это и не является предпочтительным вариантом.

Методологии, составляющие предмет настоящего изобретения, можно применять в отношении полимеров, содержащих сложные эфиры в главной цепи. В модифицированном виде указанные способы также можно применять для получения представления о разложении потенциальных полимерных систем, например таких, которые содержат сложные эфиры в боковых группах. Гидролиз сложного эфира боковой группы может привести к растворению сегмента цепи или в других случаях (в зависимости от химического состава) - к разложению основной цепи из-за локальных изменений pH, т. е. к так называемому «эффекту соседней группы».

Способ определения профиля гидролиза, представленный в настоящем документе, применим к стандартным синтетическим абсорбируемым сложным полиэфирам, полиангидридам и другим полимерам со связями, подверженными гидролитическому разложению, а также их эквивалентам, которые образуют кислотные продукты разложения.

Биологически абсорбируемые полимеры, пригодные для получения устройств, которые можно испытывать в соответствии со способом, составляющим предмет настоящего изобретения, включают стандартные биологически совместимые, биологически абсорбируемые полимеры, включая полимеры, выбранные из группы, состоящей из алифатических сложных полиэфиров, поли(аминокислот), сополимеров сложных и простых эфиров, полиалкиленовых оксалатов, полиалкиленовых эфиров дигликолевой кислоты, полиамидов, полученных из тирозина поликарбонатов, поли(иминокарбонатов), полиортоэфиров, полиоксиэфиров, полиамидоэфиров, полиоксиэфиров, содержащих аминогруппы, полиангидридов, полифосфазенов, полипропиленфумаратов, абсорбируемых сложных полиэфируретанов и их комбинаций и смесей, а также эквивалентов. Полиоксиэфиры включают полимеры на основе 3,6-диоксиоктандикарбоновой кислоты, 3,6,9-триоксиундекандикарбоновой кислоты и двухосновной кислоты, известной как двухосновная полигликолевая кислота, которые можно получить путем окисления низкомолекулярного полиэтиленгликоля.

Подходящие полимеры могут быть гомополимерами или сополимерами (статистическими, блочными, сегментированными, сужающимися блочными, привитыми, трехблочными и т. п.), имеющими линейную, разветвленную или звездообразную структуру. Подходящие мономеры для получения подходящих полимеров могут содержать один или более следующих мономеров: молочную кислоту (включая L-молочную кислоту и D-молочную кислоту), лактид (включая L-, D-, мезо- и D, L-смеси), гликолевую кислоту, гликолид, ε-капролактон, п-диоксанон (1,4-диоксан-2-он), триметиленкарбонат (1,3-диоксан-2-он), δ-валеролактон, ε-декалактон, 2,5-дикетоморфолин (морфолиндион), пивалактон, α,α-диэтилпропиолактон, этиленкарбонат, этиленоксалат, 3-метил-1,4-диоксан-2,5-дион, 3,3-диэтил-1,4, диоксан-2,5-дион, γ-бутиролактон, 1,4-диоксепан-2-он, 1,5-диоксепан-2-он, 6,6- диметилдиоксепан-2-он, 6,8-диоксибициклоктан-7-он или их комбинации. Следует понимать, что способы, составляющие предмет настоящего изобретения, можно применять и в отношении смесей полимеров.

В альтернативном варианте осуществления биологически абсорбируемые полимеры могут быть компонентом поперечносшитой сети. Другими словами, подходящие полимеры также включают поперечносшитые полимеры и гидрогели, содержащие гидролизуемые сложноэфирные или ангидридные группы. Следует понимать, что типовые биологически абсорбируемые, биологически совместимые полимеры могут быть по существу синтезированы методом полимеризации с раскрытием цикла соответствующих мономеров лактона или поликонденсации соответствующих гидроксикислот, либо с помощью комбинаций двух данных методологий полимеризации.

При разработке новых абсорбируемых полимеров для медицинских устройств и имплантатов ключевым вопросом является продолжительность периода времени, необходимого для того, чтобы материал исчез в теле пациента, т. е. абсорбировался. С решением данного вопроса связано стремление к созданию медицинских устройств и имплантатов из биологически абсорбируемых полимеров, которые имеют желательные характеристики абсорбции in vivo. И хотя окончательный ответ на данный вопрос обычно дают доклинические исследования с использованием материалов, меченных радиоактивным изотопом, которые позволяют отследить абсорбцию, распределение, метаболизм и экскрецию данных материалов и продуктов разложения, другие важные средства изучения биологической абсорбции включают гистологические исследования, в ходе которых выполняют измерение площади сечения имплантата в зависимости от времени. Например, в статье под названием «Monocryl^® Suture, a New Ultra-Pliable Absorbable Monofilament Suture», авторы Rao S. Bezwada, Dennis D. Jamiolkowski, In-Young Lee, Vishvaroop Agarwal, Joseph Persivale, Susan Trenka-Benthin, Modesto Erneta, Jogendra Suryadevara, Alan Yang и Sylvia Liu, опубликованной в Biomaterials, том 16, издание 15, октябрь 1995 г., стр. 1141-1148, описаны биологические характеристики монофиламентного шовного материала на основе капролактона и гликолида. Другим примером таких исследований является работа Craig, P. H., Williams, J. A., Davis, K. W., Magoun, A. D., Levy, A. J., Bogdansky, S. и Jones, J. P. Jr., описанная в статье под названием «A Biologic Comparison of Polyglactin 910 and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures» в Surg. Gynecol. Obstet., 141:1-10, 1975 г. Обе данные статьи включены в настоящий документ путем ссылки.

Как правило, характеристики абсорбируемых медицинских устройств in vivo получают в ходе доклинических исследований на крысах. Как описано выше, для описания характеристик шовного материала in vivo используют крыс Лонг-Эванс, причем шовный материал имплантируют в ягодичные мышцы, а затем удаляют в выбранные моменты времени после имплантации, препарируют и окрашивают для гистологической оценки. Таким образом, оценку абсорбции in vivo, как правило, выполняют с помощью данных моделей, отслеживая исчезновение имплантата в срезах тканей на гистологических препаратах.

Механические характеристики абсорбируемых медицинских устройств изменяются in vivo с течением времени. Характер разрушения данных устройств может зависеть от одной и более механических характеристик, например, от удлинения при растяжении на разрыв, модуля Юнга, разрывной нагрузки, характеристик восстановления или прочности на разрыв. Поскольку механические характеристики зависят от молекулярной массы, а молекулярная масса в свою очередь зависит от степени гидролиза, способ, составляющий предмет настоящего изобретения, можно использовать для прогнозирования механических свойств.

Хотя циклы определения профиля гидролиза, представленные в примерах ниже, по существу выполняли при температуре 75°C, можно применять и исследовать другие достаточно эффективные условия, включающие температуру, pH и прочие параметры, а также проводить поиск корреляций с характеристиками, демонстрируемыми in vivo (такими как время абсорбции или утрата механических свойств). Возможен широкий ряд корреляций при условии отсутствия существенных изменений основных механизмов разложения. Как правило, температурный диапазон может превышать приблизительно 37°C, более характерно - составлять от приблизительно 60°C до приблизительно 95°C, предпочтительно - от приблизительно 70°C до приблизительно 75°C, а наиболее предпочтительно - приблизительно 70°C. Как правило, диапазон pH может варьироваться от значений, превышающих приблизительно 2, до приблизительно 11, более характерно - от приблизительно 6,3 до приблизительно 8,3, а предпочтительно - приблизительно 7,3. Как правило, концентрация водного раствора титрующего основания, а именно гидроксида натрия, будет составлять от приблизительно 0,0001 N до приблизительно 1,0 N, более характерно - приблизительно 0,05 N. Как правило, постоянный уровень степени гидролиза образца для испытания будет составлять от приблизительно 90% до приблизительно 100%, более характерно - от приблизительно 95% до приблизительно 100%, предпочтительно - от приблизительно 98% до приблизительно 100%, а еще более предпочтительно - приблизительно 100%.

Предполагается, что изменения физических свойств заданного материала (таких как сохранение прочности шовного материала на разрыв) связаны с его профилем гидролиза, поскольку химическое разложение влияет на механические характеристики.

Учитывая, что несущая способность полукристаллических полимеров зависит от так называемых «связанных молекул», присутствующих в аморфной фазе, но соединяющих кристаллиты, расщепление данных молекул (а не сегментов цепей в кристаллитах) отвечает за сохранение прочности. Следовательно, предполагается, что степень гидролиза, необходимая для влияния на разрывную нагрузку полукристаллических полимеров, будет очень мала - в диапазоне нескольких первых процентов после гидролиза любого остаточного мономера. Чтобы получить данную информацию экспериментально, необходимо применять более разбавленный титрующий раствор и/или более низкую температуру испытаний, а также потенциально увеличить скорость сбора данных на ранних этапах определения профиля гидролиза. Для соотнесения ранней фазы профиля гидролиза и механических характеристик in vivo необходимо сгенерировать новый набор корреляционных кривых.

Следует понимать, что высокие температуры испытаний могут быть ограничены температурой кипения воды. В случаях, когда необходимо добиться существенного ускорения, можно использовать герметичную систему, которая позволяет создать давление, превышающее одну атмосферу.

Также следует понимать, что можно применять относительно низкие температуры испытаний при условии, что они превышают температуру тела. Данные температуры могут особенно подходить в случае легкоплавких полимеров. Дополнительно следует понимать, что в условиях, когда известна энергия активации гидролиза, данные можно собирать при заданной температуре испытаний, а прогнозирование гидролиза in vivo выполнять с помощью корреляционных кривых на основании данных, собранных in vitro при другой температуре.

Следует понимать, что образец должен быть достаточно большого размера, чтобы эффективно минимизировать отклонения в ходе эксперимента. Если размер образца слишком мал, будет наблюдаться нестабильность результатов. Следует отметить, что образцы очень больших размеров могут потребовать применения очень больших реакторов для гидролиза.

Следует понимать, что заданная корреляционная кривая должна быть построена при использовании тех же условий испытания, в которых оценивают образец для испытания.

Следует понимать, что для эффективного покрытия образца для испытания в гидролизере потребуется достаточный первоначальный объем воды. Гидролизер должен иметь свободный объем, достаточный для размещения образца для испытания, первоначального количества воды и конечного объема раствора титрующего основания.

Следует понимать, что дополнительно можно включить цветовой индикатор рН и средство мониторинга цвета для контроля титрования, которые необходимы для поддержания по существу постоянного значения pH при испытаниях.

Также следует понимать, что в случаях, где существенную роль играют реакции ферментативного расщепления, корреляция между in vitro и in vivo может не выдерживаться. В данных случаях может потребоваться добавление в реакционную среду соответствующих ферментов в подходящих количествах.

Типовой список биологически абсорбируемых медицинских устройств и имплантатов, которые можно испытывать способом, составляющим предмет настоящего изобретения, включает, без ограничений, например, устройства, перечисленные в таблицах 1 и 2, и их эквиваленты.

Одна из возможностей заключается в том, чтобы рассматривать гидролиз сложных полиэфиров как «обратную поликонденсацию». В данном случае для получения представления о способе разложения можно использовать математические соотношения химических процессов поликонденсации. Для этого необходимо дать определение термину «p», так называемой «степени завершенности реакции». В данном случае ее можно рассматривать как долю фрагментов кислотных групп, существующих как сложноэфирные группы, в отличие от свободных кислотных групп.

Зависимость степени завершенности реакции, p, и среднечисловой «степени полимеризации», DP_n, сложного полиэфира с нормальным распределением молекулярной массы выражена в следующем уравнении:

DP_n=1/(1-p)

«Степень полимеризации», DP, представляет собой количество повторяющихся звеньев в цепи; следовательно, соответствующее значение DP_n относится ко всей совокупности цепей. Для получения и сохранения высоких механических свойств средневзвешенная молекулярная масса должна превышать определенное пороговое значение.

Meng et al. (2) обнаружили эмпирическую взаимосвязь между сохранением прочности на разрыв (BSR) и молекулярной массой для экспериментального полимера для мульфиламентного шовного материала, содержащего 90% мол. гликолида и 10% мол. лактида:

BSR=a+b ln M (5)

где M - это масса или среднечисловая молекулярная масса, имеющая различные параметры «a» и «b» соответственно. Были найдены следующие параметры среднечисловой молекулярной массы M_n: a=446,17 и b=55,153 (оказалось, что параметры не зависели от температуры испытаний in vitro).

При решении уравнения 5, представленного выше, можно получить следующее выражение для M:

M=exp[(BSR-a)/b] (6)

Соотношение среднечисловой молекулярной массы и молекулярной массы повторяющегося звена и степени завершенности реакции для конденсационного полимера:

M_n=M₀/(1-p) (7)

где M₀ - это молекулярная масса повторяющегося звена, а p - степень завершенности реакции.

Для описания разложения сложных полиэфиров, где предполагается «обратная поликонденсация», можно использовать выражение

p=1-[COOH]/[COOH]_∞ (8)

где [COOH] - это концентрация групп карбоновой кислоты, образованных в ходе гидролиза сложных эфиров в любой заданный момент времени в ходе гидролитического разложения, а [COOH]_∞ - общее количество групп карбоновой кислоты, которые должны образоваться при полном гидролитическом разложении (или общее количество гидролизуемых сложноэфирных групп в полимере).

Таким образом, можно выразить M_n как:

M_n=M₀/[COOH]/[COOH]_∞ (9)

Подставляя M_n в уравнении 6, представленном выше, получаем:

M₀/[COOH]/[COOH]_∞=exp[(BSR-a)/b] (10)

При решении [COOH]/[COOH]_∞, допуская, что BSR стремится к нулю, можно получить

[COOH]/[COOH]_∞=M₀ exp[a/b] (11)

Подставляя значения M₀, a и b, получаем

[COOH]/[COOH]_∞=1,82% (12)

Таким образом, считается, что BSR уменьшается до нуля при степени гидролиза сложноэфирных групп в полимерной цепи менее 2%.

Полученное эмпирическим путем соотношение между BSR и степенью гидролиза сложного эфира (посредством преобразования уравнения 10) представлено в виде графика на фиг. 10.

Он будет понятен специалисту в данной области для установления соответствия между сохранением прочности на разрыв и степенью реакции.

Чтобы построить корреляционную кривую in vivo - in vitro (например, кривую зависимости времени абсорбции in vivo от времени гидролиза in vitro), можно использовать разнообразные способы. Выведение математического уравнения, описывающего зависимость, представляется целесообразным независимо от того, является ли она линейной или нелинейной. Если кривая реакции имеет линейный характер, общепринятой методологией получения описательного математического уравнения является выполнение линейной регрессии способом наименьших квадратов.

Новый способ или методология in vitro, составляющий предмет настоящего изобретения, который применяют для прогнозирования времени абсорбции in vivo биологически абсорбируемых полимерных имплантатов и медицинских устройств, имеет множество преимуществ. Преимущества заключаются в следующем. Было показано, что в условиях ускоренных испытаний абсорбируемые сложные полиэфиры могут отличаться степенью гидролитического разложения в зависимости от времени. Условия включают температуру, которая выше температуры тела, и не исключают использования температур, превышающих температуру стеклования полимерного образца для испытания. Специалисту в данной области будут понятны и другие способы ускорения гидролиза, где разложение может происходить при температуре тела. Данные условия включают более низкое или более высокое значение pH, чем значения, представленные в примерах. Альтернативные способы ускорения могут подходить для описания устройств, потенциально не обладающих стабильными размерами (например, в случае сжатия или плавления) при повышенных температурах.

Одно из преимуществ технологии определения профиля гидролиза заключается в том, что она может снизить необходимость исследований на животных. Например, для разработки исследования по изучению реакции ткани и абсорбции in vivo нового медицинского устройства на основе нового абсорбируемого полимера необходимо провести доклинические исследования на животных. Время достижения конечной точки в доклинических исследованиях нового материала неизвестно, поэтому требуются дополнительные группы животных для обеспечения сбора гистологических образцов в периоды всех существенных изменений материала. Определение профиля гидролиза позволит устранить необходимость в некоторых дополнительных группах животных, поскольку можно достоверно прогнозировать периоды существенных изменений материала.

Следовательно, в случаях, когда можно достоверно предсказать, что абсорбируемое полимерное медицинское устройство абсорбируется через приблизительно 180 суток после имплантации, следует учитывать периоды испытаний на животных, которые отвечают данным временным рамкам, вместо того чтобы учитывать множество произвольно выбранных периодов испытаний, которые могут не принести подходящих результатов. Таким образом, данная технология способствует разработке эффективного плана исследований на животных.

Помимо уменьшения количества животных, необходимых для проведения исследований, повышение эффективности, обусловленное методологиями, составляющими предмет настоящего изобретения, существенно снижает стоимость испытаний.Следующие примеры иллюстрируют принципы и способы реализации настоящего изобретения, хотя не являются ограничивающими.

Доступные в продаже продукты, относящиеся к шовным материалам, испытывали непосредственно после получения. На рынке были представлены мономеры полимеризационной чистоты. 0,05 N гидроксида натрия использовали сразу после получения от компании Fisher Chemical (Fisher Scientific).

Пример 1

Применяли прибор pH-стат 718 STAT Titrator Complete производства компании MetroOhm с программным обеспечением TiNet 2.4 или более поздних версий. Образцы поместили в стандартный стеклянный реакционный сосуд с двойным покрытием объемом 100 мл, содержащий 75 мл деионизированной воды. Содержимое сосуда перемешали магнитной мешалкой и закупорили герметичной крышкой для предотвращения испарения; при этом поддерживали давление в одну атмосферу. Температуру перемешанной деионизированной воды в сосудах регулировали с точностью до +/-0,1°C, pH поддерживали на уровне установленного значения; значение pH составляло 7,27.

В сосуде с образцом непрерывно отслеживали изменения pH (падение pH) по сравнению с установленным значением. Как правило, pH регулируют с точностью до ±0,2 или менее. Если обнаруживали какое-либо снижение, добавляли 0,05 N раствор гидроксида натрия для возвращения к установленному значению pH. Значение pH, температуру и объем основания V(t), добавленного в каждый гидролизер, регистрировали с помощью компьютера в зависимости от времени. Компьютер управлял множеством установок.

Перед каждым анализом образца на каждой испытательной установке калибровали pH-зонд при помощи эталонных растворов с pH 4,0, 7,0 и 10,0, откалиброванных при температуре испытаний. Типичный размер образца составил 100 мг в 75 мл деионизированной воды на одно испытание с титрованием 0,05 N раствором гидроксида натрия.

Пример 2

В качестве экспериментальных соединений при испытаниях использовали разнообразные лактоновые мономеры в соответствии с примером 1. Для определения воспроизводимости и точности способа, составляющего предмет настоящего изобретения, применяли гликолид (1,4-диоксан-2,5-дион).

Профиль гидролиза можно охарактеризовать различными способами. По существу это критерий степени завершенности реакции образца для испытания с водой в зависимости от времени. На фиг. 1 представлена динамика титрования как зависимость объема добавленного основания от времени, или «профиль гидролиза». На фиг. 1 представлены наложенные друг на друга профили гидролиза мономера гликолида, полученные при температуре 75°C в ходе шести циклов. Воспроизводимость является удовлетворительной, о чем свидетельствует коэффициент вариации 0,005 (относительное стандартное отклонение 0,5%) на протяжении времени, необходимого для достижения гидролиза 99% сложноэфирных групп. Точность, определяемая по отклонению от экспериментально измеренного конечного объема (среднее значение 27,3 мл) до предполагаемого теоретического конечного объема (27,6 мл), характеризуется расхождением всего в 1%.

Профиль гидролиза гликолида показывает два элемента: начальная линейная часть и следующая за ним изогнутая часть. Начальная линейная часть соответствует гидролизу одной из двух карбоксильных сложноэфирных групп кольца гликолида. Данная стадия является слишком короткой, чтобы сконфигурированная система могла точно ее отследить. Следует понимать, что можно выбрать более подходящие условия испытаний, например, более низкую температуру испытаний для сбора точных данных в отношении быстро протекающих процессов. После расщепления кольца теперь уже линейная молекула, сложный карбоксиметиловый эфир гликолевой кислоты (также известный как гликолил гликолят), содержит один оставшийся сложный эфир. Данный сложный эфир показывает вторую, более низкую скорость гидролиза и на чертеже соответствует изогнутой части. Схематически превращение лактона (гликолида) в две молекулы гидроксикислоты (гликолевой кислоты) можно выразить следующим образом:

Кинетика реакции линейного димера гликолевой кислоты (гликолил гликолята) с водой зависит от температуры, как показано на фиг. 2.

Без стремления к ограничению научной теорией было выявлено, что гидролиз линейного димера в гликолевую кислоту является реакцией первого порядка. Поскольку титрование выполняется гидроксидом натрия, т. е. сильным основанием, после образования в ходе гидролиза группы карбоновой кислоты она немедленно подвергается титрованию и превращается в натриевую соль. Таким образом, объем основания, добавленного в процессе титрования pH-статом (V(t)), пропорционален концентрации натриевой соли групп карбоновой кислоты, [COONa]. Кинетика первого порядка соотносит дифференциальное уравнение, описывающее изменение количества групп карбоксилата натрия в зависимости от времени с данной мгновенной концентрацией:

(1)

Интегрирование и замещение V(t) на [COONa] дает

(2)

где объем основания при завершении гидролиза мономера лактона в линейный димер (в момент времени t₁) обозначен как V₁, конечный объем при очень больших значениях времени, когда все сложноэфирные группы подверглись гидролизу, обозначен как V∞, а константа скорости превращения линейного димера в гликолевую кислоту при заданной температуре реакции обозначена как k₂.

Уравнение 2 можно преобразовать так, чтобы сделать возможным вычисление k₂ с помощью линейной регрессии, что и было выполнено с данными, представленными на фиг. 3. Наклоны линейной регрессии на фиг. 3 позволяют получить константу скорости реакции k₂ при каждой температуре реакции. На фиг. 4 представлен график зависимости значений ln(k₂) при гидролизе гликолил гликолята от 1000/T. Наблюдали температурную зависимость аррениусовского типа:

(3)

где A - константа (предэкспоненциальный множитель), Ea - энергия активации, R - универсальная газовая постоянная, и T - абсолютная температура.

Энергия активации гидролиза линейного димера гликолевой кислоты (гликолил гликолята) составляла 89,2 кДж/моль.

Характерная для раннего периода линейная часть графика на фиг. 5 свидетельствовала о том, что при температуре 75°C оба циклических лактона (лактид и гликолид) подвергались по существу мгновенному (по меркам экспериментальной шкалы времени) гидролизу лактона с раскрытием цикла и образованием формы линейного димера с последующим более медленным гидролизом данных линейных димеров в соответствующие гидроксикислоты. Предполагается, что на константу скорости реакции k1, соответствующую раскрытию цикла, влияет напряжение кольца различных лактонов. Было обнаружено, что при заданной температуре гидролиз димеров гликолида протекал быстрее, чем гидролиз димеров лактида.

Пример 3

После установления точности и возможности выполнения гидролитического разложения экспериментальных соединений при таких высоких температурах, как 75°C, исследовали более сложные гидролизуемые полимерные материалы, такие как используемые для получения абсорбируемых шовных материалов.

Чтобы определить, может ли абсорбируемый шовный материал разлагаться гидролитическим путем при повышенных температурах без применения физиологически нехарактерных воздействий, таких как другие химические реакции, эффекты превышения температуры стеклования (Tg) образца, изменения морфологии полимера (например, кристалличности) или другие изменения, которые не обнаруживают при температуре тела, исследователи получили профили гидролиза следующих шовных материалов производства компании ETHICON: шовные материалы VICRYL™ (полиглактин 910) и VICRYL RAPIDE™ (полиглактин 910) с покрытием при выбранных температурах до 75°C (поставляются компанией Ethicon, Inc., г. Сомервилл, штат Нью-Джерси, 08876). Данные испытания проводили в соответствии со способом, представленным в примере 1.

Следует отметить, что авторы Reed и Gilding (16), а также Agrawal et al. (17) выдвигают предположение о резком изменении кинетики гидролитического разложения при температурах, превышающих температуру стеклования (Tg), сополимеров молочной и гликолевой кислот, а Buchanan et al. также высказывают сомнения относительно испытаний ускоренного разложения при высоких температурах, превышающих Tg (18, 19). Однако линейный график Аррениуса, представленный на фиг. 6 в настоящей заявке и отображающий зависимость времени, необходимого для гидролиза половины сложноэфирных групп полимера, от 1/T, не подтверждает подобных предположений. Таким образом, это свидетельствует о допустимости применения выбранной температуры испытаний. Иными словами, тот факт, что график Аррениуса, представленный на фиг. 6, является линейным для заданного шовного материала, предполагает отсутствие изменений в механизме реакции при температурах до 75°C и подтверждает принцип корреляции данных, полученных ускоренным образом при температурах, которые выше Tg блочных полимеров в условиях in vivo. Следует обратить внимание на то, что Tg шовного материала VICRYL с покрытием составляет приблизительно 60°C, однако при инкубации в фосфатно-буферном растворе при температуре 37°C в течение 24 часов Tg снижается до приблизительно 30°C (20). Снижение Tg сополимеров молочной и гликолевой кислот во время гидролитического разложения является известным фактом (21, 22).

С помощью линейной регрессии графика Аррениуса, представленного на фиг. 6, рассчитали энергию активации гидролиза шовного материала VICRYL с покрытием, которая составила 94,6 кДж/моль, а соответствующее значение для шовного материала VICRYL RAPIDE составило 93,5 кДж/моль. Данные значения хорошо согласуются с данными о сополимерах молочной и гликолевой кислот, опубликованными в литературе (17, 22).

Ввели элемент t_x для обозначения времени, необходимого для гидролиза x процентов от общего количества присутствующих гидролизуемых групп. Таким образом, t₅ обозначает время, необходимое для взаимодействия 5% гидролизуемых групп, и т. п. Ниже будет показано, что значения t₉₀ для различных абсорбируемых сложных полиэфиров можно соотнести с временем абсорбции in vivo. Кроме того, считается, что время наступления механического повреждения абсорбируемых устройств может четко коррелировать с соответствующими значениями t_x, когда x является малым числом (менее 5 процентов). Данное предположение основано на том, что сравнительно небольшое количество цепей нуждается в расщеплении для наступления механического повреждения. Для иллюстрации в качестве меры скорости разложения на фиг. 6 выбрали t₅₀ (время, за которое происходит 50% разложения).

Степень гидролиза, которая соответствует корреляции характеристик in vitro с характеристиками in vivo, будет зависеть от полимера (для полимера, имеющего однородное распределение последовательности мономеров, в котором гидролиз сложных эфиров протекает произвольным образом). Например, можно соотнести значения t₉₅ или t₉₈ со значениями времени абсорбции in vivo. Другие значения t_x можно соотнести со значениями времени абсорбции in vivo.

Было обнаружено, что гораздо меньшие значения t можно соотнести с соответствующими значениями времени абсорбции in vivo, причем в данном случае сокращение времени испытаний станет преимуществом. Результатом каждого нового выбора параметра будет лишь иная математическая зависимость при условии идентичности основных механизмов разложения. Однако было обнаружено, что при достижении такой степени гидролиза исследуемых сложных полиэфиров, когда 90 процентов сложноэфирных групп уже подверглись гидролизу, сложные полиэфирные образцы для испытания растворялись в воде при повышенной температуре испытаний 75°C. Следовательно, для проведения любых дополнительных работ выбирали данную температуру испытаний.

Профили гидролиза множества выбранных плетеных шовных материалов ETHICON заданного размера (размер 1, наружный диаметр 0,5 мм), выпускаемых компанией Ethicon, Inc., получали при температуре 75°C. Результаты показаны на фиг. 7. Ассортимент данных шовных материалов варьировался от шовного материала PDS™ II (полидиоксанон) достаточно длительного действия до быстро рассасывающегося шовного материала VICRYL RAPIDE™. Шовные материалы VICRYL™ и VICRYL RAPIDE™ с покрытием являются мульфиламентными шовными материалами, тогда как MONOCRYL™ (полиглекапрон 25) и PDS II представляют собой монофиламентные шовные материалы. Температура стеклования последних двух шовных материалов ниже комнатной температуры. Данный чертеж также демонстрирует тот факт, что конечный объем гидроксида натрия, используемый для титрования образцов массой 100 мг, будет разным, поскольку данные шовные материалы выполнены из разных мономеров. Конечный объем зависит от количества групп карбоновой кислоты, образованных на один грамм образца. Данная зависимость представлена ниже:

где V_f - это конечный объем титрования, а C_n - концентрация мономера n, выраженная в % мол.

В представленную ниже таблицу 3 включены прогнозируемые и реальные значения конечного объема титрования образцов выбранных абсорбируемых сложных полиэфиров массой 100 мг.

Таблица 3
Прогнозируемые и реальные значения конечного объема титрования образцов выбранных абсорбируемых сложнополиэфирных шовных материалов массой 100 мг Шовный материал ETHICON Композиция (% мол.) Прогнозируемый объем титрования (мл) Реальный объем титрования (мл) Различие (%) Шовный материал VICRYL RAPIDE^® 90% GLY, 10% LAC 33,8 31,9 5,6 Шовный материал VICRYL^® 90% GLY, 10% LAC 33,8 32,2 4,7 Шовный материал MONOCRYL^® 75% GLY, 25% CAP 29,3 27,5 6,2 Шовный материал PDS II^® 100% PDO 19,6 19,4 1,0

Где GLY - гликолид, LAC - лактид, CAP - ε-капролактон, PDO - повторяющиеся звенья п-диоксанона.

ПРИМЕР 4

На фиг. 8 представлен график зависимости времени абсорбции in vivo (построенный на основании данных гистологических исследований внутримышечного применения на модели крыс) от t₉₀ (полученного из профиля гидролиза, выполненного при температуре 75°C). Данное испытание проводили в соответствии с примером 1. В данном случае t₉₀ также определяется как момент времени, когда 90% имеющихся сложноэфирных групп уже подверглись гидролизу. Время, соответствующее гидролизу 90% сложного эфира, выбрали с учетом удобства эксперимента и соответствия конечным точкам in vivo. Линейная регрессия дает следующее соотношение: y=0,014x+0,137 со значением R2, равным 0,904. Коэффициент корреляции регрессии R2, равный 0,904, указывает на удовлетворительную корреляцию между значением t₉₀ in vitro и временем абсорбции in vivo.

Способы, описанные в приведенных выше примерах, позволяют предсказать время абсорбции in vivo образца для испытания следующим образом. Сначала необходимо получить корреляционную кривую зависимости времени абсорбции in vivo от времени гидролиза in vitro, выполненного при заданной температуре испытаний, установленных значениях pH и показателе степени гидролиза (t_x). Затем в аналогичных экспериментальных условиях in vitro следует получить значение времени гидролиза in vitro. Используя данное время гидролиза in vitro и корреляционную кривую, можно предсказать время абсорбции in vivo образца для испытания.

ПРИМЕР 5

Существует множество факторов, определяющих гидролитическое разложение. Одним из них является площадь поверхности абсорбируемого устройства. Время разложения монофиламентных шовных материалов, таких как шовный материал MONOCRYL™, зависит от диаметра нити. Не является неожиданным то, что монофиламентные шовные материалы большего диаметра требуют более продолжительного времени для диффузии воды во внутреннее пространство волокна, а это приводит к более длительному времени разложения. Данная взаимосвязь представлена на фиг. 9 в виде графика зависимости t90 от диаметра волокна шовного материала MONOCRYL™ в соответствии со способом, представленным в примере 1.

ПРИМЕР 6

Мультифиламентный плетеный шовный материал, доступный в продаже и известный как Vicryl™ 2-0, подвергли испытаниям в соответствии со способом, составляющим предмет настоящего изобретения, и в соответствии с примером 1. Для получения профилей гидролиза использовали температуры испытаний, которые включали 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. Что касается анализа полученных кривых, для каждого образца для испытания, испытанного при каждой температуре, были зарегистрированы значения времени, необходимого для достижения степени гидролиза 10, 50, 90 и 98 процентов.

Таблица 4
Время разложения шовного материала Vicryl^® 2-0 при разных температурах Температура (шовный материал Vicryl^®) 10% разложения (часы) 50% разложения (часы) 90% разложения (часы) 98% разложения (часы) 50°C 127 206 265 302 60°C 49 87 112 130 70°C 14 26 33 37 80°C 8 14 18 20

Построили график зависимости обратных значений времени разложения (в секундах) от обратных значений температуры (в кельвинах). На основании уравнения прямой рассчитали значения Аррениуса. Энергию активации при 10% разложения, 50% разложения, 90% разложения и 98% разложения вычислили по наклону из соответствующих им уравнений.

Таблица 5
Значения энергии активации, рассчитанные с помощью графиков Аррениуса Шовные материалы Энергия активации 10% разложения (кДж/моль^-1) Энергия активации 50% разложения (кДж/моль^-1) Энергия активации 90% разложения (кДж/моль^-1) Энергия активации 98% разложения (кДж/моль^-1) Vicryl Rapide^® 3-0 89 81 81 81 Vicryl^® 2-0 91 88 89 89 Monocryl^® 2-0 76 79 80 80 PDS II^® 2-0 119 106 104 103

На основании рассчитанных значений Аррениуса определили время разложения шовного материала при температуре тела (37°C).

Таблица 6
Прогнозируемое разложение шовного материала при температуре 37 градусов Цельсия на основании уравнения Аррениуса 10% разложения
(часы) 50% разложения
(часы) 90% разложения
(часы) 98% разложения
(часы) Шовный материал Vicryl Rapide^®
3-0 8 18 26 31 Шовный материал Vicryl^®
2-0 21 34 44 52 Шовный материал Monocryl^® 2-0 20 45 65 79 Шовный материал PDS II^®
2-0 246 278 311 321

Четыре линейные кривые, соответствующие степени гидролиза 10, 50, 90 и 98%, имели коэффициенты корреляции более 0,985. Коэффициент корреляции графика Аррениуса для данного широкого ряда абсорбируемых полимеров указывает на выраженную линейность в диапазоне температур от 50 до 80°C. Данные температуры испытаний превышают температуру стеклования испытанных шовных материалов.

ПРИМЕР 7

Мультифиламентный плетеный шовный материал, доступный в продаже и известный как Vicryl Rapide™ 3-0, подвергли испытаниям в соответствии со способом, составляющим предмет настоящего изобретения, и в соответствии с примером 1. Для получения профилей гидролиза использовали температуры испытаний, которые включали 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. Что касается анализа полученных кривых, для каждого образца для испытания, испытанного при каждой температуре, были зарегистрированы значения времени, необходимого для достижения степени гидролиза 50, 90 и 98 процентов.

Таблица 7
Время разложения шовного материала Vicryl Rapide 3-0 при разных температурах Температура (шовный материал Vicryl Rapide^™) 10% разложения (часы) 50% разложения (часы) 90% разложения (часы) 98% разложения (часы) 50°C 52 119 172 204 60°C 23 49 70 88 70°C 11 22 30 35 80°C 4 9 13 16

Построили график зависимости обратных значений времени разложения (в секундах) от обратных значений температуры (в кельвинах). На основании уравнения прямой рассчитали значения Аррениуса. Энергию активации при 10% разложения, 50% разложения, 90% разложения и 98% разложения вычислили по наклону из соответствующих им уравнений.

Для шовного материала Vicryl Rapide™ 3-0 четыре линейные кривые, соответствующие степени гидролиза 10, 50, 90 и 98%, имели коэффициенты корреляции более 0,992. Коэффициент корреляции графика Аррениуса указывает на выраженную линейность в диапазоне температур от 50 до 80°C. Данные температуры испытаний превышают температуру стеклования испытанных шовных материалов.

ПРИМЕР 8

Монофиламентный шовный материал, доступный в продаже и известный как Monocryl™ 2-0, подвергли испытаниям в соответствии со способом, составляющим предмет настоящего изобретения, и в соответствии с примером 1. Для получения профилей гидролиза использовали температуры испытаний, которые включали 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. Что касается анализа полученных кривых, для каждого образца для испытания, испытанного при каждой температуре, были зарегистрированы значения времени, необходимого для достижения степени гидролиза 50, 90 и 98 процентов.

Таблица 8
Время разложения шовного материала Monocryl при разных температурах Температура (шовный материал Monocryl) 10% разложения (часы) 50% разложения (часы) 90% разложения (часы) 98% разложения (часы) 50°C 138 303 420 498 60°C 68 144 212 268 70°C 27 56 75 85 80°C 13 26 36 44

Для шовного материала Monocryl™ 2-0 четыре линейные кривые, соответствующие степени гидролиза 10, 50, 90 и 98%, имели коэффициенты корреляции более 0,984. Коэффициент корреляции графика Аррениуса указывает на выраженную линейность в диапазоне температур от 50 до 80°C. Данные температуры испытаний превышают температуру стеклования испытанных шовных материалов.

ПРИМЕР 9

Монофиламентный шовный материал, доступный в продаже и известный как PDS II 2-0, подвергли испытаниям в соответствии со способом, составляющем предмет настоящего изобретения, и в соответствии с примером 1. Для получения профилей гидролиза использовали температуры испытаний, которые включали 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. Что касается анализа полученных кривых, для каждого образца для испытания, испытанного при каждой температуре, были зарегистрированы значения времени, необходимого для достижения степени гидролиза 10, 50, 90 и 98 процентов.

Таблица 9
Время разложения шовного материала PDS II 2-0 при разных температурах Температура (PDS II) 10% разложения (часы) 50% разложения (часы) 90% разложения (часы) 98% разложения (часы) 60°C 241 395 469 501 70°C 69 121 149 157 80°C 21 45 56 61

Для шовного материала PDS II™ 2-0 четыре линейные кривые, соответствующие степени гидролиза 10, 50, 90 и 98%, имели коэффициенты корреляции более 0,998. Коэффициент корреляции графика Аррениуса указывает на выраженную линейность в диапазоне температур от 50 до 80°C. Данные температуры испытаний превышают температуру стеклования испытанных шовных материалов.

Хотя настоящее изобретение было показано и описано применительно к его подробным вариантам осуществления, специалистам в данной области будет понятно, что возможны различные изменения в форме и деталях без отступления от сущности и объема заявленного изобретения.

Список литературы

(1) Ceonzo K, Gaynor A, Shaffer L, Kojima K, Vacanti CA, Stahl GL. Polyglycolic Acid-Induced Inflammation: Role of Hydrolysis and Resulting Complement Activation. Tissue Eng 2006; 12(2):301-8.

(2) Deng M, Zhou J, Chen G, Burkley D, Xu Y, Jamiolkowski D, Barbolt T. Effect of load and temperature on in vitro degradation of poly(glycolide-co-L-lactide) multifilament braids. Biomaterials 2005; 26:4327-4336.

(3) Sawhney AS, Hubbell JA. Rapidly degraded terpolymers of dl-lactide, glycolide, and ε-caprolactone with increased hydrophilicity by copolymerization with polyethers. J Biomed Mat Res 1990; 24:1397-1411.

(4) Johansson H, Sebelius H. Saponification of glycolide and lactide in acid solution. Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft (Abteilung) B: Abhandlungen 1919, 52B 745-52.

(5) Ringer O, Skrabal A. Hydrolysis of lactic acid lactide. Monatshefte fuer Chemie 1923; 43:507-23.

(6) Mhala MM, Mishra JP. Hydrolysis of dl-lactide. Indian Journal of Chemistry 1970; 8(3):243-6.

(7) Mhala MM, Mishra JP, Ingle TS. Kinetics of hydrolysis of glycolide. Indian Journal of Chemistry 1972; 10(10):1006-10.

(8) Lanza P. Multi-purpose recording pH meter. Journal of Electroanalytical Chemistry 1967; 13(1-2):67-72.

(9) Salmi EJ, Leino E. The alkaline hydrolysis of esters of glycolic, lactic, and a-hydroxyisobutyric acids. Suomen Kemistilehti B 1944; 17B:19-21.

(10) Tsibanov VV, Loginova TA, Neklyudov AD. Analysis of pH-stat curves of enzymic hydrolysis in variable volumes of solution. Zhurnal Fizicheskoi Khimii 1982; 56(5): 1183-8.

(11) Williams KR. Automatic titrators in the analytical and physical chemistry laboratories. Journal of Chemical Education 1998; 75(9):1133-1134.

(12) Baran J, Penczek S. Hydrolysis of Polyesters of Phosphoric Acid. 1. Kinetics and the pH Profile. Macromolecules 1995; 28(15):5167-76.

(13) Tunc DC, Goekbora M, Higham P. A new method for the estimation for the absorption time of bioabsorbable polymers in the body. Technology and health care: official journal of the European Society for Engineering and Medicine 2002; 10(3-4):237-42.

(14) Soucek MD, Johnson AH. New intramolecular effect observed for polyesters: An anomeric effect. JCT Research 2004; 1(2):111-116.

(15) Gebauer B, Jendrossek D. Assay of poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase activity and product determination. Applied and Environmental Microbiology 2006; 72(9):6094-6100.

(16) Gilding DK, Reed AM. Biodegradable polymers for use in surgery-poly(glycolic)/poly(lactic acid) homo and copolymers: 2. in vitro degradation. Polymer 1981; 22:494-8.

(17) Agrawal CM, Huang D, Schmitz JP, Athanasiou KA. Elevated Temperature Degradation of a 50:50 Copolymer of PLA-PGA. Tissue Engineering 1997; 3(4):345-352.

(18) Weir NA, Buchanan FJ, Orr JF, Farrar DF, Dickson GR. Degradation of poly-L-lactide. Part 2: increased temperature accelerated degradation. Proc Inst Mech Eng 2004; 218(5):321-30.

(19) Degradation rate of bioresorbable materials. Edited by Fraser Buchanan. Woodhead Publishing Limited, 2008.

(20) Ethicon Data on File.

(21) Shah S, Cha Y and Pitt CG. Poly(glycolic acid-do-DL-lactic acid): Diffusion or degradation controlled drug delivery? J. Controlled Release 1992; 18:261-270.

(22) Dunne M, Corrigan OI, Ramtoola Z. Influence of particle size and dissolution conditions on the degradation properties of polylactide-co-glycolide particles. Biomaterials 2000; 21(16):1659-1668.

Группа изобретений относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования поведения in vivo биологически разлагаемых полимерных имплантатов и медицинских устройств, такого как время абсорбции или время гидролиза. Настоящее изобретение предлагает новую методологию in vitro, определение профиля гидролиза, предназначенную для исследования разложения абсорбируемых полимеров. Данные, полученные с помощью данного способа in vitro, коррелируют с данными абсорбции in vivo, что позволяет прогнозировать точное поведение материала in vivo, например время абсорбции. Осуществление изобретения обеспечивает более точное прогнозирование абсорбции in vivo. 2 н. и 34 з.п. ф-лы, 9 пр., 9 табл., 10 ил.

1. Способ прогнозирования абсорбции in vivo синтетических абсорбируемых полимеров, образованных из них имплантатов или медицинских устройств, имеющих гидролизуемые связи в цепи, на основании испытания in vitro, включающий следующие стадии:

(a) проведение гидролиза известного количества образца для испытания при известном времени абсорбции in vivo, при по существу постоянном значении рН и по существу постоянной температуре испытаний, которая равна или больше температуры тела, с использованием известной концентрации титрующего основания, регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени;

(b) регистрация времени, необходимого для достижения постоянного уровня степени гидролиза образца для испытания, где указанная степень гидролиза находится в диапазоне от приблизительно 95% до приблизительно 100%;

(c) повторение стадий (а) и (b) при условиях испытания, выбранных для стадий (а) и (b), с использованием по меньшей мере одного отличного образца для испытания с другим известным временем абсорбции in vivo;

(d) построение корреляционной кривой in vivo - in vitro, отражающей зависимость времени абсорбции in vivo от времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (b);

(e) проведение гидролиза известного количества образца для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo при условиях испытания, выбранных для стадий (а) и (b), с использованием известной концентрации титрующего основания, регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени;

(f) прогнозирование поведения in vivo с помощью корреляционной кривой, построенной на стадии (d), и времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (е).

2. Способ по п. 1, в котором указанная температура испытаний находится в диапазоне от более приблизительно 60°С до приблизительно 95°С.

3. Способ по п. 1, в котором указанная температура испытаний находится в диапазоне от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С.

4. Способ по п. 1, в котором указанная температура испытаний составляет приблизительно 70°С.

5. Способ по п. 1, в котором указанное значение рН находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 11.

6. Способ по п. 1, в котором указанное значение рН находится в диапазоне от приблизительно 6,3 до приблизительно 8,3.

7. Способ по п. 1, в котором указанное значение рН составляет 7,3.

8. Способ по п. 1, в котором указанное титрующее основание представляет собой водный раствор гидроксида натрия.

9. Способ по п. 8, в котором указанный водный раствор гидроксида натрия имеет концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,0001 N до приблизительно 1,0 N.

10. Способ по п. 8, в котором указанный водный раствор гидроксида натрия имеет концентрацию приблизительно 0,05 N.

11. Способ по п. 1, в котором указанный образец для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo имеет монофиламентную форму.

12. Способ по п. 1, в котором указанный образец для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo имеет мультифиламентную форму.

13. Способ по п. 1, в котором указанный образец для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo имеет форму неволокнистого имплантируемого медицинского устройства.

14. Способ по п. 1, дополнительно включающий цветовой индикатор рН и средство мониторинга цвета для контроля титрования, которые необходимы для поддержания указанного по существу постоянного значения рН.

15. Способ по п. 1, в котором указанный постоянный уровень степени гидролиза образца для испытания находится в диапазоне от приблизительно 98% до приблизительно 100%.

16. Способ по п. 1, в котором указанный постоянный уровень степени гидролиза образца для испытания составляет приблизительно 100%.

17. Способ по п. 1, в котором синтетический абсорбируемый полимер, образованные из него имплантаты или медицинские устройства выбраны из группы, состоящей из алифатических сложных полиэфиров, поли(аминокислот), сополимеров сложных и простых эфиров, полиалкиленовых оксалатов, полиалкиленовых эфиров дигликолевой кислоты, полиамидов, полученных из тирозина поликарбонатов, поли(иминокарбонатов), полиортоэфиров, полиоксиэфиров, полиамидоэфиров, полиоксиэфиров, содержащих аминогруппы, полиангидридов, полифосфазенов, полипропиленфумаратов, абсорбируемых сложных полиэфируретанов и их комбинаций и смесей.

18. Способ прогнозирования времени абсорбции in vivo синтетических абсорбируемых полимеров, образованных из них имплантатов и медицинских устройств, имеющих гидролизуемые связи в цепи, на основании испытания in vitro, включающий следующие стадии:

(a) проведение гидролиза известного количества образца для испытания при известном времени абсорбции in vivo, при по существу постоянном значении рН и по существу постоянной температуре испытаний, которая равна или больше температуры тела, с использованием известной концентрации титрующего основания, регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени;

(b) регистрация времени, необходимого для достижения постоянного уровня степени гидролиза образца для испытания, где указанная степень гидролиза находится в диапазоне от приблизительно 95% до приблизительно 100%;

(c) построение корреляционной кривой in vivo - in vitro, отражающей зависимость времени абсорбции in vivo от времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (b);

(d) проведение гидролиза известного количества образца для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo при условиях испытания, выбранных для стадий (а) и (b), с использованием известной концентрации титрующего основания, регистрация объема титрующего основания в зависимости от времени;

(e) прогнозирование времени абсорбции in vivo по корреляционной кривой, построенной на стадии (с), и времени гидролиза in vitro, зарегистрированного на стадии (d).

19. Способ по п. 18, в котором указанная температура испытаний находится в диапазоне от приблизительно 60°С до приблизительно 95°С.

20. Способ по п. 18, в котором указанная температура испытаний находится в диапазоне от приблизительно 70°С до приблизительно 75°С.

21. Способ по п. 18, в котором указанная температура испытаний составляет приблизительно 70°С.

22. Способ по п. 18, в котором указанное значение рН находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 11.

23. Способ по п. 18, в котором указанное значение рН находится в диапазоне от приблизительно 6,3 до приблизительно 8,3.

24. Способ по п. 18, в котором указанное значение рН составляет приблизительно 7,3.

25. Способ по п. 18, в котором указанное титрующее основание представляет собой водный раствор гидроксида натрия.

26. Способ по п. 25, в котором указанный водный раствор гидроксида натрия имеет концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,0001 N до приблизительно 1,0 N.

27. Способ по п. 25, в котором указанный водный раствор гидроксида натрия имеет концентрацию приблизительно 0,05 N.

28. Способ по п. 18, в котором указанный образец для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo имеет монофиламентную форму.

29. Способ по п. 18, в котором указанный образец для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo имеет мультифиламентную форму.

30. Способ по п. 18, в котором указанный образец для испытания с неизвестным временем абсорбции in vivo имеет форму неволокнистого имплантируемого медицинского устройства.

31. Способ по п. 18, дополнительно включающий цветовой индикатор рН и средство мониторинга цвета для контроля титрования, которые необходимы для поддержания указанного по существу постоянного значения рН.

32. Способ по п. 18, в котором указанный постоянный уровень степени гидролиза образца для испытания находится в диапазоне от приблизительно 98% до приблизительно 100%.

33. Способ по п. 18, в котором указанный постоянный уровень степени гидролиза образца для испытания составляет приблизительно 100%.

34. Способ по п. 18, в котором синтетический абсорбируемый полимер, образованные из него имплантаты или медицинские устройства выбраны из группы, состоящей из алифатических сложных полиэфиров, поли(аминокислот), сополимеров сложных и простых эфиров, полиалкиленовых оксалатов, полиалкиленовых эфиров дигликолевой кислоты, полиамидов, полученных из тирозина поликарбонатов, поли(иминокарбонатов), полиортоэфиров, полиоксиэфиров, полиамидоэфиров, полиоксиэфиров, содержащих аминогруппы, полиангидридов, полифосфазенов, полипропиленфумаратов, абсорбируемых сложных полиэфируретанов и их комбинаций и смесей.

35. Способ по п. 1, в котором по существу постоянная температура испытаний составляет более приблизительно 37°С.

36. Способ по п. 18, в котором по существу постоянная температура испытаний составляет более приблизительно 37°С.