СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНАХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/50 C12Q1/28 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности иммунологии сельскохозяйственных животных и птиц.

Известна методика определения активности пероксидазы (см. З. Лойда. Гистохимия ферментов. M., 1982. Диаминабензидиновый метод Graham, Karnovsky, 1966, с. 206), включающая взятие, подготовку, фиксацию пробы, ее инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, трис-НСl и бензидина.

Наиболее близким является способ определения активности пероксидазы (см. З. Лойда. Гистохимия ферментов. M., 1982. Диаминабензидиновый метод выявления пероксисом Novikoff, Goldfisher, 1969, с.208), предусматривающий взятие ткани, подготовку, фиксацию и инкубирование пробы в среде, состоящей из буферного раствора трис-НСl (гидроксиметил) аминометан и бензидина. Недостатком прототипа является то, что рН сильно щелочная, что препятствует активации ферментов, в результате затрудняется процесс и неточно определяется активность фермента.

Техническим решением задачи является повышение максимального выявления активности фермента.

Поставленная задача достигается тем, что, в частности, в способе выявления пероксидазы в иммунокомпетентных органах животных, включающем взятие и обработку пробы, фиксацию, промывку и заливку, инкубацию в среде, содержащей 0,1 М трис-НСl-буфер, соединение бензидина и раствор перекиси водорода, оценку качественной реакции по окраске, инкубацию осуществляют в среде, содержащей в качестве соединения бензидина - основной бензидин, растворенный в 2-3 мл 96 об.%-ного этилового спирта с добавлением 20 мл дистиллированной воды небольшими порциями.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что использование основного бензидина обеспечивает рН, близкую к нейтральной.

Пример конкретного осуществления способа определения активности пероксидазы в иммунокомпетентных органах животного.

Пероксидазы являются гемопротеидами, которые катализируют окисление различных веществ с помощью перекиси водорода. Эти ферменты обнаружены в многочисленных животных и растительных тканях. Например, у животных пероксидаза встречается в молочной (присутствуют также в молоке), щитовидной, слюнных железах и в тучных клетках. В лейкоцитах содержится также миелопероксидаза. Из растительных пероксидаз наиболее тщательно изучена пероксидаза хрена. Пероксидазной активностью обладают белки с гемом в качестве простетической группы, при этом они необязательно являются ферментами; в таком случае их называют псевдопероксидазами.

Бензидиновая реакция основана на окислении бензидина пероксид-пероксидазной системой до нестабильного бензидинового синего, который самопроизвольно превращается в стабильный бензидиновый коричневый. Способ определения активности пероксидазы состоит из следующих этапов.

Взятие пробы
После взятия пробы (биопсия, материал от экспериментальных животных) ткань обрабатывают с максимальной быстротой, т.к. активность ферментов может изменяться под воздействием аутолитических процессов. Объем или количество материала определяется задачами исследования, характером подготовки ткани и видом органа. При изучении внутриклеточной локализации ферментов толщина тканевых кусочков должна быть минимальной не более 1 см.

Фиксация
Фиксация применяется при исследовании внутриклеточной локализации ферментов (Lojda, 1965). Для фиксации обычно используются альдегиды или их смеси. Применявшаяся прежде фиксация в ацетоне с последующей заливкой в парафин или целлоидин в настоящее время не рекомендуется.

При фиксации в формальдегиде результаты (ферментативная активность, сохранность морфологической структуры) зависят от концентрации, рН, времени фиксации и температуры.

Обычно концентрация формальдегида составляет 4%. Эта концентрация наилучшим образом удовлетворяет требованиям сохранности структуры и ферментативной активности. В более высоких концентрациях фиксатор слишком сильно подавляет активность ферментов и вызывает артефакты сморщивания, тогда как в более низких он не полностью иммобилизирует фермент и не обеспечивает должной сохранности ткани.

Лучше всего готовить раствор формальдегида 4% на трис-НСl-буфере с рН 7,2-7,5. Интенсивно встряхивают его и фильтруют.

Фиксацию проводят при температуре +4^oС (в холодильнике); при более высокой температуре фермент инактивируется значительно быстрее.

Время фиксации зависит от вида исследуемого фермента и органа, а также от размера тканевого блока. Для блоков, толщина которых не превышает 5 мм, время фиксации в формальдегиде составляет 12 часов. Более длительная фиксация вызывает сморщивание ткани и существенную инактивацию фермента. В течение первых 10-30 минут ферментативная активность снижается пропорционально увеличению времени фиксации, а затем остается относительно стабильной. Поэтому время фиксации можно увеличить, т.к. инактивация гидролаз не происходит.

Затем извлекают кусочки из фиксатора, "высушивают" их фильтровальной бумагой и переносят в охлажденный трис-НСl-буфер (рН 7,2-7,5).

Промывка и заливка
Для повышения остаточной активности фермента тканевой блок после фиксации следует тщательно промыть. Промывка повышает остаточную активность в два и даже в три раза, что позволяет обнаруживать клетки с низкой ферментативной активностью. Промывку проводят в проточной воде или при + 4^oС в дистиллированной воде, трис-НСl буфере (рН 7,2-7,5).

Время промывки зависит от времени фиксации, так при фиксации 12 часов необходимо промывать такое же время.

Перед заливкой тканевые препараты обезвоживают при + 4^oС в течение 30-45 минут в 50%-ном ацетоне, а затем в трех сменах 100%-ного ацетона 3-24 часов. В последней смене ацетона материал оставляют на 1-2 часа при комнатной температуре. Тканевые блоки просветляют в трех сменах (по 10 минут каждая) бензола, толуола или ксилола, промокают фильтровальной бумагой, помещают в парафин на 30-45 мин при 56^oС и переносят в сосуды для заливки с новой сменой парафина.

Приготовление парафиновых срезов
Парафиновый блок (на колодке) укрепляют в объектодержателя микротома, длинник блока располагают параллельно или перпендикулярно к санкам микротома.

Затем укрепляют нож перпендикулярно к длиннику микротома либо косо. Косое положение показано для резки плотных тканей. Блок и нож сближают для соприкосновения, выравнивают поверхность путем срезания толстых срезов, после обнаружения кусочков тканей или органа переходят к срезу необходимой толщины (от 3-5 до 15 мкм).

Полученные срезы при помощи кисточки или препаровальной иглы снимают с бритвы микротома и помещают в чашку с теплой дистиллированной водой. Для наклеивания срез вылавливают из воды на заранее подготовленное предметное стекло. Срезы на стекле оставляют для фиксации на 6-24 часа при комнатной температуре.

Приготовление трис-HCl-буфера
В колбу на 100 мл вносят 50 мл 0,1 М раствора триса (гидроксиметил) аминометан с относительной молекулярной массой 121,14 и добавляют 40-44 мл HCl 0,1 н. и доводят дистиллированной водой до метки (рН 7,2-7,5).

Приготовление инкубационной смеси
20 мг основного бензидина растворяют в 2-3 мл 96 об.% этилового спирта и добавляют 20 мл дистиллированной воды небольшими порциями, затем вносят буферную смесь 28-30 мл, перемешивают и добавляют 3-5 капель 3%-ной перекиси водорода.

Инкубация
Инкубируют в течение 15-30 минут, затем сливают инкубационную среду, промывают в дистиллированной воде. Докрашивают ядра нейтральным красным 0,5% или 0,5% сафранином, приготовленным на забуференном физиологическом растворе.

Для длительного хранения препарата необходимо поместить проинкубированные срезы в 0,1%-ный водный раствор четырехокиси осмия на дистиллированной воде или 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2) на 5 минут при комнатной температуре. Затем промывают в дистиллированной воде, высушивают и докрашивают ядра.

Результаты: структуры, обладающие ферментативной активностью, окрашиваются в коричневый цвет.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Для повышения точности выявления активности пероксидазы при инкубации срезов используют среду, содержащую основной бензидин, растворенный в 2-3 мл этилового спирта 96%, с последующим добавлением 20 мл дистиллированной воды небольшими порциями.

Способ выявления пероксидазы в иммунокомпетентных органах животных, включающий взятие и обработку пробы, фиксацию, промывку и заливку, инкубацию в среде, содержащей 0,1 М трис-HCl-буфер, соединение бензидина и раствор перекиси водорода, оценку качественной реакции по окраске, отличающийся тем, что инкубацию осуществляют в среде, содержащей в качестве соединения бензидина основной бензидин, растворенный в 2-3 мл 96 об.%-ного этилового спирта с добавлением 20 мл дистиллированной воды небольшими порциями.