ИНЪЕЦИРУЕМЫЕ СТЕРЖНИ ИЗ ФОСФАТА КАЛЬЦИЯ ДЛЯ ДОСТАВКИ ОСТЕОГЕННЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K33/06 A61K33/42 A61K38/18 A61P19/10 

Родственные заявки

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США №60/502493, поданной 12 сентября 2003 г., описание которой включено в данную заявку по ссылке.

Область изобретения

[0002] Предлагаемое изобретение относится к области остеогенных белков и содержащих их фармацевтических составов.

Предпосылки создания изобретения

[0003] Идиопатический остеопороз - это заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся прогрессирующей потерей костной массы и повышенной хрупкостью костей, которые приводят к значительному увеличению подверженности переломам. Остеопороз входит в число самых распространенных заболеваний опорно-двигательного аппарата. Он поражает пятьдесят шесть процентов женщин старше 45 лет. Praemer et al., "Musculoskeletal Conditions in the United States" (Заболевания опорно-двигательного аппарата в Соединенных Штатах), Amer. Acad. of Orthopaedic Surgeons, Park Ridge, IL (1992). Поскольку число случаев остеопороза увеличивается с возрастом и процент заболеваемости среди пожилых лиц в популяции растет, со временем остеопороз станет более распространен. Местное лечение остеопороза затруднительно, и на сегодняшний день не существует известного средства или способа лечения. Наконец, и это является наиболее существенным, остеопороз связан со значительными заболеваемостью и смертностью. Наиболее серьезным видом переломов, причина которых - остеопороз, является перелом проксимальной части бедренной кости в области тазобедренного сустава. Переломы костей тазобедренного сустава, число случаев которых составляет более 300000 в год, в настоящее время являются самыми распространенными переломами среди пожилых людей. Каждая шестая женщина европеоидной расы в течение жизни переносит перелом костей тазобедренного сустава (Cummingset al., Arch. Intern. Med., vol. 149, pp.2455-2458 (1989)), а среди женщин, достигших возраста 96 лет, такой перелом переносит каждая третья.

[0004] Кроме лечения пораженных остеопорозом костей, существует потребность в способах лечения или профилактики связанных с остеопорозом переломов, например путем местного введения остеогенных белков. Остеогенные белки представляют собой белки, способные стимулировать формирование хряща и/или кости или способствовать стимуляции.

В последние годы было выделено и описано большое количество таких остеогенных белков, а некоторое количество было получено рекомбинантными методами.

[0005] Кроме того, были разработаны разнообразные лекарственные формы для доставки остеогенных белков в участок, где желательно стимулировать формирование кости.

[0006] Однако, несмотря на значительные усилия, прилагаемые в данной области, все еще остается потребность в эффективном способе восстановления и/или лечения пораженных остеопорозом или остеопенией костей, а также минимизации или снижения количества случаев или тяжести связанных с остеопорозом переломов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение относится к композициям для доставки остеогенных белков путем инъекции, т.е. к остеогенным композициям. Эти композиции могут иметь форму твердого стержня, предпочтительно цилиндрического твердого стержня, или отверждающейся пасты. Композиции содержат остеогенный кальций-фосфатный материал.

[0008] В некоторых предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения остеогенный белок может являться членом семейства «костных морфогенетических белков» (BMP), более предпочтительно - одним из белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 и BMP-13, а наиболее предпочтительно - белком BMP-2. Остеогенный белок предпочтительно присутствует в количестве, варьирующемся в пределах от приблизительно 1% до приблизительно 90%, более предпочтительно - от приблизительно 15% до приблизительно 40% от массы твердых стержней согласно данному изобретению, и в количестве, варьирующемся в пределах от приблизительно 0.01% до приблизительно 2%, более предпочтительно - от приблизительно 0.03% до приблизительно 1% от массы пасты согласно данному изобретению.

[0009] В некоторых предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения кальций-фосфатный материал содержит материал, выбранный из аморфного фосфата кальция типа апатита, слабокристаллизованного фосфата кальция типа апатита, гидроксиапатита, трикальция фосфата, фторапатита и их комбинаций. Наиболее предпочтительно кальций-фосфатный материал представляет собой слабокристаллизованный фосфат кальция типа апатита. Кальций-фосфатный материал предпочтительно присутствует в количестве, варьирующемся в пределах от приблизительно 10% до приблизительно 99%, более предпочтительно - от приблизительно 40% до приблизительно 60% от массы остеогенной композиции в форме стержня, и в количестве, варьирующемся в пределах от приблизительно 30% до приблизительно 70%, более предпочтительно - от приблизительно 45% до приблизительно 55% от массы остеогенной композиции в форме отверждающейся пасты.

[0010] Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения относятся к остеогенным композициям, которые содержат также ингибитор резорбции кости. Ингибитор резорбции кости предпочтительно представляет собой бифосфонат, выбранный из алендроната (alendronate), цимадроната (cimadronate), клодроната (clodronate), ЕВ 1053, этидронатов (etidronates), ибандроната (ibandronate), неридроната (neridronate), олпадроната (olpadronate), памидроната (pamidronate), резидроната (risedronate), тилудроната (tiludronate), YH 529, золедроната (zoledronate) и их фармацевтически приемлемых солей, эфиров, кислот, а также их смесей.

[0011] Другие варианты реализации настоящего изобретения относятся к остеогенным композициям, которые содержат также какую-либо добавку, выбранную из фармацевтически приемлемых солей, полисахаридов, пептидов, белков, аминокислот, синтетических полимеров, природных полимеров, поверхностно-активных веществ, а также их комбинаций, более предпочтительно выбранную из карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, полимера молочной кислоты (полилактида), полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, полиоксиэтилена оксида, карбоксивинилового полимера, поливинилового спирта, декстрана сульфата и их комбинаций. Добавка предпочтительно присутствует в количестве, варьирующемся в пределах от приблизительно 1% до приблизительно 90%, более предпочтительно - от приблизительно 20% до приблизительно 40% от массы остеогенной композиции в форме стержня, и в количестве, варьирующемся в пределах от приблизительно 1% до приблизительно 90%, более предпочтительно - от приблизительно 10% до приблизительно 20% от массы остеогенной композиции в форме отверждающейся пасты.

[0012] В случае, когда остеогенная композиция согласно настоящему изобретению имеет форму твердого цилиндрического стержня, диаметр этого цилиндрического стержня предпочтительно лежит в пределах от приблизительно 0.1 мм до приблизительно 3.0 мм, более предпочтительно - составляет приблизительно 1.0 мм, а длина цилиндрического стержня предпочтительно лежит в пределах от приблизительно 0.5 см до предпочтительно 5.0 см.

[0013] Еще один вариант реализации настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции в форме стержня для доставки остеогенных белков путем инъекции, при этом композиция содержит остеогенный белок и калций-фосфатный материал, а способ включаюет следующие этапы: (a) смешивание сухой формы остеогенного белка с сухой формой фосфата кальция, в результате которого получают сухую смесь; (b) восстановление сухой смеси путем добавления водного буфера, в результате которого получают пасту; (c) формовка пасты, в результате которой получают композицию в форме стержня; и (d) сушка композиции в форме стержня, полученной на этапе (c), в результате которой получают композицию в форме стержня для доставки остеогенных белков путем инъекции. В предпочтительных способах реализации водный буфер выбирают из фосфатного буферного раствора, физиологического раствора, буферов на основе глицина и глутаминовой кислоты и их комбинаций. Отношение объем: масса (мл:г) водного буфера к сухой смеси лежит в пределах от приблизительно 0.5:1 до приблизительно 2:1. Формовку предпочтительно выполняют путем формовки, экструзии, прессования, сверления или комбинаций этих операций. В некоторых предпочтительных способах реализации композицию в форме стержня нарезают перед этапом (d) или после него.

[0014] Еще один вариант реализации настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции в форме пасты для доставки остеогенных белков путем инъекции, при этом композиция содержит остеогенный белок и кальций-фосфатный материал, а способ включает этап смешивания сухой формы кальций-фосфатного материала с водным буфером, содержащим остеогенный белок, с получением пасты. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения водный буфер выбирают из фосфатного буферного раствора, физиологического раствора, буферов на основе глицина и глутаминовой кислоты и их комбинаций. Отношение водного буфера к кальций-фосфатному материалу варьируется от приблизительно 0.5:1 до приблизительно 2:1.

[0015] Дальнейшие варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам лечения млекопитающих, страдающих дефектами костей, включающим введение в участок дефекта кости эффективного количества описанной здесь композиции для доставки остеогенных белков путем инъекции. Дальнейшие варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам лечения млекопитающих, страдающих дефектами костей, включающим следующие этапы: (a) введение в участок дефекта кости эффективного количества описанной здесь композиции для доставки остеогенных белков путем инъекции, и (b) введение в участок дефекта кости эффективного количества ингибитора резорбции кости. Введение ингибитора резорбции кости можно проводить до этапа (a), после этапа (a) или одновременно с этапом (a).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0016] Фигура 1 представляет собой график, показывающий кинетику высвобождения rhВМР-2 из стержней α-BSM in vitro при использовании 1251-rhBMP-2 в качестве метки.

[0017] Фигура 2 представляет собой график, показывающий местное удержание rhBMP-2 из стержней α-BSM in vivo при использований 251-rhBMP-2 в качестве метки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0018] В целом, способы и составы согласно настоящему изобретению относятся к регенерации костной ткани и сопутствующему увеличению костной массы, плотности костей и прочности костей. Более конкретно, предложенное изобретение включает инъецируемые твердые стержни и пасты, содержащие остеогенный белок, кальций-фосфатный носитель и, факультативно, добавки и активные вещества, такие как ингибитор резорбции кости, а также способы приготовления таких остеогенных композиций и способы лечения, в которых применяются такие остеогенные композиции. Кальций-фосфатные твердые стержни и отверждающиеся пасты согласно настоящему изобретению подходят для внутрикостной доставки остеогенных белков. Посредством применения способов и композиций согласно настоящему изобретению можно успешно снизить тяжесть остеопороза и количество остеопоротических поражений, что, в конечном счете, приведет к уменьшению числа случаев переломов костей. Другие способы применения в клинике включают заживление переломов, восстановление хрящей, заживление несрастающихся дефектов и артродез. Инъецируемые твердые стержни и отверждающиеся пасты согласно настоящему изобретению можно также применять для стимуляции роста костей, что необходимо при использовании имплантантов для замещения суставов, согласно описанию предварительной заявки США №60/502526 ("Promotion of Bone growth in Joint Replacement Implants Using Osteogenic Proteins″ - Стимуляция роста кости в имплантах для замещения суставов); описание этой предварительной заявки включено в настоящую заявку во всей полноте путем ссылки.

[0019] Первый вариант реализации настоящего изобретения относится к композициям в форме стержней для доставки остеогенных белков путем инъекции, содержащим остеогенный белок и кальций-фосфатный материал. Композиция согласно этому первому варианту реализации настоящего изобретения может факультативно включать другие добавки (связующие вещества, наполнители) и/или активные вещества, такие как ингибитор резорбции кости.

[0020] Эти композиции в форме твердых стержней подходят для местной внутрикостной доставки и, следовательно, их можно вводить путем инъекции непосредственно в участок, пораженный остеопорозом или остеопенией, для эффективной стимуляции образования и/или сохранения кости. Кроме того, инъецируемые композиции в форме стержней демонстрируют замедленный характер высвобождения остеогенного белка, доставляемого таким способом. Твердые стержни согласно настоящему изобретению предпочтительно являются цилидрическими и имеют диаметр, варьирующийся от приблизительно 0.1 мм до приблизительно 3.0 мм, более предпочтительно, составляющий приблизительно 1.0 мм, что делает возможной доставку при помощи иглы размера 16G. Кроме того, твердые стержни предпочтительно имеют длину, варьирующуюся от приблизительно 1.0 мм до приблизительно 5.0 см.

[0021] В отличие от существующих инъецируемых составов остеогенные композиции согласно этому первому варианту реализации настоящего изобретения вводят в твердой форме, что позволяет избежать трудностей, связанных с жидкими или вязкими составами. Например, при использовании жидких или гелеобразных составов жидкости организма могут преждевременно разбавить остеогенное вещество до достижения эффекта стимулирования костей. Настоящее изобретение позволяет избежать эффекта разбавления благодаря применению твердого носителя, который медленно разрушается in vivo, обеспечивая, таким образом, отложенное, замедленное высвобождение активного вещества (веществ).

Кроме того, в отличие от жидких или вязких составов, которые могут мигрировать из места введения, твердые композиции согласно настоящему изобретению удерживаются и остаются в участке желательного роста кости, где они вызывают стимуляцию роста кости. Такие композиции также позволяют более точно размещать твердый стержень путем инъекции в зоны потери костной массы. Обычно композиция должна оставаться в этом участке от приблизительно 5 дней до приблизительно 2 месяцев. В случае преждевременного разрушения композиции либо не будет иметь место желаемый эффект стимуляции роста кости, либо образовавшаяся кость не будет обладать желаемой прочностью. Наконец, хотя остеогенную композицию согласно этому способу реализации настоящего изобретения вводят в твердой форме, ее предпочтительно формуют в виде цилиндрического стержня, что делает ее подходящей как для введения путем инъекции, так и для имплантирования в организм. Безусловно, при желании можно использовать другие формы стержней, например шестигранные, квадратные или полукруглые. Кроме того, применение твердых стержней в значительной степени подавляет хорошо известное хирургическое осложнение, связанное с возникновением эмболии в ходе процедуры внутрикостной инъекции (по сравнению с жидкими или гелеобразными формами). Поскольку объем вводимого путем инъекции высококонцентрированного твердого стержня намного меньше того, который требуется для распределения той же дозы в жидкой или гелеобразной форме, уменьшается риск возможного смещения внутрикостных фрагментов кости, жира или эмболии, вызываемых инъекцией большого объема жидкого/гелеобразого носителя под давлением. Данную композицию можно применять в участке желательного роста кости любым удобным способом, включая введение при помощи обычной иглы для подкожных инъекций или шприца.

[0022] Второй способ реализации настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции в форме твердого стержня для доставки остеогенных белков путем инъекции. На первом этапе сухую форму остеогенного белка смешивают с сухой формой кальций-фосфатного материала, получая в результате сухую смесь. Другими словами, сначала для образования сухой смеси применяют порошкообразные или сухие формы как остеогенного белка, так и фосфата кальция. В случае, когда в композицию включены добавки и/или дополнительные активные вещества, эти материалы также можно применять в сухой или порошкообразной форме и включать в сухую смесь.

[0023] На втором этапе сухую смесь восстанавливают путем добавления водного буфера, получая в результате пасту. Подходящие водные буферы включают, без ограничения, фосфатный буферный раствор, физиологический раствор, буферы на основе глицина и их комбинации.

В случае, когда в качестве остеогенного белка применяют ВМР-2, предпочтительно применяют буфер на основе глицина с рН, приблизительно равным 4.5; более предпочтительно - буфер на основе глицина, имеющий следующий состав: 5 ммоль L-глутаминовой кислоты, 2.5% глицина, 0.5% сахарозы, 5 ммоль NaCl и 0. 01% полисорбата polysorbate 80.

[0024] Отношение объем : масса (мл:г) водного буфера к сухой смеси варьирует от приблизительно 0.5:1 до приблизительно 2:1. Однако нижний предел этого массового отношения ограничивает лишь один принцип: количество добавляемой к сухой смеси жидкости должно быть достаточным для образования пасты, которую можно формовать путем выдавливания из шприца или другим способом. Кроме того, верхний предел этого массового отношения также ограничивает лишь один принцип: количество добавляемой к сухой смеси жидкости должно быть настолько большим, чтобы после последующего высушивания полученная форма, т.е. форма стержня, нарушалась; другими словами, если использовать слишком много жидкости, образованная на третьем этапе форма стержня после сушки остеогенного соединения будет нарушена.

[0025] Этот этап проводят в условиях, при которых происходит практически равномерное смешивание. В процессе смешивания компоненты объединяются, и его можно использовать для контроля реакций между компонентами. Хотя предпочтительно, чтобы сухая смесь содержала все желаемые компоненты, также возможно добавлять добавку или дополнительное активное вещество непосредственно перед началом смешивания или перед завершением смешивания. Такие добавка или активное вещество предпочтительно имеют сухую форму, однако также возможно добавлять к пасте добавку или дополнительное активное вещество в гидратированной форме.

[0026] На третьем этапе способа согласно настоящему изобретению пасту формуют, в результате чего образуется композиция в форме стержня. Формовку или придание формы можно выполнять, применяя одну из ряда известных методик, таких как формовка, экструзия, прессование, сверление и/или резка. В предпочтительном способе реализации этого изобретения пастой заполняют шприц для подкожный инъекций и экструдируют ее через носик для иглы. В этом случае вставляют шток шприца и прикладывают достаточное давление, чтобы экструдировать непрерывный длинный отрезок пасты на какую-либо сухую поверхность. Затем при помощи какого-либо режущего инструмента, такого как бритва, скальпель, нож и т.п., наносят разрезы, в результате чего образуются инъецируемые композиции в форме стержней. Резку можно также проводить после описанного ниже этапа сушки. В качестве альтернативы, пасту можно поместить в цилиндрическую форму, катетер, воздухо- или газопроницаемую трубку (например, из силикона или Теflоn®/FЕР (фторированный этилен-пропилен)) или любое другое приспособление экструзионного типа.

[0027] На последнем этапе полученную на предыдущем этапе композицию в форме стержня сушат или отверждают, в результате чего образуется композиция в форме стержней для доставки остеогенных белков путем инъекции согласно настоящему изобретению (первый способ реализации). Сушку можно проводить путем высушивания на воздухе или инкубации при повышенных температурах, т.е. по меньшей мере 37°С. Температура сушки ограничивается лишь заботой о том, чтобы не произошло разрушения остеогенного белка, которое обычно происходит где-то в диапазоне от 55°С до 60°С.

При проведении сушки в сушилке на 37°С сушка занимает приблизительно по меньшей мере один час, а предпочтительно сушку проводят в течение ночи. Остаточная влажность композиции в форме стержня составляет предпочтительно менее 10%.

[0028] Третий способ реализации настоящего изобретения относится к композиции в форме отверждающейся пасты для доставки остеогенных белков путем инъекции, содержащей остеогенный белок и кальций-фосфатный материал. Композиция согласно этому третьему способу реализации настоящего изобретения может факультативно включать другие добавки (связующие вещества, наполнители) и/или активные вещества, такие как ингибитор резорбции костей.

[0029] Эта паста подходит для местной внутрикостной доставки, и, следовательно, ее можно вводить путем инъекции непосредственно в участок, пораженный остеопорозом или остеопенией, после чего эта паста затвердевает до образования твердой формы и эффективно стимулирует образование и/или сохранение кости. Поскольку после введения паста затвердевает в условиях по меньшей мере 37°С, т.е. в организме млекопитающего, устраняются многие недостатки, связанные с применением жидких и гелеобразных композиций. Аналогично описанным выше инъецируемым композициям в форме твердых стержней композиция в форме затвердевшей пасты демонстрирует замедленный характер высвобождения остеогенного белка. Время жизни инъецируемой отверждающейся пасты (т.е. время, в течение которого пасту возможно вводить путем инъекции) можно продлить путем охлаждения пасты.

[0030] Четвертый вариант реализации настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции в форме пасты для доставки остеогенных белков путем инъекции. В этом способе сухую форму кальций-фосфатного вещества смешивают с водным буфером, содержащим остеогенный белок, в результате чего образуется паста. В случае, когда в композицию включены добавки и/или дополнительные активные вещества, эти материалы также можно либо применять в сухой форме и смешивать их предварительно с сухой формой кальций-фосфатного материала, либо смешивать непосредственно с водным буфером и кальций-фосфатным материалом. Смешивание проводят в условиях, при которых происходит практически равномерное смешивание. В процессе смешивания компоненты объединяются, и его можно использовать для контроля реакций между компонентами.

[0031] Подходящие водные буферы включают, без ограничения, фосфатный буферный раствор, физиологический раствор, буферы на основе глицина и их комбинации. В случае, когда в качестве остеогенного белка применяют ВМР-2, применяют предпочтительно буфер на основе глицина с рН, приблизительно равным 4.5; более предпочтительно - буфер на основе глицина, имеющий следующий состав: 5 ммоль L-глутаминовой кислоты, 2.5% глицина, 0.5% сахарозы, 5 ммоль NaCl и 0.01% полисорбата polysorbate 80. Массовое отношение водного буфера к сухому фосфату кальция варьируется от приблизительно 0.5:1 до приблизительно 2:1.

[0032] В качестве альтернативы сухую форму остеогенного белка смешивают с сухой формой кальций-фосфатного материала, получая в результате сухую смесь. Затем эту сухую смесь восстанавливают путем добавления водного буфера, получая пасту. Эти этапы идентичны первому и второму этапам способа приготовления композиции в форме твердого стержня (второй способ реализации) за исключением того, что массовое отношение водного буфера к сухому фосфату кальция варьируется от приблизительно 0.5:1 до приблизительно 2:1.

[0033] Ниже приведено более подробное описание активного вещества, носителя, добавок и ингибиторов резорбции кости, подходящих для применения в настоящем изобретении.

АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО

[0034] Активное вещество, присутствующее в остеогенных композициях согласно настоящему изобретению, предпочтительно выбирают из семейства белков, известного как надсемейство белков «трансформирующих факторов роста бета» (TGF-β). Это семейство включает активины, ингибины и «костные морфогенетические белки» (BMPs). Эти белки BMP включают ВМР-белки ВМР-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и ВМР-7, раскрытые, например, в Патентах США №5108922, 5013649, 5116738, 5106748, 5187076 и 5141905, BMP-8, раскрытый в РСТ WO 91/18098, BMP-9, раскрытый в РСТ WO 93/00432, BMP-10, раскрытый в РСТ WO 94/26893, BMP-11, раскрытый в РСТ WO 94/26892, BMP-12 и BMP-13, раскрытый в РСТ WO 95/16035, BMP-15, раскрытый в Патенте США № 5635372, и BMP-16, раскрытые в Патенте США №6331612. Другие белки ТФР-бета (TGF-β), которые можно применять в настоящем изобретении в качестве активных веществ, включают Vgr 2 (Jones et al., Mol. Endocrinol., vol. 6, pp.1961 1968 (1992)), а также любые другие факторы роста и дифференцировки (growth and differentiation factor, GDF), включая описанные в РСТ WO 94/15965, WO 94/15949, WO 95/01801, WO 95/01802, WO 94/21681, WO 94/15966, WO 95/10539, WO 96/01845, WO 96/02559 и др. В настоящем изобретении также можно использовать BIP, раскрытый в WO 94/01557, НР00269, раскрытый в JP 7 250688, и МР52, раскрытый в РСТ WO 93/16099. Описания всех указанных выше патентов, публикаций в журналах и опубликованных международных заявок включены в настоящую заявку по ссылке.

[0035] Предпочтительно активное вещество включает по меньшей мере один белок, выбранный из подкласса белков, широко известных как BMP, у которых была обнаружена остеогенная активность и другие типы ростовой и дифференцировочной активности. Субпопуляция белков BMP, предпочтительных в настоящий момент для применения в настоящем изобретении, включает BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 и BMP-13, наиболее предпочтителен ВМР-2, последовательность которого раскрыта в Патенте США №5013649, описание которого включено в настоящую заявку по ссылке

[0036] Активное вещество может представлять собой вещество, полученное рекомбинантными способами или выделенное из белковой композиции (очищенное). Активное вещество, например TGF-β, такой как BMP, или другой димерный белок, может представлять собой гомодимер или гетеродимер с другими BMP (например, гетеродимер, образованный одним мономером BMP-2 и одним мономером ВМР-6) или с другими членами надсемейства TGF-β, такими как антивины, ингибины и TGF-β1 (например, гетеродимер, образованный одним мономером BMP и одним мономером родственного члена надсемейства T4F-β). Примеры таких гетеродимерных белков описаны, например, в РСТ WO 93/09229, описание которой включено в настоящую заявку по ссылке. Активное вещество может содержать ДНК, кодирующую белки BMP, и клетки, трансдуцированные или трансфецированные генами, кодирующими ВМР-белки.

[0037] Активное вещество может, кроме того, содержать дополнительные вещества, такие как белки Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus и Follistatin. Эти семейства белков описаны в общих чертах в Sasai et al., Cell, vol. 79, pp.779-790 (1994) (Chordin); РСТ WO 94/05800 (Noggin); и Fukui et al., Dev. Biol., vol. 159, pp.131-139 (1993) (Follistatin). Белки Hedgehog описаны в РСТ WO 96/16668, WO 96/17924 и WO 95/18856. Семейство белков Frazzled представляет собой сравнительно недавно открытое семейство белков, обладающих высокой гомологией с внеклеточным доменом рецепторных белков семейства, известного как frizzled. Семейство генов и белков Frizzled описано в Wang et al., J. Biol. Chem., vol. 271, pp.4468-4476 (1996). Активное вещество может также включать другие растворимые рецепторы, такие как укороченные растворимые рецепторы, раскрытые в PCT WO 95/07982.

Из описания WO 95/07982 специалисту в данной области будет понятно, что можно приготовить укороченные растворимые рецепторы для множества других рецепторных белков. Приготовленные таким образом укороченные рецепторы также включены в настоящее изобретение. Указанные выше публикации включены в настоящую заявку по ссылке.

[0038] Количество активного вещества, применяемое здесь, представляет собой количество, достаточное (эффективное) для стимуляции повышенной остеогенной активности существующего или инфильтрирующего предшественника (клетка-предшественник остеобластов) или других клеток (здесь и далее «эффективное количество»). Оно будет зависеть от размера и природы дефекта, который подвергают лечению, а также от состава применяемого кальций-фосфатного носителя. Обычно количество остеогенного белка, присутствующее в остеогенной композиции в форме твердого стержня согласно настоящему изобретению, варьирует от приблизительно 1% до приблизительно 90%, более предпочтительно - от приблизительно 15% до приблизительно 40% от массы остеогенной композиции. Обычно количество остеогенного белка, присутствующее в остеогенной композиции в форме отверждающейся пасты согласно настоящему изобретению, варьирует от приблизительно 0.01% до приблизительно 2%, более предпочтительно - от приблизительно 0.03% до приблизительно 1% от массы остеогенной композиции.

НОСИТЕЛЬ

[0039] Согласно всем примерам реализации настоящего изобретения в качестве носителя применяют кальций-фосфатный материал. «Кальций-фосфатный материал» означает здесь любой синтетический материал, замещающий кость, содержащий в качестве основного компонента фосфат кальция, т.е. материал, не менее 90% массы которого может быть отнесено на счет кальция и/или фосфата. Кальций-фосфатный материал согласно настоящему изобретению может представлять собой любой биосовместимый кальций-фосфатный материал, известный в данной области.

Подходящие фосфатно-кальциевые материалы могут быть получены любым из разнообразных способов, при использовании любых подходящих исходных компонентов, либо приобретены.

[0040] В некоторых предпочтительных примерах реализации настоящего изобретения кальций-фосфатный материал присутствует в количествах, варьирующих от приблизительно 10% до приблизительно 99%, более предпочтительно - от приблизительно 40% до приблизительно 60% от массы остеогенной композиции в форме твердого стержня согласно настоящему изобретению. В некоторых других предпочтительных способах реализации настоящего изобретения кальций-фосфатный материал присутствует в количестве, варьирующем от приблизительно 30% до приблизительно 70%, более предпочтительно - от приблизительно 45% до приблизительно 55% от массы остеогенной композиции в форме отверждающейся пасты согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, кальций-фосфатный материал применяют в сухой, т.е. порошкообразной форме.

[0041] Формы фосфата кальция, подходящие для применения в этом изобретении, включают без ограничения аморфный фосфат кальция типа апатита (АСР, АФК), слабокристаллизованный фосфат кальция типа апатита (СКА, РСА), гидроксиапатит (ГА), трикальция фосфат и фторапатит. В предпочтительном примере реализации кальций-фосфатный материал представляет собой твердый слабокристаллизованный фосфат кальция типа апатита, имеющий отношение кальций-к-фосфату (Ca/Р), сравнимое с отношением встречающихся в природе минеральных компонентов костей, более предпочтительно - имеющий отношение кальций-к-фосфату ниже, чем приблизительно 1:1.5, наиболее предпочтительно - приблизительно 1:1.4.

[0042] Подходящие РСА-материалы можно идентифицировать путем смешивания предшественников РСА, гидрирования ограниченным количеством воды (с образованием замазки или пасты), формования в стержни цилиндрической формы, после чего сформованный материал оставляют для затвердевания до состояния РСА-материала. Желательные предшественники способны к затвердеванию во влажной среде при температуре, равной или приблизительно равной температуре тела, в течение менее чем 5 часов, а предпочтительно - в пределах 10-30 минут.

[0043] Согласно настоящему изобретению кальций-фосфатный носитель может содержать любой замещающий кость материал, который содержит одну из указанных выше форм фосфата кальция в качестве основного компонента, т.е. по меньшей мере 90% массы которого может быть отнесено на счет кальция и/или фосфата. Замещающий кость материал может содержать только одну из указанных выше форм фосфата кальция, с дополнительными компонентами или без них, или же замещающий кость материал может содержать комбинацию описанных выше форм фосфата кальция с дополнительными компонентами или без них. Кроме того, для приготовления кальций-фосфатного материала, подходящего для применения в настоящем изобретении, можно использовать одну или более из указанных выше форм фосфата кальция.

Способы изготовления таких материалов хорошо известны в данной области. Однако подойдет любой способ, результатом которого является получение сухого кальций-фосфатного материала, т.е. порошкообразного.

[0044] «Аморфный» означает здесь материал, в значительной степени обладающий свойством аморфности. «Значительная степень аморфности» подразумевает содержание аморфного вещества более 75%, предпочтительно - более 90% и характеризуется широкой, лишенной характерных особенностей дифрактограммой.

[0045] Термины "Слабокристаллизованный фосфат кальция типа апатита", "РСА-фосфат кальция" и "РСА-материал" используются здесь для описания синтетического слабокристаллизованного фосфата кальция типа апатита. Слабокристаллизованный материал типа апатита не ограничивается единственной фазой фосфата кальция, при условии, что он обладает характеристическими спектрами рентгеновской дифракции (XRD) и инфракрасными спектрами Фурье (FITR). Фосфат кальция РСА обладает практически таким же спектром рентгеновской дифракции, что и кость. Спектр рентгеновской дифракции обычно характеризуется лишь двумя широкими пиками в области 20-35Е, причем центр одно приходится на 26Е, а другого - на 32Е. ИК спектр Фурье характеризуется пиками на 563 см^-1, 1034 см^-1, 1638 см^-1 и 3432 с см^-1 (±2 см^-1); крутые склоны наблюдаются при 603 см^-1 и 875 см^-1, причем дублет имеет максимумы при 1422 см^-1 и 1457 см^-1. Материалы РСА, предпочтительные для применения в настоящем изобретении, описаны в Патентах США №№5650176, 5683461 и 6214368, описание каждого из которых включено в данную заявку по ссылке. Подходящие материалы описаны также в серии родственных заявок, озаглавленных "Delivery Vehicle" (Носитель для доставки) "Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Form a Novel Bioceramic" (Переработка аморфного фосфата кальция с целью образования нового биокерамического материала), "Orthopedic and Dental Ceramic Implants" (ортопедические и стоматологические керамические имплантаты) и "Bioactive Ceramic Composites" (биоактивные керамические композиты), при этом все указанные патенты поданы 16 октября 1997 на имя корпорации ЕТЕХ Corporation (Кембридж, Массачусетс) и включены в настоящую заявку по ссылке. Учитывая полноту описания этих вышеупомянутых патентных документов, мы не будем подробно описывать детали приготовления подходящих материалов РСА. Обзора свойств РСА будет достаточно. Материал РСА отличается способностью к биорезорбции (рассасыванию) и минимальной кристалличностью. Кристалличность РСА практически совпадает с кристалличностью костей. Также материал РСА биосовместим и не причиняет вреда организму, в который его вводят.

[0046] Кристаллический гидроксиапатит (ГА, НА) описан, например, в патентах США №№33221 и 33161, каждый из которых включен в настоящую заявку по ссылке. В этих патентах описано, как готовить реминерализующие кальций-фосфатные композиции и тонкокристаллический, некерамический, постепенно рассасывающийся материал-носитель из гидроксиапатита на основе тех же кальций-фосфатных композиций.

Аналогичная кальций-фосфатная система, которая состоит из тетракальций фосфата (ТТСР) и монокальций фосфата (МСР) или его моногидратной формы (МСРМ), описана в патентах США №5053212 и 5129905, каждый из которых включен в описание настоящей заявки по ссылке. Дополнительные кристаллические НА-материалы, широко известные как даллиты, описаны в патенте США №5962028, описание которого включено в настоящую заявку по ссылке.

ДОБАВКИ

[0047] В остеогенных композициях согласно настоящему изобретению можно применять добавки. Многие подобные связующие вещества, которые повышают когезионную способность (способность к сцеплению), и наполнители, которые стабилизируют и/или регулируют высвобождение активных компонентов, хорошо известны специалистам в области составления рецептур. Подходящие добавки включают, без ограничения, фармацевтически приемлемые соли, полисахариды, пептиды, белки, аминокислоты, синтетические полимеры, природные полимеры и/или поверхностно-активные вещества. Подходящие полимеры включают, например, полимеры, описанные в Патенте США №5171579, описание которого полностью включено в настоящую заявку по ссылке. Предпочитаемые добавки включают материалы типа целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ, CMC), гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ, НРМС) и метилцеллюлоза (МЦ, МС), синтетические полимеры, такие как полимеры молочной кислоты (полилактиды) и полиэтиленгликоли, например полилактид/полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон (ПВП, PVP), полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG), полиоксиэтиленоксид, карбоксивиниловый полимер и поливиниловый спирт (ПВС, PVA), а также декстран сульфат и их комбинации. Другие подходящие добавки включают, без ограничения, альгинат натрия, хитозан, коллаген, желатин, гиалуронан, а также различные пептиды, белки и аминокислоты. На данный момент не предполагается использовать в настоящем изобретении добавки, которые обладают вспенивающим эффектом.

[0048] В одном из предпочтительных способов реализации настоящего изобретения применяют добавку в сухой или порошкообразной форме, которую смешивают с активными веществами, носителем и водной жидкостью для того, чтобы приготовить инъецируемую композицию согласно настоящему изобретению. В некоторых предпочтительных способах реализации добавка (добавки) присутствует в количестве, варьирующем от приблизительно 1% до приблизительно 90%, более предпочтительно - от приблизительно 20% до приблизительно 40% от массы остеогенной композиции в форме твердых стержней. В некоторых предпочтительных способах реализации настоящего изобретения активное вещество (вещества) присутствует в количестве, варьирующем от приблизительно 1% до приблизительно 90%, более предпочтительно - от приблизительно 10% до приблизительно 20% от массы остеогенной композиции в форме отверждающейся пасты.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА.

[0049] Инъецируемые остеогенные композиции согласно настоящему изобретению могут также включать дополнительное активное вещество или дополнительные активные вещества. Такие дополнительные активные вещества можно смешивать, предпочтительно в сухой форме, хотя гидрированные формы также подходят для применения, с активным веществом, носителем или водной жидкостью для приготовления инъецируемых остеогенных композиций согласно настоящему изобретению. В качестве альтернативы подобные дополнительные активные вещества можно вводить параллельно с остеогенными композициями согласно настоящему изобретению либо в какой-либо последовательности, либо одновременно (здесь и далее «схема параллельного введения»). Дополнительные активные вещества можно применять либо для достижения дополнительных желаемых эффектов, либо, в некоторых случаях, для противодействия возможным нежелательным эффектам, таким как инфекция, воспаление и транзиторная (transient) резорбция (рассасывание).

[0050] Например, хотя многое уже известно об возможности остеогенного применения белков TGF-β, недавние отчеты показывают, что местное введение определенных «остеостимулирующих» веществ, таких как ВМР-2, стимулирует транзиторную активность остеокластов (местные очаги резорбции) в участке введения. Эта реакция, которая иногда предшествует образованию новой кости, индуцированному белком BMP, была названа «явление транзиторной резорбции». Вещества - известные ингибиторы резорбции кости могут, следовательно, играть важную роль в задержке или уменьшении первоначальной резорбции кости, связанной с местным введением BMP, не подавляя последующего образования кости.

[0051] Таким образом, в предпочтительных примерах реализации настоящего изобретения ингибитор резорбции кости применяют в качестве дополнительного активного вещества, присутствующего в инъецируемой остеогенной композиции либо в качестве ко-агента, вводимого параллельно с инъецируемой остеогенной композицией для минимизации начальной резорбции кости, связанной с внутрикостной доставкой активного вещества, такого как BMP. Термин «подавление резорбции кости» используется в настоящем описании для обозначения предотвращения (профилактики) потери костной ткани, в частности - подавления потери существующей костной ткани вследствие непосредственного или опосредованного изменения образования остеокластов или их активности. Таким образом, термин «ингибитор резорбции кости» используется в настоящем описании для обозначения вещества, которое предотвращает или подавляет (ингибирует) потерю костной ткани вследствие непосредственного или опосредованного изменения образования остеокластов или их активности.

[0052] В некоторых предпочтительных способах реализации ингибитор резорбции кости представляет собой бифосфонат. Термин «бифосфонат» используется в настоящем описании для обозначения соответствующих бифосфоновых кислот и солей, а также разнообразных кристаллических и аморфных форм бифосфоната. Клинически было показано, что лечение бифосфонатом резко снижает индексы ремоделирования кости, увеличивает минеральную плотность костей, а также снижает риск перелома бедра и позвоночника у страдающих остеопорозом женщин (см., например, Н.Fleisch, Bisphosphonates in Bone Disease, from the Laboratory to the Patient (Биофосфонаты при заболевании костей. Из лаборатории к пациенту), 3rd ed., Parthenon Publishing (1997), которая включена в настоящую заявку по ссылке).

[0053] Подходящие для применения в настоящем изобретении бифосфонаты включают, без ограничения, алендронат, цимадронат, клодронат, ЕВ 1053, этидронаты, ибандронат, неридроната олпадронат, памидронат, резидронат, тилудронат, YH 529, золедронат и их фармацевтически приемлемые соли, эфиры, кислоты, а также их смеси. Количество бифосфоната и, фактически, количество любого ингибитора резорбции кости, которое может оказаться полезным, представляет собой количество, эффективное для предотвращения или подавления временной (transient) потери костной ткани, связанной иногда с местным введением остеогенного белка, такого как BMP (здесь и далее - «эффективное количество»), путем непосредственного или опосредованного изменения образования или активности остеокластов, а необходимая дозировка будет зависеть от величины и природы подвергаемого лечению дефекта кости, а также от количества доставляемого остеогенного вещества. Обычно количество бифосфоната, которое необходимо доставить, варьирует от приблизительно 0.1 до приблизительно 3000 мг, более предпочтительно - от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мг, а наиболее предпочтительно - от приблизительно 10 до приблизительно 500 мг на кубический сантиметр материала.

[0054] В случае применения схемы параллельного введения согласно настоящему изобретению ингибитор резорбции кости обычно доставляют в подходящем носителе.

Этот носитель может представлять собой любой фармацевтически приемлемый носитель. Многочисленные и разнообразные фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и легко доступны в данной области (см., например, Martin, Е.W., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., текущее издание, которое включено в настоящее описание по ссылке). Предпочитаемые в настоящее время носители готовят в форме твердых стержней или паст, как описано в других разделах настоящей заявки.

[0055] В схеме параллельного введения ингибитор резорбции можно вводить последовательно (либо до, либо после) или одновременно с инъецируемыми композициями в форме твердых стержней или паст согласно настоящему изобретению. Кроме того, ингибитор резорбции кости можно применять местно (внутрикостно), но также его можно применять парентерально в других участках, например внутримышечно или подкожно, либо перорально путем проглатывания, или вводить внутривенно путем инъекции для системной доставки. Предпочтительно ингибитор резорбции кости, например бифосфонат, доставляют системно, т.е. пероральным или внутривенным путями, либо до введения композиции в форме инъецируемого твердого стержня или пасты согласно настоящему изобретению, либо одновременно с ним. Далее ингибиторы резорбции кости можно имплантировать хирургическим путем в участок, который предстоит лечить. Следует отметить, однако, что несмотря на свои терапевтические преимущества, бифосфонаты плохо всасываются в желудочно-кишечном тракте при пероральном приеме. Чтобы разрешить проблему плохой биодоступности, применяли внутривенное введение, однако этот способ считают дорогостоящим и неудобным вследствие продолжительности процедуры и необходимости частого введения доз. Настоящее изобретение может, следовательно, устранить этот недостаток благодаря введению бифосфоната в остеогенную композицию согласно настоящему изобретению и местной доставке непосредственно в участок, где желательно его действие.

[0056] Вышеприведенное описание, относящееся к введению ингибитора резорбции кости относится в общем также к введению любого дополнительного активного вещества. Другие подходящие дополнительные активные вещества включают, без ограничения, другие остеогенные белки, антибиотики, противовоспалительные препараты, факторы роста, пептиды, белки, цитокины, олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, ДНК и полимеры.

Эти соединения можно добавлять, предпочтительно в сухой форме, путем смешения, с получением в результате пасты, как описано в методиках приготовления согласно настоящему изобретению.

МЕТОДИКИ ВВЕДЕНИЯ

[0057] Настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции для лечения пациентов, у которых обнаружены дефекты костей. «Дефекты костей» в используемом здесь значении включают поражение костей остеопорозом, поражение костей остеопенией, переломы костей, дефект хрящей, а также любые другие заболевания, имеющие отношения к костям или хрящам, которые можно облегчить или скорректировать при помощи стимуляции роста кости или хряща. Соответственно пятый вариант реализации настоящего изобретения относится к способу лечения млекопитающих, имеющих какой-либо дефект костей, путем введения в пораженный участок (участок дефекта) эффективного количества инъецируемой композиции в форме стержня или пасты согласно настоящему изобретению.

[0058] Родственный шестой пример реализации настоящего изобретения относится к способу лечения млекопитающих, имеющих дефект кости, путем введения в пораженный участок эффективного количества композиции в форме стержня или пасты согласно настоящему изобретению, а также путем введения эффективного количества ингибитора резорбции кости. Ингибитор резорбции кости можно также вводить в участок дефекта кости, но его можно вводить и каким-либо другим путем, т.е. парентерально, путем хирургической имплантации, перорально, внутривенно. Кроме того, введение ингибитора резорбции кости может иметь место до введения композиции в форме стержня или пасты согласно настоящему изобретению, одновременно с ним или после него.

[0059] В целом, способы и композиции согласно настоящему изобретению предназначены для лечения пациентов, демонстрирующих признаки заболеваний, связанных с остеопорозом или остеопенией, включая остеопоротические поражения костей. Выявление таких пациентов можно осуществлять при помощи любых известных в соответствующей области процедур.

Такие процедуры дают клиницисту информацию относительно локализации и тяжести остеопоратических и остеопенических поражений костей. Помимо определения локализиции поражения поражений, которые предстоит лечить, клиницист может использовать эту информацию для выбора подходящего для данного пациента способа введения и дозы остеостимулирующего вещества. Подходящие диагностические процедуры включают измерение массы/плотности кости путем двухэнергентической рентгеновской абсорбциометрии (ДРА, DEXA), Kilgus, et al., J. Bone & Joint Surgery, vol. 75 В, pp.279-287 (1992); Markel, et al., Acta Orthop. Scand., vol.61, pp.487-498 (1990); и количественную компьютерную томографию (ККТ, QCT), Laval Jeantet, et al., J. Comput. Assist. Tomogr., vol.17, pp.915-921 (1993); Markel, Calcif. Tissue Int., vol.49, pp.427-432 (1991); однофотонную абсорбциометрию Markel, et al. Calcif. Tissue Int., vol.48, pp.392-399 (1991); трансмиссионную скорость ультразвука (UTV); Heaney, et al., JAMA, vol.261, pp.2986-2990 (1989); Langton, et al., Clin. Phys. Physio. Meas., vol.11, pp.243-249 (1990); а также радиографическое измерение, Gluer, et al., J. Bone Min. Res., vol.9, pp.671-677 (1994). Другие способы выявления пациентов с риском перелома костей включают оценку связанных с возрастом факторов, таких как внимание, а также предшествующие случаи переломов, связанных с остеопорозом, Porter, et al., BMJ, vol.301, pp.638-641 (1990); Hui, et al., J. Clin. Invest, vol.81, pp.1804-1809 (1988). Указанные выше публикации включены в настоящую заявку по ссылке.

[0060] Конкретные режимы дозирования будут зависеть от клинических симптомов, на которые направлено лечение, а также от различных особенностей пациента (например, вес, возраст, пол) и клинической картины (например, степени повреждения, участка повреждения и т.п.).

[0061] Инъецируемые остеогенные композиции согласно настоящему изобретению можно вводить любым клинически приемлемым способом инъекции. Ряд коммерчески доступных шприцев, возможно, подойдет для применения в настоящем изобретении, а также для введения композиций согласно настоящему изобретению. Такие шприцы включают без ограничения шприц Calasept® (JS Dental Manufacturing, Ridgefield CT, Коннектикут, США); аспирирующий шприц Henke-Ject® и стоматологические шприцы/иглы Нуро® (Smith & Nephew MPL, Franklin Park, IL (Иллинойс, США)); внутрикостные иглы от MPL, Inc., Chicago IL (Иллинойс, США); и шприцы Luer-Lok® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Для применения подходят любые шприцы, которые могут удерживать и доставлять пасту или инъецируемый стержень и/или позволяющие проводить экструзию при помощи уплотняющей детали.

[0062] В одном способе реализации данного изобретения композиции в форме твердых стержней доставляют внутрь кости чрескожно при помощи иглы для подкожных инъекций соответствующего размера и типа или предварительно помещают хирургическим путем в выбранную анатомическую область. Чрескожное размещение подкожной иглы можно осуществить при помощи ручной пальпации известных анатомических ориентиров, в сочетании с флюороскопией для визуализации процесса размещения или без нее. Флюороскопию можно также применять в сочетании с хирургической имплантацией до размещения иглы для подкожный инъекций или одновременно с ним.

[0063] В предпочтительном способе реализации в выбранную анатомическую область вначале вводят чрескожно проволочный проводник (обычно называемый "k-wire" - спица Киршнера), который будет служить направляющей для иглы для подкожных инъекций. Иглу для подкожных инъекций вводят вслед за проволочным проводником, который после этого удаляют, оставляя на месте только введенную на место иглу для подкожных инъекций. Композицию в форме твердого стержня вводят в обращенный к поршню (носику) конец иглы для подкожных инъекций. После загрузки композиции в иглу вводят второй проволочный проводник, при помощи которого продвигают твердую композицию к кончику иглы. Затем иглу удаляют, а проволочный проводник оставляют, чтобы он удерживал композицию в желаемом участке внутри кости. В конце удаляют проволочный проводник, при этом твердая композиция остается на месте. В другом способе реализации композицию в форме твердого стержня согласно данному изобретению предварительно помещают внутрь ствола иглы. После помещения в желаемую анатомическую область поршень шприца вдвигают в ствол иглы, в то время как устройство извлекают, при этом композиция в форме твердого стержня остается в желаемом положении.

[0064] Композиции согласно предложенному изобретению позволяют доставлять терапевтически эффективные количества остеогенного белка в поврежденный участок, в котором желательно образование хряща и/или кости. Данные составы можно применять в качестве замены аутологичных трансплантатов кости для свежих и несрастающихся переломов, артродезов позвонков и исправления дефектов костей в области ортопедии, черепно/челюстно-лицевой реконструкции, при остеомиелите для регенерации костей, а также в области стоматологии для заполнения альвеолярного бугра и дефектов периодонта, а также гнезд от удаленных зубов.

[0065] Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но ни в коем случае не являются ограничивающими. Модификации, изменения и незначительные улучшения предусмотрены и входят в объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

[0066] Все материалы, применяемые в этих примерах, являются материалами фармацевтического класса.

Кальций-фосфатный материал представлял собой коммерчески доступный материал - заменитель кости (здесь и далее «α-BSM»), продаваемый под торговым названием CEIREDEX компанией Etex Corporation, 38 Sydney Street, Cambridge, MA 02139 (Кембридж, Массачусетс, США), который подробно описан в Патентах США №5683461, 6117456 и 6214368, а также в РСТ WO 98/16209. Применяемый в качестве активного вещества остеогенный белок представлял собой рекомбинантный костный морфогенетический белок человека 2 (recombinant human bone morphogenetic protein-2 rhBMP-2). Способ приготовления и свойства белка rhВМР-2 хорошо известны [Wang, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., vol.87, pp.2220-2224 (1990)].

Пример 1 - Приготовление

[0067] [66] Готовили разнообразные инъецируемые твердые стержни, (А-Е) из α-BSM, rhBMP-2 и одного из следующих компонентов: карбоксиметилцеллюлоза (CMC), поливинилпирролидон (PVP) и декстран сульфат. Сухие порошки каждого из компонентов смешивали в стерильной колбе для смешивания и восстанавливали до состояния густой замазки путем добавления водного буфера на основе глицина, имеющего значение рН, приблизительно 4.5, и содержащего 5 ммоль L-глутаминовой кислоты, 2. 5% глицина, 0.5% сахарозы, 5 ммоль NaCl и 0.01% полисорбата polysorbate 80, при определенном соотношении жидкости (мл) к порошку (г) (Ж/П), и смешивали в течение 1 минуты до образования пасты. Количество всех компонентов, а также конкретные задействованные отношения Ж/П представлены ниже в Таблице 1.

Таблица 1 стержень α-BSM (%воды)   rhBMP-2 (% воды) отношение Ж/П     Карбоксиметилцеллюлоза (% воды)     А 68 17 15 1.0 В 56 29 15 1.2 С 45 40 15 1.5     Поливинилпирролидон (% воды)     D 45 40 15 0.6     Декстран Сульфат (% воды)     Е 45 40 15 0.6

[0068] Каждый вид пасты загружали в шприц и экструдировали с формированием цилиндрических стержней, имеющих диаметр приблизительно 1 мм и длину приблизительно 5 см. Затем эти пятисантиметровые стержни нарезали на куски желаемой длины для описанного ниже исследования.

[0069] После формовки стержни отверждали до твердого состояния в условиях, симулирующих условия in vivo, т.е. в инкубаторе при 37°, в течение ночи. Процесс затвердевания можно отсрочить на несколько часов, если хранить стержни при более низкой температуре, т.е. около 4°С.

[0070] Теоретическая доза rhBMP-2 для каждого стержня А-Е составляла 1.50 микрограмм rhBMP-2 на миллиграмм стержня. Все стержни были на вид гладкими, плотными, связанными и неломкими, и их можно было вводить путем инъекции через иглу размера 1-6G.

Пример 2 - Иследования In Vitro

[0071] Наблюдали корреляцию между содержанием добавки и образованием частиц. После погружения в водный буфер на основе глицина, описанный в примере 1, на 14 дней, стержни, содержащие более высокий % добавки (40% карбоксиметилцеллюлозы, 40% поливинилпирролидона или 40% декстран сульфата, т.е. стержни С-Е соответственно) распадались на более мелкие частицы быстрее, т.е. в пределах 1 суток, чем стержни со средним (29% карбоксиметилцеллюлозы, т.е. стержень В) и низким (17% карбоксиметилцеллюлозы, т.е. стержень А) содержанием добавок. Стержни, содержащие низкие количества добавок (17% карбоксиметилцеллюлозы, т.е. стержень А) сохраняли свою стержнеподобную структуру намного дольше, чем их аналоги с более высоким содержанием карбоксиметилцеллюлозы, т.е. на протяжении промежутков времени порядка дней - недель.

[0072] Кроме того, проводили исследование кинетики высвобождения in vitro rhBMP-2 из стержней α-BSM, содержащих либо 17% (стержень А), 29% (стержень В), либо 40% (стержень С) карбоксиметилцеллюлозы, используя 1251-rhBMP-2 в качестве метки. Аналогично результатам общих наблюдений стержни, содержащие более высокий % карбоксиметилцеллюлозы, высвобождали rhBMP-2 быстрее, чем стержни с низким % карбоксиметилцеллюлозы, как показано на Фиг.1.

Пример 3 - Исследование биосовместимости и эффективности на крысах

[0073] Оценивали биосовместимость и эффективность инъецируемых композиций на основе фосфата кальция в форме стержней (приготовленных, как описано в Примере 1), как внутрикостные, так и эктопические, на животной модели (крысы).

[0074] Хирургическим путем наносили внутрикостные повреждения в дистальной части бедренных костей шести крыс CD. Крыс делили на две группы (А и В) по три особи. В одну конечность каждой крысы вводили сегмент исследуемого стержня длиной 2 мм (фосфат кальция/гПВМР-2/носитель), а в конечность на другой половине туловища вводили сегмент контрольного стержня длиной 2 мм (фосфат кальция /носитель). Крысам группы А вводили в качестве исследуемого стержня стержень А (68/17/15 (мас./мас.)% АСР (аморфный фосфат кальция)/СМС (карбоксиметилцеллюлоза)/rhВМР-2), описанный в примере 1, а крысам группы В вводили в качестве исследуемого стержня стержень В (56/29/15 (мас./мас.)% ACP/CMC/rhBMP-2), описанный в Примере 1. Кроме того, один стержень длиной 10 мм имплантировали подкожно латеральнее средней линии вентральной области грудной клетки, причем с другой стороны вводили контрольный стержень. И снова, крысам группы А вводили в качестве исследуемого стержня стержень А (68/17/15 (мас./мас.)% ACP/CMC/rhBMP-2), описанный в примере 1, а крысам группы В вводили в качестве исследуемого стержня стержень В (56/29/15 (мас./мас.)% ACP/CMC/rhBMP-2), описанный в Примере 1.

[0075] Через 2 недели животных умерщвляли для оценки результата, включающей радиографию на оборудовании Faxitron и гистоморфометрию. Рентгенограммы и результаты гистологического исследования 2-недельных эксплантатов дистальной области бедра продемонстрировали общее увеличение образования костного каллуса на стороне, которую лечили rhВМР-2, по сравнению с плацебо. В частности, стержни с более высоким содержанием карбоксиметилцеллюлозы (В) образовали костные каллусы размером от средних до крупных, по сравнению со стержнями с более низким содержанием карбоксиметилцеллюлозы (А), которые образовывали каллусы размером от небольших до средних. Рентгенограммы и результаты гистологического исследования для подкожных имплантатов также указывали на образование кости на стороне, которую лечили rhBMP-2, по сравнению с плацебо. В частности, стержни с более высоким содержанием карбоксиметилцеллюлозы (В) формировали более устойчивый эктопический ответ кости по сравнению со стержнями с более низким содержанием карбоксиметилцеллюлозы (А). Во всех группах наблюдали хорошую биосовместимость без воспалительной реакции на имплантаты.

Пример 4 - Исследование внутрикостного местного биораспределения на кроликах

[0076] Стержни A-D из Примера 1 вводили путем чрескожной инъекции во внутрикостные впадины дистальных бедренных костей кролика (n=4 участков на группу) при помощи катетера размера 14 с иглой размера 16G). Конкретно, применяли 10 мм стержни A-D, содержащие приблизительно мкКи 1251-rhВМР-2. Перед инъекцией при помощи дозакалибратора Capintec измеряли количество радиоактивности в синтетических стержнях. Местное удержание rhBMP-2 мониторировали в течение 4 недель посредством гамма-сцинтиграфии. Данные о местном биораспределении in vivo позволяют предположить, что имеет место замедленное высвобождение rhBMP-2 из стержней, и что стержни, содержащие более высокий % добавки, проявляли более быстрое высвобождение in vivo, чем их аналоги с более низким % добавки, как показано на Фиг.2.

Пример 5 - Приготовление

[0077] Отверждающиеся пасты, содержащие либо 1 мг rhBMP-2 на мл пасты, либо 4.5 мг rhBMP-2 на миллилитр пасты, готовили путем добавления 2 мл растворов с соответствующей концентрацией rhBMP-2 в водном буфере на основе глицина, описанного в Примере 1, к 2.5 г α-BSM. Смеси перемешивали в стерильных колбах в течение 1 минуты до образования отверждающейся пасты.

Пример 6 - Обезьяна Cynomoloqous -Внутрикостная инъекция пасты

[0078] Отверждающиеся пасты с концентрацией 1 мг на мл и 4.5 мг на мл, описанные в Примере 5, извлекали из стерильных колб при помощи 3 мл шприца с иглой размера 18G, а затем вводили путем инъекции под контролем флюороскопии в различные внутрикостные участки обезьян cynomologous. Участки включали дистальную часть бедра, проксимальную часть бедра, дистальную часть лучевой кости, проксимальную часть большой берцовой кости. Через 1 месяц наблюдали значительное количество новой костной ткани в участках, куда путем инъекции вводили rhBMP-2.

[0079] Хотя изобретение было описано посредством предпочтительных вариантов реализации и конкретных примеров, специалисты в данной области путем рутинных экспериментов смогут определить, что в рамках изобретения возможны разнообразные изменения и модификации без отклонения об объема изобретения. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено приведенным выше подробным описанием, но определено прилагаемой формулой и ее эквивалентами.

Настоящее изобретение относится к медицине и касается доставки остеогенных белков путем инъецирования в форме твердого стержня. Композиции содержат кальций-фосфатный материал, остеогенный белок и необязательные добавки, например такие, как ингибитор резобции кости. Описаны также способы приготовления фармацевтических композиций и способы применения остеогенных композиций для лечения дефектов кости. Изобретение обеспечивает снижение тяжести остеопороза и количество остеопоротических поражений, заживление переломов, восстановление хрящей, заживление несрастающихся дефектов и артродез, стимуляцию роста костей. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Композиция для доставки остеогенных белков путем инъекции, содержащая: остеогенный белок и кальций-фосфатный материал, отличающаяся тем, что указанная композиция имеет форму твердого стержня, подходящего для внутрикостной инъекции.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что остеогенный белок выбран из группы, состоящей из членов семейства «костных морфогенетических белков» (BMP).

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что остеогенный белок выбран из группы, состоящей из BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13 и МР-52.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что остеогенный белок присутствует в количестве от примерно 1% до примерно 90% от массы композиции, предпочтительно в количестве примерно от 15% до примерно 40% от массы композиции.

5. Композиция по п.1, содержащая дополнительно ингибитор резорбции кости.

6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что ингибитор резорбции кости представляет собой бифосфонат, например бифосфонат, выбранный из группы, включающей алендронат, цимадронат, клодронат, ЕВ1053, этидронаты, ибандронат, неридронат, олпадронат, памидронат, резидронат, тилудронат, YH 529, золедронат и их фармацевтически приемлемые соли, эфиры, кислоты и их смеси.

7. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что кальций-фосфатный материал содержит материал, выбранный из группы, состоящей из аморфного фосфата кальция типа апатита, слабокристаллизованного фосфата кальция типа апатита, гидроксиапатита, трикальция фосфата, фторапатита и их комбинаций.

8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что кальций-фосфатный материал содержит слабокристаллизованный фосфат кальция типа апатита.

9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что слабокристаллизованный фосфат кальция типа апатита имеет отношение кальций-к-фосфату меньшее, чем 1:1,5, предпочтительно примерно равное 1:1,4.

10. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что кальций-фосфатный материал присутствует в количестве примерно от 10% до примерно 99%, предпочтительно примерно от 40% до примерно 60% от массы композиции.

11. Композиция по любому из пп.1-6, содержащая дополнительно добавку, выбранную из группы, включающей фармацевтически приемлемые соли, полисахариды, пептиды, белки, аминокислоты, синтетические полимеры, природные полимеры, поверхностно-активные вещества и их сочетания, например, такие как карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, полимер молочной кислоты (полилактид), полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, полиоксиэтиленоксид, карбоксивиниловый полимер, поливиниловый спирт, декстрансульфат и их сочетания.

12. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что добавка присутствует в количестве примерно от 1% до примерно 90% от массы композиции.

13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что добавка присутствует в количестве примерно от 20% до примерно 40% от массы композиции.

14. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанный стержень является цилиндрическим, причем диаметр указанного цилиндрического стержня составляет примерно от 0,1 до 3,0 мм.

15. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что длина указанного стержня составляет примерно от 1,0 до 5,0 см.

16. Способ приготовления композиции, содержащей остеогенный белок и кальций-фосфатный материал, для доставки остеогенных белков путем инъекции, включающий следующие этапы:
(a) смешивание сухой формы остеогенного белка с сухой формой фосфата кальция, с получением сухой смеси;
(b) восстановление сухой смеси путем добавления водного буфера с получением пасты;
(c) формование пасты с получением композиции в форме стержня; и
(d) сушку композиции в форме стержня, полученной на этапе (с), с получением композиции в форме стержня, подходящего для внутрикостной инъекции.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что композиция представляет собой композицию по любому из пп.1-15.

18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что водный буфер выбирают из группы, состоящей из фосфатного буферного раствора, физиологического раствора, буферов на основе глицина и их комбинаций.

19. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что отношение водного буфера к сухой смеси варьирует от примерно 0,5:1 до примерно 2:1.

20. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что формование выполняют при помощи операции, выбранной из группы, включающей формование, экструзию, прессование, сверление и сочетания указанных операций.

21. Способ по п.16 или 17, включающий далее этап резки композиции в форме стержня до этапа (d) или после него.

22. Способ лечения млекопитающего с дефектом кости, включающий (a) введение в участок дефекта кости эффективного количества состава для доставки остеогенных белков путем инъекции композиции по любому из пп.1-15.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что дефект представляет собой поражение кости остеопорозом.

24. Способ лечения по п.22, отличающийся тем, что дополнительно включает этап: (b) введения в участок дефекта кости эффективного количества ингибитора резорбции кости.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что этап (a) выполняют перед этапом (b), или этап (b) выполняют перед этапом (a), или этап (a) и этап (b) выполняют одновременно.

26. Применение композиции, содержащей остеогенный белок и кальций-фосфатный материал, в качестве композиции для приготовления лекарственного препарата для лечения млекопитающего с дефектом кости, включающее введение путем инъекции в участок дефекта кости эффективного количества композиции для доставки остеогенных белков, причем композицию инъецируют в виде твердого стержня, подходящего для внутрикостной инъекции.

27. Применение по п.26, в котором композицию, содержащую остеогенный белок и кальций-фосфатный материал, применяют в сочетании с введением в участок дефекта кости эффективного количества ингибитора резорбции кости.

28. Применение по п.27, в котором композицию, содержащую остеогенный белок и кальций-фосфатный материал, вводят до, после или одновременно с ингибитором резорбции кости.