СИСТЕМА И СПОСОБ МНОГОФАЗНОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ФАКТОРОВ РОСТА Российский патент 2017 года по МПК A61K38/18 A61K47/34 A61K9/52 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА ПРЕДШЕСТВУЮЩЕЙ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с Парижской Конвенцией по заявке США номер 61/474049, поданной 11 апреля 2011 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к системам и способам высвобождения биологических веществ. В частности, изобретение относится к высвобождению факторов роста, связанных с биоимплантатами. Более конкретно, изобретение представляет собой систему и способ получения многофазного профиля высвобождения, по меньшей мере, одного фактора роста с целью улучшения характеристик биоимплантата.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Факторы роста (ФР) представляют собой пептиды и белки, которые стимулируют рост и/или дифференцировку клеток путем взаимодействия ФР с (определенными рецепторами клеточной поверхности. Факторы роста играют ключевую роль в восстановлении и регенерации тканей, и экзогенное введение ФР можно применять для стимуляции заживления различных тканей и органов, включая костную, хрящевую, кожу и слизистую, а также для улучшения восстановления тканей путем стимуляции ангиогенеза на участке восстановления.

Суперсемейство трансформирующего фактора роста бета (TGFβ) секретируемых факторов роста и дифференцировки у млекопитающих насчитывает свыше 30 членов. Эти димерные белки отличаются структурой, основанной на узле из семи консервативных остатков цистеина. Они регулируют пролиферацию, дифференцировку и миграцию различных типов клеток и играют важную роль в морфогенезе, органогенезе, обеспечении жизнедеятельности тканей и заживлении ран. Суперсемейство факторов роста TGFβ может быть подразделено на несколько подсемейств, включающих подсемейство трансформирующего фактора роста бета, костный морфогенетический белок (BMP) и семейство фактора роста и дифференцировки (GDF) (также называемое подсемейство BMP), и подсемейство ингибинов и активинов.

Подсемейство BMP суперсемейства TGFβ содержит, по меньшей мере, двадцать белков, включая BMP-2, BMP-3 (также известен как остеогенин), BMP-3b (также известен как фактор роста и дифференцировки 10, GDF-10), BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (также известен как остеогенный белок-1, OP-1), BMP-8 (также известен как остеогенный белок-2, OP-2), BMP-9, BMP-10, BMP-11 (также известен как фактор роста и дифференцировки 8, GDF-8, или миостатин), BMP-12 (также известен как фактор роста и дифференцировки 7, GDF-7), BMP-13 (также известен как фактор роста и дифференцировки 6, GDF-6), BMP-14 (также известен как фактор роста и дифференцировки 5, GDF-5), и BMP-15 (для обзора см., например, Azari et al. Expert Opin Invest Drugs 2001; 10:1677-1686).

Было показано, что BMP стимулируют синтез матрикса в хондробластах; стимулируют активность щелочной фосфатазы и синтез коллагена в остеобластах, индуцируют дифференцировку ранних мезенхимальных клеток-предшественников в остеогенные клетки (остеоиндукция), регулируют хемотаксис моноцитов и мезенхимальных клеток, и регулируют дифференцировку нервных клеток (для обзора см., например, Azari et al. Expert Opin Invest Drugs 2001; 10:1677-1686 и Hoffman et al. Appl. Microbiol. Biotech 2001; 57:294-308).

Одной из множества функций белков BMP является стимуляция образования хрящевой, костной и соединительной ткани у позвоночных. Наиболее остеоиндуктивными членами подсемейства BMP являются BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8 и BMP-9 (см., например, Hoffman et al., Appl. Microbiol Biotech 2001, 57-294-308; Yeh et al., J Cellular Biochem., 2005; 95-173-188; и Boden, Orthopaedic Nursing 2005,24:49-52). Такая остеоиндуктивная способность BMP давно считается очень перспективной при различных терапевтических и клинических применениях, включая восстановление переломов; спондилодез; лечение заболеваний скелета, регенерацию черепа, челюстные дефекты и дефекты кости; и при пероральных и дентальных введениях, таких как дентиногенез и цементогенез в ходе регенерации периодонтальных ран, лунки после удаления трансплантата, аугментации гребня и Синус-лифтинга. В настоящее время рекомбинантный BMP-2 человека продается как INFUSE® от Medtronic, одобренный FDA для применения в спондилодезе, для репаративной регенерации в зоне несращения переломов и в челюстно-лицевой хирургии, в то время как рекомбинантный BMP-7 человека продается как OP-1® от Stryker и одобрен как альтернатива аутотрансплантатам в случае несращения трубчатых костей, не поддающегося лечению, и заднебокового (межпоперечного) спондилодеза поясничного отдела позвоночника, при котором применение аутотрансплантата и взятие костного мозга не являются практически осуществимыми или не предполагают проведение спондилодеза.

Другие рекомбинантные факторы роста, экзогенно использованные с целью стимуляции восстановления кости, включают различные TGFβs (см. Clokie & Bell, J. Craniofacial Surg. 2003, 14:268-77), членов суперсемейства фактора роста фибробластов (FGFs) (см. Kawaguchi et al., (2007) J. Orthopaedic Res. 25(4): 480-487), членов суперсемейства фактора роста тромбоцитов (PDGFs) (см. Hollinger et al., 2008 JBJS 90(s1):48-54), и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Street et al., 2002 PNAS 99:9656-61)

Для эффективности этих факторов роста они должны быть активны и должны находиться в достаточной концентрации во время достижения соответствующими реактивными клетками критической плотности на участке восстановления. Малый период полураспада, термическая неустойчивость, чувствительность к протеазе и/или растворимость ФР требует введение в комбинацию с ними носителя для достижения данного требования.

Для доставки ФР была произведена оценка нескольких носителей. Они включают губки из тканевого коллагена, желатиновые гидрогели, фибриновые гели, гепарин, обращенно-фазовые полимеры, такие как полоксамеры, скаффолды, состоящие из полимолочной кислоты (PLA), полигликолевой кислоты (PGA) или их сополимеров (PLGA), скаффолды, состоящие из конъюгата гепарина с PLGA, и неорганические материалы, такие как фосфаты кальция. Например, в биоимплантате (GEM-21S®), который используют для периодонтальной регенерации, применяется бета-трифосфат кальция (β-TCP) в качестве носителя для rhPDGF-BB (см. http://www.osteohealth.com/GEM21S.aspx).

Однако эти носители обладают ограниченной эффективностью в связи с потерей активности фактора роста при связи с носителем, неэффективным высвобождением ФР на участке имплантации и/или слабой защитой от протеолиза и разрушения. Например, в биоимплантате Infuse® использует коллагеновую губку типа I в качестве носителя для rhBMP-2. Происходит выброс rhBMP-2 из носителя, и период полураспада BMP в раневой области составляет 1-3 суток (Winn et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev. 31:303; Friess et. al., 1999, Intl. J. Pharm.,187:91). К моменту перемещения мезенхимальных стволовых клеток, которые регенерируют кость, на раневую область, только доли процента искомого загруженного количества присутствует для стимуляции этих клеток к восстановлению кости. Существующий раствор для обеспечения эффективного уровня BMP, остающегося в этот более поздний период времени, служит для значительного увеличения количества изначально загруженного BMP. Эти увеличенные дозы повышают риск осложнений, включая костеобразование за пределами участка имплантата, аутоиммунную реакцию и, возможно, злокачественную опухоль. В дальнейшем это существенно увеличит стоимость имплантата.

Таким образом, в данной области существует необходимость в материалах и способах, высвобождающих факторы роста с профилем, который сводит к минимуму загружаемое количество фактора роста, необходимого для достижения требуемого терапевтического эффекта.

Одной стратегией является инкапсулирование ФР в биоразлагаемой полимерной матрице, высвобождающей ФР с профилем замедленного высвобождения на протяжении многих суток. Например, BMP вступили в комбинацию с поли-молочной кислотой(PLA) или сополимером молочной и гликолевой кислот (PLGA) для получения профилей замедленного высвобождения. Однако включение BMP в PLA или в PLGA может изменить или разрушить естественные свойства BMP, снижая его активность, и сложно регулировать профиль высвобождения для обеспечения достижения наивысшей эффективности биоимплантата. В дальнейшем скорость разрушения этих носителей, как правило, такова, что ФР в больших количествах остаются запертыми спустя долгое время после завершения процесса заживления.

Другой стратегией является химическая иммобилизация ФР непосредственно на носителе и удерживание его на участке имплантата. Однако это также может привести к частичной или полной потере активности ФР и ограничивает активность ФР таким образом, что только клетки, находящиеся в непосредственном контакте с носителем, способны взаимодействовать с ФР и проявлять реакцию (см. Steinmuller-Nethl, D. et al., Biomaterials, 2006, 27: 4547-56), что нежелательно в виду ограничения данного эффекта незамедлительной границей раздела с носителем и не на всей площади раневой области.

В силу природы в процессе заживления ран многочисленные ФР присутствуют в пределах раневой области и окружающей ткани в различных концентрациях в различные периоды времени. Например, сразу после перелома кости тромбоциты на месте повреждения первоначально будут высвобождать большое количество PDGF, при резком снижении уровня белка в пределах места перелома в течение последующих суток (см. Tyndall et al., Clinical Orthopaedics and Related Research, 2003, 408: 319–330). Наоборот, BMP-2 выражается во всех фазах процесса заживления (см. Rasubala et al. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2003, 41: 173–178). Концентрация данных факторов роста оценивается ниже по порядку величины чем те, что используются во время терапевтических применений экзогенных ФР ввиду соответствия концентрации клеточным требованиям и синергическому действию многочисленных факторов роста. Получение системы, позволяющей доставлять факторы роста с многофазными профилями высвобождения и высвобождать многочисленные факторы роста с различными профилями высвобождения, позволило бы использовать биоимплантаты с профилями высвобождения ФР, которые более точно имитируют высвобождение ФР в течение естественного процесса заживления, чем существующие биоимплантаты, которые высвобождают единичный фактор роста одним выбросом или замедленным высвобождением.

Информация уровня техники предоставлена с целью ознакомления с информацией, соответствие которой настоящему изобретению заявитель считает возможным. Не предполагается обязательным признание и не подлежит толкованию, что что-либо из указанной выше информации представляет собой известный уровень техники в отношении настоящего изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к системе, способу и набору для многофазного высвобождения, по меньшей мере, одного фактора роста, например, на участке применения. Для этой цели система по изобретению может быть применена в качестве биоимплантата или т.п. В одном из аспектов способ по изобретению доставляет, по меньшей мере, один фактор роста при первоначальном высвобождении с последующей доставкой, по меньшей мере, одного фактора роста в “профиле замедленного высвобождения”. Изобретение использует систему доставки для первоначального высвобождения и носитель для замедленного высвобождения.

В одном из аспектов происходит высвобождение того же фактора роста в первоначальном профиле и профиле замедленного высвобождения. В другом аспекте происходит высвобождение различных факторов роста, где первый фактор роста высвобождается в первоначальном профиле, и второй фактор роста высвобождается в профиле замедленного высвобождения. Как известно специалистам в данной области, считается, что высвобождение двух различных факторов роста таким различным образом более точно имитирует естественную систему высвобождение фактора роста на участке применения.

В одном из аспектов изобретения предоставлен носитель, обеспечивающий замедленное высвобождение, по меньшей мере, одного фактора роста, в сочетании со средством доставки, обеспечивающим первоначальное высвобождение, по меньшей мере, одного фактора роста. Комбинация носителя со средством доставки дает в результате многофазный профиль высвобождения фактора(ов) роста.

В предпочтительных вариантах осуществления фактором роста («ФР») является член суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGFβ). В особенно предпочтительных вариантах осуществления фактором роста является Костный морфогенетический белок (BMP).

В одном из аспектов настоящего изобретения, носитель («НС») состоит из частиц фосфата кальция, диспергированных в полимерном скаффолде или матрице. В одном из аспектов скаффолд или матрица в дальнейшем покрывается слоем гидроксиапатита.

В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, один фактор роста применяется в качестве жидкости для частиц кальция и в дальнейшем лиофилизируется на частицы перед соединением с полимерной матрицей.

В другом аспекте настоящего изобретения носитель формируется посредством смешивания одного или нескольких порошков фосфата кальция с жидким раствором, содержащим, по меньшей мере, один фактор роста для получения фосфатно-кальциевого цемента. В одном из аспектов производится размалывание цемента на частицы цемент.

В предпочтительных вариантах осуществления средством доставки является обращенно-фазовый полимер. В особенно предпочтительных вариантах осуществления обращенно-фазовым полимером является полоксамер, более конкретно полоксамер 407 (также известен, как Pluronic™ F127).

Как указано выше, в одном из аспектов средство доставки и носитель выполнены с возможностью высвобождения одинакового фактора роста, в то время как в другом аспекте носитель и средство доставки выполнены с возможностью высвобождения различных факторов роста. В еще одном аспекте по изобретению, носитель и средство доставки каждый выполнены с возможностью высвобождения комбинаций из двух или более факторов роста, при высвобождении комбинации каждым разным или одинаковым фактором.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к системе для многофазного высвобождения факторов роста на участке применения, содержащей:

- средство доставки, содержащее, по меньшей мере, один первый фактор роста; и

- носитель, содержащий, по меньшей мере, один второй фактор роста;

где:

- средство доставки выполнено с возможностью высвобождения, по меньшей мере, одного первого фактора роста в первоначальном профиле высвобождения за первый период времени;

- носитель выполнен с возможностью высвобождения, по меньшей мере, одного второго фактора роста в профиле замедленного высвобождения за второй период времени.

В другом аспекте изобретение относится к способу многофазного высвобождения факторов роста, способ содержит:

- доставку, по меньшей мере, одного первого фактора роста с первоначальным профилем высвобождения;

- доставку, по меньшей мере, одного второго фактора роста в профиле замедленного высвобождения.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к набору для многофазной доставки факторов роста, набор содержит:

- компонент-средство доставки;

- по меньшей мере, один первый фактор роста, связанный со средством доставки;

- компонент-носитель; и

- по меньшей мере, один второй фактор роста, связанный с носителем.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Здесь изобретение будет описываться со ссылкой на приложенные фигуры, описанные в кратком изложении ниже.

На фигуре 1 показан профиль замедленного высвобождения, продемонстрированный носителем по изобретению.

На фигуре 2 показан первоначальный профиль высвобождения, продемонстрированный средством доставки по изобретению.

На фигуре 3 показано различие профилей высвобождения на основе количества фактора роста в средстве доставки и носителе. многофазный профиль высвобождения наблюдается при включении факторов роста как в средство доставки, так и в носитель (50-50).

На фигуре 4 показана активность in vivo биоимплантантов, где происходит высвобождение фактора роста, как показано на фигуре 3 в соответствии со способом по изобретению.

На фигуре 5 показано образование новой кости (Кость) на частицах фосфата кальция (CaP) при получении биоимплантата в соответствии со способом по изобретению проведения имплантации на мыши.

На фигуре 6 показано гистологическое появление новой кости (Кость), образующейся на носителе (Носитель) при получении биоимплантата в соответствии со способом по изобретению проведения имплантации на мыши

На фигуре 7 показан краткий профиль замедленного высвобождения фактора роста, произведенный носителем, полученным в соответствии со способом по изобретению.

На фигуре 8 показаны возможности изменения профиля замедленного высвобождения посредством изменения свойств носителя, полученного в соответствии со способом по изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Факторы роста (ФР) играют ключевую роль в восстановлении и регенерации тканей, и экзогенные ФР можно применять для стимуляции заживления различных тканей и органов. Для эффективности экзогенных факторов роста в стимуляции заживления они должны удерживаться на участке, требующем восстановления, и быть защищены от инактивации, секвестрации и разрушения. Для достижения этого используют носители. Однако высвобождение факторов роста из этих носителей не проходит идеально и не может с легкостью быть модифицировано. Настоящее изобретение основано на открытии того, что многофазное высвобождение факторов роста из биоимплантата повышает эффективность имплантата.

Авторы настоящего изобретения разработали способы и материалы для повышения эффективности, например, биоимплантатов посредством улучшения динамики высвобождения или профиля высвобождения факторов роста на участке имплантации, при этом сохраняя активность факторов роста. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фактору роста, системе доставки и способу, содержащему носитель, состоящий из, по меньшей мере, одного фактора роста, в комбинации со средством доставки, также состоящим из, по меньшей мере, одного фактора роста. По меньшей мере, один фактор роста, высвобождаемый released by носителем и средством доставки может быть одинаковым или различным.

Система и способ по изобретению можно использовать для различного множества терапевтических и клинических областей применения включая: заживление перелома; пересадка кости; спондилодез; и регенерация черепа, дефекты кости и нижней челюсти. Для таких областей применения система по изобретению предпочтительно предоставляется на или в форме биоимплантата.

Определения

Если не дано иное определение ниже, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют одинаковое значение, как общепринято понимается специалистом в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение.

В рамках изобретения термин «биоимплантат» относится к материалу, подходящему для имплантации и содержащему экзогенный фактор роста или биологически активный фактор. Как будет указано далее в настоящем документе, система по настоящему изобретению предпочтительно используется посредством применения таковой к биоимплантату. Далее биоимплантат предоставляется в тело индивидуума, где система высвобождает, по меньшей мере, один фактор роста в многофазном профиле высвобождения.

В рамках изобретения термин «фактор роста» относится к пептидам и белкам, которые стимулируют рост и/или дифференцировку клеток путем взаимодействия ФР с определенными рецепторами клеточной поверхности. Примеры факторов роста включают костные морфогенетические белки (BMP), трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), инсулиноподобные факторы роста (IGF), факторы роста фибробластов (FGFs), фактор роста тромбоцитов (PDGF) и фактор роста эндотелия сосудов. В предпочтительных вариантах осуществления факторами роста являются BMP.

Под «рекомбинантным» подразумевают белок, полученный транзиторно трансфицированной, стабильно трансфицированной или трансгенной клеткой-хозяином или животным, как в соответствии с экспрессирующей конструкцией, содержащей containing кДНК для такого белка. Термин «рекомбинантный» также включает фармацевтически приемлемые соли такого полипептида.

В рамках изобретения термин «полипептид» или «белок» относится к полимеру мономеров аминокислот, которые являются альфа аминокислотами, связанными между собой амидами. Полипептиды представляют собой, таким образом, по меньшей мере, два аминокислотных остатка по длине, и являются, как правило, длиннее. В общем смысле, термин «пептид» относится к полипептиду, который является только несколькими аминокислотными остатками по длине. Полипептид, в отличие от пептида, может содержать любое количество аминокислотных остатков. Таким образом, термин полипептид включал пептиды, а также более длинные последовательности аминокислот.

В рамках изобретения термины «костный морфогенетический белок» или «костный морфогенетический белок» или «BMP» используют взаимозаменяемо и относят к любому члену подсемейства морфогенетического белка кости (BMP) суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGFβ) факторов роста и дифференцировки, включая BMP-2, BMP-3 (также известен, как остеогенин), BMP-3b (также известен как фактор роста и дифференцировки 10, GDF-10), BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (также известен как остеогенный белок-1, OP-1), BMP-8 (также известен как остеогенный белок-2, OP-2), BMP-9, BMP-10, BMP-11 (также известен как фактор роста и дифференцировки 8, GDF-8, или миостатин), BMP-12 (также известен как фактор роста и дифференцировки 7, GDF-7), BMP-13 (также известен как фактор роста и дифференцировки 6, GDF-6), BMP-14 (также известен как фактор роста и дифференцировки 5, GDF-5), и BMP-15.

Термины «костный морфогенетический белок» и «BMP» также включают аллельные варианты BMP, функционально консервативные BMP и мутантные BMP, которые сохраняют активность BMP. активность BMP таких вариантов и мутантов можно подтвердить любыми способами, хорошо известными в данной области (см. раздел Анализы для измерения активности BMP ниже) или как описано в примере 1.

В предпочтительных вариантах осуществления BMP является BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 или BMP-9. В особенно предпочтительных вариантах осуществления BMP является BMP-2, BMP-4 или BMP-7.

В предпочтительных вариантах осуществления BMP представляет собой BMP млекопитающего (например, BMP-2 млекопитающего или BMP-7 млекопитающего). В особенно предпочтительных вариантах осуществления BMP является BMP человека (hBMP) (например, hBMP-2 или hBMP-7).

В рамках изобретения термин «скаффолд» относится к материалу, целью которого является обеспечение структуры, поддерживающей слипание, перемещение и врастание клеток на участке восстановления ткани.

В рамках изобретения термин «носитель» относится к материалу, содержащему один или множество компонентов, и выполнен с возможностью высвобождения, по меньшей мере, одного фактора роста на участок применения в профиле «замедленного высвобождения» за период времени. В одном из аспектов период времени, затрачиваемого носителем для высвобождения, по меньшей мере, одного фактора роста, составляет от нескольких суток до нескольких недель. Предпочтительно, носитель выполнен с возможностью высвобождения, по меньшей мере, одного фактора роста за период времени, составляющий несколько недель.

В предпочтительных вариантах осуществления носитель также выступает в качестве скаффолда или матрицы. Как указано выше, в одном из аспектов изобретения, носитель формируется из частиц фосфата кальция, диспергированных в макропористом полимерном скаффолде или матрице. В одном из аспектов скаффолд или матрица далее покрываются слоем гидроксиапатита. В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, один фактор роста применяется в качестве жидкости для частиц кальция и в дальнейшем лиофилизируется на частицы перед соединением с полимерной матрицей.

В рамках изобретения термин «средство доставки» относится к материалу, который содержит, по меньшей мере, один фактор роста и выполнен с возможностью высвобождения, по меньшей мере, одного фактора роста на участке применения в первоначальном профиле высвобождения за период времени. В одном из аспектов материал, из которого образуется средство доставки, находится в форме геля. В одном из аспектов период времени, затрачиваемый средством доставки для высвобождения, по меньшей мере, одного фактор роста, составляет от нескольких часов до нескольких суток. В предпочтительном варианте осуществления изобретения средство доставки высвобождает большинство, меньшей мере, одного фактора роста в «первоначальном высвобождении» или «первоначальном профиле высвобождения», который длится несколько часов. Предпочтительно, средство доставки выполнено с возможностью высвобождения, по меньшей мере, 80% фактора(ов) роста, содержащихся в них (или связанных с ними) в пределах 72 часов.

В предпочтительных вариантах осуществления средство доставки представляет собой обращенно-фазовый полимер. В рамках изобретения термин «обращенно-фазовый» относится к свойству, с помощью которого полимер претерпевает обратимый фазовый температурозависимый переход из жидкости в гель. В одном из аспектов температура перехода составляет от 15°C до 37°C. Предпочтительно температура перехода составляет от 15°C до 25°C. Как известно специалистам в данной области, материалы «нормальной фазы» повышают их вязкость со снижением температуры. Напротив, у обращенно-фазовых материалов снижаются показатели вязкости по мере снижения температуры ниже их температуры перехода.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления обращенно-фазовым полимером является полоксамер, более конкретно Pluronic™ F127 (также известен как полоксамер 407).

В рамках изобретения термин «замедленное высвобождение» или «профиль замедленного высвобождения» относится к высвобождению, по меньшей мере, одного фактора роста носителем за период времени, составляющий несколько суток или несколько недель, при этом количество, высвобождаемое за первоначальный период, аналогично или меньше количества, высвобождаемого за тот же период времени по прошествии нескольких суток или недель имплантации. Предпочтительно, профиль замедленного высвобождения длится, по меньшей мере, одну неделю. Как понятно специалистам в данной области, как правило, количество фактора роста, высвобождаемого в профиле замедленного высвобождения за первые трое суток, будет меньше количества, высвобождаемого за последующие семь суток.

В рамках изобретения термин «первоначальное высвобождение» или «профиль первоначального высвобождения» относится к первоначальному высвобождению средством доставки большого количества, по меньшей мере, одного фактора роста с последующим постепенным уменьшением высвобождаемого количества за период времени, составляющий несколько часов или суток. В одном из аспектов первоначальный профиль высвобождения приводит к доставке, по меньшей мере, 80% загруженного фактора (ов) роста в рамках периода, составляющего приблизительно 72 часа. Первоначальный профиль высвобождения показан на фигуре 2.

В рамках изобретения термин «многофазное высвобождение» относится к первоначальному высвобождению, по меньшей мере, одного фактора роста за первоначальный период времени и последующим «замедленным» высвобождением, по меньшей мере, одного фактор роста за второй период времени. Предпочтительно, первоначальный период времени составляет приблизительно несколько часов, и второй период времени составляет приблизительно от нескольких суток до нескольких недель. Такой профиль высвобождения может обозначаться как «бифазное высвобождение», так как оно проходит в два этапа. В предпочтительных вариантах осуществления первоначальное высвобождение обеспечивает система доставки по изобретению, и «замедленное» высвобождение обеспечивает носитель по изобретению.

В одном из аспектов изобретения, компонент-средство доставки содержит, по меньшей мере, 10% и не более 50% от общего количества фактора(ов) роста, доставляемых системой по изобретению, и компонент-носитель содержит, по меньшей мере, 50% от общего количества фактора(ов) роста, доставляемых системой.

Анализы для измерения активности BMP

Анализы для определения in vitro и in vivo функции рекомбинантных BMP хорошо известны в данной области, (см., например, патент США № 4761471; патент США № 4789732; патент США № 4795804; патент США № 4877864; патент США № 5013649; патент США № 5166058; патент США № 5618924; патент США № 5631142; патент США № 6150328; патент США № 6593109; Clokie и Urist, Plast. Reconstr. Surg. 2000; 105:628-637; Kirsch et al., EMBO J 2000; 19:3314-3324; Vallejo et al., J. Biotech. 2002; 94:185-194; Peel et al., J. Craniofacial. Surg. 2003; 14:284-291; и Hu et al., Факторы роста, 2004; 22:29-33).

Такие анализы включают: in vivo анализы для количественного измерения остеоиндуктивной активности BMP после имплантации (например, в мышцу задней конечности или грудную область) в грызуне (например, крысе или мыши) (см., например, патент США № 4761471; патент США № 4789732; патент США № 4795804; патент США № 4877864; патент США № 5013649; патент США № 5166058; патент США № 5618924; патент США № 5631142; патент США № 6150328; патент США № 6503109; Kawai и Urist., Clin. Orthop. Relat. Res., 1988; 222:262-267; Clokie и Urist, Plast. Reconstr. Surg., 2000;105:628-637; и Hu et al., Факторы роста, 2004;22:29-33); in vivo анализы для количественного измерения активности BMP по регенерации дефектов черепа, вызванных использованием трепана, у млекопитающих (например, крыс, собак или обезьян) (см., например, патент США № 4761471 и патент США № 4789732); in vitro анализы для количественного измерения активности BMP по индукции пролиферации in vitro культивированных хондроцитов (см., например, патент США № 4795804); in vitro анализы для количественного измерения активности BMP по индукции активности щелочных фосфатов в in vitro культивированных мышечных клетках (например, C2C12 клетки, ATCC Number CRL-1772) или стромальных клетках костного мозга (например, мыши W-20 клетки, ATCC Number CRL-2623) (см., например, патент США № 6593109; Ruppert et al., Eur J Biochem 1996;237:295-302; Kirsch et al., EMBO J, 2000;19:3314-3324; Vallejo et al., J Biotech, 2002;94:185-194; Peel et al., J Craniofacial Surg., 2003;14:284-291; и Hu et al., Факторы роста, 2004;22:29-33); in vitro анализы для количественного измерения активности BMP по индукции экспрессии FGF-рецептора 2 (FGFR3) в линиях культивированных мезенхимальных клеток-предшественников (например, мыши C3H10T1-2 клетки) (см., например, Vallejo et al. J Biotech 2002;94:185-194); in vitro анализы для количественного измерения активности BMP по индукции синтеза протеогликана в клетках зачатка конечности курицы (см., например, Ruppert et al., Eur J Biochem 1996;237:295-302); и in vitro анализы для количественного измерения активности BMP по индукции участия остеокальцина в стромальных клетках костного мозга (например, мышиные W-20 клетки; ATCC Number CRL-2623) (см., например, патент США № 6593109).

Анализы измерения связывания и высвобождения BMP

Для измерения связывания и высвобождения рекомбинантного BMP из носителя можно использовать различные анализы. Например, количество рекомбинантных BMP белков может быть измерено любым из методов, хорошо известных в данной области, включая дот-блоттинг, иммунологический анализ (например, иммуноферментные сорбционные анализы, ELISA), измерение увеличения радиоактивности, присутствующей в буфере высвобождения, где биоимплантат включает радиоактивно меченый BMP и хроматографию (например, жидкостную хроматографию высокого давления, ВЭЖХ и ионообменную хроматографию).

Такие способы хорошо известны в данной области (См. например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1999; Gosling, ed.. Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press. 2000; Oliver, ed., HPLC of Macromolecules: A Practical Approach., Oxford University Press, 1998; Millner, ed. High Resolution Chromatography: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999; Hockfield et al. Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993; Gore, ed. Spectrophotometry and Spectrofluorimetry: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000).

Например, имеется описание протоколов для радиоиммунологического анализа BMP-белков (см., например, патент США № 4857456). Например, описаны протоколы для анализа методом иммуноблоттинга BMP-белков (см., например, Wang et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:2220-2224). Например, ELISA наборы для количественного измерения уровней белка BMP-2 человека, крысы или мыши коммерчески доступны, например, от R&D Systems (catalog #DBP200, PDBP200 или SBP200). Например, ELISA наборы для количественного измерения уровней белка BMP-7 человека коммерчески доступны, например, от R&D Systems (каталожный номер DY354 или DY354E).

Наборы

В одном из аспектов изобретение относится к набору, содержащему систему, описанную в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления набор содержит необходимые компоненты для изготовления средства доставки и носителя, а также необходимые факторы роста. Таким образом, набор по изобретению содержал бы необходимые компоненты для изготовления средства доставки и носителя, а также, по меньшей мере, один фактор роста, связанный со средством доставки, и, по меньшей мере, один фактор роста, связанный с носителем.

Предпочтительно, средство доставки и связанный(ые) фактор(ы) роста сохраняются в раздельных контейнерах для составления комбинаций во время использования. Это было бы особенно предпочтительно в случаях, когда средство доставки может содержать жидкость или гель. В таком случае, связанный(ые) фактор(ы) роста можно хранить в отдельном контейнере как лиофилизированный порошок. Во время использования фактор(ы) роста в форме порошка можно комбинировать с жидкостным или гелевым средством доставки.

Набор предпочтительно содержит дополнительный контейнер, содержащий носитель, на который можно загрузить или нанести связанный(ые) фактор(ы) роста. В одном из вариантов осуществления материал носителя также может храниться отдельно от связанного(ых) фактор(ов) роста.

В предпочтительном варианте осуществления набор по изобретению содержал бы, по меньшей мере, три контейнера для каждого из следующего: 1) компонент-средство доставки; 2) по меньшей мере, один первый фактор роста (т.е. фактор(ы) роста, связанный(ые) со средством доставки); и, 3) носитель и, по меньшей мере, один второй фактор роста (т.е. фактор(ы) роста, связанный(ые) с носителем). На практике использования, по меньшей мере, один второй фактор роста в форме порошка выступает в комбинации со средством доставки в форме жидкости или геля, и смесь затем применяется на носителе, на который предварительно загружается, по меньшей мере, один второй фактор роста.

В одном из аспектов набор по изобретению может содержать любые необходимые реагенты и/или инструкции и/или сосуды, которые могут потребоваться.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение описывается посредством следующих примеров. В этих примерах показаны новые открытия авторов изобретения о том, что многофазный профиль высвобождения фактора роста, такого как rhBMP-2, полученный посредством загрузки части BMP в носителе, высвобождающий BMP с замедленным высвобождением, и части BMP в средстве доставки, высвобождающем BMP с первоначальным высвобождением, является более эффективным, чем носители, производящие выброс или замедленное высвобождение.

Как очевидно специалисту в данной области, возможно поместить один фактор роста в носителе и отличный фактор роста в средстве доставки, что повлечет за собой получение различных профилей высвобождения каждого фактора роста.

Следует понимать, что примеры, предоставленные в настоящем документе, предназначены исключительно для демонстрации настоящего изобретения и не для ограничения в какой-либо мере объема изобретения. Аналогично, изобретение не ограничивается какими-либо предпочтительными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Фактически, многие модификации и вариации по изобретению могут быть очевидны специалистам в данной области при прочтении настоящего описания. Изобретение, таким образом, подлежит ограничению только терминами приложенной формулы изобретения совместно с полным объемом эквивалентов, который определен формулой изобретения.

ПРИМЕР 1: Производство композитного носителя замедленного высвобождения, содержащего BMP посредством инкапсулирование в PLGA.

Настоящий пример демонстрирует, как составить носитель, содержащий rhBMP-2 и высвобождающий фактор роста в профиле замедленного высвобождения.

Материалы и методы

PLGA 75/25 с удельной вязкостью 1,33 дл/г (MW=205,000-210,000) приобретали от Birmingham Polymers Inc. (Birmingham, AL). Тетрафосфат кальция (TTCP) получали от Taihei Chemical Industrial Co. (Osaka, Japan) и дифосфат кальция безводный (DCPA) и диметилсульфоксид (DMSO) получали от Sigma Chemical Co. (MO, USA). Сахарные частицы приобретали от Tate & Lyle North America Inc. (Toronto, Canada).

Резорбируемые частицы фосфата кальция получали путем смешивания эквимолярных TTCP и DCPA с деонизированной дистиллированной водой (ddH₂O) при 100% относительной влажности в течение 24 часов. Реагент подвергался помолу и просеивался через 45 мкм сито.

Рекомбинантный BMP-2 человека (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) получали в буферной смеси (1,5 мг/мл, pH 4,5; 5 мм глутаминовая кислота, 2,5% глицин, 0,5% сахароза и 0,01% Tween™ 80 с ddH₂O). Белковый раствор добавляли во флаконы, содержащие порошок CaP, и перемешивали в течение, по меньшей мере, 15 минут. Порошок затем замораживали и лиофилизировали.

Частицы с (CaP-BMP) или без (CaP) BMP затем использовались для получения микрочастиц CaP–PLGA скаффолд блоков посредством инверсии фазы/выщелачивания частиц следующим образом: PLGA растворяли в DMSO в концентрации 11,5% (масс./об.). К данному раствору тщательно смешивались частицы CaP и CaP-BMP в соответствии с соотношением CaP/PLGA 2:1 (масс./масс.). Сахарные кристаллы с размерынм диапазоном 0,85–1,18 мм диспергировались в CaP/PLGA, и смесь отвердевала при -18°C в форме. PLGA осаждали, и сахарные кристаллы выщелачивались посредством замачивания в ddH₂O, смена которой производилась три раза.

Слой гидроксиапатита нанесен на и на всем протяженности макропористых композитных скаффолдов следующим образом: сухие цилиндры PLGA/CaP размером 2 мм в диаметре и 2 мм длиной, были заранее намочены в 70% этаноле и погружены в 60 мл 3×SBF на 9-суточный период при 37°C. SBF получали следующим образом: к 1,8 л ddH2O с интенсивным перемешиванием добавляли следующие соли последовательно 29,711 г NaCl, 2,206 г CaCl₂-2H₂O, 10 мл 1M HCl, 0,852 Na₂HPO₄. Окончательный объем был доведен до 2 л. Смена раствора SBF производилась ежедневно. После нанесения покрытия 3PCC образцы были промыты в ddH₂O и высушены на воздухе.

В результате этого образовался макропористый композитный носитель (3PS), способный высвобождать rhBMP-2 с профилем замедленного высвобождения за временной период, составляющий, по меньшей мере, семь суток. Данные результаты показаны на фигуре 1.

ПРИМЕР 2: Производство носителя замедленного высвобождения, содержащего BMP посредством инкапсулирование в фосфатно-кальциевый цемент

Настоящий пример демонстрирует, как составить носитель из фосфатно-кальциевого цемента (CPC), содержащий rhBMP-2 с профилем замедленного высвобождения.

Материалы и методы

Тетрафосфат кальция (TTCP) получали от Taihei Chemical Industrial Co. (Osaka, Japan) и дифосфат кальция безводный (DCPA) получали от Sigma Chemical Co. Макропористые бифазные гранулы (Eclipse) фосфата кальция приобретали от Citagenix (Laval Qc, Canada). Рекомбинантный BMP-2 человека (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) получали в буферной смеси (1,5 мг/мл, pH 4,5; 5 мм глутаминовая кислота, 2,5% глицин, 0,5% сахароза и 0,01% Tween™ 80 с ddH2O).

Резорбируемые частицы фосфата кальция получали путем смешивания эквимолярных TTCP и DCPA с раствором rhBMP-2. Реагент подвергался помолу и просеивался через 300 и 100 мкм сито, и частицы от 100 до 300µm были сохранены.

В результате образовались частицы носителя фосфатно-кальциевого цемента, в которые был включен rhBMP-2. При имплантации в животное BMP высвобождается замедленным образом за период времени, составляющий, по меньшей мере, несколько недель.

Для получения носителя с замедленным высвобождением на основе CPC, который также выступал в качестве частиц CPC макропористого скаффолда (0,1 до 0,3 мм), смешивали макропористые гранулы фосфата кальция (1-2 мм) в соотношении 1:1 (масс./масс.).

ПРИМЕР 3: Производство носителя замедленного высвобождения, содержащего BMP, посредством использования покрытия, связывающего BMP.

Настоящий пример демонстрирует, как составить носитель с профилем замедленного высвобождения посредством применения покрытия, связывающего BMP. Одним таким способом является нанесение покрытия на скаффолд с антителом или белком, связывающим BMP, как описано в нашей одновременно рассматриваемой заявке США номер 13/002444 (содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Материалы и методы

Очищенные поликлональные кроличьи антитела против BMP-2 человека приобретали от Cell Sciences, (Canton MA., Каталожный №PA0025). Макропористые бифазные гранулы (Eclipse) фосфата кальция (BCP) гранулы приобретали от Citagenix (Laval, Qc, Canada.)

Стерильные BCP гранулы взвешивали боксе микробиологической безопасности и помешали в стерильные TTP пробирки (Mandel Scientific, Guelph ON, Canada). Раствор антитела разбавляли в фосфатно-буферном солевом растворе до конечной концентрации 150, 300 и 600ng антитела в 1 мл PBS, фильтр стерилизовали и наносили а скаффолд в соотношении 1:1 об./об. Образцы выдерживались в течение, по меньшей мере, 15 минут при комнатной температуре, перед тем как были заморожены и лиофилизированы. Раствор BMP затем наносили на гранулы, оставляли намокать в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем замораживали и повторно лиофилизировали.

В результате образовались BCP гранулы, покрытие антителом, связывающим и высвобождающим rhBMP-2 замедленным образом.

Возможное количество rhBMP-2 для связывания может быть увеличено посредством увеличения количества использованных антител. Скорость высвобождения можно повысить посредством использования антител с более низкой аффинностью или авидностью.

ПРИМЕР 4: Изготовление BMP, содержащего средство доставки, с использованием F127

Настоящий пример демонстрирует, как приготовить средство доставки, содержащее rhBMP-2, с использованием F127.

Материалы и методы

Полоксамер получали следующим образом: 100 мл дистиллированной воды охлаждали при 4°C и различное количество полоксамер 407 медленно добавляли при перемешивании за временной период, составляющий несколько часов, до полного растворения всех твердых гранул с получением конечного раствора с диапазоном от 12 до 33%. Полоксамерный раствор затем стерилизовали в автоклаве (121°C, 20 минут, 30psi). После стерилизации полоксамерный раствор хранили при 4°C до использования.

Лиофилизированный рекомбинантный порошок BMP-2 человека (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) добавляли к полоксамерному раствору и медленно перемешивали.

Альтернативно rhBMP-2 добавляли из раствор (1 мг/мл, pH 4,5; 5 мм глутаминовая кислота, 2,5% глицин, 0,5% сахароза и 0,01% Tween 80) при соотношении 1/10 или 1/20 (об./об.).

В результате образовалось средство доставки, высвобождающее более 80% rhBMP -2 за первые двое суток (как показано на фигуре 2).

ПРИМЕР 5: Получение биоимплантата с многофазным профилем высвобождения

Настоящий пример демонстрирует, как получить биоимплантат 3PS-F127, содержащий rhBMP-2, высвобождающий rhBMP-2 с многофазным профилем высвобождения.

Материалы и методы

3PS носитель (как описано в примере 1), содержащий 0, 4,55 или 9,1 мкг rhBMP-2 на 5 мг носителя, получали и хранили в пробирках Eppendorf. Средство доставки, содержащее 0, 4,55 или 9,1 мкг rhBMP-2 в 45,5 мкл F127 (приготовлен, как описано в примере 4) хранили в пробирках Eppendorf при 4°C. Непосредственно перед использованием F127 был отмерен пипеткой на 3PS носителе, и носитель смешивали со средством доставки.

Данный биоимплантат 3PS-F127 затем использовали для измерения высвобождения BMP in vitro и активности костеобразования in vivo, как описано ниже.

Соотношение носителя к средству доставки может варьироваться для получения геля (соотношение объемов 1:1) или оттискного материала (соотношение объемов 2:1). В дальнейшем соотношение BMP к носителю или размеру частиц носителя можно варьировать для изменения профиля замедленного высвобождения. В конечном итоге, количество rhBMP-2 в носитель и средстве доставки можно варьировать для изменения количества rhBMP-2, высвобождаемого первоначально за первые несколько часов по сравнению с количеством, высвобождаемым за последующие недели.

ПРИМЕР 6: in vitro анализ для высвобождения BMPs из биоимплантатов.

В настоящем примере описано, как измерить высвобождение rhBMP-2 из различных биоимплантатов, описанных в примерах с 1 по 5.

Материалы и методы

Биоимплантаты, содержащие известное количество rhBMP-2, приготовленного, как показано в примерах с 1 по 5, переносили в пробирки Eppendorf. Общее количество использованного rhBMP-2 составляло 9,1 мкг rhBMP-2 на 5 мг носителя и 45,5 мкл F127, или 20 мкг rhBMP-2 до 10 мг носителя к 100 мкл F127.

Образцы инкубировали путем выдерживания в 1 мл раствора буфера высвобождения, содержащего фосфатно-буферный солевой раствор (PBS)+1% BSA при 37°C. Буфер удаляли и заменяли свежим буфером высвобождения по прошествии различных периодов времени (например, 1, 2, 5, 7 и 10 суток), и собранные растворы хранили в 1,5 мл флаконах при -20°C для дальнейшего анализа.

Количество BMP-2, высвобождаемого в буфер, измеряли использованием коммерческого ELISA (Quantikine™ hBMP-2 ELISA, RnD Systems). ELISA проводили по инструкциям производителя.

Результаты

BMP не было обнаружено в буфере высвобождения, собранного из любого из биоимплантатов, в которые был загружен BMP. Образцы носителя, в которые был загружен rhBMP-2, продемонстрировали замедленное высвобождение rhBMP-2 за период проведения исследования, в то время как только образцы в средстве доставки были высвобождены в «первоначальном профиле высвобождения».

При объединении носителя и средства доставки были получены различные профили высвобождения в зависимости от загруженного в них компонента BMP. При загрузке 100% rhBMP-2 (9,1 мкг) в пределах 3PS (5 мг) носителя, который затем смешивали с 33% F127 (45,5 мкл), профиль высвобождения BMP соответствовал замедленной схеме, где количество BMP, высвобождаемого за первые 2 суток, составляло 5ng, с 3 по 5 сутки оно составляло 8 ng, и с 5 по7 сутки оно составляло 10ng (фигура 3; 100-0).

При загрузке 100% rhBMP-2 (9,1 мкг) в пределах 33% F127 (45,5 мкл)с последующим перемешиванием с 3PS носителем (5 мг), который не содержал в себе BMP, количество высвобождаемого BMP за первые сутки составляло 2363ng, за вторые сутки составляло 381ng, а затем - 12ng на третьи сутки (фигура 3; 0-100).

При распределении BMP между носителем и средством доставки, биоимплантат демонстрировал бифазный профиль высвобождения с промежуточным первоначальным высвобождением и последующим замедленным высвобождением BMP (фигура 3; 50-50).

ПРИМЕР 7: in vitro анализ для испытания активности высвобождаемых BMP.

В настоящем примере описано, как определить, сохраняет ли свою активность rhBMP-2, высвобождаемый из биоимплантатов. Для демонстрации биологической активности высвобождаемого rhBMP реактивные клетки можно культивировать с высвобождаемым продуктом и измерить их ответ на фактор роста. Такие анализы известны в данной области (см. Peel et al., J. Craniofac. Surg. 2003, 14:284-291).

Материалы и методы

Были приготовлены материалы с или без rhBMP-2, как описано в примерах с 1 по 5. Продукты высвобождения получали, как описано в примере 3, за исключением того, что буфером являлась минимальная эссенциальная среда Альфа с 15% эмбриональной бычьей сывороткой и антибиотиками (aMEM+15%FBS+AB)

Клетки C2C12 высевали на 24-луночные планшеты для культивирования тканей размером 0,5×10⁵ клеткок/мл, 1 мл альфа MEM+15%FBS на лунку. По прошествии различных периодов времени от 24 до 72 часов среду удаляли и наносили различные продукты высвобождения. Отрицательный контроль включал C2C12 клетки, культивированные с помощью свежего aMEM+15%FBS+AB. Положительный контроль включал C2C12 клетки, инкубированные с помощью aMEM+15%FBS+AB, содержащего 25, 50 и 100нг/мл rhBMP-2. Через 48 часов клетки лизировали в 1 мл буфере для лизиса клеток (Cellytic Sigma Aldrich), и активность щелочной фосфатазы (ALP) клеточных лизатов измерялась с использованием анализа пара-нитрофенол-фосфат (Sigma Aldrich). Содержание клеточного белка лизатов измеряли с использованием Coomassie Plus Реагент (Fisher) и использовали для нормализации активности щелочных фосфатов к количеству number клеток в каждой лунке.

Как правило, для определения потери активности BMP при связи с носителем или средством доставки оценивают стандартную кривую результатов активности ALP/PTN для стандартов rhBMP-2, которые не связаны с носителем или средством доставки. Концентрацию активного rhBMP-2 в продуктах высвобождения можно определить из данной стандартной кривой, и это выражается в процентном содержании общего количества rhBMP-2, присутствующего в продуктах высвобождения, как указано в ELISA.

ПРИМЕР 8: оценка остеоиндуктивной активности многофазных имплантатов BMP

В настоящем примере описано, как определить остеоиндуктивную активность BMP, содержащего биоимплантат in vivo. Для оценки способности биоимплантатов индуцировать костеобразование использовали анализ мышечного кармана мыши. В данной модели биоимплантат помещают в мышечный карман, полученный в задней конечности мыши, и размер образовавшейся индуцированной кости пропорционален количеству испытанного BMP. Такие анализы известны в данной области (см. например, Barr et al., Пероральн Surg. Пероральн Med. Пероральн Pathol. Пероральн Radiol. Endod., 2010; 109:531-40.)

Материалы и методы

Биоимплантаты получали, как описано в примерах 1 и 5. Под анестезией двусторонние карманы были сделаны в берцовых мышцах задней конечности самца CD-1 мыши возрастом 37-42 суток, тупым путем. Биоимплантаты затем помещали в стерильные желатиновые капсулы, которые были размещены в мышечном кармане. Мышцы подтягивали, и кожу сжимали зажимом Mitchel.

Животных подвергали эвтаназии на 28 послеоперационные сутки. Задние конечности собирали и фиксировали 10% буферным формалином. После фиксации были сделаны изображения образцов с использованием микросреза КТner (General Electric Healthcare eXplore™ Locus SP). Образцы сканировали и воссоздавали с помощью производственного программного обеспечения с разрешением 59 мкм. После воссоздания изображений исследуемую область Данная область включала все области, содержащие кость, индуцированную биоимплантатом. Их легко можно отличить от скелетных костей на основе расположения и плотности.

С целью проведения анализа количества и качества кости в исследуемой области, воксели mCT изображений сегментировали в костевые и некостевые стадии. Сегментирование было достигнуто посредством определения порогового значения для воксельных оттенков серого, в которых воксель считался костью. Общий объем (TV), объем костной ткани (BV), плотность костного минерала общего объема (TV-MD), плотность костного минерала объема костной ткани (BV-MD), плотность костного минерала общего объем (TV-MC), содержание минералов в объеме костной ткани (BV-MC) и часть объема костной ткани (BVF) исследуемой области определяли для каждого образца. Значения были скорректированы с учетом присутствия кальция ввиду носителя с использованием значения верхнего порога, который выбирал только носителя, и вычитания его из значений, полученных с использованием нижнего порога, который включал носителя вместе с новой костью (см. Humber et al., Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 2010. 109:372-384).

После завершения анализа microCT образцы либо закладывали в смолу, либо декальцифицировали в муравьиной кислоте и закладывали в воск. Образцы, заложенные в смоле, оценивали посредством СЭМ backscatter, в то время как образцы, заложенные в воске, были разрезаны и помечены следами гематоксилина и эозина (H&E) и исследованы посредством светолучевой микроскопии для оценки типов скани, присутствующих на участке имплантации.

Результаты

A носитель и средство доставки объединяли, как описано в пример 5.

Согласно показателям анализа MicroCT, биоимплантаты со всеми BMP в пределах носителя 3PS, имеюшего замедленный профиль высвобождения BMP, производили наименьшее количество косточек (фигура 4; 100-0 биоимплантаты со всеми BMP в пределах средства доставки F127, имеющего профиль выбросного высвобождения BMP, производили косточки промежуточного размера (фигура 4; 0-100), в то время как биоимплантаты с 50% BMP, загруженного на носитель и 50% загруженного на средство доставки с многофазным профилем высвобождения BMP произвели наибольшее количество косточек кости (фигура 4; 50-50).

СЭМ Backscatter показало, что к 28 суткам костеобразование произошло на всей протяженности биоимплантата и на частицах фосфата кальция particulate,включенных в PLGA (фигура 5). Гистологически подтверждено, что образованная ткань являлась костью (фигура 6).

ПРИМЕР 9: in vivo анализ для высвобождения BMP из биоимплантатов

В настоящем примере описано, как измерить высвобождение rhBMP-2 из различных биоимплантатов, описанное в примерах 1, 2, 3, 4 или 5, после имплантации в животном. Способы для осуществления этого хорошо известны в данной области. Например, см. Uludag et al. J Biomed Mater Res, 46, 193–202, 1999.

Материалы и методы

Рекомбинантный hBMP-2 является радиоактивно меченым с Iodine125 (I-125) от Perkin Elmer. Радиоактивно меченый rhBMP-2 (hot) смешивают с немеченым rhBMP-2 (холодным) для получения смешанной смеси 1:100.

Биоимплантаты, содержащие известное количество rhBMP-2, получают, как показано в примерах с 1 по 5. Биоимплантаты вживляли в животных, как описано в примере 8. В различные периоды времени животных умерщвляли, и вырезали участок имплантата. Вырезанную ткань затем взвешивали, и количество радиоактивности определли с использованием счетчика гамма-излучения.

Для определения связи подсчетываемого количества с белком, ткань гомогенизируется в 0,5 мл PBS+0,5% BSA. Два мл 10% трихлоруксусной кислоты, охлажденной до температуры замерзания, добавляют к гомогенату и затем выдерживают, по меньшей мере, 1 час при 4°C. Гомогенат затем центрифугируют и супернатант удаляют. Радиоактивность осадка затем измеряется с использованием счетчика гамма-излучения.

Осуществляется корректировка на распад радиоактивности, связанной с имплантатами, и оценивается общее количество BMP, остающегося в имплантате.

ПРИМЕР 10: Изготовление носителя с профилем короткого замедленного высвобождения

В настоящем примере описан способ получения носителя, высвобождающего фактор роста с профилем короткого замедленного высвобождения.

Материалы и методы

Макропористые бифазные гранулы (Eclipse) фосфата кальция (BCP) приобретали у Citagenix (Laval, Qc, Canada.) Рекомбинантный BMP-2 человека (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) получали буферной смеси (1,5 мг/мл, pH 4,5; 5 мм глутаминовая кислота, 2,5% глицин, 0,5% сахароза и 0,01% Tween™ 80 с ddH2O).

Стерильный раствор rhBMP-2 инкубировали со стерильными гранулами BCP в соотношении 9,1 мкг к 5 мг или 4,55 мкг к 5 мг (BMP к BCP) в течение 15-минутного встряхивания. Образцы затем были асептически.заморожены и лиофилизированы.

После лиофилизации носители взвешивали в 5 мг аликвотах и помещали в стерильные пробирки Epindorf. В некоторых пробирках находится 33% F127 (добавленного 45,5 мкл). Затем определяли профиль высвобождения BMP, как описано в примере 6.

Результаты

Носители, на которые наносилось F127 (BCP), показали профиль выбросного высвобождения наибольшего количества BMP, высвобожденного за первые сутки, а затем уменьшенного количества BMP, высвобожденного на каждом последующем моменте времени. Смешивание BCP в рамках F127 (BCP-Pol) приводило к профилю короткого замедленного высвобождения, при котором аналогичное количество BMP собирали каждые сутки за первые 4 суток (фигура 7).

ПРИМЕР 11: Изменение профиля замедленного высвобождения носителя

В настоящем примере описан способ изменения профиля высвобождения из носителя.

Материалы и методы

PLGA с различными показателями удельной вязкости и молекулярной массы были приобретены у Birmingham Polymers Inc. (Birmingham, AL). Носители были изготовлены с использованием этих PLGA, как описано в примере 1. Профиль высвобождения BMP из этих носителей определялся согласно способу Примера 6.

Результаты

Все носители произвели профили замедленного высвобождения. Однако высвобождаемого количества BMP отличалось в зависимости от вязкости/молекулярной массы используемого PLGA. Носители, полученные с низкой вязкостью PLGA (Pol-1), высвобождали больше rhBMP-2, чем носители с высокой вязкостью (Pol-2) PLGA, используемые за 12-недельный период проведения исследования (фигура 8).

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается комбинации многофазного высвобождения по меньшей мере одного фактора роста на участке применения, содержащей средство доставки, содержащее по меньшей мере один первый фактор роста, и носитель, содержащий по меньшей мере один второй фактор роста, где средство доставки представляет собой жидкий или гелеобразный полимер, который представлен в жидкой форме для нанесения на носитель и выполнен для высвобождения по меньшей мере одного первого фактора роста в первоначальном профиле высвобождения за первый период времени, и носитель состоит из множества частиц, которые выполнены для высвобождения по меньшей мере одного второго фактора роста в профиле замедленного высвобождения за второй период времени. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности в стимуляции заживления при защите от инактивации и разрушения. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 пр., 8 ил.

1. Комбинация многофазного высвобождения факторов роста на участке применения, содержащая:

- средство доставки, содержащее по меньшей мере один первый фактор роста, и

- носитель, содержащий по меньшей мере один второй фактор роста;

где:

- средство доставки представляет собой жидкий или гелеобразный полимер, который представлен в жидкой форме для нанесения на носитель и выполнен для высвобождения по меньшей мере одного первого фактора роста в первоначальном профиле высвобождения за первый период времени, и

- носитель состоит из множества частиц, которые выполнены для высвобождения по меньшей мере одного второго фактора роста в профиле замедленного высвобождения за второй период времени.

2. Комбинация по п. 1, где полимер представляет собой гель, образованный из полоксамера 407.

3. Комбинация по п. 1, где носитель содержит частицы фосфата кальция.

4. Комбинация по п. 1, где первый период времени включает несколько часов или дней и где второй период времени включает несколько дней или недель.

5. Комбинация по п. 1, где по меньшей мере один первый фактор роста и по меньшей мере один второй фактор роста являются одинаковыми или разными и по меньшей мере один из первого и второго факторов роста выбирают из: факторов роста суперсемейства трансформирующих факторов роста бета; инсулиноподобных факторов роста (IGF); факторов роста фибробластов (FGF); фактора роста тромбоцитов (PDGF) и факторов роста эндотелия сосудов (VEGF).

6. Комбинация по п. 1, где по меньшей мере один второй фактор роста представляет собой ВМР-2 или ВМР-7.

7. Комбинация по п. 1, где средство доставки доставляет по меньшей мере 10% от общего количества по меньшей мере одного первого фактора роста и носитель доставляет по меньшей мере 50% от общего количества по меньшей мере одного второго фактора роста.

8. Комбинация по п. 1, где множество частиц диспергировано в полимерной матрице.

9. Комбинация по п. 8, где полимерная матрица содержит полимолочную кислоту (PLA) или сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA).

10. Комбинация по п. 1, где по меньшей мере один второй фактор роста носителя предусмотрен на поверхности частиц или смешан внутри частиц.

11. Набор многофазного высвобождения факторов роста, содержащий:

- компонент-средство доставки;

- по меньшей мере один первый фактор роста, связанный со средством доставки и выполненный с возможностью быть доставленным с помощью средства доставки;

- компонент-носитель и

- по меньшей мере один второй фактор роста, связанный с носителем и выполненный с возможностью быть доставленным на носителе;

- где:

- средство доставки представляет собой жидкий или гелеобразный полимер, представленный в жидкой форме для нанесения на носитель и выполненный для высвобождения по меньшей мере одного первого фактора роста в первоначальном профиле высвобождения за первый период времени, и

- носитель содержит множество частиц и выполнен с возможностью высвобождения по меньшей мере одного второго фактора роста в профиле замедленного высвобождения за второй период времени.

12. Набор по п. 11, где носитель содержит частицы фосфата кальция.

13. Набор по п. 11, где по меньшей мере один второй фактор роста представляет собой ВМР-2 или ВМР-7.

14. Набор по п. 11, где по меньшей мере один первый фактор роста составляет по меньшей мере 10% от общего количества факторов роста, представленных в наборе, и по меньшей мере один второй фактор роста составляет по меньшей мере 50% от общего количества факторов роста, представленных в наборе.

15. Набор по п. 11, где первый период времени включает несколько часов или дней и второй период времени включает несколько дней или недель.

16. Набор по п. 11, где множество частиц диспергировано в полимерной матрице.

17. Набор по п. 11, где по меньшей мере один второй фактор роста носителя предусмотрен на поверхности частиц или смешан внутри частиц.

18. Набор по п. 11, где:

по меньшей мере один первый фактор роста и по меньшей мере один второй фактор роста являются одинаковыми или разными и по меньшей мере один из первого и второго факторов роста выбирают из: факторов роста суперсемейства трансформирующих факторов роста бета; инсулиноподобных факторов роста (IGF); факторов роста фибробластов (FGF); фактора роста тромбоцитов (PDGF) и факторов роста эндотелия сосудов (VEGF).

19. Набор по п. 11, где по меньшей мере один второй фактор роста представляет собой ВМР-2 или ВМР-7.