Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты) Российский патент 2017 года по МПК C12N1/16 C12P7/46 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новых штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica, используемых для получения чистой янтарной кислоты (ЯК).

Традиционно для получения ЯК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов янтарной кислоты является их чувствительность к низким значениям pH, что приводит к необходимости добавления щелочи в процессе культивирования. В результате образуются соли янтарной кислоты. Для дальнейшего выделения и очистки янтарной кислоты необходимо использовать сильную минеральную кислоту, что негативно сказывается на экологичности процесса, ведет к образованию дополнительных отходов и, как следствие, к повышению стоимости производства янтарной кислоты.

В связи с этим особый интерес для создания продуцентов янтарной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям pH.

Перспективным объектом для производства янтарной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности.

Среди дрожжей известны различные продуценты янтарной кислоты, отличающиеся как по уровню накопления продукта, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.

Штамм дрожжей Issatchenkia orientalis 257 [WO 2014018757] выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода глюкозы (12,0 об. %). Культивирование осуществляют в колбах в течение 96 часов с добавлением мела. При этом янтарная кислота накапливалась до 89 г/л при средней скорости биосинтеза 0,93 г/л*ч и конверсии около 78% (г/г). Недостатком данного процесса является необходимость культивирования на среде с мелом.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae SUC-297 [WO 2011064151] при культивировании в ферментере объемом 1,0 м³ с минеральной средой и глюкозой в качестве источника углерода накапливает за 95 часов 43 г/л янтарной кислоты, при этом образуются вторичные продукты: 16,4 г/л этанола и 14,9 г/л глицерина. Недостатком данного процесса является низкая конверсия за счет образования вторичных продуктов.

Известен штамм дрожжей Yarrowia lipolytica PGC01003 [Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 179], который при культивировании в ферментере на минеральной среде в периодическом режиме с подпиткой и при поддержании pH на уровне 6,0, используя в качестве источника углерода глицерин, производит 160,2 г/л янтарной кислоты, при конверсии 40% (г/г). Недостатком данного штамма является необходимость поддерживать значение рН=6,0 на протяжении всего процесса ферментации.

В работе (RU 2487931) для получения янтарной кислоты предложено использовать штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753. При культивировании штамма в лабораторном ферментере в периодическом режиме с подпиткой на минеральной среде без использования титрующих агентов он за 54 часа накапливает 42 г/л янтарной кислоты с конверсией 39%, конечное pH равно 2,9 [Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113 (11), 2425-2432]. Штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3753 является ауксотрофом по лейцину.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала микроорганизмов, продуцирующих янтарную кислоту без использования веществ, стабилизирующих pH.

Задача решена путем создания штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 продуцента янтарной кислоты.

Заявляемый штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 получен из коллекционного штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ У-3753 путем автоселекции. Штамм ВКПМ У-3753 культивировали в ферментере в хемостатном режиме в течение 840 часов, несколько раз дискретно увеличивая скорость протока и снижая pH. Отбор нового штамма производился в конце ферментации по размеру колоний после высева образца культуральной жидкости на агаризованную среду.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y-4215.

Полученный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 также как штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ У-3753 является ауксотрофом по лейцину, но имеет более высокие показатели по продукции и конверсии.

Задача решена также путем создания штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 продуцента янтарной кислоты.

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 получен из штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 путем восстановления прототрофности по лейцину.

Для этого штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 трансформировали линейным фрагментом ДНК с геном LEU2, комплементирующим делению размером 681 п.о. в мутантной аллели leu2-270.

Полученный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 способен расти и продуцировать янтарную кислоту на минеральной среде с глюкозой без добавления лейцина и применения титрующих агентов.

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

На модифицированной полной среде YPD (мас. %: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность ровная, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.

В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.

На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), карбоната кальция (1%), фосфатного буфера (50 мМ, pH 6,8) и лейцина (0,002%) после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину, лейцину. Не патогенен. Температура роста 28-30°C.

Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°C в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

На модифицированной полной среде YPD (мас. %: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность ровная, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.

В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.

На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), карбоната кальция (1%) и фосфатного буфера (50 мМ, pH 6,8) после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину. Не патогенен. Температура роста 28-30°C. Оптимальное pH 5,5, способен к росту в кислой среде (до pH 3).

Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°C в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215.

Посевной материал получают, высевая культуру, хранящуюся в 10% глицерине при -70°C, на среду, содержащую (мас. %): глицерин - 2,0; дрожжевой экстракт - 1,0; пептон - 1,0; карбонат кальция - 1,0; агар - 2,0; вода - остальное. Выращивают в течение 2 суток и для засева одной пробирки используют полную петлю посевного материала.

Культивируют штамм в пробирках при температуре 30°C при 250 об/мин в 10 мл минеральной питательной среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 2,5; Na₂HPO₄⋅12H₂O - 0,6; KH₂РО₄ - 0,071; NH₄Cl - 1,177; (NH₄)₂SO₄ - 0,065; MgSO₄⋅7H₂O - 0,065; CaCl₂ -0,0011; Лимонная кислота - 0,18; Биотин (витамин B7) - 0,00002; Тиамин (витамин B1) - 0,0001; L-Лейцин - 0,5; раствор микроэлементов - 0,46 (состав в мас. %: CuSO₄⋅5H₂O - 0,6; KJ - 0,0088; MnSO₄⋅5H₂O - 0,3; H₃ВO₄ - 0,02; CoCl₃⋅6H₂O - 0,0955; ZnSO₄⋅7H₂O - 4,2; FeSO₄⋅7H₂O - 6,5; H₂SO_4конц. - 0,5), вода - остальное. Значение pH среды доводят до уровня 7,1 путем внесения 25%-ного раствора NH₄OH. Время выращивания - 48 часов, для засева одной колбы используют 10 мл культуральной жидкости.

Культивирование в колбах осуществляют в среде и условиях, описанных выше. Рабочий объем 100 мл. Время выращивания - 24 часа. Для засева в посевной ферментер используют 100 мл культуральной жидкости.

В посевном ферментере штамм культивируют в периодическом режиме с рабочим объемом 1000 мл, в среде такого же состава, но с концентрацией глюкозы 100 г/л при температуре 30°C и скорости вращения мешалки 700 об/мин. Аэрацию осуществляют воздухом с расходом 1 л/мин. Значение pH поддерживают в течение всего процесса культивирования на уровне 5,5 добавлением 25%-го раствора NH₄OH. Время выращивания - 56 часов. Для засева в основной ферментер используют 100 мл культуральной жидкости.

В основном ферментере культивирование штамма осуществляют как в посевном ферментере, но в периодическом режиме с подпиткой. Начальная концентрация глюкозы в среде - 50 г/л. Подпитка осуществляется на 12, 18, 24, 30 и 36-й час культивирования по 40 мл раствора глюкозы, концентрацией 700 г/л. Процесс культивирования проходит без использования титрующих агентов. Время культивирования - 60 часов.

Концентрацию янтарной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ с использованием системы Waters HPLC (Waters, США), колонки с обратной фазой ReproSil-Pur C18-AQ (4 mm×250 mm, 5 mm, Dr. Maisch, Германия) по методу, описанному в (Biotechnology and Bioengineering, 2010, Nov. 107 (4): 673-682). Остаточную концентрацию глюкозы определяют спектрофотометрически глюкозооксидазным методом с помощью набора реагентов «Диаком Глюкоза» (Диаком-ВНЦМДЛ, Россия) согласно инструкции производителя.

По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 50 г/л, конверсия по глюкозе 40%, конечное значение pH 2,8.

Пример 2. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297.

Культивирование штамма Y-4297 осуществляют по примеру 1, но в среду не добавляют лейцин, культивирование в посевном ферментере первые 16 часов проходит без аэрации, далее аэрацию осуществляют воздухом с расходом 0,25 л/мин.

Время культивирования в основном ферментере - 53 часа.

По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 49 г/л, конверсия по глюкозе 43%, конечное значение pH 2,4.

Полученный штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-4297 способен расти на среде без L-лейцина, что имеет преимущество с экономической точки зрения.

Таким образом, получены перспективные для использования в промышленности, высокопродуктивные штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющие производить янтарную кислоту без добавления титрующих агентов.

Группа изобретений относится к микробиологической промышленности. Заявлены штамм дрожжей Yarrowia lipolytica Y-3753ch и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica Y4215Leu+, обладающие способностью продуцировать янтарную кислоту. Штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационными номерами ВКПМ Y-4215 и ВКПМ Y-4297 соответственно. Заявленные штаммы могут быть использованы для получения чистой янтарной кислоты. Изобретение позволяет получить чистую янтарную кислоту. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.

1. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 - продуцент янтарной кислоты.

2. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4297 - продуцент янтарной кислоты.