ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 2F9-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ЛИЗОСТАФИНУ И ИНГИБИРУЮЩИХ ЕГО ЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12N5/07 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к лизостафину.

Лизостафин - цинк зависимая глицил-глициновая эндопептидаза, продуцируемая клетками Staphylococcus simulans, является специфичной для бактерий вида Staphylococcus. aureus. Молекулярный вес лизостафина - 27 кД. Лизостафин разрушает клеточную стенку бактерий S. aureus. Лизостафин не токсичен и слабо иммуногенен для животных и рассматривается как перспективный компонент антибактериальных препаратов для лечения инфекций, вызываемых стафилококками, в частности для лечения эндокардитов, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами S. aureus. Лизостафин - единственный препарат, способный разрушать биопленки бактерий S. aureus и S. epidermidis. Лизостафин активен против всех антибиотикоустойчивых штаммов патогенных стафилококков, включая MRSA-штаммы, и по эффективности превосходит другие противостафилококковые биологические препараты - бактериофаги, бактериоцины и фаговые эндолизины.

Рекомбинантный лизостафин практически не отличается по свойствам от активной формы лизостафина из бактерий S. simulans. Все клинические штаммы S. aureus чувствительны к рекомбинантному лизостафину с МИК от 0,03 до 2 мкг/мл (Bastos М С F, Coutinho В G and Coelho M L V Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical Applications Pharmaceuticals 2010, 3, 1139-1161).

Имеются данные о получении гибридом (A1G5A1, A2C1D10 и L1F3), моноклональные антитела которых специфичны к лизостафину и использовались для его очистки с помощью аффинной хроматографии. Известна также гибридома LTN1, продуцирующая МКА к фрагменту лизостафина между 3 и 13 аминокислотами: пептиду (THEHSAQWLN). МКА LTN1 специфически связываются с продуктом гидролиза лизостафина размером 17 кДа (Huang J., Wu H., Zhang J., Huang O. Purification of recombinant lysostaphin by monoclonal antibody affinity chromatography. [Статья на китайском языке] Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 2009 Jan; 25(1): 147-51).

Сведений о гибридомах-продуцентах МКА, ингибирующих литическую активность лизостафина, в доступной литературе нет.

Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к лизостафину, подавляющие его антистафилакокковую активность и пригодные для количественного определения лизостафина.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для его количественного определения.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК», коллекционный номер - Н-29. Депозитор: Федеральное бюджетное учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным лизостафином в течение 56 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 4000 (Merk, Германия) (Nowinski R.C, Lostrom M.E., Tam M.R., Stone M.R. and Burnette W.N. The isolation of hybrid lines producing monoclonal antibodies against the p 15 (E) protein of ceotropic murine Leukemia viruses. Virology, 1979, 93, 111-126.). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.

Характеристика штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 (гибридомы 2F9).

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы 2F9 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда DMEM или RPMI - 1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 10⁵ на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 10⁶ на одну мышь при первичном введении и 10⁵ на одну мышь при вторичном введении. За 14 суток до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентодекана (пристана). Иммуноасцитическая жидкость образуется на 14-20 сутки в объеме 3-5 мл. Синтез МКА, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).

Характеристика полезного продукта. Гибридома 2F9 продуцирует специфичные моноклональные антитела к лизостафину, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:1000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:100000. Моноклональные антитела из КЖ и ПАЖ выделяют с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок A или G сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 2-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения)

Контаминация штамма. Контаминанты, включая бактерии, дрожжи, грибы, в гибридной линии не выявлены. Наличие микроплазм и вирусов в гибридоме не определяли.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.

Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре - 70°C и затем опускают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°C. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 65-75%.

Свойства полезного продукта. Гибридома 2F9 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к IgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши. МКА специфичны к нативному и рекомбинантному лизостафину, имеют константу аффинности 1,72×10¹⁰ M^-1 (Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J. Immunol. Methods, 1987, 100, 173-179.), подавляют антистафилококковую активность лизостафина и пригодны для его количественного определения.

Доказательства свойств МКА гибридомы 2F9 представлены на следующих фигурах:

Фиг.1. Твердофазный иммуноферментный анализ для определения лизостафина в анализируемом образце с помощью моноклональных антител гибридомы 2F9.

Фиг.2. Подавление роста культуры S. aureus на плотной питательной среде лизостафином в присутствии МКА гибридом 1F5, 2F9 и 2G10.

Фиг.3. Иммуноблот моноклональных антител гибридом с препаратами лизостафина.

Пример 1. Получение гибридомы 2F9.

Иммунизацация.

Мышей линии BALB/c иммунизируют препаратом рекомбинантного лизостафина по схеме:

- подкожное введение мышам 200 мкг лизостафина в 4 точки в полном адъюванте Фрейнда;

- через 28 суток повторное введение мышам 100 мкг лизостафина в 4 точки в неполном адъюванте Фрейнда;

- через 28 суток внутривенная инъекция мышам 20 мкг лизостафина в физиологическом растворе.

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после инъекции лизостафина. Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью твердофазного ИФА.

Гибридизация.

Через 3 суток извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 10⁸ спленоцитов мыши с 10⁷ клетками миеломной линии РЗ-X63-Ag8.653 в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000 (Merk, Германия) в течение 1 минуты.

Селекция.

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде DMEM "Sigma" с 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Скрининг гибридных клонов.

Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют твердофазный иммуноферментный метод.

Для проведения ИФА в лунки 96-луночной полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 500 нг лизостафина, приготовленного на 0,01 М карбонатном буфере pH 9,6 в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°C в течение 18 ч. Лунки планшета отмывают забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Тв). Вносят в лунки по 100 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности и инкубируют при температуре 37°С в течение 45 мин. Три раза отмывают ЗФР-Тв и вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл. Панель инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ЗФР-Тв и добавляют в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 40 минут, затем 5 раз отмывают лунки раствором ЗФР-Тв и добавляют в лунки по 100 мкл тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 2 М серной кислоты. Планшеты сканируют на планшетном ридере Пикон (Россия), измеряя поглощение при 450 нм.

Клонирование.

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных ммакрофагов мыши из расчета 10⁴ клеток на лунку. Скрининг клонов проводят твердофазным ИФА, как описано выше.

Культивирование.

Клоны гибридомы культивируют при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда DMEM или RPMI - 1640, содержащая 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Криоконсервация.

Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной сыворотки теленка - 90% и диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.

Пример 2. Определение количества лизостафина в твердофазном иммуноферментном анализе.

Для проведения твердофазного ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят лизостафин в концентрациях 4 мкг, 800 нг, 160 нг, 32 нг, 6,4 нг, 3,2 нг, 1,6 нг и 0,8 нг в мл 0,01 М карбонатного буфера (pH 9,6) в объеме 100 мкл и выдерживают при температуре 6°C в течение 16 часов. Последующие стадии анализа проводят аналогично стадиям, описанным для скрининга гибридных клонов. Моноклональные антитела вносят в лунки в объеме 100 мкл с концентрацией 5 мкг/мл. Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.

В ИФА моноклональные антитела гибридомы 2F9 специфически взаимодействуют с лизостафином и определяют до 0,80 нг/мл белка в анализируемом образце (фиг.1).

Пример 3. Ингибирование литической активности лизостафина в суспензии бактерий стафилококка МКА гибридомы 2F9.

Ночную агаровую культуру S. aureus суспендируют в буфере ЗФР. Бактерии инактивируют прогревом суспензии при температуре 80°С в течение 1 час. Прогретую суспензию разводят до мутности, равной оптической плотности 0,32 при длине волны 590 нм.

90 мкл культуральной жидкости гибридом 1F5 и 2F9 смешивают с 10 мкл лизостафина с концентрацией 300 мкг/мл. Смеси инкубируют в течение 1 час при температуре 37°C. После инкубации смеси вносят в 1 мл инактивированной суспензии S. aureus с оптической плотностью 0,32. Реакцию гидролиза клеток стафилококка проводят в течение 1 час при температуре 37°C. После реакции суспензию разводят ЗФР в два раза и измеряют оптическую плотность (таблица 1).

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2F9, в отличие от МКА гибридомы 1F5 подавляют литическое действие лизостафина в инактивированной суспензии бактерий S. aureus (таблица 1).

Пример 4. Ингибрование подавления роста культуры стафилококка на плотной питательной среде лизостафином МКА гибридомы 2F9.

Ночную агаровую культуру S. aureus суспендируют в ЗФР до мутности, равной стандарту оптической плотности 10 единиц. Полученную суспензию разводят в 10 раз ЗФР и 0,2 мл разведенной суспензии равномерно наносят на питательный агар LA, залитый в чашку Петри. Толщина агара - 15 мм. 200 мкл культуральной жидкости гибридом 1F5, 2F9 и 2G10 смешивают с 20 мкл лизостафина с концентрацией 300 мкг/мл. Полученную смесь последовательно разводят двукратно культуральной жидкостью гибридом до концентрации лизостафина 15 и 7,5 мкг/мл. Смеси инкубируют в течение 1 час при температуре 37°C.После инкубации в пробирки титрования лизостафина вносят бумажные фильтры и после их смачивания наносят на агар LA с засеянной культурой стафилококка. Чашки инкубируют 18 ч при температуре 37°C.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2F9 в отличие от МКА гибридомы 1F5 и 2G10 подавляют бактерицидное действие лизостафина при выращивании бактерий S. aureus на плотной питательной среде (Фиг.2).

Пример 5. Иммуноблот.

Для проверки специфичности МКА гибридомы 2F9 к рекомбинантному лизостафину и лизостафину, продуцируемуму бактериями S. Simulans, проводят СДС-электрофорез белков в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 2 часов при 220 В, 20 мА. Белки из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-P) в течение 1 час при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в 20 мМ трис-буфер, pH 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран и приготовления растворов МКА и конъюгата антител против иммуноглобулинов G мыши с пероксидазой хрена используют 20 мМ трис-буфер, pH 7,4, содержащий 150 мМ NaCl и 0,5% твин 20. Блокированные и промытые мембраны разрезают на полосы, содержащие адсорбированные фракции препаратов лизостафина, и инкубируют каждую полосу отдельно в растворах МКА с концентрацией 1 мкг/мл в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее, после промывки буфером полоски обрабатывают раствором антимышиных антител конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают буфером и окрашивают диаминобензидином с использованием 0,5 мг/мл 3.3′-диаминобензидина с 0,1 мг/мл NiCl₂, 0,1 мг/мл CoCl₂, 0,03% H₂O₂ в ЗФР pH 7,2. Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2F9, по данным иммуноблота взаимодействуют с нативным и рекомбинантным лизостафином (фиг.3). Не ингибирующие литическую активность лизостафина МКА (гибридомы 1F5 и 2G10) выявляют помимо основной полосы лизостафина (27 кД) три дополнительные полосы (23, 18 и 16 кД) у рекомбинантного белка и полосу 23 кД у природного белка, а МКА 2F9 - три дополнительные полосы (21, 19 и 18 кД) как у рекомбинантного, так и у природного белка.

Таким образом, на основании представленных примеров МКА гибридомы 2F9 специфичны к лизостафину и ингибируют его литическую активность. Высокоаффинные МКА гибридомы 2F9 позволяют определять лизостафин в образцах до концентраций 0,8 нг/мл. МКА гибридомы 2F9 могут быть использованы для изучения структурно-функциональных свойств лизостафина и контроля качества препаратов на основе лизостафина.

Таблица 1 Ингибирование литической активности лизостафина МКА в суспензии бактерий S. aureus. Состав смеси Оптическая плотность культуральная жидкость гибридомы 2F9, суспензия бактерий S. aureus 0,16 культуральная жидкость гибридомы 2F9, лизостафин, суспензия бактерий S. aureus 0,15 культуральная жидкость гибридомы 1F5, суспензия бактерий S. aureus 0,16 культуральная жидкость гибридомы 1F5, лизостафин, суспензия бактерий S. aureus 0,12 Питательная среда для гибридом, суспензия бактерий S. aureus 0,16 Питательная среда для гибридом, лизостафин, суспензия бактерий S. aureus 0,12

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к лизостафину. Предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для его количественного определения. Высокоаффинные МКА гибридомы 2F9 позволяют определять лизостафин в образцах до концентраций 0,8 нг/мл. МКА гибридомы 2F9 могут быть использованы для изучения структурно-функциональных свойств лизостафина и контроля качества препаратов на основе лизостафина. 3 ил., 1 табл., 5 пр.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для количественного определения лизостафина, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК», коллекционный номер Н-29.