СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (ВАРИАНТЫ) И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/68 B82B3/00 G01N27/28 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и электрохимии и может быть использовано для детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК) (ДНК или РНК) электрохимическим методом с использованием модифицированных электродов, в частности модифицированных углеродными наноматериалами.

В последние годы большое внимание уделяется разработке диагностических ПК-сенсоров на основе углеродных нанотрубок (УНТ) [Wang, J,. Nanomaterial-based electrochemical biosensors // Analyst. 2005 V.130. P.421-426. Mercosi, A., Pumera, M., Llopis, X., Perez, В., Valle, M., Alegret, S. New materials for electrochemical sensing. // Trends Anal. Chem. 2005. V.24. P.836-838.], предназначенных для выявления инфекций и генетических нарушений, обуславливающих развитие заболеваний человека [Balasubramanian, K., Burghard, М. Biosensors based on carbon nariotubes // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V.385. P.452-468; Pumera, M., Sanches, S., Ichinose, I., Tang, J. Electrochemical nanobiosensors // Sens. Actiators. 2007. V.123. P.1195-1205]. Система распознавания биосенсора основана на специфическом взаимодействии биомолекул либо биологических надмолекулярных структур. Для преобразования процесса распознавания биомолекулы в аналитический сигнал элемент биологического распознавания должен находиться в прямом пространственном контакте с преобразователем [Balasubramanian K., Burghart М. Biosensors based on carbon nanotubes // Anal. Bioanal Chem. 2006, V.385. P.452-468], при этом генерируемый биосенсором сигнал функционально связан с количеством определяемого компонента. Высокоорганизованная структура и разнообразные электронные свойства УНТ делают перспективным использование этого материала для создания подобных биосенсоров в качестве как структурного, так и преобразующего элементов [Mercosi, A., Pumera, М., Llopis. X:; Perez, В., Valle, М., Alegret, S. New materials for electrochemical sensing. // Trends Anal. Chem. 2005. V.24. Р.836-838].

Перспективным направлением в создании биосенсоров является разработка электрохимических биосенсоров, отличающихся высокой селективностью и чувствительностью [Wang, J., Survey and Summary. From DNA biosensors to gene chip. // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P.3011-3016]. Известны способы электрохимической детекции биомолекул по изменению сопротивления электрода при специфическом связывании биомолекул НК-зондами (олигонуклеотидными зондами), иммобилизованными на поверхности углеродных нанотрубок (УНТ), входящих в состав электропроводящей системы [Carbon nanotube biosensors with aptamers as molecular recognition elements and method for sensing target material using the same. H.M. So, J.O. Lee, Y.H. Kim, K.H. Won, H.J. Chang, K.J. Kong, Y.M. Choi. US2008/0094078 A1. 2008. (US 7854826 B2, 2010); Sensors employing single-walled carbon nanotubes. M.S. Strano, S. Baik, P.Barone. US 2007/0292896 Al. 2007]. Описано использование композитов из массивов ориентированных углеродных нанотрубок (УНТ), химически присоединенных к подложке, выполненной из алюминия,; золота или оксида кремния, с ковалентно присоединенными олигонуклеотидными зондами для электрохимической детекции ПК [Berti F., Lozzi L., Palchetti I., Santucci S., Marrazza G. Electrochim. Acta. 2009, V.54. P.5035-5041; Arumugam P.U., Chen H., Siddiqui S., Weinrich J.A.P., Jejelowo A., Li J., Meyyappan M.. Biosens. Bioelectron. 2009, V.24. P.2818-2824; Pumera M., Sanchez S., Ichinose I., Tang J. Sens. Actuat. B. 2007, V.123. P.1195-1205]. В качестве сигнала о гибридизации олигонуклеотидного зонда и детектируемой нуклеиновой кислоты (НК) используют значения изменения тока.

Известен способ детекции ДНК - прототип изобретения [Wang S.G., Wang R., Sellin P.J., Zhang Q. DNA biosensors based on self-assembled carbon nanotubes // Biochem. Biophys/. Res. Commun. 2004. V.325, №4. P.1433-1437.], где для детекции 21-звенного фрагмента ДНК используют методы циклической вольтамперометрии и дифференциальной импульсной вольтамперометрии в электрохимическом анализаторе, представляющем собой трехэлектродную электрохимическую йчейку, электроды которой соединены с регистрирующим устройством. УНТ-содержащий рабочий электрод электрохимического анализатора получают путем выращивания вертикально ориентированных многостенных углеродных нанотрубок методом каталитического осаждения из газовой фазы на электроде, представляющем собой золотую фольгу-подложку, покрытую слоем каталитических частиц никеля. УНТ-содержащий электрод обрабатывают концентрированной азотной кислотой для удаления каталитических частиц никеля и окисления концов нанотрубок. К образовавшимся при окислении на концах нанотрубок карбоксильным группам ковалентно присоединяют 21-звенный

олигодезоксирибонуклеотидный зонд, содержащий на 5'-конце линкер с первичной аминогруппой. Измерение электрохимических свойств проводят, подавая линейную развертку потенциала на электроды. Детекцию проводят сравнением пиков, полученных на вольтамперограмме в области от 0 до - 0.5 В.

Недостатками известного способа и устройства являются высокая стоимость и трудоемкость получения электродов. Такие модифицированные электроды имеют ряд недостатков: низкая стабильность, технические сложности введения олигонуклеотидного зонда на поверхность УНТ, низкое содержание молекул зонда в составе электрода, и, как следствие, относительно невысокая чувствительность, дороговизна золотой фольги-подложки.

Задачей изобретения является упрощение, удешевление и ускорение процесса детекции специфических последовательностей НК (ДНК или РНК).

Поставленная задача решается двумя вариантами способа и устройством.

По первому варианту поставленная задача решается тем, что в способе детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, детекцию осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на их поверхности олигонуклеотидным зондом, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, при этом после регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) строят профиль изменения относительной емкости электрода от номера цикла.

По второму варианту способа задача решается тем, что в способе детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, детекцию осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на поверхности углеродных нанотрубок олигонуклеотидным зондом, содержащим остаток полиароматического углеводорода в качестве якорной группы для иммобилизации зонда, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, или по наличию или отсутствию пика на емкостной характеристике, делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, а также определяют концентрацию детектируемой НК, при этом после регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) строят профиль изменения относительной емкости электрода от номера цикла, а олигонуклеотидный зонд модифицируют остатками пирена или других полиароматических углеводородов.

Поставленная задача решается тем, что устройство для реализации способа детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом представляет собой электрохимический анализатор, состоящий из трехэлектродной электрохимической ячейки, электроды которой соединены с регистрирующим устройством, содержащим источник питания, например, потенциостат, а рабочий электрод выполнен из электропроводящей кремниевой или металлической подложки, с выращенными на ней вертикально ориентированными углеродными нанотрубками, по всей поверхности которых нековалентно иммобилизован олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК, или модифицированный олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК, между рабочим и вспомогательным электродом расположен сепаратор, при чем олигонуклеотидный зонд предварительно модифицируют полиароматическим углеводородом, который выступает в качестве якорной группы для нековалентной иммобилизации модифицированного олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода, а также олигонуклеотидный зонд модифицируют остатками пирена или других полиароматических углеводородов.

На фиг.1 представлено устройство для реализации способа. Все элементы трехэлектродной ячейки расположены на основании (1), например из фторопласта, на основание помещен токосъемник вспомогательного электрода (2), выполненный, например, из титана с иридиевым напылением, к нему подведен электрод сравнения (3J, например, хлорсеребряный, и рабочий электрод (4), нанотрубки на рабочем электроде ориентированы перпендикулярно плоскости кремниевой подложки рабочего электрода. Электрод сравнения и рабочий электрод касаются сепаратора (5), например, из нетканого полипропиленового волокна, покрывающегб вспомогательный электрод. Рабочий электрод и электрод сравнения фиксируются с помощью штатива (6). Токосъемники всех электродов подключены к регистрирующему устройству, например, потенциостату Elins P-30S (7).

Предварительно получают УНТ-модифицированный рабочий электрод, представляющий собой электропроводящуйэ кремниевую или металлическую подложку с выращенными на ней вертикально ориентированными многостенными углеродными нанотрубками. Далее в течение 18-24 ч проводят нековалентную, в отличие от прототипа, иммобилизацию специально синтезированного олигонуклеотидного зонда, комплементарного участку детектируемой НК, путем инкубации УНТ-модифицированного электрода в 200 мкл водного раствора зонда с концентрацией 1-5·10^-5 М. В качестве олигонуклеотидного зонда, в отличие от прототипа, используют не только олигодезоксирибонуклеотиды, но и олигорибонуклеотиды и их синтетические модифицированные аналоги (олиго(2'-O-метилрибонуклеотиды), LNA-модифицированные олигонуклеотиды и др.), а также олигонуклеотидые зонды, содержащие остаток полиароматического углеводорода. Модифицированные электроды высушивают и используют в составе трехэлектродной электрохимической ячейки для специфической детекции НК.

Для измерения электрохимических характеристик полученных электродов методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке на основание (1) помещают токосъемник вспомогательного электрода (2), на вспомогательный электрод помещают два слоя сепаратора (5) из нетканого полипропиленового волокна. Сепаратор избыточно пропитывают раствором электролита, при этом электрод сравнения (3) и рабочий электрод (4) с массивом углеродных нанотрубок касаются сепаратора (5). Электроды подключают к регистрирующему устройству (7).

Суть метода измерения заключается в подаче на УНТ-модифицированный рабочий электрод с иммобилизованным на нем олигонуклеотидным зондом напряжения, изменяющегося по заданному закону (линейная развертка потенциала), и регистрации тока в цепи. Циклические вольтамперограммы в области потенциального окна для проведения измерений [-0.2; 1] В регистрируют с использованием потенциостата Elms Р-30S, работающего в потенциодинамическом режиме. Потенциал измеряют относительно хлорсеребряного электрода сравнения. Скорость развертки потенциала составляет 20 мВ/с.Рабочий электрод циклируют при комнатной температуре в электролите следующего состава: 0.1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия, 1 мМ ИагЭДТА, pH 7.4. Через 3 цикла в электрохимическую ячейку добавляют раствор исследуемой НК в этом же буфере и продолжают циклирование. В качестве исследуемых НК использовали протяженные синтетические фрагменты РНК. После введения исследуемого образца наблюдают изменение циклической вольтамперограммы, а именно, изменение площади вольтамперограмм от цикла к циклу. Форма получаемых вольтамперограмм соответствует электрохимическим процессам в ячейке, а средний ток пропорционален площади поверхности материала электрода. По полученным данным строят циклические вольтамперограммы и рассчитывают емкость электрода на каждом цикле. При увеличении/уменьшении емкости в процессе циклирования можно сделать выводы о состоянии и активности поверхности электрода. На основе этих данных делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце НК участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду. Кроме того, по изменению площади вольтамперограмм можно оценить концентрацию НК.

При нековалентной иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхность вертикально ориентированных УНТ посредством якорной группы (по второму варианту) регистрируют не только изменение площади вольтамперограмм от цикла к циклу, но и появление специфического пика на циклической вольтамперограмме, связанного с фиксацией детектируемой НК в комплексе с модифицированным зондом на поверхности УНТ-электрода (фиг.2). Интенсивность пика на циклической вольтамперограмме пропорциональна концентрации определяемой НК, что позволяет проводить количественную оценку.

Отличительными признаками изобретения по первому варианту являются:

- использование в качестве зондов олигодезоксирибонуклеотидов или олигорибонуклеотидов, а также их модифицированных аналогов (олиго(2'-O-метилрибонуклеотиды), LNA и др.);

- регистрация циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца НК (РНК или ДНК), содержащей участок, комплементарный олигонуклеотидному зонду, нековалентно иммобилизованному на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода;

- регистрация наличия или отсутствия в исследуемом образце НК (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм.

Отличительными признаками изобретения по второму варианту являются:

- использование в качестве зондов олигодезоксирибонуклеотидов или олигорибонуклеотидов, а также их модифицированных аналогов (олиго(2'-O-метилрибонуклеотиды), LNA и др.);

- предварительная модификация олигонуклеотидного зонда полиароматическим углеводородом в качестве якорной группы для нековалентной иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода;

- модификация олигонуклеотидного зонда остатками пирена или других полиароматических углеводородов;

- регистрация циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на поверхности углеродных нанотрубок олигонуклеотидным зондом, содержащим остаток полиароматического углеводорода в качестве якорной группы, до и после внесения в исследуемый раствор образца НК (РНК или ДНК), содержащей участок, комплементарный зонду;

- регистрация наличия или отсутствия в исследуемом образце НК (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, или по наличию или отсутствию пика на вольтамперограммах.

- определение концентрации детектируемой НК по интенсивности пика на циклической вольтамперограмме.

Отличительные признаки по устройству:

- рабочий электрод представляет собой электропроводящую кремниевую или металлическую подложку, модифицированную вертикально ориентированными углеродными нанотрубками;

- по всей поверхности углеродных нанотрубок нековалентно иммобилизованы молекулы олигонуклеотидного зонда, комплементарного определяемому участку детектируемой НК;

- олигонуклеотидный зонд предварительно модифицирован полиароматическим углеводородом, который выступает в качестве якорной группы для иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода;

- олигонуклеотидный зонд модифицирован остатками пирена или других полиароматических углеводородов;

- между рабочим и вспомогательным электродом расположен сепаратор.

Типичный пример №1

1. Получение модифицированного рабочего электрода

Массивы ориентированных многостенных углеродных нанотрубок выращивают известным аэрозольным CVD методом на кремниевых подложках размером 5×5 мм путем разложения 2%-ного раствора ферроцена в толуоле при температуре 800°С [Кудашов А.Г., Куреня А.Г., Окотруб А.В., Гусельников А.В., Данилович B.C., Булушева Л.Г. Синтез и структура пленок углеродных нанотрубок, ориентированных перпендикулярно подложке // ЖТФ. 2007. Т.77, №12. С.96-100. Окотруб А.В., Булушева Л.Г., Кудашов А.Г., Белавин В.В., Комогорцев С.В. Массивы углеродных нанотруб, ориентированных перпендикулярно подложке: анизотропия структуры и свойств. // Российские нанотехнологии. 2008. Т.3. Вып.3-4. С.122-131.]. Одну из сторон кремниевой подложки и все боковые поверхности подложки тщательно очищают от углеродного материала, к чистой кремниевой поверхности прикрепляют контакт проводящим клеем.

2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ I

Получение олигонуклеотидного зонда I (ОНЗ I) конструкции 5'-p-(HEG)-p-GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATGG, где HEG-остаток гексаэтиленгликоля, проводят на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 с использованием стандартного твердофазного фосфитамидного метода.

3. Получение модифицированного электрода I

Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ I на поверхности углеродных нанотрубок. Для этого рабочий электрод, модифицированный углеродными нанотрубками, помещают в 10^-5 М водный раствор ОНЗ 1 так, чтобы массив углеродных нанотрубок был полностью погружен в раствор. Иммобилизацию олигонуклеотида на поверхность углеродных нанотрубок проводят при перемешивании (скорость 600 об/мин) при 37°C в течение 18 чр. Электрод высушивают в течение 2 ч при 1-2 мм. рт.ст. в эксикаторе с P₂O₅. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду ОНЗ I составила 94 мкмоль/г.

4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода I

Для измерения электрохимических характеристик полученного электрода методом циклической вольтамперометрии с линейнйй разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке (фиг.1) на основание (1) помещают токосъемник вспомогательного электрода (2), на вспомогательный электрод помещают два слоя сепаратора (5) из нетканого полипропиленового волокна. Сепаратор избыточно пропитывают 50 мкл раствора электролита, при этом электрод сравнения (3) и рабочий электрод (4) с массивом углеродных нанотрубок касаются сепаратора (5). Состав электролита 0.1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия, 1 мМ Na₂ЭДТА, pH 7.4. Электроды подключают к регистрирующему устройству (6). Циклические вольтамперограммы в области потенциального окна для проведения измерений [-0.2; 1] В регистрируют с использованием потенциостата Elins Р-30S, работающего в потенциодинамическом режиме. Потенциал измеряют относительно хлорсеребряного электрода сравнения. Скорость развертки потенциала составляет 20 мВ/с.Регистрируют емкость модифицированного электрода на каждом цикле работы электрода. После установления равновесия на сепаратор наносят 50 мкл раствора исследуемой РНК (5'-CUGCCAUCAUCCA0GGGGCUGGACUUCCUCU) в том же буфере. В таком же режиме регистрируют циклические вольтамперограммы и рассчитывают емкость электрода. После введения исследуемого образца наблюдают изменение формы циклических вольтамперограмм, соответствующее гибридизации зонда ОНЗ I и детектируемой РНК и делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце РНК участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, а также оценивают его концентрацию.

Типичный пример №2.

1. Получение модифицированного рабочего электрода

Модифицированный рабочий электрод получают как описано в примере №1.

2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ II

Получение олигонуклеотидного зонда II (ОНЗ II) конструкции 5'-Pyr-p-HEG-p-GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATGG, где Pyr - остаток пирена, HEG - остаток гексаэтиленгликоля, проводят путем присоединения пиренилметиламина к 5'-концевой фосфатной группе ОНЗ I по методике, описанной в работе [Новопашина, Д.С, Тоцкая, О.С., Холодарь, С.А., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г. Биоорг. Химия. 2008. Т.34. №5. С.671-682].

3. Получение модифицированного электрода II

Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ II на поверхности углеродных нанотрубок как описано в примере №1. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду ОНЗ II составила 157 мкмоль/г.

4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода

Проводят измерения электрохимических характеристик полученного электрода методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке как описано в примере №1. После введения раствора исследуемого образца РНК (5'-CUGCCAUCAUCCAUGGGGCUGGACUUCCUCU) наблюдают изменение формы циклических вольтамперограмм: изменение их площадей от цикла к циклу (фиг.3) и появление пика (фиг.4). Увеличение емкости после добавления раствора детектируемой РНК является сигналом того, что в исследуемом образце РНК содержится участок, комплементарный иммобилизованному олигонуклеотидному зонду. Интенсивность появляющегося на вольтамперограмме пика пропорциональна концентрации определяемой РНК и определяется по предварительно построенной калибровочной кривой.

Типичный пример №3

1. Получение модифицированного рабочего электрода

Модифицированный рабочий электрод получают как описано в примере №1.

2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ III

Получение олигонуклеотидного зонда III (ОНЗ III) конструкции 5'-Pyr-pHEG-p-G^mG^mA^mA^mG^mU^mC^mC^mA^mG^mC^mC^mC^mC^mA^mU^mG^mG^mA^mU^mG^mA^mU^mG^mG^m, где Pyr - остаток пирена, HEG - остаток гексаэтиленгликоля, G^m, A^m, U^m и C^m - 2'-O-метилрибонуклеотиды, проводят путем присоединения пиренилметиламина к концевой фосфатной группе 5'-pHEG-p-G^mG^mA^mG^mU^mC^mC^mA^mG^mC^mC^mC^mC^mA^mU^mG^mG^mA^mU^mG^mA^mU^mG^mG^m по методике, описанной в работе [Новопашина, Д.С., Тоцкая, О.С., Холодарь, С.А., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г. Биоорг. Химия. 2008. Т.34. №5. С.671-682]. Синтез исходного олигонуклеотида 5'-pHEG-p-

G^mG^mA^mA^mG^mU^mC^mC^mA^mG^mC^mC^mC^mC^mA^mU^mG^mG^mA^mU^mG^mA^mU^mG^mG^m проводят на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 стандартным твердофазным фосфитамидным методом.

3. Получение модифицированного электрода III

Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ III на поверхности углеродных нанотрубок как описано в примере №1. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду составила 148 мкмоль/г.

4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода III

Проводят измерения электрохимических характеристик полученного электрода методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке как описано в примере №1. После введения раствора исследуемого образца РНК (5'-CUGCCAUCAUCCAUGGGGCUGGACUUCCUCU) наблюдают изменение формы циклических вольтамперограмм: изменение их площадей от цикла к циклу и появление пика, аналогично описанному в примере №2. Увеличение емкости после добавления раствора РНК является сигналом того, что в исследуемом образце РНК содержится участок, комплементарный иммобилизованному олигонуклеотидному зонду. Интенсивность появляющегося на вольтамперограмме пика пропорциональна концентрации определяемой РНК и определяется по предварительно построенной калибровочной кривой.

Типичный пример №4

1. Получение модифицированного рабочего электрода

Модифицированный рабочий электрод получают как описано в примере №1.

2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ IV

Получение олигонуклеотидного зонда IV (ОНЗ IV) конструкции 5-Pyr-р-АААААААААА, где Pyr - остаток пирена, проводят путем присоединения пиренилметиламина к концевой фосфатной группе 5'-р-AAAAAAAAAA по методике, описанной в работе [Новопашина, Д.С., Тоцкая, О.С, Холодарь, С.А., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г. Биоорг. Химия. 2008. Т.34. №5. С.671-682]. Синтез исходного олигорибонуклеотида 5'-р-AAAAAAAAAA проводят на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 стандартным твердофазным фосфитамидным методом.

3. Получение модифицированного электрода IV

Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ ГУ на поверхности углеродных нанотрубок как описано в примере №1. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду составила 128* мкмоль/г.

4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода IV

Проводят измерения электрохимических характеристик полученного электрода

методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке как описано в примере №1. После введения раствора исследуемого образца РНК (5'-CCCCCCCC) наблюдают незначительные изменения формы циклических вольтамперограмм. Строят зависимость относительного изменения емкости от номера цикла (фиг.5). Наблюдают незначительные изменения (до 5%) емкости после добавления раствора. Делают вывод об отсутствии в исследуемом образце РНК участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду

Таким образом, заявляемый способ и устройство расширяют возможности способа детекции специфических последовательностей НК (РНК или ДНК) путем регистрации электрохимических характеристик электродов методом циклической вольтамперометрии, упрощают, удешевляют и ускоряют его, позволяют проводить детекцию исследуемых образцов в малых объемах, что весьма существенно при проведении исследований и разработке диагностических систем. Кроме того, способ позволяет не только обнаружить специфическую последовательность НК (РНК или ДНК), но и оценить ее концентрацию.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и электрохимии. По первому варианту способ осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на их поверхности олигонуклеотидным зондом, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты и по изменению емкостной характеристики делают вывод о наличии или отсутствии в образце участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду. Второй вариант способа отличается тем, что нековалентную иммобилизацию олигонуклеотидного зонда на поверхность нанотрубок осуществляют посредством якорной группы, предварительно введенной в зонд. В этом варианте регистрируют не только изменение площади вольтамперограмм от цикла к циклу, но и появление специфического пика на циклической вольтамперограмме, связанного с фиксацией детектируемой НК в комплексе с модифицированным зондом. Интенсивность пика на циклической вольтамперограмме пропорциональна концентрации определяемой НК, что позволяет проводить количественную оценку. Устройство для реализации способа детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот представляет собой электрохимический, анализатор, который состоит из трехэлектродной электрохимической ячейки, электроды которой соединены с регистрирующим устройством, а рабочий электрод выполнен из кремниевой подложки, модифицированной вертикально ориентированными углеродными нанотрубками с иммобилизированным олигонуклеотидным зондом, комплементарным определяемой НК. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.

1. Способ детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, отличающийся тем, что детекцию осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на их поверхности олигонуклеотидным зондом, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду.

2. Способ детекции по п.1, отличающийся тем, что после регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) строят профиль изменения относительной емкости электрода от номера цикла.

3. Способ детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, отличающийся тем, что детекцию осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на поверхности углеродных нанотрубок олигонуклеотидным зондом, содержащим остаток полиароматического углеводорода в качестве якорной группы для иммобилизации зонда, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, или по наличию или отсутствию пика на емкостной характеристике делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, а также определяют концентрацию детектируемой НК.

4. Способ детекции по п.3, отличающийся тем, что после регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) строят профиль изменения относительной емкости электрода от номера цикла.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что олигонуклеотидный зонд модифицируют остатками пирена или других полиароматических углеводородов.

6. Устройство для реализации способа детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, представляющее собой электрохимический анализатор, состоящий из трехэлектродной электрохимической ячейки, электроды которой соединены с регистрирующим устройством, содержащим источник питания, например потенциостатом, отличающееся тем, что рабочий электрод выполнен из электропроводящей кремниевой или металлической подложки с выращенными на ней вертикально ориентированными углеродными нанотрубками, по всей поверхности которых нековалентно иммобилизован олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК, или модифицированный олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК; между рабочим и вспомогательным электродами расположен сепаратор.

7. Устройство по п.6, отличающееся тем, что олигонуклеотидный зонд предварительно модифицируют полиароматическим углеводородом, который выступает в качестве якорной группы для нековалентной иммобилизации модифицированного олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода.

8. Устройство по п.6, отличающееся тем, что олигонуклеотидный зонд модифицируют остатками пирена или других полиароматических углеводородов.