Перекрестные ссылки на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке США № 61/463850, поданной 23 февраля 2011 г., и заявке США № 61/574270, поданной 30 июля 2011 г.
Область техники
Настоящее раскрытие в целом относится к системам и способам секвенирования нуклеиновых кислот и композициям, которые можно использовать в таких системах и способах.
Уровень техники
Для детектирования и типирования бактериальных и вирусных патогенов в настоящее время доступно несколько методов. Они включают способы, использующие:
1) непрямое определение генетической последовательности, включая специфичную к виду/штамму ПЦР, ПЦР на основе повторяющихся последовательностей (rep-ПЦР), гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) и оптическое картирование ДНК,
2) прямое определение последовательности посредством или типирования мультилокусных последовательностей (MLST), или полного секвенирования бактериального генома, или
3) комбинацию вышеупомянутого, такую как определение нуклеотидного состава продуктов ПЦР посредством масс-спектрометрии.
Первая группа методов (Cepheid, PathoGenetix, Inc., OpGen, Inc.) имеет более низкое разрешение и дискриминационную способность по сравнению со второй группой методов и ограничивается небольшим количеством исследованных консервативных участков генома. Методы во второй группе при этом чрезмерно дороги и обеспечивают только низкую производительность, хотя с появлением высокопроизводительных методов секвенирования второго (SOLiD и PGM от Life Technologies/Ion Torrent, Illumina, Roche 454, Complete Genomics) и третьего (Pacific Biosciences, Helicos) поколения стоимость в расчете на образец имеет тенденцию к уменьшению ниже 10000 $. Кроме того, доступные в настоящее время способы секвенирования страдают или от сложной подготовки образцов и образования кластеров ДНК (SOLiD и Ion Torrent от Life Technologies, Roche 454, Complete Genomics, Illumina), от короткой длины считывания (Helicos, SOLiD, Illumina), или от высокой частоты ошибок (Pacific Biosciences). Кроме того, доступные в настоящее время приборы для одномолекулярного секвенирования (Pacific Biosciences и Helicos) являются громоздкими, очень дорогими и требуют высококвалифицированного персонала для эксплуатации. Третья группа методов (Ibis Biosciences Inc.) способна к определению нуклеотидного состава только относительно коротких последовательностей продуктов ПЦР и страдает от всех ограничений обычной ПЦР.
В отличие от доступных в настоящее время одномолекулярных способов (Helicos, Pacific Biosciences) зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, не требует разработки мутантных полимераз, способных к включению модифицированных нуклеотидов, дорогостоящих меченых нуклеотидов, или лазеров и дорогих высокоскоростных съемочных камер. Таким образом, зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, может быть интегрировано в недорогие портативные используемые по месту лечения системы.
Кроме того, зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, предусматривает максимальную гибкость и быстрое изменение конфигурации, делая возможным быстрый ответ на неожиданные эндемические угрозы, новые заболевания, пандемии и новые угрозы биотеррора посредством простого обновления связанной с платформой базы данных нуклеиновых кислот и программного обеспечения без какого-либо изменения в реагентах. В этом заключается отличие от многочисленных диагностических платформ, использующих ПЦР, в которых требуется значительное время для изменения конфигурации и проверки анализа перед перестройкой платформы для работы с любыми новыми целями. В этом заключается также отличие от не основанной на секвенировании одномолекулярной платформы Genom Sequence Scanning, использующей технологию Direct Linear Analysis (DLA) (PathoGenetiX), которая основана на пространственном расположении меток, разделенных по меньшей мере тремя т.п.о., что делает данную технологию нечувствительной к меньшим т.п.о. вставкам или делециям, а также вариациям в отдельных нуклеотидах.
Кроме того, зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, предусматривает максимальную возможность мультиплексирования. Тогда как основанные на ПЦР и применении микроматриц способы ограничены детектированием только известного(ых) возбудителя(ей) инфекции(й) и не могут идентифицировать мутировавшие или биоинженерные варианты (т.е. с разницей в одном нуклеотиде), зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе является, в некотором смысле, "агностиком в отношении цели", поскольку данные способы расшифровывают первичную структуру любых возможных молекул ДНК, содержащихся в образце или полученных из образца, и, таким образом, способны к детектированию и идентификации тысяч известных или неизвестных (например, генетически модифицированных) целей одновременно. Такая изначально присущая "широкополосная" возможность мультиплексирования, обеспечиваемая системами и способами, описанными в настоящем документе, отличает их от подходов, использующих ПЦР, в которых требуются специальные наборы реагентов (праймеры и зонды) для детектирования каждого патогена. Кроме того, основанные на ПЦР технологии ограничены числом анализов, возможных при мультиплексных реакциях, просто вследствие природы ПЦР, или необходимостью разделения образца (т.е. содержащего целевые нуклеиновые кислоты) между множеством реакций, причем достигается компромисс между чувствительностью детектирования и точностью количественного анализа.
Сущность изобретения
Зависящее от вращения транскрипционное секвенирование основано на РНК-полимеразе, иммобилизованной относительно твердой поверхности. В результате транскрипции РНК-полимераза прикладывает крутящий момент к нуклеиновой кислоте, который, в свою очередь, проявляет себя в виде вращающихся меток, прикрепленных к нуклеиновой кислоте.
В одном аспекте предлагается способ определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Такой способ в целом включает приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты в условиях секвенирования, детектирование характера вращения вращающейся метки и повторение стадий приведения в контакт и детектирования несколько раз. Как правило, условия секвенирования включают присутствие по меньшей мере одного нуклеозидтрифосфата, а РНК-полимераза иммобилизована на твердом субстрате, причем представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты содержит вращающуюся метку. Последовательность представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты основана на, последовательно, присутствии или отсутствии изменения в характере вращения в присутствии данного по меньшей мере одного нуклеозидтрифосфата.
В некоторых вариантах осуществления РНК-полимераза представляет собой РНК-полимеразу бактериофага (например, РНК-полимеразу T7, РНК-полимеразу T3). В некоторых вариантах осуществления РНК-полимераза представляет собой бактериальную РНК-полимеразу (например, РНК-полимеразу E. coli). В некоторых вариантах осуществления РНК-полимераза иммобилизована на твердой поверхности посредством His-метки. Типичными, представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты могут быть молекулы прокариотов, бактерий, простейших и эукариотов. Представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты, как правило, являются двухцепочечными, и могут содержаться в биологическом образце. Представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты дополнительно может включать последовательность промотора РНК-полимеразы.
В некоторых вариантах осуществления вращающаяся метка включает первую метку и вторую метку. Например, в некоторых вариантах осуществления первая метка является магнитной. Типичный твердый субстрат изготовлен из стекла. Другие типичные твердые субстраты включают КМОП или ПЗС. В некоторых вариантах осуществления условия секвенирования включают присутствие единственного нуклеозидтрифосфата; в некоторых вариантах осуществления условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где первый нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве.
В некоторых вариантах осуществления стадия детектирования включает испускание света на вращающуюся метку. В некоторых вариантах осуществления стадия детектирования дополнительно включает наблюдение характера вращения посредством микроскопа. В некоторых вариантах осуществления стадия детектирования дополнительно включает фиксацию характера вращения на КМОП или ПЗС. В некоторых вариантах осуществления стадия детектирования включает фиксацию характера вращения в виде магнитного изображения. В некоторых вариантах осуществления магнитное изображение фиксируют на датчике ГМС или матрице MRAM. В некоторых вариантах осуществления стадия детектирования включает фиксацию характера вращения в виде электрического поля. В некоторых вариантах осуществления изображение фиксируют на датчике RAM.
Такие способы также могут включать прикладывание направленной силы к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты. Например, направленную силу можно получать с применением магнита или с применением потока или давления.
В другом аспекте предлагается способ определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Такой способ, как правило, включает предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизована РНК-полимераза; приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты в первых условиях секвенирования, причем представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты содержит вращающуюся метку, причем первые условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где первый нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве; детектирование характера вращения вращающейся метки в первых условиях секвенирования; и определение информации о местоположении первого нуклеозидтрифосфата вдоль представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании изменения в характере вращения.
Такой способ может дополнительно включать предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизована РНК-полимераза; приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей вращающуюся метку, во вторых условиях секвенирования, причем вторые условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где второй нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве; детектирование характера вращения вращающейся метки во вторых условиях секвенирования; и определение информации о местоположении второго нуклеозидтрифосфата вдоль представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании изменения в характере вращения.
В некоторых вариантах осуществления стадии приведения в контакт и детектирования во вторых условиях секвенирования осуществляют одновременно со стадиями приведения в контакт и детектирования в первых условиях секвенирования. В некоторых вариантах осуществления стадии приведения в контакт и детектирования во вторых условиях секвенирования осуществляют одну за другой до или после стадий приведения в контакт и детектирования в первых условиях секвенирования.
Такие способы также могут включать предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизована РНК-полимераза; приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей вращающуюся метку, в третьих условиях секвенирования, причем третьи условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где третий нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве; детектирование характера вращения вращающейся метки в третьих условиях секвенирования; и определение информации о местоположении третьего нуклеозидтрифосфата вдоль представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании изменения в характере вращения. Такие способы могут дополнительно включать определение последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты из информации о местоположении первого, второго и третьего нуклеозидтрифосфатов в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты.
Такие способы дополнительно могут включать предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизована РНК-полимераза; приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей вращающуюся метку, в четвертых условиях секвенирования, причем четвертые условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где четвертый нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве; детектирование характера вращения вращающейся метки в четвертых условиях секвенирования; и определение информации о местоположении четвертого нуклеозидтрифосфата вдоль представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании изменения в характере вращения.
В некоторых вариантах осуществления твердая поверхность представляет собой стеклянную пластину. Такая стеклянная пластина может быть покрыта медью и ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления РНК-полимераза представляет собой РНК-полимеразу T7. В некоторых вариантах осуществления РНК-полимераза T7 иммобилизована на твердом субстрате посредством His-метки.
В другом аспекте предлагается способ определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Такой способ, как правило, включает предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизованы одна или несколько РНК-полимераз; приведение в контакт одной или нескольких РНК-полимераз с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты в первых условиях секвенирования, причем представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты содержит вращающуюся метку, причем первые условия секвенирования включают присутствие первого из четырех нуклеозидтрифосфатов; и детектирование в первых условиях секвенирования, имеет ли место изменение в характере вращения. Если изменение в характере вращения имеет место, данный способ дополнительно включает повторение стадии приведения в контакт и последующих стадий в первых условиях секвенирования, тогда как, если изменение в характере вращения не имеет места, данный способ дополнительно включает повторение стадии приведения в контакт и последующих стадий во вторых условиях секвенирования, причем вторые условия секвенирования включают присутствие второго из четырех нуклеозидтрифосфатов. Аналогично, если изменение в характере вращения имеет место, данный способ дополнительно включает повторение стадии приведения в контакт и последующих стадий в первых условиях секвенирования, тогда как, если изменение в характере вращения не имеет места, данный способ дополнительно включает повторение стадии приведения в контакт и последующих стадий в третьих условиях секвенирования, причем третьи условия секвенирования включают присутствие третьего из четырех нуклеозидтрифосфатов. Последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты может быть получена на основании, последовательно, появления изменения в характере вращения в первых, вторых или третьих условиях секвенирования.
В еще одном аспекте предлагается промышленное изделие. Промышленные изделия, как правило, включают твердый субстрат, на котором иммобилизовано несколько ферментов РНК-полимераз. В некоторых вариантах осуществления твердый субстрат покрыт медью и ПЭГ; в другом варианте осуществления, твердый субстрат покрыт никелем и ПЭГ. Альтернативно, твердый субстрат может быть покрыт Ni-NTA. В некоторых вариантах осуществления твердый субстрат представляет собой КМОП или ПЗС.
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие дополнительно включает вращающуюся метку. Вращающаяся метка может включать несферическую метку или сферическую метку, имеющую неоднородную поверхность, которую можно различить оптически. Промышленное изделие также может включать последовательности промотора РНК-полимеразы T7 и/или биотинилированные последовательности нуклеиновой кислоты связывающего участка. Промышленные изделия, описанные в настоящем документе, также могут включать один или несколько нуклеозидтрифосфатов.
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие дополнительно включает инструкции для: идентификации вращения вращающейся метки относительно оси через магнитную реперную метку; составления последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании вращения и присутствия нуклеозидтрифосфата; или прикладывания магнитной силы. Такие инструкции могут предлагаться в электронной форме.
В еще одном аспекте предлагается устройство для секвенирования по одному основанию представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты. Такое устройство, как правило, включает модуль секвенирования, причем модуль секвенирования включает резервуар для помещения твердого субстрата, причем твердый субстрат содержит несколько РНК-полимераз, иммобилизованных на нем; источник для обеспечения направленной силы, причем направленная сила является достаточной и имеет такое направление, что к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты, транскрибируемым рядом РНК-полимераз, иммобилизованными на твердой поверхности, прикладывается напряжение; источник света для испускания света на вращающуюся метку, связанную с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты, транскрибируемыми рядом РНК-полимераз, иммобилизованными на твердой поверхности; и оптику для детектирования характера вращения вращающейся метки, связанной с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты, транскрибируемыми рядом РНК-полимераз, иммобилизованными на твердой поверхности.
Такое устройство дополнительно может включать компьютерный процессор и/или флюидику для содержания и переноса реагентов и буферов, участвующих в секвенировании нуклеиновых кислот. Типичными реагентами являются нуклеозидтрифосфаты, и типичным буфером может являться промывочный буфер. В некоторых вариантах осуществления источник для обеспечения направленной силы может представлять собой магнит или поток жидкости. В некоторых вариантах осуществления оптика содержит микроскоп и дополнительно может включать съемочную камеру.
Такое устройство дополнительно может включать модуль подготовки образца, причем модуль подготовки образца включает резервуар для помещения биологического образца; и флюидику для содержания и переноса реагентов и буферов, участвующих в выделении и подготовке нуклеиновых кислот для секвенирования. Типичные реагенты включают реагенты для клеточного лизиса и/или расщепляющие ферменты, тогда как типичные буферы включают лизисный буфер и/или промывочный буфер.
Такое устройство дополнительно может включать модуль финальной обработки матрицы, причем модуль финальной обработки матрицы включает флюидику для содержания и переноса реагентов и буферов, участвующих в прикреплении последовательностей промотора РНК-полимеразы и вращающихся меток к молекулам нуклеиновой кислоты. Типичные реагенты включают фермент лигазу, связывающую молекулярный мотор последовательность, магнитную метку и/или связывающий участок, тогда как типичные буферы включают лигазный буфер, связывающий магнитную реперную метку буфер и/или связывающий вращающуюся метку буфер.
В еще одном аспекте предлагается способ определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, где представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты включают вращающуюся метку, и где последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты основана на данных, полученных во время транскрипции представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Такой способ обычно включает получение первого данного для первого положения представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, причем первое данное указывает на присутствие или отсутствие вращения и/или на промежуток времени между оборотами вращающейся метки; получение второго данного для первого положения представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, причем второе данное указывает на присутствие и/или количество одного или нескольких нуклеозидтрифосфатов, доступных во время транскрипции; получение другого первого данного и другого второго данного для второго положения представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты; получение еще одного первого данного и еще одного второго данного для третьего положения представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты; повторение стадий получения первого данного и второго данного для четвертого и последующих положений представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты; и определение последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании первого данного и второго данного, полученных для каждого положения. В некоторых вариантах осуществления первое данное и второе данное учитывают как нуклеотид в указанном положении.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, хорошо понятные среднему специалисту в области техники, к которой принадлежат системы, способы и композиции веществ. Хотя при реализации на практике или тестировании систем могут использоваться системы, способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, ниже описаны способы и композиции веществ, подходящие системы, способы и материалы. Кроме того, системы, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предлагаются в качестве ограничивающих. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые ниже, включены посредством ссылки во всей полноте.
Описание чертежей
Фигура 1 демонстрирует вариант осуществления комплекса одномолекулярного зависящего от вращения транскрипционного секвенирования (фигура 1A) и варианта осуществления комплексов зависящих от вращения транскрипционного секвенирования на чипе (фигура 1B), как описано в настоящем документе.
Фигура 2A представляет собой изображение магнитных вращающихся меток, полученное с применением 20x объектива для воды. На данном изображении FOV ограничено детектором, а не объективом. На данном изображении магнитные вращающиеся метки имеют диаметр, равный 2,7 микрон. Фигура 2B представляет собой изображение магнитных вращающихся меток под напряжением (в данном случае в присутствии магнитной силы), и она демонстрирует, при сравнении с фигурой 2A, что магнитные вращающиеся метки сдвигаются "вверх", благодаря применению магнита. Двойные изображения получены благодаря присутствию двух источников света, освещающих вращающуюся метку сверху под двумя различными углами. Следовательно, когда вращающиеся метки выходят из фокальной плоскости, две "тени" разделяются. Данный способ можно использовать для определения того, насколько однородным является напряжение в плоскости образца и в различных расположениях по оси z вне плоскости. Вращающиеся метки, которые еще в фокусе на фигуре 2B, вероятно, прикреплены к твердой поверхности. Фигура 2C представляет собой фотографию массива вращающихся меток, связанных меченой His РНК-полимеразой, и матрицы ДНК размером 5,1 т.п.о. на пассивированной твердой поверхности.
Фигура 3 представляет собой графики, демонстрирующие два режима секвенирования нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе: панель A демонстрирует асинхронный способ секвенирования "нуклеотидного порядка" в реальном времени, при котором ограниченная концентрация одного нуклеозидтрифосфата (гуанина (G) на данной панели) заставляет полимеразу приостанавливаться при введении нуклеотидов G в образующуюся цепочку. Панель B демонстрирует синхронный способ секвенирования, при котором введение нуклеозидтрифосфатов "по одному основанию" приводит к непрерывной расшифровке нуклеотидной последовательности.
Фигура 4 представляет собой графики из четырех разных проточных ячеек, причем в каждой различные нуклеозидтрифосфаты присутствуют в лимитирующем количестве. Нижняя панель демонстрирует последовательность нуклеиновых кислот, составленную из четырех проточных ячеек.
Фигура 5 представляет собой схему, демонстрирующую один вариант осуществления проточной ячейки, описанной в настоящем документе. Например, проточные ячейки могут включать вырезанную лазером приклеивающуюся под давлением (PSA) пленку толщиной приблизительно 50 микрон, лежащую поверх датчика OmniVision (OV 14810; после удаления окна и покрытия SiN). Данная конфигурация приводит к расположению проточной ячейки поверх КМОП-чипа. Затем накладывают стеклянную или полимерную пластину, имеющую отверстия для микрофлюидных трубок сквозной подачи.
Фигура 6A представляет собой фотографию, а фигура 6B представляет собой схематический рисунок, демонстрирующие прототипную твердую поверхность, причем для передачи света используются волокна, а для визуализации используется микрообъектив. Пластина с твердой поверхностью, содержащая нуклеиновые кислоты с вращающейся меткой и РНК-полимеразы, изображена расположенной ниже волокон и выше объектива.
Фигура 7 демонстрирует один вариант осуществления системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанной в настоящем документе. Схема демонстрирует источник напряжения, источник освещения и четыре проточные ячейки поверх чипов твердой поверхности с подводящей и отводящей флюидикой.
Фигура 8A представляет собой фотографию, а фигура 8B представляет собой схематический рисунок, демонстрирующие один вариант осуществления системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования. В данном варианте осуществления используют 20x объектив для воды, "super-lens" от Olympus, который обеспечивает FOV больше чем 1 мм с NA=0,9, что представляет собой высокое разрешение с большим полем обзора. Также показаны твердая поверхность, передача света и источник напряжения (например, магнит).
Фигура 9A представляет собой фотографию, а фигура 9B представляет собой схематический рисунок, демонстрирующие другой вариант осуществления системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования. В данном варианте осуществления показана компактная оптическая система с целью оптического разрешения с AF, волокнами для освещения, 20x объективом Mitutoyo, трубчатой линзой и съемочной камерой. Дискообразный магнит также видим выше цели, но он не попал на данное изображение. Для разрешения 1 микрон в пространстве объектива можно использовать одну или несколько съемочных камер, имеющих размер пиксела больше чем 20 микрон.
Фигура 10 демонстрирует, что вращение вращающейся метки (например, пары, содержащей первую метку и вторую метку) можно детектировать даже при использовании низкого разрешения (т.е. 10×10 пикселов на гранулу, отображаемую через объектив или посредством способа на чипе). Возможно дополнительное уменьшение до 5×5 пикселов с применением более совершенных алгоритмов. Кроме того, если используется суживающийся жгут, то разрешение возрастает для каждой гранулы, расположенной поверх сердцевин жгута, в количество раз, связанное с размером сердцевин и размером каждого пиксела на другой стороне жгута, а также количеством пикселов на детекторе, разделяющим сердцевины.
Фигура 11A представляет собой блок-схему, иллюстрирующую пример анализа характера вращения вращающейся метки, а фигура 11B представляет собой блок-схему, иллюстрирующую пример способа определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.
Одинаковые символы сносок на разных чертежах указывают на одинаковые элементы.
Подробное описание
Настоящее раскрытие описывает систему одномолекулярного секвенирования, в которой многие ограничения существующих одномолекулярных систем ослаблены, включая сложность, стоимость, масштабируемость, и в которой, наконец, большие длины считывания, выше производительность и выше точность. С помощью способа и системы одномолекулярного секвенирования в реальном времени, описанных в настоящем документе, можно секвенировать тысячи нуклеотидов за очень короткое время с высокой точностью, благодаря высоко процессивному транскрипционному механизму и простым оптической и визуализационной системам.
Преимущества настоящей системы многочисленны. Например, в качестве матрицы используется двухцепочечная нуклеиновая кислота, что уменьшает и ограничивает требования к подготовке образца. Кроме того, не требуются меченые нуклеотиды, поскольку можно использовать очень простые способы визуализации (например, КМОП), который значительно снижают стоимость. Также можно использовать ферменты РНК-полимеразы дикого типа; отсутствует необходимость в специальных модификациях фермента, и химия поверхности и технологии иммобилизации фермента являются обычными. Настоящие системы и способы подходят для гомополимерных последовательностей, поскольку вращение одинаково для каждого нуклеотида и, таким образом, является кумулятивным для множества нуклеотидов. Настоящие системы и способы также легко могут быть приспособлены для высокопроизводительного секвенирования.
Обзор зависящего от вращения транскрипционного секвенирования
Зависящее от вращения транскрипционное секвенирование основано на транскрипции представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты РНК-полимеразой. РНК-полимераза иммобилизована на твердой поверхности, и с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты связана вращающаяся метка. Во время транскрипции РНК-полимераза устанавливает транскрипционый глазок в матричной нуклеиновой кислоте, которая содержит РНК:ДНК гибрид от приблизительно 8 оснований. Когда РНК-полимераза продвигается вдоль матрицы двухцепочечной нуклеиновой кислоты, она должна расплести спираль у переднего края глазка и вновь отжечь цепочки у заднего края. Крутящий момент, возникающий в результате расплетения двухцепочечной спирали, приводит к вращению матричной нуклеиновой кислоты относительно РНК-полимеразы приблизительно на 36º на включенный нуклеотид. Следовательно, когда РНК-полимераза иммобилизована на твердой поверхности, а вращающаяся метка прикреплена к матричной нуклеиновой кислоте, вращение матричной нуклеиновой кислоты можно наблюдать, и оно указывает на транскрипционную активность (т.е. включение нуклеозидтрифосфата) фермента.
Как описано в настоящем документе, последовательность представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты определяют или получают на основании изменений в характере вращения вращающейся метки. Как также описано в настоящем документе, детектирование присутствия или отсутствия вращения нуклеиновой кислоты может быть осуществлено, например, с применением освещения вращающейся метки, связанной с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты. Способы вращательного секвенирования, описанные в настоящем документе, могут быть распространены на секвенирование всего генома с применением набора ферментов РНК-полимераз и любого количества обычных способов визуализации, подходящих для фиксации вращения вращающейся метки.
Фигура 1 демонстрирует вариант осуществления одномолекулярного секвенирования (Фигура 1A) и матричный вариант осуществления на чипе (Фигура 1B) комплекса зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанного в настоящем документе. Комплекс зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанный в настоящем документе, можно использовать для определения последовательности представляющей интерес молекулы 10 нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления РНК-полимераза 20, иммобилизованная на твердой поверхности 30 или на чипе 80, приходит в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты 10 (т.е. молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей неизвестную последовательность). В соответствии со способами, описанными в настоящем документе, представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты 10 включает вращающуюся метку 40. В определенных условиях секвенирования, которые включают присутствие по меньшей мере одного нуклеозидтрифосфата, изменения в движении и/или скорости вращающейся метки 40 создают характер вращения. Данные стадии повторяют многократно, и определяют последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты на основании, последовательно, присутствия или отсутствия изменения в характере вращения в определенных условиях секвенирования. Эти особенности подробнее рассмотрены ниже.
Твердая поверхность
Для зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанного в настоящем документе, РНК-полимеразу иммобилизуют на твердой поверхности. В вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, твердую поверхность, как правило, изготавливают из кремниевого стекла (например, боросиликатного стекла, плавленного кварца или кварца). Материалы твердой поверхности для одномолекулярной визуализации хорошо известны и обычно используются в данной области техники, и те же самые материалы твердой поверхности, используемые для одномолекулярной визуализации, можно также использовать в матричном формате. При этом также можно использовать другие материалы (например, полипропилен, полистирол, кремний, нитрид кремния и другие полимеры или их композиции), при условии, что они подходят для применения в секвенировании, описанном в настоящем документе. Фигура 1B демонстрирует вариант осуществления "на чипе", в котором твердая поверхность 30 также включает систему детектирования. Данные типы твердых поверхностей (например, КМОП и ПЗС) также известны в данной области техники, и ниже рассмотрены подробнее.
До иммобилизации одной или нескольких биологических молекул на твердой поверхности, твердую поверхность обычно модифицируют (например, функционализируют) для приема и связывания биологических молекул. Способы функционализирования твердых поверхностей для иммобилизации биологических ферментов известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления твердую поверхность можно функционализировать с помощью меди или никеля, тогда как в некоторых вариантах осуществления твердую поверхность можно функционализировать с помощью Ni-NTA (смотри, например, Paik et al., 2005, Chem. Commun. (Camb), 15: 1956-8) или Cu-NTA. Альтернативно, для модификации твердой поверхности для иммобилизации можно использовать металлы, такие как кобальт или тому подобные.
Перед модифицированием твердой поверхности, твердую поверхность можно обрабатывать, например, фрагментами ПЭГ. Такие способы можно использовать, для того, чтобы регулировать плотность РНК-полимераз на твердой поверхности, а также можно использовать, для того, чтобы получить упорядоченное расположение РНК-полимераз на твердой поверхности, такое как однородное, полуупорядоченное или случайное множество РНК-полимераз. Окружение из ПЭГ приводит к минимальным взаимодействиям между ферментом и поверхностью (за исключением связывающейся метки на N- или C-конце), и в результате приводит к минимальному нарушению исходной конформации иммобилизованного фермента. Кроме того, способы пассивирования поверхности известны в данной области техники и могут включать, например, обработку твердой поверхности бычьим сывороточным альбумином (БСА).
РНК-полимераза
Способы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанные в настоящем документе, основаны на действии РНК-полимеразы во время процесса транскрипции и вращательной силе, прикладываемой к транскрибируемой нуклеиновой кислоте (смотри, например, US 2007/0077575). При том, что в способах секвенирования, описанных в настоящем документе, можно использовать мультисубъединичные РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразу E. coli или других прокариотов или одну из эукариотических РНК-полимераз), небольшие односубъединичные РНК-полимеразы, как например, из бактериофага, являются особенно подходящими. Односубъединичные РНК-полимеразы или гены, кодирующие такие ферменты, могут быть получены из бактериофагов T3, T7, SP6 или K11.
РНК-полимеразы бактериофагов являются очень процессивными и точными по сравнению с многими из мультисубъединичных РНК-полимераз, и часто производят меньше ошибок делеция-вставка. Кроме того, РНК-полимеразы из бактериофага значительно менее склонны к обратному движению по сравнению с мультисубъединичными, такими как РНК-полимераза из E. coli. Были описаны РНК-полимеразы из нескольких различных бактериофагов. Просто в качестве примера, РНК-полимераза T7 состоит из единственного полипептида, имеющего молекулярную массу, равную 99 кДа, и клонирование и экспрессия гена, кодирующего РНК-полимеразу T7, описаны в патенте США № 5693489. Структура РНК-полимеразы T7 определена до уровня в 3,3 ангстрема, причем были определены четыре различные кристаллические структуры: РНК-полимераза T7 отдельно (свободная), РНК-полимераза T7, связанная с промотором нуклеиновой кислоты, весь инициирующий комплекс (РНК-полимераза T7, связанная с промотором нуклеиновой кислоты, и один или несколько факторов транскрипции), и РНК-полимераза T7, связанная ингибитором.
РНК-полимеразы, которые подходят для применения в способах, описанных в настоящем документе, как правило, обеспечивают обороты нуклеиновой кислоты продолжительностью в диапазоне от субмикросекундной до 100 миллисекунд для каждого нуклеотида, включенного в транскрипт, но также можно использовать РНК-полимеразы, которые обеспечивают обороты продолжительностью в диапазоне от 100 миллисекунд вплоть до нескольких секунд на нуклеотид. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что, для того чтобы произвести необходимое вращение, РНК-полимераза должна транскрибировать двухцепочечную нуклеиновую кислоту.
Плотность и/или распределение РНК-полимераз на твердой поверхности можно контролировать или регулировать, например для того, чтобы оптимизировать конкретные осуществляемые реакции секвенирования. Как известно в данной области техники, из множества биологических молекул можно создавать упорядоченное расположение. Например, множество биологических молекул можно случайным образом распределить на твердой поверхности, равномерно распределить или распределить упорядоченным или полуупорядоченным образом. В некоторых вариантах осуществления твердая поверхность может нести больше чем 100 РНК-полимераз, или больше чем 1000 РНК-полимераз (например, больше чем 10000 РНК-полимераз), иммобилизованных на ней. В некоторых вариантах осуществления твердая поверхность может нести по меньшей мере одну РНК-полимеразу, иммобилизованную на ~5 мкм2 (например, по меньшей мере одну РНК-полимеразу, иммобилизованную на ~2,5 мкм2, ~1 мкм2, ~0,5 мкм2 или ~0,1 мкм2). Следует понимать, что плотность РНК-полимераз на твердой поверхности может зависеть, по меньшей мере частично, от размера представляющих интерес секвенируемых молекул нуклеиновой кислоты, а также конкретной используемой вращающейся метки.
При том, что способы секвенирования, описанные в настоящем документе, основаны на вращении, создаваемом во время транскрипции РНК-полимеразой, для создания вращения можно использовать другие молекулярные моторы в сочетании с РНК-полимеразой. Молекулярные моторы представляют собой биологические молекулы, которые потребляют энергию, как правило, посредством гидролиза нуклеотидтрифосфата, и превращают ее в движение или механическую работу. Примеры молекулярных моторов включают, без ограничения, геликазы, топоизомеразы, ДНК-полимеразы, миозин, АТФазы и ГТФазы. В некоторых вариантах осуществления молекулярный мотор может быть иммобилизован на твердой поверхности, и транскрипция посредством РНК-полимеразы может происходить в положении на представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты между молекулярным мотором и вращающейся меткой. В таких случаях характер вращения будет представлять собой результат всех вращательных сил, прикладываемых к молекуле нуклеиновой кислоты молекулярным мотором, в сочетании с вращательной силой, прикладываемых к молекуле нуклеиновой кислоты РНК-полимеразой. В качестве альтернативы ферментативному молекулярному мотору для создания вращения можно использовать, например, твердотельный MEMS-мотор в сочетании с РНК-полимеразой.
РНК-полимераза может быть иммобилизована на твердой поверхности с применением любого количества известных средств. Например, в одном варианте осуществления РНК-полимераза содержит His-метку (например, His-метки, несущие 4 остатка His, 6 остатков His, или 10 остатков His). His-метку или другую подходящую метку можно использовать при условии, что она совместима с химией поверхности (например, функционализацией), рассмотренной выше.
Представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты
Молекулы нуклеиновой кислоты для зависящего от вращения транскрипционного секвенирования могут быть получены практически из любого источника, включая эукариоты, бактерии и простейшие. Эукариотические нуклеиновые кислоты могут быть из людей или других млекопитающих (например, приматов, лошадей, крупного рогатого скота, собак, кошек и грызунов) или из не млекопитающих (например, птиц, рептилий (например, змей, черепах, аллигаторов и т.д.) и рыб), тогда как прокариотические нуклеиновые кислоты могут быть из бактерий (например, патогенных бактерий, таких как, без ограничения, Streptococcus, E. coli, Pseudomonas и Salmonella) или простейших (например, Crenarchaeota и Euryarchaeota).
Молекулы нуклеиновой кислоты для зависящего от вращения транскрипционного секвенирования могут содержаться в любом количестве биологических образцов. Типичные биологические образцы включают, без ограничения, жидкости (например, кровь, мочу, семенную жидкость) и ткани (например, орган, кожу, слизистую оболочку и опухоль).
Как рассмотрено в настоящем описании, одним из преимуществ способов зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанных в настоящем документе, является то, что в качестве матрицы используется двухцепочечная нуклеиновая кислота. Это снижает необходимость в манипулировании образцом и нуклеиновой кислотой, что является значительным преимуществом, особенно при секвенировании нуклеиновых кислот, больших, чем 1 тысяча пар оснований (т.п.о.; например, больших, чем 2 т.п.о., больших, чем 5 т.п.о., больших, чем 10 т.п.о., больших, чем 20 т.п.о., или больших, чем 50 т.п.о.) по длине, поскольку многие способы, используемые для получения нуклеиновых кислот из биологических образцов, приводят к нежелательному расщеплению, фрагментации или разрыванию нуклеиновых кислот. Очевидно, что в настоящих способах можно использовать одноцепочечные нуклеиновые кислоты (или образцы, содержащие одноцепочечные нуклеиновые кислоты). Однако, такие одноцепочечные нуклеиновые кислоты должны быть превращены в двухцепочечную нуклеиновую кислоту, для того чтобы проявлять вращение во время транскрипции. Способы получения двухцепочечных нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области техники и зависят от природы одноцепочечной нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК). Такие способы, как правило, включают применение хорошо известных ДНК полимераз и/или ферментов обратных транскриптаз.
Подготовка образца зависит от источника, но, как правило, включает выделение нуклеиновой кислоты с последующим лигированием промотора. Матрицы нуклеиновой кислоты, используемые в способах секвенирования, описанных в настоящем документе, не требуют какой-либо специальной подготовки и, следовательно, можно использовать стандартные способы выделения ДНК. Наконец, последовательность промотора, которая распознается конкретной используемой в системе транскрипционного секвенирования РНК-полимеразой, должна быть лигирована с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты. Последовательности промотора, распознаваемые большим количеством РНК-полимераз, известны в данной области техники и широко используются. Кроме того, способы лигирования одной молекулы нуклеиновой кислоты (например, последовательности промотора) с другой молекулой нуклеиновой кислоты (например, представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей неизвестную последовательность) хорошо известны в данной области техники, а ряд ферментов лигаз коммерчески доступны.
Кроме того, выделенные нуклеиновые кислоты, необязательно, можно фрагментировать, и, если требуется, можно выбирать или фракционировать определенные размеры. Например, выделенные нуклеиновые кислоты можно фрагментировать с применением ультразвуковой обработки и, если требуется, отбирать по размеру с применением обычной методики гель-электрофореза.
Кроме того, представляющие интерес нуклеиновые кислоты, необязательно, можно скруглять, например в плазмиду, так что секвенирование можно осуществлять на кольцевой мишени повторяющимся или рекурсивным образом.
Вращающиеся метки
Для способов зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанных в настоящем документе, секвенируемая представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты включает вращающуюся метку, связанную с ней. Такая метка прикреплена к нуклеиновой кислоте так, что она вращается под воздействием крутящего момента, прикладываемого к нуклеиновой кислоте РНК-полимеразой. Вращающиеся метки могут быть большими, достигая нескольких микрон (например, больше чем 1 микрон, 2 микрона, 3 микрона или 5 микрон) в диаметре, и маленькими, достигая нанометров (например, приблизительно 50 нм, 100 нм, 250 нм, 500 нм, 750 нм, 850 нм или 950 нм) в диаметре. Как используется в настоящем описании, вращающаяся метка может быть несферической или сферической; однако, если вращающаяся метка представляет собой одну сферу, она должна нести какой-либо элемент неоднородности, который можно использовать для детектирования вращения.
Несферическая метка может включать единственный фрагмент, не являющейся сферой (например, суживающийся стержень, треугольный, конический или в форме яйца). Кроме того, несферическая метка может быть изготовлена с применением двух (или более) сферических меток разного размера (например, первая метка прикреплена ко второй метке), которые вместе обеспечивают асимметрию, которая позволяет детектировать вращение. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая метки могут иметь одинаковый или по существу одинаковый размер. Например, первая метка, связанная с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, может рассматриваться как реперная метка, тогда как вторая метка, прикрепленная к первой метке, может рассматриваться как вращающаяся метка. В некоторых вариантах осуществления первая метка, связанная с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, имеет больший размер, тогда как вторая метка, прикрепленная к первой метке, имеет меньший размер. Такая конфигурация помещает вторую метку насколько возможно далеко от точки вращения первой метки, что повышает различение вращения при оптическом детектировании. Таким образом, размер меньшей метки должен быть достаточно большим для целей детектирования, но достаточно малым для минимизации гидродинамических эффектов, обусловленных размером всей вращающейся метки.
Например, в некоторых вариантах осуществления вращающаяся метка может включать гранулу большего размера (например, от приблизительно 1 микрона вплоть до приблизительно 3 микрон в диаметре) в качестве первой метки и гранулу меньшего размера (например, от приблизительно 0,5 микрон вплоть до приблизительно 1 микрона в диаметре) в качестве второй метки. Например, гранула большего размера может иметь размер 0,75 или 1 микрон, а гранула меньшего размера может иметь размер 0,5 микрон. Такие размеры подходят для различения вращения (с применением, как описано подробнее ниже, например, оптической системы, которая включает объектив Mitutoyo с увеличением 50x с числовой апертурой, равной 0,75, в комбинации с 1x трубчатой линзой и научной съемочной камерой с КМОП с размером пиксела 6,5 микрометра или меньше). В некоторых вариантах осуществления первая метка может составлять 0,75 микрон в диаметре, а вторая метка может составлять 0,35 микрон в диаметре. Такие размеры также подходят для различения вращения (с применением, как описано подробнее ниже, например, 100x объектива с числовой апертурой, равной 0,9 или выше, с применением научной съемочной камеры КМОП).
Соединение между, например, первой меткой и второй меткой может представлять собой механическое соединение или связь (например, связь стрептавидин-биотин), химическую связь (например, аминную или карбоксильную), магнитное притяжение или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления первая метка и вторая метка могут быть физически прикреплены одна к другой посредством, например, реакции полимеризации.
С другой стороны, вращающаяся метка может быть сферической, при условии, что ее вращение можно детектировать. Применение сферических вращающихся меток снижает или устраняет нелинейную динамику, создаваемую несферической вращающейся меткой, и сферическая вращающаяся метка будет проявлять меньшее гидродинамическое сопротивление во время вращения, чем несферическая вращающаяся метка. Одним примером сферической метки, имеющей элемент неоднородности, который можно использовать для детектирования вращения, является янус-гранула. Смотри, например, Casagrande et al. (1989, Europhys. Lett. 9:251). Янус-гранулой называется сферическая гранула, у которой одна полусфера является гидрофобной, а другая полусфера является гидрофильной, вследствие никелевого покрытия на половине сферы. Различные свойства полусфер позволяют детектировать вращение, даже когда вращающаяся метка является сферической.
В некоторых вариантах осуществления, рассмотренных в настоящем описании, вращающаяся метка может быть магнитной. Магнитные метки, сферические или несферические, хорошо известны в данной области техники и могут иметь форму магнитных гранул, стержней или других магнитных фрагментов, таких как, без ограничения, суперпарамагнитные частицы. Вся вращающаяся метка может быть магнитной, или только часть вращающейся метки может быть магнитной. Например, в некоторых вариантах осуществления только первая метка вращающейся метки может быть магнитной. Существует ряд коммерческих источников магнитных меток. Следующие абзацы описывают ряд способов, которыми можно создать магнитную вращающуюся метку для применения в способах секвенирования, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления на обычные полимерные гранулы можно наносить наномагнитный раствор (например, 1% масс./об. в толуоле или ксилоле с кобальтом, или Fe3O4, или FePt в толуоле или ксилоле), для того чтобы сделать их магнитными. В некоторых вариантах осуществления наномагнитные материалы можно применять к половине поверхности полимерной гранулы. Это приводит к магнитным гранулам, половины которых демонстрируют различные коэффициенты преломления или другие оптические свойства (например, рассеяние). В некоторых вариантах осуществления суперпарамагнитные частицы (или половина частицы) могут быть покрыты наносеребрянными чернилами для создания оптически отражающих и, в то же время, полностью суперпарамагнитных гранул. В данных вариантах осуществления с такими "чернилами" (например, PRIMAXX) можно использовать процессы осаждения и выпаривания для наделения определенными оптическими свойствами магнитных частиц или частей магнитных частиц. В некоторых вариантах осуществления суперпарамагнитные частицы (или половина частицы) могут быть покрыты квантовыми точками для наделения определенными оптическими свойствами частиц, которые уже являются магнитными. В некоторых вариантах осуществления в качестве вращающихся меток можно использовать магнитохромные частицы. В магнитохромных частицах наномагниты образуют цепочки в полимерах или заключены в углеродные оболочки. Цепочки наночастиц выровнены относительно друг друга с применением внешнего магнитного или электромагнитного поля. Когда свет рассеивается на частице, выровненные цепочки действуют в качестве дифракционных решеток Брэгга, и рассеивают свет соответствующим образом в определенных направлениях. Магнитохромные частицы вращаются внутри внешнего поля так, что можно наблюдать за модуляцией интенсивности между остановившейся частицей, у которой все цепочки выровнены, и частицей в состоянии вращения, у которой цепочки не полностью выровнены, для того, чтобы определять продолжительность вращения от начального положения до положения покоя или остановки до следующего вращения.
В некоторых вариантах осуществления первая магнитная метка может быть объединена со второй меткой, что может вызывать изменение электрического поля на детекторе. Такие электрические метки известны в данной области техники и могут представлять собой полимерные сферы, которые включают металлические элементы, они заряжены или представляют собой радиочастотные осцилляторы микронного размера, которые вызывают изменение в магнитном или электрическом поле, которое может быть зафиксировано прибором (описанным подробнее ниже).
Просто для того, чтобы предложить пространственное представление и без ограничения каким-либо конкретным размером или расстоянием, нижняя поверхность вращающейся метки, даже при транскрипции молекулы нуклеиновой кислоты размером 10 т.п.о., может быть только в 3 мкм от верха твердой поверхности. То есть, вращающаяся метка расположена очень близко к твердой поверхности даже в начале транскрипции. В конце транскрипции вращающаяся метка может быть близка к контакту с ферментом РНК-полимеразой и, таким образом, отделена от верха твердой поверхности очень маленьким расстоянием. Другими словами, вращающаяся метка, которая имеет диаметр, равный 2 мкм, будет иметь приблизительно такой же размер, что и транскрибируемая молекула нуклеиновой кислоты. Специалистам в данной области техники будет понятно, что транскрипция представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты РНК-полимеразой может проходить в обратном направлении, посредством чего вращающаяся метка движется в направлении от твердой поверхности во время транскрипции.
Вращающиеся метки могут быть прикреплены к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты с применением связывающих участков. Связывающие участки для прикрепления вращающихся меток к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты известны в данной области техники и содержат, без ограничения, химическую связь (например, поперечную, ван-дер-ваальсову или водородную связь) или белковую связь (например, связанные пары биотин-стрептавидин, дигоксигенин и распознающее антитело, гидразиновое связывание или гистидиновое мечение). Например, в некоторых вариантах осуществления вращающаяся метка может быть покрыта, по меньшей мере частично, стрептавидином, тогда как биотинилированный связывающий участок нуклеиновой кислоты может быть лигирован с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления меченая биотином нуклеиновая кислота (например, приблизительно 500 пар оснований (п.о.)) может быть лигирована с одним концом представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты. Представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты, несущие меченый биотином связывающий участок, затем могут быть соединены с покрытыми стрептавидином вращающимися метками. Существует ряд коммерчески доступных меток, включая магнитные метки, которые покрыты или частично покрыты различными химическими составами, которые можно использовать для связывания представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты и/или связывания второй метки (например, Dynal, Invitrogen, Spherotech, Kisker Inc., Bangs Laboratories Inc.).
Напряжение молекул нуклеиновой кислоты
В некоторых вариантах осуществления способы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанные в настоящем документе, включают прикладывание направленной силы к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты, которая приводит к тому, что представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты оказываются под некоторым напряжением. Напряжение представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты становится важным для более длинных представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты, поскольку более длинные молекулы нуклеиновой кислоты могут складываться или сворачиваться вокруг себя. Аномальная спиральная структура представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты любого типа может гасить или скрывать крутящий момент, передаваемый от РНК-полимеразы на вращающуюся метку.
Направленная сила, прикладываемая к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты, должна быть достаточной для поддержания двухцепочечной спиральной природы представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, особенно в направлении по ходу транскрипции от транскрипционного комплекса, и особенно, когда вращающаяся метка находится на расстоянии тысяч или сотен тысяч нуклеотидов от РНК-полимеразы. Тем не менее, направленная сила, прикладываемая к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты, не должна быть настолько сильной (т.е. прикладывать настолько большое напряжение), что затруднится каким-либо образом вращение вращающейся метки или разрушится остов представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Такое напряжение представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты также может уменьшать броуновское движение вращающейся метки или другие шумовые влияния (например, термофлюидные шумовые влияния), тем самым, повышая точность детектирования характера вращения вращающейся метки.
Предполагается, что напряжение поднимает связанную с нуклеиновой кислотой вращающуюся метку вверх и в сторону от поверхности с предписанными величиной силы и расположением в трехмерном пространстве. Направление напряжения может растягивать представляющую интерес нуклеиновую кислоту на угол, по существу равный 90º, (т.е. по оси z) относительно плоскости твердой поверхности (т.е. оси x), но направленная сила также может растягивать представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты в направлении, которое составляет большее или меньше, чем 90º, от плоскости твердой поверхности. Следует понимать, однако, что вращающаяся метка не может быть настолько близка к твердой поверхности, что поверхность (например, вследствие химии поверхности или поверхностных жидкостных явлений) влияет (например, изменяет, искажает, ослабляет, снижает, устраняет) на профиль крутящего момента и/или характер движения вращающиеся метки, как сигнал активности РНК-полимеразы.
В некоторых вариантах осуществления источник напряжения (или источник направленной силы) может представлять собой магнит. В таких случаях вращающаяся метка или часть вращающейся метки может быть магнитной. Как указано в настоящем описании, магнитные метки (например, гранулы, стержни и т.д.) хорошо известны в данной области техники. Например, может быть приложена магнитная сила, которая обеспечивает однородную пространственную силу в направлении оси z с величиной, равной, например, приблизительно 1 пН, для того, чтобы достаточно вытягивать представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты и не допускать какого-либо петлеобразования. В то же время, такие магниты создают только очень малую силу в направлении оси x. Данные особенности позволяют вращающимся меткам свободно вращаться, при этом стабилизируя все броуновское движение вращающихся меток. В некоторых вариантах осуществления источник напряжения может возникать, как результат направленного потока, например, жидкости (например, воды или буфера) или воздуха.
Величину напряжения, прикладываемого к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты, можно калибровать с применением стандартной флюидной методики и включать в процесс сбора данных и анализа или основные вызывающие алгоритмы. Например, такая калибровка может включать наблюдение за броуновским движением вращающейся метки, прикрепленной к транскрибируемой РНК-полимеразой молекуле нуклеиновой кислоты, которая иммобилизована на поверхности, в различных местоположениях выше поверхности, при различных углах относительно плоскости поверхности и/или в различных потоках или магнитных полях.
Просто для того, чтобы предложить пространственное представление и без ограничения каким-либо конкретным размером или расстоянием, в варианте осуществления на чипе вращающаяся метка может быть расположена на порядка 1 микрона выше поверхности, когда прикладывается напряжение. Например, поскольку каждое основание отстоит на 0,3 нм от следующего основания, у молекулы нуклеиновой кислоты размером одна т.п.о., которая прикреплена у поверхности к РНК-полимеразе, вращающаяся метка на другом конце будет на расстоянии от поверхности, равном приблизительно 300 нм. Данное расстояние можно изменять с применением, без ограничения, различных способов иммобилизации РНК-полимеразы на твердой поверхности и нуклеиновых кислот (например, последовательностей промотора, последовательностей связывающего участка) различной длины. Зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, может подходить для ситуаций, в которых вращающаяся метка отстоит от 10 нм до нескольких микрон от поверхности.
Фигура 2 демонстрирует магнитные гранулы в 2,7 микрона до (фигура 2A) и после (фигура 2B) приложения магнитного поля.
Способы детектирования
Детектирование характера вращения вращающейся метки в различных условиях секвенирования в способах зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанных в настоящем документе, требует источника света для испускания света на вращающуюся метку и оптики для визуализации вращающейся метки и наблюдения изменения в характере вращения. При том, что любое количество подходящих способов освещения и оптики можно использовать в способах зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанных в настоящем документе, следующие варианты осуществления предлагаются в качестве примеров простоты настоящих систем и способов, и отсутствия каких-либо требований для сложных и дорогостоящих технологий детектирующего компонента.
Источник света может представлять собой LED, или источник света может представлять собой белый свет или одно- или многожильный оптический кабель. Источник света может представлять собой постоянное освещение или может предоставляться в виде импульсного освещения, если требуется. Свет может испускаться из одного направления или из множества направлений. Например, источник света может представлять собой полимерные волокна или жгуты, которые могут быть настраиваемыми (например, по интенсивности и/или спектру). Для идентификации вращающейся метки (например, формы вращающейся метки) и идентификации ее вращения можно использовать дифракцию Френеля и/или Фраунгофера, исходя из размера вращающейся метки и расстояния от нее до детектора.
Оптика может представлять собой простые линзы и объективы (например, линзу микроскопа с 50x объективом, например Mitutoyo 50x с числовой апертурой, равной 0,75) и трубчатую линзу с 1x увеличением. Оптика также может включать съемочную камеру (например, видеокамеру, например, научный КМОП), работающую с соответствующим числом кадров в секунду. Альтернативно, оптика может использовать современную технологию комплементарных металлооксидных полупроводников (КМОП) или прибора с зарядовой связью (ПЗС), при условии, что они обладают подходящим числом пикселов (и при условии, что источник света обеспечивает достаточно фотонов для изображения вращения вращающейся метки). Используемые в настоящее время КМОП-детекторы очень быстры (например, 1000 или более кадров в секунду, что соответствует экспозициям, равным 1 мс или менее). Такой уровень скорости детектора устраняет любую неоднозначность, вызываемую стохастической природой быстрого включения нуклеотидов, доставляющей проблемы используемым в настоящее время подходам. Например, многие используемые в настоящее время подходы (например, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Inc.) обычно ограничены экспозициями, равными 10 мс или больше, вследствие необходимости сбора достаточного количества флуоресцентных фотонов в окне экспозиции съемочной камеры, что приводит к ошибкам в получаемых данных о последовательности.
Возможность использования малого размера пиксела для детектора визуализации является другим преимуществом настоящих способов по сравнению с другими технологиями секвенирования (например, Pacific Biosciences, Complete Genomics Inc. и другими, которые основаны на одномолекулярной флуоресценции или общей флуоресценции при высокопроизводительном захвате изображений). Зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, может использовать малый размер пиксела (например, 1,4 микрона, что представляет собой существующий в настоящее время уровень техники для съемочных камер сотовых телефонов) по сравнению с 6,5 микрона, что представляет собой существующий уровень для КМОП-датчиков, применяемых в других применениях секвенирования в реальном времени. Это в первую очередь обусловлено тем, что современные способы секвенирования могут работать при большем шуме, чем другие системы. Следует заметить, что при зависящем от вращения транскрипционном секвенировании, описанном в настоящем документе, производительность визуализации может быть гораздо выше из-за возможности использования датчиков большего размера, имеющих малые пикселы (например, 8-10 мегапикселов, что обычно для сотовых телефонов следующего поколения), и посредством визуализации больших участков поверхности. Способы детектирования для способов зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанных в настоящем документе, делают возможным применение аппаратного обеспечения коммерческой съемочной камеры с КМОП с помощью модификаций только программного обеспечения, в противоположность другим системам секвенирования в промышленности, которые основаны на специализированных оптических платформах (например, ChemFet, Ion Torrent).
Способ получения данных в режиме видео от таких датчиков, как правило, использует значение интенсивности каждого пиксела (например, с применением данных в формате RAW). Когда источник света представляет собой белый LED или RGB-осветитель с соответствующим балансом цветов, в соседних пикселах регистрируют дифракционные и теневые картины вращающейся метки, и изображение может быть создано, как если бы датчик представлял собой черно-белый датчик. Например, отчетливая тень или дифракция, например, несферической вращающейся метки, может быть зарегистрирована на пикселах детектора, и вращение можно детектировать, благодаря влиянию изменения на дифракцию.
Просто в качестве примера, детектирование вращения (например, детектирование характера вращения вращающейся метки) может происходить следующим образом. Вращающиеся метки могут быть освещены сверху с применением, например, связанных LED или волокон - LED или матрицы LED. Ниже проточной ячейки твердой поверхности можно использовать объектив Mitutoyo 50x, имеющий числовую апертуру, равную 0,75, скорректированный на бесконечность, в сочетании с трубчатой линзой, которая отображает поле обзора на научный КМОП-чип (например, имеющий 5,5 MP с расстоянием 6,5 микрон между центрами пикселов, каждый из которых имеет размер приблизительно 6,5 микрон). Если отвести 10×10 пикселов на каждую вращающуюся метку, то такой размер пиксела достаточен для детектирования вращения гранул в 1 микрон, что на всей поверхности КМОП может давать больше, чем 55000 вращающихся меток. Если каждая вращающаяся метка прикреплена к представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты размером 5 т.п.о., с помощью зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанного в настоящем документе, можно секвенировать более чем 275 м.п.о. за один проход на одном чипе. Для сравнения, геном E. coli составляет 4,5 м.п.о. Если скорость транскрипции составляет 10 нуклеотидов в секунду, что является приемлемой величиной для иммобилизованной РНК-полимеразы, весь геном E. coli можно секвенировать, как описано в настоящем документе, за 500 секунд, т.е. менее чем за 10 минут. Детектор, обладающий возможностью регистрировать вплоть до 100 кадров в секунду (т.е. 10 кадров на каждый транскрибируемый нуклеотид) является достаточным для систем и способов секвенирования, описанных в настоящем документе. Приведенные выше вычисления никак не включают эффективность прикрепления. Вместе с тем, в асинхронном режиме секвенирования в предположении, что остановка РНК-полимеразы составляет менее чем 10 кадров, это не добавит дополнительное время реакции к приведенным выше вычислениям, однако, асинхронный режим секвенирования может добавлять время к реакции, если скорость-лимитирующий нуклеозидтрифосфат доведен до слишком низкого уровня (например, для увеличения точности и минимизации ошибок делеции).
Далее следует другой пример детектирования характера вращения вращающейся метки. Вращающиеся метки могут быть освещены с применением связанных LED или волокон - LED или матрицы LED, где комплексы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования помещают поверх суживающегося волновода, имеющего размер сердцевины 350 нм с одой стороны и размер сердцевины 6,5 микрон с другой (сужение приблизительно 1:19), который может быть связан с поверхностью научного КМОП-чипа (например, Fairchild Imaging). Такой чип имеет 5,5 мегапикселов с расстоянием 6,5 микрон между центрами пикселов, каждый из которых имеет размер приблизительно 6,5 микрон. В этом случае, если отвести 3×3 пиксела на каждую вращающуюся метку, что достаточно для детектирования вращения гранулы в 1 микрон на сердцевине в 350 нм, то это дает возможность расположить более чем 610000 вращающихся меток на таком чипе. Если каждая вращающаяся метка прикреплена к представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты размером 5 т.п.о., то всего более чем 3 миллиарда п.о. может быть секвенировано за один проход на одном чипе. Это один раз по существу охватывает весь человеческий геном. Приведенные выше вычисления не принимают во внимание эффективности прикрепления, влияние округления сигнала от округлых сердцевин сужения на квадратных пикселах или потерю пикселов, вследствие несоответствия в процессе связывания сердцевины с пикселом.
Далее следует пример детектирования характера вращения в высокопроизводительной системе секвенирования. Например, вместо применения суживающегося волновода и научного КМОП-датчика, описанных в примере выше, можно использовать чип OmniVision Inc., например, с 14,5 MP и 1,2 микрона на пиксел, после удаления окна детектора и прикрепления одного или нескольких компонентов комплексов зависящего от вращения транскрипционного секвенирования непосредственно на массив микролинз чипа. Характер вращения вращающихся меток размером 2,8 микрона можно детектировать на 2×2 пикселах с применением обработки сигнала видео. При учете 2 дополнительных пикселов в каждом направлении для множества вращающихся меток поблизости друг от друга на вращающуюся метку можно отвести всего 8 пикселов. В этом случае отдельный чип может нести более чем 1,8 миллиона вращающихся меток, прикрепленных к секвенируемым представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты. Следовательно, трех таких чипов будет достаточно, для того чтобы секвенировать полный человеческий геном, тогда как четыре чипа могут значительно повысить точность. Можно использовать электронные устройства для обеспечения считывания таких датчиков с достаточными скоростями (например, для соответствия скорости включения нуклеотидов для конкретного чипа), основанные на ППВМ или других конструкциях ЦСП, и непосредственное сохранение на массивы твердотельных накопителей, их компоненты известны в данной области техники.
Просто в качестве примера, детектирование вращения может происходить следующим образом. Структурированное освещение с помощью LED (например, модуль Lightspeed genomics, приспособленный для возбуждения без спекл-структуры с помощью линзы 4x) можно использовать для создания дифракционной тени вращающейся метки на поверхности съемочной камеры SciCMOS (например, 5,5 MP при 100 кадрах в секунду). В интерференционной картине можно использовать 5 кадров на изображение, для того чтобы повысить разрешение в 9 раз, в результате создавая датчик с 49 MP при 20 кадрах в секунду. Каждой отдельной молекуле может быть отведено, например, 5×5 пикселов, что обеспечивает приблизительно 2 миллиона вращающихся меток на чип. В предположении, что эффективность связывания меток друг с другом пуассоновская, 660000 доступных отдельных молекул РНК-полимеразы, причем каждая транскрибирует молекулы нуклеиновой кислоты размером 5 т.п.о., дают 3,3 миллиарда п.о., которые могут быть секвенированы за один проход. В способе асинхронного секвенирования могут осуществляться четыре реакции (хотя в некоторых вариантах осуществления осуществляют три реакции, и четвертый нуклеотид выводят из информации секвенирования, полученной с другими тремя нуклеозидтрифосфатами). При учете 5 кадров на остановку фермента с общей продолжительностью каждой остановки 250 мс при том, что иначе полимераза включает 15 нуклеотидов в секунду, наивысшая производительность составляет 18 миллиардов п.о. в час. Такая скорость секвенирования значительно выше, чем в любой современной технологии, даже для малых длин считывания. Как указано в настоящем описании, современная технология съемочных камер мобильных телефонов (10 MP, размер пиксела 1,2 мкм) удовлетворяет требованиям данной системы.
Аналогично, цветные (например, с покрытием с RGB-фильтром на датчике) или монохромные датчики съемочных камер сотовых телефонов или цифровых съемочных камер удовлетворяют требованиям для применения в способах и системах секвенирования, описанных в настоящем документе (например, датчик с 14,5 MP и пикселом 1,25 микрона). Даже при том, что каждый пиксел RGB-датчика покрыт красным, или зеленым, или синим фильтром по схеме, такие датчики можно использовать в системах и способах секвенирования, описанных в настоящем документе, поскольку источник света, применяемый в системах и способах секвенирования, описанных в настоящем документе, может иметь широкий спектр (например, белые(ые) LED) и передавать на детекторную часть чипа (например, кремниевого) съемочной камеры рассеянный, отраженный, дифрагированный или проходящий оптический сигнал.
В данном примере количество пикселов, используемых для детектирования каждой вращающейся метки, может быть определено по тени или дифракции вращающейся метки. При применении прямого освещения светом вместо возбуждения флуоресценции толстые оптические фильтры, которые блокируют возбуждающий свет и/или обладают полосой пропускания флуоресценции, не являются необходимыми. Такие фильтры могут иметь толщину сотен микрон, что может усложнять оптические конструкции, необходимые для приема флуоресценции на небольшом количестве пикселов на детекторе на чипе. Прием света на небольшом количестве пикселов является важным, поскольку один аспект производительности систем секвенирования определяют по общему количеству пикселов на детекторе, деленному на количество пикселов, отведенное на каждый участок или событие. Например, с КМОП-датчиком 8 MP типа используемого в iPhone, отведение 10 пикселов на участок делает возможным общее количество участков, равное 800000. Если за один проход на одном участке секвенируется нуклеиновая кислота со средним размером 1 т.п.о., то максимальная производительность составляет 800 м.п.о. на проход. При применении дифракции Фраунгоффера и гранул по 3 микрометра на расстоянии, равном 1 микрометр, можно использовать менее чем 10 пикселов на участок без необходимости в линзах, имеющих сложные оптические конструкции.
В одном варианте осуществления может предлагаться источник напряжения, который позволяет поднимать множество вращающихся меток над поверхностью на площади, например, большей чем 4×4 мм2. Настоящие способы и системы не ограничены полем обзора (FOV), особенно когда секвенирование осуществляют на чипе, где эффективным FOV является вся площадь чипа. Например, площадь поверхности датчика Omnivision 14 MP составляет приблизительно 6×4 мм.
Как указано в настоящем описании, одним из многих преимуществ, обеспечиваемых способами зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанными в настоящем документе, является чрезвычайно быстрое включение нуклеотидов РНК-полимеразами, благодаря их стохастической природе. Высокая скорость включения и получаемая в результате скорость вращения, однако, могут делать получение данных требующих усилий. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в описываемых в данный момент асинхронных способах секвенирования, например, необходимо регистрировать только информацию "конечной точки", например, только общее количество оборотов до того, как произойдет остановка. То есть, нет необходимости фиксировать отдельные стадии включения, которые могут быть очень быстрыми и сложными для эффективного отображения с помощью простого детектора. Следовательно, при условии, что реакцию секвенирования регистрируют при достаточно высокой частоте кадров для детектирования общего количества оборотов между остановками РНК-полимеразы (вследствие присутствия нуклеозидтрифосфата в скорость-лимитирующем количестве), точная последовательность нуклеиновых кислот может быть определена.
В некоторых вариантах осуществления характер вращения магнитной вращающейся метки может быть зафиксирован с применением матрицы ГМС (гигантское магнитосопротивление) в качестве датчика. В некоторых вариантах осуществления для детектирования характера вращения магнитной вращающейся метки можно использовать массив спиновых клапанов или MRAM. Например, компьютерный массив памяти (например, RAM, например, DRAM) может быть модифицирован (например, отшлифован для удаления с поверхности слоев, которые могут экранировать влияние магнитного поля) так, чтобы допускать модификацию поверхности вблизи от емкостных элементов ячеек памяти. Индуцируемое электрическое поле магнитной вращающейся метки может быть воспринято двухмерным массивом ячеек/конденсаторов RAM. Затем ячейки массива RAM могут быть считаны непосредственно с применением программного обеспечения для чтения из памяти после инсталляции памяти в компьютер. В случае если в качестве датчика используется MRAM, можно использовать поток для получения источника напряжения представляющей интерес нуклеиновой кислоты без применения магнитного поля. Альтернативно, в качестве источника напряжения можно использовать магнитное поле в поле, где воспринимаемый сигнал ячеек MRAM модифицирован.
Условия секвенирования
Если вернуться к фигуре 1A, комплекс 100 зависящей от вращения транскрипции может быть создан несколькими различными способами. Например, связанные с промотором представляющие интерес молекулы 10 нуклеиновой кислоты могут доставляться к твердой поверхности 30, несущей иммобилизованную на ней РНК-полимеразу 20. В данном варианте осуществления вращающаяся метка 40 может быть связана с представляющими интерес молекулами 10 нуклеиновой кислоты до или после образования комплекса представляющих интерес молекул 10 нуклеиновой кислоты с иммобилизованной РНК-полимеразой 20. В другом примере РНК-полимераза 20 и связанные с промотором представляющие интерес молекулы 10 нуклеиновой кислоты могут быть объединены и затем помещены на твердую поверхность 30. Как указано, вращающаяся метка 40 может быть связана со связанными с промотором представляющими интерес молекулами 10 нуклеиновой кислоты до или после того, как комплекс помещают на твердую поверхность 30. В другом примере вращающиеся метки 40 могут быть прикреплены к связанным с промотором представляющим интерес молекулам 10 нуклеиновой кислоты и приведены в контакт с РНК-полимеразой 20. РНК-полимераза 20 может быть иммобилизована на твердом субстрате 30 до введения меченых вращающейся меткой представляющих интерес молекул 10 нуклеиновой кислоты, или весь комплекс может быть помещен и иммобилизован на твердом субстрате 30.
Зависящее от вращения транскрипционное секвенирование, описанное в настоящем документе, может осуществляться в асинхронном (т.е. скорость-лимитирующем) режиме (фигура 3A), или в синхронном (т.е. по одному основанию) режиме, или в любой их комбинации для определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты (фигура 3B). По меньшей мере, "условия секвенирования", как используется в настоящем описании, обозначает присутствие по меньшей мере одного нуклеозидтрифосфата, который можно использовать, как описано ниже, для определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.
В дополнение к присутствию по меньшей мере одного нуклеозидтрифосфата, как рассмотрено подробнее в настоящем описании, условия, в которых осуществляют реакции секвенирования, хорошо известны в данной области техники. Например, можно использовать соответствующие буферные компоненты (например, KCl, Tris-HCl, MgCl2, ДТТ, Tween-20, БСА) для получения подходящей окружающей среды для фермента.
a) Асинхронное секвенирование
Способ зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанный в настоящем документе, можно использовать для секвенирования нуклеиновых кислот на основании асинхронного включения нуклеотидов. Для асинхронных вариантов осуществления условия секвенирования, в которых проходит начальная реакция (т.е. первые условия секвенирования), включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где нуклеозидтрифосфаты присутствуют в различных количествах, по меньшей мере одно из которых является скорость-лимитирующим, и по меньшей мере одно из которых не является скорость-лимитирующим. Например, один из четырех нуклеозидтрифосфатов предлагается в скорость-лимитирующем количестве (например, в количестве, которое меньше, чем количество других трех нуклеозидтрифосфатов). В такой реакции РНК-полимераза будет эффективно останавливаться каждый раз, когда она пытается включить нуклеозидтрифосфат, предлагаемый в скорость-лимитирующем количестве, в транскрипт, и такую остановку можно наблюдать по характеру вращения вращающейся метки, как описано в настоящем документе.
Следует заметить, что количество оснований между каждой остановкой может быть точно определено посредством детектирования кумулятивного вращения между остановками. Таким образом, точное положение, например, каждого нуклеотида гуанина (G) вдоль последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты может быть быстро определено по изменениям в характере вращения, когда нуклеозидтрифосфат G предлагается в скорость-лимитирующих количествах. Аналогичные реакции могут быть проведены во вторых, третьих и, если требуется, четвертых условиях секвенирования, в которых, соответственно, второй, третий и четвертый нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве. Как показано на фигуре 4, совокупная информация от четырех реакций, осуществляются ли они одновременно одна с другой или следуют последовательно одна за другой, предоставляет полную последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.
Даже картину от одной реакции, дающей последовательность позиций одного из четырех нуклеотидов, можно сравнивать с базами данных нуклеиновых кислот, и использовать для идентификации молекулы нуклеиновой кислоты с высоким уровнем достоверности. Кроме того, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты можно составлять с использованием информации о местоположении, получаемой от трех из четырех нуклеозидтрифосфатов, поскольку информация о местоположении четвертого нуклеотида в последовательности может быть логически выведена, если другие три нуклеотида известны.
b) Синхронное секвенирование или секвенирование по одному основанию
Способ зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанный в настоящем документе, можно использовать для секвенирования нуклеиновых кислот в синхронном режиме, который иначе известен как секвенирование по одному основанию. Для синхронного или по одному основанию вариантов осуществления условия секвенирования, в которых проходит начальная реакция (т.е. первые условия секвенирования), включают присутствие единственного нуклеозидтрифосфата. В такой реакции транскрипция посредством РНК-полимеразы будет происходить, только если представляющая интерес нуклеиновая кислота содержит комплементарное основание в этом положении, что можно наблюдать как изменение в характере вращения вращающиеся метки, как описано в настоящем документе. Исходя из структурных характеристик двойной спирали, включение одного нуклеотида РНК-полимеразой приводит к вращению приблизительно на 36. Такие условия реакции продолжаются до тех пор, пока характер вращения вращающиеся метки не изменяется. Следует понимать, что кумулятивное изменение в характере вращения можно использовать для точного определения количества раз, когда первый нуклеозидтрифосфат был последовательно включен в транскрипт (например, в гомополимерный участок представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты).
Когда изменения в характере вращения вращающейся метки в первых условиях секвенирования (т.е. в присутствии первого нуклеозидтрифосфата из четырех нуклеозидтрифосфатов) перестают наблюдаться, или если изменения в характере вращения не наблюдаются в первых условиях секвенирования, реакцию проводят во вторых условиях секвенирования. Вторые условия секвенирования включают присутствие второго нуклеозидтрифосфата из четырех нуклеозидтрифосфатов. Изменения в характере вращения вращающиеся метки указывают на транскрипцию (т.е., включение одного или нескольких конкретных присутствующих нуклеозидтрифосфатов в транскрипт посредством РНК-полимеразы), тогда как отсутствие изменения в характере вращения вращающейся метки указывает на то, что транскрипция не происходила.
Такие реакции в первых условиях секвенирования, вторых условиях секвенирования, третьих условиях секвенирования (т.е. в присутствии третьего нуклеозидтрифосфата из четырех нуклеозидтрифосфатов) или четвертых условиях секвенирования (т.е. в присутствии четвертого нуклеозидтрифосфата из четырех нуклеозидтрифосфатов) могут проводиться таким образом, что последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты последовательно определяют на основании изменений в характере вращения и/или кумулятивного угла вращения вращающейся метки в каждом из соответствующих условий секвенирования. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть осуществлены стадии удаления оставшихся нуклеозидтрифосфатов в одних условиях секвенирования до введения других условий секвенирования. Например, поверхность, на которой иммобилизована РНК-полимераза, может быть отмыта или промыта до внесения другого нуклеозидтрифосфата. Хотя такие стадии отмывания не являются необходимыми, следует понимать, что такие стадии повысят точность получаемой информации о последовательности.
c) Дополнительные методики секвенирования
Способы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанные в настоящем документе, пригодны для ряда различных изменений и обычных модификаций, которые могут быть использованы, например, без ограничения, для повышения точности информации секвенирования и увеличения количества информации, полученной в реакции секвенирования.
Например, многие РНК-полимеразы обладают способностью к "смене цепочек" или "циклической транскрипции". Эту особенность можно выгодно использовать в способах, описанных в настоящем документе, для повышения точности получаемой информации о последовательности. Например, когда РНК-полимераза достигает конца представляющей интерес нуклеиновой кислоты, РНК-полимераза может "перепрыгнуть" на противоположную цепочку и продолжить транскрипцию. Смотри, например, McAllister at al. (US 2007/0077575) и Rong et al. (1998, "Template Strand Switching by T7 RNA Polymerase", J. BioL. Chem., 273(17):10253-60). Кроме того, некоторые РНК-полимеразы могут "перепрыгнуть" из двухцепочечной матрицы ДНК на гибридный транскрипт ДНК-РНК и возобновить транскрипцию цепочки ДНК. Кроме того, рекурсивное секвенирование представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты такого типа может подвергаться генетическому конструированию посредством введения (например, лигирования) промотора РНК-полимеразы на каждый конец представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, так что РНК-полимераза связывает и транскрибирует противоположную цепочку.
Кроме того, одна или несколько различных РНК-полимераз (например, РНК-полимераз из различных организмов или различные РНК-полимеразы из одного организма) могут быть иммобилизованы на твердой поверхности. Как известно в данной области техники, различные РНК-полимеразы распознают и связывают различные последовательности промотора. Следовательно, один или несколько различных промоторов РНК-полимераз могут быть лигированы с различными популяциями представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты, и объединенную популяцию представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты можно секвенировать на основании характера вращения вращающейся метки с применением одной или нескольких различных РНК-полимераз, иммобилизованных на твердой поверхности. Посредством дифференциального мечения, например различных РНК-полимераз или различных популяций представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты (с применением, например, гранул, испускающих на различных длинах волн, флуоресцентных меток или флуоресцентно-меченых антител), последовательность одной популяции представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты можно отличить от последовательности другой популяции представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты. С применением таких способов реакции секвенирования на различных популяциях представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты можно осуществлять одновременно.
В некоторых вариантах осуществления как РНК-полимеразы, так и популяции представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты могут быть дифференциально мечеными. Следует понимать, что мечение представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты может осуществляться непосредственно через нуклеиновую кислоту или, например, через вращающуюся метку. Способность к дифференциальному мечению на разных уровнях реакции секвенирования можно использовать, например, для сравнения процессивности различных РНК-полимераз на представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей ту же последовательность, что может идентифицировать, например, гомополимерные участки или участки метилирования, или для сравнения транскрипции представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты, имеющих различные последовательности, посредством более чем одной РНК-полимеразы.
Просто в качестве примера, любую комбинацию ферментов РНК-полимераз (например, из одного или нескольких бактериофагов из T7, T3, SP6 или K11) в сочетании с соответствующими последовательностями нуклеиновой кислоты промотора можно использовать в способах зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанных в настоящем документе. Как рассмотрено в настоящем описании, данная особенность позволяет мультиплексирование реакций секвенирования. Другие варианты, в которых используются различные РНК-полимеразы в сочетании со своими специфичными последовательностями промотора, а также методы дифференциального мечения, предполагаются настоящим описанием.
В некоторых вариантах осуществления две асинхронных реакции зависящего от вращения транскрипционного секвенирования могут осуществляться в одинаковых условиях секвенирования (например, первых условиях секвенирования). Когда секвенирование продвигается на достаточное количество нуклеотидов (например, по меньшей мере 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов или 10000 нуклеотидов), условия секвенирования одной из реакций могут быть изменены (например, на вторые условия секвенирования), и зависящее от вращения транскрипционное секвенирование продолжают. Итоговую информацию о последовательности, полученную в первых условиях секвенирования, можно использовать для выравнивания конкретной представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты в первой реакции с той же самой конкретной представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты во второй реакции, что, когда условия секвенирования изменены, позволяет получать информацию о положении в последовательности для двух нуклеотидов в конкретной представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что вследствие скручивания молекул нуклеиновой кислоты РНК-полимеразой вращающаяся метка может производить "нагрузку", возможно замедляющую РНК-полимеразу. Это можно предупредить или ослабить, например, посредством применения вращающейся метки, имеющей другую форму (например, две продолговатые гранулы или комбинация гранула-стержень), что может приводить к большему трению в жидкостной среде, чем для простой сферической гранулы. С другой стороны, могут иметь место РНК-полимеразы и/или условия секвенирования, в которых механическую нагрузку на РНК-полимеразу можно использовать для благоприятного воздействия на скорость секвенирования.
Промышленные изделия/наборы
В настоящем описании предлагаются промышленные изделия (например, наборы). Промышленное изделие может включать твердый субстрат, как рассмотрено в настоящем описании, на котором иммобилизовано множество ферментов РНК-полимераз. Множество ферментов РНК-полимераз относится к по меньшей мере 10 РНК-полимеразам (например, к по меньшей мере 20, 50, 75 или 100 ферментам), к по меньшей мере 100 РНК-полимеразам (например, к по меньшей мере 200, 500 или 1000 ферментов) или к по меньшей мере 1000 РНК-полимераз (например, к по меньшей мере приблизительно 2500, 5000, 10000 или 50000 ферментов).
Промышленные изделия хорошо известны в данной области техники и могут включать упаковочный материал (например, блистерные упаковки, бутыли, тубы, сосуды или контейнеры) и, в дополнение к твердой поверхности, несущей иммобилизованные на ней РНК-полимеразы, могут включать один или несколько дополнительных компонентов.
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие может включать вращающуюся метку. Как описано в настоящем документе, вращающаяся метка может представлять собой несферическую метку или сферическую метку, несущую элемент неоднородности, который можно использовать для детектирования вращения.
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие может включать последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие промотору РНК-полимеразы. Как рассмотрено в настоящем описании, промоторы, которые направляют транскрипцию, осуществляемую РНК-полимеразами, хорошо известны и обычно применяются в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие может включать связывающий участок. Как рассмотрено в настоящем описании, связывающий участок можно использовать для прикрепления представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты к вращающимся меткам. В некоторых вариантах осуществления связывающий участок включает последовательности нуклеиновой кислоты, которые, например, могут быть биотинилированными, так что они связываются с гранулами, мечеными стрептавидином.
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие может включать один или несколько нуклеозидтрифосфатов. Когда предлагается более чем один нуклеозидтрифосфат, они могут предлагаться в комбинации (например, в одном контейнере) или отдельно (например, в отдельных контейнерах).
В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие дополнительно включает инструкции. Инструкции могут предлагаться в бумажной форме или в любом количестве электронных форм (например, электронного файла на, например, CD или флэш-диске, или указания на сайт в интернете (например, ссылки)). Такие инструкции можно использовать для того, чтобы идентифицировать вращение вращающейся метки относительно оси через магнитную реперную метку, чтобы составлять последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании характера вращения и присутствия нуклеозидтрифосфата; и/или чтобы прикладывать соответствующее напряжение к нуклеиновой кислоте.
Системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования
Система зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанная в настоящем документе, включает по меньшей мере модуль секвенирования. Модуль секвенирования для секвенирования представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты, как правило, включает резервуар для помещения твердого субстрата, источник напряжения для обеспечения направленной силы, источник света для испускания света на вращающуюся метку и оптику для детектирования характера вращения вращающейся метки. Источник напряжения, источник света и оптика рассмотрены в настоящем описании. Резервуар для помещения твердого субстрата может быть сконфигурирован, например, в виде встроенной камеры. Обычно твердый субстрат для использования в системе зависящего от вращения транскрипционного секвенирования несет несколько РНК-полимераз, иммобилизованных на нем, и, для высокопроизводительной системы секвенирования, твердая поверхность может представлять собой вариант осуществления на чипе, как описано в настоящем документе. Модуль секвенирования также может включать компьютерный процессор или средство для связи с компьютерным процессором. Кроме того, как часть модуля секвенирования может предлагаться программное обеспечение для первичного анализа.
Кроме того, модуль секвенирования дополнительно может включать нагревающий и охлаждающий элемент, и систему контроля температуры для изменения и регулирования температуры реакций секвенирования. Кроме того, модуль секвенирования дополнительно может включать флюидику (например, один или несколько резервуаров для реагентов или буферов и трубопровод для доставки одного или нескольких реагентов или буферов в реакционную камеру (например, чип)). Флюидика для доставки одного или нескольких реагентов или буферов также может включать, без ограничения, по меньшей мере один насос. Без ограничения, типичные реагенты, которые можно использовать в реакции секвенирования могут включать, например, нуклеозидтрифосфаты, ферменты (РНК-полимеразу) и вращающиеся метки. Также без ограничения, типичные буферы, которые можно использовать в реакции секвенирования, могут включать, например, промывочный буфер, связывающий фермент буфер и буфер для секвенирования.
Фигура 5 представляет собой схему, демонстрирующую типичную проточную ячейку 70. В показанной проточной ячейке 70 вырезанная лазером приклеивающаяся под давлением (PSA) пленка толщиной приблизительно 50 микрон лежит поверх датчика OmniVision (OV 14810; после удаления и покрытия окна SiN). Данная конфигурация приводит к расположению проточной ячейки поверх КМОП-чипа 80. Затем накладывают стеклянную или полимерную пластину, имеющую отверстия для микрофлюидных трубок 90 сквозной подачи. В поле показано множество зависящих от вращения транскрипционных комплексов 100. Фигура 6 демонстрирует фотографию (панель A) и схематический рисунок (панель B) типичной проточной ячейки 70, в которой волокна 60 используют для передачи света, и микрообъектив 200 используют для визуализации. Также показана твердая поверхность 30.
Фигура 7 представляет собой схему, демонстрирующую систему 300 зависящего от вращения транскрипционного секвенирования. Схема демонстрирует источник 50 напряжения, источники 60 света и проточные ячейки 70 с подводящей и отводящей флюидикой 90. Проточные ячейки 70 на фигуре 7 показаны на чипе 80 (например, КМОП, ПЗС или их модифицированных версиях).
Фигуры 8A и 9A демонстрируют фотографии различных вариантов осуществления системы 300 зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанной в настоящем документе, а фигуры 8B и 9B представляют собой соответствующие схематические рисунки вариантов осуществления, показанных на каждой фотографии. Что касается фигур 8B и 9B, обе системы 300 зависящего от вращения транскрипционного секвенирования демонстрируют твердую поверхность 30, источник 60 света и флюидику 90 для доставки и удаления различных реагентов и/или буферов. На каждой из фигур 8 и 9 показан источник 50 напряжения; на фигуре 9 источник 50 напряжения сдвинут в сторону для более легкого доступа к проточной ячейке на твердой поверхности 30. Обе системы 300 зависящего от вращения транскрипционного секвенирования с фигур 8 и 9 используют аналогичную оптику 200. Система 300 на фигуре 8 использует 20x объектив 200 для воды (здесь "super-lens" от Olympus, который обеспечивает FOV больше чем 1 мм с NA=0,9, т.е., высокое разрешение с большим полем обзора), а система 300 на фигуре 9 использует трубчатую линзу 200 20x объектива. Обе фигуры 8 и 9 также содержат съемочную камеру 200.
В одном варианте осуществления в системе зависящего от вращения транскрипционного секвенирования можно следующим образом использовать структурированное освещение и стробоскопию. Например, каждое из двух или нескольких волокон может быть связано с отдельным LED, а их освещение направлено под различными углами по отношению к плоскости твердой поверхности. Источники света можно независимо контролировать по интенсивности света (или "амплитуде"), по спектральному составу (например, различные цветные LED или белые LED с фильтром) и по времени (например, посредством включения электроники одним запускающим устройством, но после разных задержек, вводимых во временной режим запускающего устройства). То же запускающее устройство, но, например, с другой задержкой, или амплитудой, или формой может инициировать запуск съемки съемочной камеры. Поскольку длину выдержки съемочной камеры можно контролировать независимо, можно согласовать по времени первый источник света (например, отражение можно фиксировать на, например, четные кадры) и второй источник света (например, отражение можно фиксировать на, например, нечетные кадры) для освещения вращающейся метки и ее признаков. Поскольку освещение производится под различными углами (например, сверху и снизу, т.е. в эпиположении, или сверху и под углом, например, 45º к вертикали), вращающуюся метку можно детектировать на одном изображении и не детектировать на другом изображении. Поскольку фиксируют серию изображений, и поскольку можно использовать более чем один источник, можно фактически реконструировать трехмерную форму вращающейся метки на каждом кадре. Данный уровень детектирования приводит к более высокой точности и меньшему количеству ошибок делеции в окончательной последовательности.
Системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанные в настоящем документе, могут значительно ускорить диагностику по месту лечения и геномику, благодаря полностью параллельному одномолекулярному анализу с разрешением в один нуклеотид. Данная система хорошо подходит для высокомультиплексной идентификации мишени и обладает максимальной гибкостью, будучи пригодной для изменения конфигурации для исследования одновременно или последовательно различных нуклеиновых кислот-мишеней, например патогенов и человеческих биомаркеров. Кроме того, при этом современные основанные на ПЦР и применении микроматриц способы секвенирования нуклеиновых кислот ограничены способностью детектирования только известных последовательностей или возбудителя(ей) инфекции из-за специальных наборов реагентов (праймеров и зондов), требуемых для положительной идентификации.
Для системы, разработанной, например, для высокопроизводительной клинической диагностики или для диагностики по месту лечения, система зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанная в настоящем документе, может быть соединена с модулем подготовки образца и модулем финальной обработки матрицы.
Модуль подготовки образца может быть сконфигурирован для лизирования клеток, посредством чего высвобождаются нуклеиновые кислоты, и модуль подготовки образца также может обладать способностью к нарезке/фрагментации нуклеиновой кислоты. Модуль подготовки образца, как правило, включает резервуар для помещения биологического образца и флюидику для доставки одного или нескольких реагентов или буферов к биологическому образцу. Модуль подготовки образца может быть сконфигурирован для приема множества различных биологических образцов, или модуль подготовки образца может быть сконфигурирован для приема конкретного типа биологического образца (например, мазка, образца ткани, образца крови или плазмы, слюны или части культуры) или биологического образца, предоставленного в определенной форме (например, в сосуде или тубе или на фильтровальной бумаге). Модуль подготовки секвенирования также может быть сконфигурирован для захвата некоторых молекул из биологического образца (например, бактериальных клеток, вирусов и т.д.) с применением, например, фильтров, колонок, магнитов, иммунологических способов или их комбинаций (например, Pathogen Capture System, NanoMR Inc.).
Модуль подготовки образца может содержать реагенты или буферы, участвующие в получении нуклеиновых кислот из биологического образца и подготовке нуклеиновых кислот для секвенирования. Например, реагенты, участвующие в получении нуклеиновых кислот для секвенирования, включают реагенты для клеточного лизиса, расщепляющие нуклеиновую кислоту ферменты, ДНК-полимеразы, олигонуклеотиды и/или связывающие ДНК средства (например, гранулы или твердые матрицы для связывания и отмывания представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты), тогда как буферы, участвующие в получении нуклеиновых кислот для секвенирования, включают лизисный буфер, промывочный буфер, элюирующий буфер или связывающий буфер. Поскольку для зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанного в настоящем документе, требуются матрицы двухцепочечной нуклеиновой кислоты, модуль подготовки образца может содержать необходимые реагенты и буферы для превращения одноцепочечной ДНК или РНК в двухцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты (например, реагенты для ПЦР).
Многие из функциональных компонентов модуля подготовки образца коммерчески доступны (например, силикагелевая мембрана (наборы Qiagen или Ambion) или как составная часть Palladium System (Integrated Nano Technoliogies Inc.)). Кроме того, в качестве альтернативы ферментативному расщеплению матриц нуклеиновой кислоты коммерчески доступны приборы, которые фрагментируют нуклеиновые кислоты (например, Covaris).
Модуль финальной обработки матрицы может быть сконфигурирован для прикрепления последовательностей промотора РНК-полимеразы и вращающихся меток к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты. Модуль финальной обработки матрицы, как правило, включает флюидику для доставки одного или нескольких реагентов или буферов к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты. Например, модуль финальной обработки матрицы может содержать реагенты и буферы для цели лигирования последовательностей промотора РНК-полимеразы к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты, и модуль финальной обработки матрицы также может содержать реагенты и буферы для прикрепления вращающейся метки к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты. Например, реагенты, участвующие в лигировании последовательностей промотора или связывании вращающихся меток с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты, включают, очевидно, последовательности промотора и вращающиеся метки, но также могут включать, например, ферменты лигазы, связывающий участок или реагенты для ПЦР, тогда как буферы, участвующие в лигировании последовательностей промотора или связывании вращающихся меток с представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты, включают буфер для лигирования, связывающий вращающуюся метку буфер, связывающий фермент буфер, промывочный буфер и буфер для секвенирования.
В зависимости от конфигурации системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанной в настоящем документе, несколько РНК-полимераз могут быть иммобилизованы на твердой поверхности до внесения связанных с промоторами и вращающимися метками представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты. Альтернативно, несколько РНК-полимераз могут быть объединены со связанными с промоторами и вращающимися метками представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты, а весь комплекс помещен на твердую поверхность. Второй способ осуществим, поскольку кинетика связывания для РНК-полимераз и соответствующих последовательностей промотора очень быстра, эффективна и специфична.
Определение последовательности после зависящего от вращения транскрипционного секвенирования
Фигура 10 демонстрирует снимок с видео и соответствующую оцифровку характера вращения вращающейся метки (сверху), который затем показан в форме графика (снизу). Вращающаяся метка представляет собой покрытую стрептавидином гранулу размером 2,8 микрона с прикрепленной к ней покрытой биотином гранулой размером 1 микрон. Транскрипция осуществлялась посредством меченой с помощью His РНК-полимеразы в присутствии всех четырех нуклеозидтрифосфатов. Фигура 10 демонстрирует, что характер вращения вращающейся метки можно ясно и надежно детектировать и измерять по изображению, зафиксированному с помощью детектора.
Фигура 11A представляет собой блок-схему, иллюстрирующую вращательный анализ. Из вращательного анализа можно определять ряд метрик, включая временную отметку, смещение (от n=1 и n-1), смещение ограничивающего круга, диаметр гранул, ориентацию пары, суммарное вращение, угловую скорость и эксцентриситет эллипса. Сегментацию изображений можно использовать для разделения всех пикселов на два класса, передний план (вращающаяся метка) и задний план. Используя один метод (метод Оцу) можно вычислять гистограмму изображения и вероятности каждого уровня интенсивности и затем можно определять порог, который минимизирует разброс внутри класса. При использовании другого метода (метода треугольника) проводят линию между максимумом гистограммы в точке b на оси уровня серого и наименьшим значением на оси уровня серого a. Расстояние L по нормали к линии и между линией и гистограммой вычисляют для всех значений от a до b. Уровень, при котором расстояние между гистограммой и линией максимален, соответствует пороговому значению. При использовании еще одного метода (адаптивного среднего или медианы), локализованное окно (т.е. 5×5 пикселов) можно использовать для нахождения максимального разброса интенсивности, который затем используют для вычисления среднего или медианы для этого окна.
Метод ограничивающего эллипса может использовать любой из нескольких методов: центроидный метод с нормализацией по моментам второго порядка участка переднего плана (вращающейся метки); метод большой оси эллипса, где максимальное расстояние до края участка от центра тяжести участка является первой точкой большой оси, а отражение (от центра тяжести) является второй точкой; метод малой оси эллипса, которая является максимальным расстоянием до края участка от центра тяжести участка, и перпендикулярна большой оси; и метод ориентации эллипса, представляющей собой угол между большой осью эллипса и осью x.
Фигура 11B представляет собой блок-схему, иллюстрирующую пример способа 1100 определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах способ 1100 можно воплощать с применением одного или нескольких компьютерных программных приложений, выполняемых с применением одного или нескольких вычислительных устройств. С целью иллюстрации предлагается неограничивающий пример контекста, который направлен на определение последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей вращающуюся метку, на основании данных, полученных во время транскрипции представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.
Способ 1100 начинается с установления расшифровываемого положения в текущее нуклеотидное положение в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты (1110), секвенируемой с применением зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанного в настоящем документе. Расшифровываемое положение может быть, например, первым транскрибируемым нуклеотидом, первым транскрибируемым нуклеотидом представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты (т.е. после последовательностей промотора) или любым положением нуклеотида вдоль представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.
Первое данное (т.е. первую информацию) в расшифровываемом положении в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты получают (1120) из системы зависящего от вращения транскрипционного секвенирования или определяют на основании информации из процесса, зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, и определяют или получают (1120) вторую информацию (т.е. второе данное) в расшифровываемом положении в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты. Например, первое данное может представлять собой информацию относительно вращения вращающейся метки. Например, первое данное может представлять собой скорость вращения (т.е. угол поворота/время), определение присутствия или отсутствия вращения или изменение в установленном характере вращения. Например, второе данное может представлять собой информацию относительно присутствия и/или доступности (например, концентрацию) одного или нескольких нуклеозидтрифосфатов в реакции секвенирования.
Нуклеотид в расшифровываемом положении затем может быть определен на основании первого и второго данных. Например, если первое данное указывает на изменение в характере вращения, и второе данное указывает на присутствие нуклеозидтрифосфата гуанина в реакции, то определяют, что нуклеотид в расшифровываемом положении в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты представляет собой цитозин. Аналогично, если первое данное указывает на отсутствие изменения в характере вращения, и второе данное указывает на присутствие нуклеозидтрифосфата гуанина в реакции, определяют, что нуклеотид в указанном положении в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты представляет собой не гуанин (т.е. аденин, гуанин и тимин).
Если определяют, что расшифровываемое положение можно продвинуть в следующее положение (1140), расшифровываемое положение устанавливают равным следующему нуклеотидному положению в представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты (1150) и продолжают (1120) способ 1100. Если определяют, что расшифровываемое положение нельзя продвинуть в следующее положение (1140), составляют (1160) последовательность представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании первой информации и второй информации, полученных в каждом расшифровываемом положении, и способ 1100 завершается. Расшифровываемое положение нельзя продвинуть в следующее положение, когда транскрипция не может продолжаться вследствие, например, окончания транскрипции представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты или прекращения активности РНК-полимеразы (например, вследствие спада ферментативной активности).
Варианты осуществления объекта изобретения и операции, описанные в данном описании изобретения, могут быть реализованы в виде цифровых электронных схем или в виде компьютерного программного обеспечения, программно-аппаратного обеспечения или аппаратного обеспечения, или в виде комбинаций одного или нескольких из них. Варианты осуществления объекта изобретения, описанные в настоящем документе, могут быть реализованы в виде одной или нескольких компьютерных программ, т.е., одного или нескольких модулей компьютерных программных инструкций, закодированных на компьютерной среде для хранения, для выполнения посредством устройства для обработки данных или для управления его работой. Альтернативно или дополнительно, программные инструкции могут быть закодированы в искусственно создаваемом распространяющемся сигнале, например, создаваемом машиной электрическом, оптическом или электромагнитном сигнале, который создают для кодирования информации для передачи на подходящее приемное устройство для выполнения посредством устройства для обработки данных. Компьютерная среда для хранения может представлять собой машиночитаемое устройство хранения, машиночитаемый субстрат для хранения, массив или устройство памяти с произвольным или последовательным доступом, мобильное устройство связи или комбинацию одного или нескольких из них или входить в их состав. Кроме того, хотя компьютерная среда для хранения не является распространяющимся сигналом, компьютерная среда для хранения может являться источником или назначением компьютерных программных инструкций, закодированных в искусственно создаваемом распространяющемся сигнале. Компьютерная среда для хранения также может представлять собой один или несколько отдельных физических компонентов или сред (например, множество CD, дисков или других устройств для хранения) или входить в их состав.
Операции, описанные в настоящем документе, могут быть реализованы в виде операций, осуществляемых посредством устройства для обработки данных над данными, сохраненными на одном или нескольких машиночитаемых устройствах для хранения или получаемыми из других источников. Термин "устройство для обработки данных" охватывает все типы приспособлений, устройств и машин для обработки данных, включая, в качестве примера, программируемый процессор, мобильное устройство связи, компьютер, систему на чипе, или несколько из них, или комбинации вышеизложенного. Устройство может включать логические схемы специального назначения, например ППВМ (программируемую пользователем вентильную матрицу) или ASIC (интегральную схему специального назначения). Устройство может также включать, помимо аппаратного обеспечения, код, который создает среду выполнения для компьютерной программы, о которой идет речь, например код, который образует программно-аппаратное обеспечение процессора, стек протоколов, систему управления базами данных, операционную систему, кроссплатформенную среду выполнения, виртуальную машину или комбинацию одного или нескольких из них. Устройство и среда выполнения могут реализовывать различные другие инфраструктуры вычислительных моделей, такие как веб-сервисы, распределенные вычисления и инфраструктуры сетевых параллельных вычислений.
Компьютерная программа (также известная как программа, программное обеспечение, программное приложение, скрипт или код) может быть написана на любом языке программирования, включая компилируемые или интерпретируемые языки, декларативные или процедурные языки, и она может быть развернута в любой форме, в том числе в виде автономной программы или в виде модуля, компонента, подпрограммы, объекта или другой единицы, подходящей для применения в вычислительной среде. Компьютерная программа может, но не обязательно, соответствовать файлу в файловой системе. Программа может быть сохранена в части файла, который содержит другие программы или данные (например, один или несколько скриптов, сохраненных в документе на языке разметки), в отдельном файле, отведенном программе, о которой идет речь, или в множестве скоординированных файлов (например, файлов, которые хранят один или несколько модулей, подпрограмм или частей кода). Компьютерная программа может быть развернута для выполнения на одном компьютере или на множестве компьютеров, которые расположены в одном месте или распределены по разным местам и связаны друг с другом коммуникационной сетью.
Способы и логические последовательности действий, описанные в настоящем документе, могут осуществляться одним или несколькими программируемыми процессорами, выполняющими одну или несколько компьютерных программ для осуществления действий посредством оперирования над входными данными и создания выходных данных. Способы и логические последовательности действий могут также осуществляться посредством логических схем специального назначения, например ППВМ или ASIC, и устройство также может быть реализовано в виде них.
Процессоры, подходящие для выполнения компьютерной программы, включают, в качестве примера, микропроцессоры как общего, так и специального назначения и любой один или несколько процессоров цифрового компьютера любого типа. Как правило, процессор принимает инструкции и данные от доступной только для чтения памяти, или от памяти с произвольным доступом, или от них обеих. Существенными элементами компьютера являются процессор для осуществления действий в соответствии с инструкциями и одно или несколько устройств памяти для хранения инструкций и данных. Как правило, компьютер также включает одно или несколько емких устройств для хранения данных, например, магнитные, магнитооптические диски или оптические диски, или он оперативно связан с ними для приема данных, или передачи данных, или для обеих целей. Тем не менее, компьютер не обязательно имеет такие устройства. Кроме того, компьютер может быть встроен в другое устройство, например, в мобильное устройство связи, карманный персональный компьютер (КПК), мобильный аудио или видеоплеер, игровую консоль, приемник глобальной системы определения местоположения (GPS) или портативное устройство для хранения (например, флэш-диск для универсальной последовательной шины (USB)), если упомянуть только некоторые. Устройства, подходящие для хранения компьютерных программных инструкций и данных, включают все формы энергонезависимой памяти, сред и устройств памяти, включая в качестве примера полупроводниковые устройства памяти, например, EPROM, EEPROM, и устройства флэш-памяти; магнитные диски, например, внутренние жесткие диски или сменные диски; магнитооптические диски; и диски CD-ROM и DVD-ROM. Процессор и память могут быть дополнены логическими схемами специального назначения или включены в них.
Для обеспечения взаимодействия с пользователем варианты осуществления объекта изобретения, описанные в настоящем описании изобретения, могут быть реализованы на компьютере, имеющем устройство отображения, например, монитор CRT (электронно-лучевая трубка) или LCD (жидкокристаллический дисплей), для отображения информации для пользователя, и клавиатуру и указывающее устройство, например, мышь или трекбол, посредством которого пользователь может осуществлять ввод в компьютер. Кроме того, компьютер может взаимодействовать с пользователем посредством отправки документов на устройство, используемое пользователем, и получения документов от него; например, посредством отправки веб-стрниц в веб-браузер на клиентском устройстве пользователя в ответ на запрос, полученный от веб-браузера.
Варианты осуществления объекта изобретения, описанного в настоящем описании изобретения, могут быть реализованы в вычислительной системе, которая включает серверный компонент, например в виде сервера данных, или которая включает промежуточный компонент, например, сервер приложений, или которая включает компонент конечного пользователя, например, клиентский компьютер, имеющий графический интерфейс пользователя или веб-браузер, посредством которого пользователь может взаимодействовать с воплощением объекта изобретения, описанным в настоящем описании изобретения, или любую комбинацию одного или нескольких таких серверных, промежуточных или пользовательских компонентов. Компоненты системы могут быть соединены друг с другом посредством любой формы или среды передачи цифровых данных, например, коммуникационной сети. Примеры коммуникационных сетей включают локальную сеть ("LAN") и глобальную сеть ("WAN"), межсетевое объединение (например, Интернет) и одноранговые сети (например, одноранговые сети ad hoc).
Вычислительная система может включать клиенты и серверы. Клиент и сервер обычно удалены друг от друга и, как правило, взаимодействуют посредством коммуникационной сети. Взаимосвязь клиента и сервера возникает, благодаря работе компьютерных программ, запущенных на соответствующих компьютерах и имеющих клиент-серверное взаимоотношение друг с другом. В некоторых вариантах осуществления сервер передает данные (например, HTML-страницу) на клиентское устройство (например, для целей отображения данных и получения пользовательского ввода от пользователя, взаимодействующего с клиентским устройством). Данные, возникающие на клиентском устройстве (например, результат взаимодействия с пользователем), могут быть приняты от клиентского устройства на сервере.
В соответствии с настоящим изобретением обычные методы молекулярной биологии, микробиологии, биохимии и рекомбинантной ДНК могут использоваться в пределах компетентности в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе. Настоящее изобретение далее будет описано в нижеследующих примерах, которые не ограничивают объем способов и композиций веществ, описанных в формуле изобретения.
Примеры
Пример 1. Подготовка твердой поверхности
Монослой NTA подготавливали, как описано (смотри Paik et al., 2005, Chem. Commun., 15:1956-58). Поверхности Ni-NTA получали посредством погружения NTA-функционализированных субстратов в буфер 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), содержащий 0,1 M NiCl2, на 30 мин. Затем субстраты несколько раз промывали водой Milli-Q, и сушили под струей азота.
Свежеочищенные субстраты погружали в перегнанный раствор толуола, содержащий 1% (об./об.) 3-глицидилоксипропилтриметоксисилана, под аргоном на 2 дня. После удаления субстратов из раствора, их промывали перегнанным толуолом, и сушили под струей азота. Субстраты, функционализированные SAM с концевой эпоксигруппой, инкубировали в буфере 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), содержащем 2,5 мМ N,N-бис(карбоксиметил)-L-лизина (NTA), при 60ºC в течение 4 ч. Субстраты промывали водой Milli-Q и сушили в порядке подготовки к микроконтактной печати.
Наблюдали ограниченный эффект неспецифического связывания меченого His белка с NTA SAM, что демонстрирует, что NTA SAM является подходящей поверхностью для изготовления структур из иона Ni(II) с помощью методов микроконтактной печати и нанолитографии глубокого пера.
Пример 2. Клонирование и очистка меченой His РНК-полимеразы
Фрагмент ДНК, который кодирует 38 аминокислот SBP-метки, синтезировали посредством ПЦР с применением pTAGk19 в качестве матрицы и синтетических олигомеров ДНК RP46 и RP47 (смотри ниже) в качестве праймеров. Фрагмент расщепляли с помощью NcoI и лигировали в pBH16117, получая pRP6.
SBP-His-РНК-полимеразу и His-РНК-полимеразу экспрессировали и очищали, как описано ранее (He et al., 1997, J. Protein Expression Purif., 9:142-51; и Keefe et al, 2001, J. Protein Expression Purif., 23:440-46).
Пример 3. Иммобилизация РНК-полимеразы
Для иммобилизации молекул РНК-полимеразы на Si(III) следовали следующей схеме реакции: (a) 40% NH4F, 10 мин, 25ºC; (b) газ Cl2, 20 мин, 100ºC; (c) mPEG, в течение ночи, вакуум, 150ºC; (d) DSC, DEIDA, DMAP, DMF, в течение ночи, 25ºC; (f) BBTO, диэтиловый эфир, 6 ч., 25ºC; (g) CuSO4, этанол 20 мин, 25ºC; (h) инкубация 6x His-меченого белка.
Пример 4. Микроконтактная печать (μCΡ) и образование комплексов
Смесь 10:1 (об./об.) поли(диметилсилоксана) (PDMS) и отверждающего средства (Sylgard 184, Dow Corning) отливали по структурированному кремниевому шаблону для получения штампов PDMS с линейными штрихами по 5 микрон с промежутками, равными 3, и линейными штрихами по 10 микрон с промежутками, равными 5 микронам. Неокисленные штампы PDMS инкубировали в буфере 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), содержащем 0,1 M NiCl2, в течение приблизительно 1 ч. и затем сушили с помощью струи азота. Штампы приводили в контакт с субстратом с концевой NTA на 3 мин. После снимания штампа субстраты с печатью Ni(II) инкубировали в приблизительно 200 мкл буфера 25 мМ Tris-HCl (pH 7,5), содержащего 100 нМ His-РНКП T7 с дцДНК, промотором и магнитными метками, прикрепленными посредством связей стрептавидин-биотин, в течение 30 мин и затем промывали буфером 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и водой Milli-Q для удаления избытка белка.
Пример 5. Связывание и вращение
Конъюгированные с SA гранулы по 2,8 микрона (Dynal) и биотинилированные гранулы по 1,0 микрону разбавляли (1:20 и 1:200 соответственно) ФСБ и смешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Покровные стекла покрывали конъюгатом Νi2+-ΝΤΑ с HRP (Qiagen), и собирали проточные камеры посредством расположения покровных стекол по одной линии с небольшими промежутками, как описано ранее (смотри Noji et al., 1997, Nature, 386:299-302).
Матрицу ДНК размером 4 т.п.о., биотинилированную с одного конца, смешивали с парами SA-гранул и инкубировали с 20 нМ His-РНКП T7, 0,3 мМ ГТФ и 0,1 мМ АТФ в течение 2 мин, для того чтобы дать образоваться комплексу элонгации. Образец (~30 мкл) впрыскивали в проточную ячейку, инкубировали в течение 5 мин, и прикладывали магнитную силу, равную 0,1 пН. Проточные ячейки промывали TB, после чего добавляли 0,5 мМ НТФ.
Было обнаружено, что расположение магнита со смещением от местоположения гранул, т.е. не непосредственно сверху, но под углом относительно источника света и объектива, позволяет легче осуществлять калибровку изменений местоположения и сил.
Пример 6. Образование комплекса зависящего от вращения транскрипционного секвенирования
Фигура 2C демонстрирует множество вращающихся меток, связанных с меченой His РНК-полимеразой и матрицей ДНК размером 5,1 т.п.о., на пассивированной, покрытой никелем стеклянной пластине. "Полуслучайное" множество создавали посредством прикладывания магнитного поля, что позволяло гранулам располагаться на упорядоченном расстоянии друг относительно друга. Нуклеиновые кислоты, несущие одну, две и три гранулы, прикрепляли к поверхности посредством переворачивания пластины вверх дном, так что коническое магнитное поле тянуло магнитные метки на поверхность стекла упорядоченным образом. Прохождение магнитных гранул в двухмерном пространстве активно создавало картину, показанную на фигуре 2C. Затем магнит удаляли и проточную камеру снова переворачивали вверх дном, для того чтобы магнит прикладывал напряжение к нуклеиновым кислотам. Реакционную смесь для секвенирования затем доставляли в проточную камеру, для того чтобы начать транскрипцию и секвенирование всех молекул параллельно.
Пример 7. Подготовка матрицы
Матрицу ДНК для секвенирования посредством транскрипции подготавливали, объединяя вместе фрагмент ДНК фага T7 размером 4,6 т.п.о., несущий промотор T7, и биотинилированный фрагмент ДНК Лямбда размером 0,5 т.п.о. Фрагмент размером 4,6 т.п.о. получали посредством ПЦР с применением прямого праймера #T7pPK13 и праймера #T7phi17REV, содержащего участок распознавания XbaI с 3'-конца. ПЦР-фрагмент размером 0,5 т.п.о. получали посредством ПЦР с применением праймеров #F3 и #R3 в присутствии биотин-16-дУТФ (Roche). После завершения ПЦР, очищенный продукт ПЦР расщепляли с помощью NheI, и очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
После расщепления продукта ПЦР с помощью XbaI кусок размером 4,6 т.п.о. соединяли посредством лигирования в течение ночи при 15ºC с биотинилированным фрагментом ПЦР размером 0,5 т.п.о., расщепленным с помощью NheI. Получаемый продукт лигирования размером 5,1 т.п.о. анализировали с применением электрофореза на 0,7% агарозном геле, и экстрагировали из геля с применением набора QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Данную ДНК использовали в экспериментах по транскрипции и секвенированию.
Для ПЦР использовали следующие праймеры: #T7pPK13: GCA GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GGG AGG GAT GGA GCC TTT AAG GAG GTC AAA TGG CTA ACG (SEQ ID NO:1; последовательность промотора T7 подчеркнута, полужирное G - это +1, и полужирное C представляет собой участок остановки в положении +20); #T7phi17REV: GGC A-T CTA GA- TGC ATC CCT ATG CAG TCC TAA TGC (SEQ ID NO:2; содержит сайт Xba); #F3: GGC AGC TAG CTA AAC ATG GCG CTG TAC GTT TCG C (SEQ ID NO:3; содержит сайт рестрикции NheI на 5'-конце); и #R3: AGC CTT TCG GAT CGA ACA CGA TGA (SEQ ID NO:4).
Следующая таблица демонстрирует реакционную смесь, использованную для получения фрагмента размером 4,6 т.п.о. из фага T7, содержащего промотор T7. ПЦР-амплификацию осуществляли в следующих циклически повторяющихся условиях: 94ºC на 30 секунд, 32 цикла при 94ºC по 10 секунд, 55ºC на 30 секунд, 65ºС на 4 минуты 10 секунд, 65ºC на 10 минут, за чем следовало помещение при 4ºC.
(New England Biolabs)
(конечная концентрация 0,4 мМ)
(конечная концентрация 0,4 мМ)
Следующая таблица демонстрирует реакционную смесь, использованную для получения фрагмента лямбда размером 0,5 т.п.о., содержащего несколько биотинов. ПЦР-амплификацию осуществляли в следующих циклически повторяющихся условиях: 94ºC на 10 минут, 32 цикла при 94ºC на 10 секунд, 55ºC на 30 секунд, 72ºC на 1 минуту, 72ºC на 7 минут, за чем следовало помещение при 4ºC.
Пример 8. Одномолекулярная реакция транскрипции и секвенирования
Вариант 1 (образование двойных частиц внутри проточной ячейки)
1000 мкл Dynabeads MyOne Streptavidin T1 размером 1 микрон разбавляли ФСБ 1:100, опускали с помощью магнита, для того чтобы промыть, удаляли супернатант и ресуспендировали гранулы в 20 мкл буфера B+0,1% БСА. Гранулы переносили в пробирку 0,5 мл, и подвергали воздействию ультразвука в течение 2 мин до вливания в проточную ячейку.
Немагнитные полистирольные биотинилированные гранулы размером 0,8 микрон (Kisker, PC-B-0.8) подготавливали следующим образом: 10 мкл гранул расформировывали и ресуспендировали в 10 мкл буфера B+0,1% БСА для получения исходного раствора промытых гранул.
Стеклянную пластину, функционализированную ПЭГ-Cu++, (MicroSurfaces, Inc) пассивировали с буфером B+1%БСА.
Следующую реакционную смесь готовили при комнатной температуре, и инкубировали в течение 3 мин при 37ºC.
45 мкл буфера Β добавляли к реакционной смеси с комплексами элонгации РНКП T7-ДНК, остановившимися в положении +20 матрицы, и смесь вливали в проточную ячейку в течение периода, равного 5 мин.
Проточную ячейку промывали буфером B, и вливали магнитные гранулы SA размером 1 мкм (46 мкл буфера B+0,1% БСА, смешанные с 6 мкл промытых гранул в буфере B+0,1% БСА) в течение периода, равного 12 мин. Проточную ячейку промывали буфером B+0,1% БСА.
Полистирольные биотинилированные гранулы размером 0,8 микрон (2 мкл промытых гранул + 48 мкл 1×B/0,1% БСА) вливали в проточную ячейку, и инкубировали в течение 15 мин для образования двойных частиц со связанными с поверхностью магнитными гранулами SA. Проточную ячейку промывали буфером B для удаления несвязанных полистирольных гранул размером 0,8 микрон.
Транскрипцию/секвенирование начинали вливанием буфера B+250 мкМ НТФ+10 мМ ДТТ в проточную ячейку. Использовали четыре различных смеси НТФ (каждая содержала меньшее количество одного из нуклеотидов) в четырех различных проточных ячейках.
Вариант 2 (заранее сформированные двойные частицы)
В целом реакцию транскрипции/секвенирования готовили как описано выше в варианте 1, но вместо последовательного введения магнитных и полистирольных гранул двойные частицы формировали заранее следующим образом. 1000 мкл смеси Dynabeads MyOne SA T1 (Dynal) размером 1 микрон, разбавленные ФСБ 1:100, и полистирольные биотиновые гранулы размером 0,8 микрон (Kisker), разбавленные 1:500, смешивали на встряхивателе в течение 30 мин при комнатной температуре для образования двойных частиц. Гранулы опускали с помощью магнита, удаляли супернатант с несвязанными полистирольными частицами и ресуспендировали гранулы в 20 мкл буфера B+0,1% БСА. Гранулы переносили в пробирку 0,5 мл, и подвергали воздействию ультразвука в течение 2 мин до добавления к реакционной смеси.
Пример 9. Предполагаемая стоимость секвенирования всего генома с применением зависящего от вращения транскрипционного секвенирования
Следует отметить, что одним из преимуществ зависящего от вращения транскрипционного секвенирования, описанного в настоящем документе, является низкая стоимость, особенно принимая во внимание способность к очень продолжительной работе. Таблица ниже демонстрирует предполагаемые стоимости секвенирования всего человеческого генома.
Следует понимать, что при том что системы, способы и композиции веществ описаны в настоящем документе в сочетании с рядом различных аспектов, приведенное выше описание различных аспектов предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем систем, способов и композиций веществ. Другие аспекты, преимущества и модификации лежат в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.
Раскрыты системы, способы и композиции, которые можно использовать для раскрытых систем, способов и композиций, можно использовать в сочетании с ними, можно использовать в подготовке к ним, или которые являются их продуктами. Эти и другие материалы раскрыты в настоящем описании, и следует понимать, что раскрыты комбинации, подмножества, взаимодействия, группы и т.д. данных систем, способов и композиций. То есть, при том что конкретная ссылка на каждую из различных отдельных и совместных комбинаций и перестановок данных композиций и способов может быть явно не раскрыта, каждая из них прямо предполагается и описана в настоящем документе. Например, если конкретная часть системы, композиция веществ или конкретный способ раскрыты и рассмотрены, и рассмотрен ряд частей системы, композиций или способов, все без исключения комбинации и перестановки частей системы, композиций и способов прямо предполагаются, если прямо не указано обратное. Аналогичным образом, все их подмножества или комбинации также прямо предполагаются и раскрыты.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ CRISPR/CAS9, ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ | 2020 |
|
RU2810091C2 |
| АНАЛИЗ МНОЖЕСТВА АНАЛИТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОДНОГО АНАЛИЗА | 2019 |
|
RU2824049C2 |
| ВРАЩАЮЩАЯСЯ ПЛАТФОРМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ | 2012 |
|
RU2601139C2 |
| СПОСОБЫ И СРЕДСТВА ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕКИ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ | 2019 |
|
RU2815513C2 |
| СПОСОБЫ ИНКАПСУЛИРОВАНИЯ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК, ИНКАПСУЛИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2793717C2 |
| СПОСОБЫ ИНКАПСУЛИРОВАНИЯ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК, ИНКАПСУЛИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2750567C2 |
| Способ безметочного одномолекулярного секвенирования ДНК и устройство для его реализации | 2017 |
|
RU2679494C1 |
| СПОСОБ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ | 2002 |
|
RU2291197C2 |
| НАБОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ ДЛЯ СИНТЕЗА 3′-O-ПРОПАРГИЛ-МОДИФИЦИРОВАННОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ | 2014 |
|
RU2688435C2 |
| СЛОЖНЫЕ КОМПЛЕКСЫ СВЯЗАННОЙ НА ПОВЕРХНОСТИ ТРАНСПОСОМЫ | 2020 |
|
RU2790295C2 |
Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Для осуществления указанного способа предоставляют твёрдый субстрат, на котором иммобилизована РНК-полимераза, и последовательно детектируют местоположения первого, второго и третьего из четырёх нуклеотидов, а оставшиеся положения, не занятые первыми тремя, определяют как положения четвёртого нуклеотида. Для определения каждого конкретного положения первого, второго и третьего нуклеотида РНК-полимеразу приводят в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей детектируемую оптически вращающуюся метку в первых, вторых и третьих условиях секвенирования соответственно. Первые, вторые и третьи условия секвенирования включают присутствие четырёх нуклеотидтрифосфатов, где первый, второй или третий нуклеотидтрифосфат из четырёх соответственно присутствует в скорость-лимитирующем количестве. При этом остановка вращения вращающейся метки указывает на присутствие того нуклеотидтрифосфата, который находится в скорость-лимитирующем количестве. Настоящее изобретение позволяет повысить чувствительность и точность количественного анализа при секвенировании. 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 9 пр.
1. Способ определения последовательности представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты, включающий:
предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизована РНК-полимераза;
приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты в первых условиях секвенирования, причем представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты содержит детектируемую оптически вращающуюся метку, причем первые условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где первый нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве;
детектирование остановки в характере вращения вращающейся метки в первых условиях секвенирования, где указанная остановка в характере вращения указывает на присутствие скорость-лимитирующего нуклеотида в этом положении;
приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей детектируемую оптически вращающуюся метку, во вторых условиях секвенирования, причем вторые условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где второй нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве;
детектирование остановки в характере вращения вращающейся метки во вторых условиях секвенирования, где указанная остановка в характере вращения указывает на присутствие скорость-лимитирующего нуклеотида в этом положении;
приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей детектируемую оптически вращающуюся метку, в третьих условиях секвенирования, причем третьи условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где третий нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве;
детектирование остановки в характере вращения вращающейся метки в третьих условиях секвенирования, где указанная остановка в характере вращения указывает на присутствие скорость-лимитирующего нуклеотида в этом положении; и
определение последовательности молекулы нуклеиновой кислоты-мишени на основе информации о местоположении указанных первого, второго и третьего нуклеозидтрифосфатов.
2. Способ по п. 1, в котором твердый субстрат представляет собой стекло.
3. Способ по п. 1, в котором РНК-полимераза представляет собой РНК-полимеразу бактериофага.
4. Способ по п. 3, в котором РНК-полимераза бактериофага представляет собой РНК-полимеразу Т7 или РНК-полимеразу Т3.
5. Способ по п. 1, в котором РНК-полимераза представляет собой бактериальную РНК-полимеразу.
6. Способ по п. 5, в котором бактериальная РНК-полимераза представляет собой РНК-полимеразу E. coli.
7. Способ по п. 1, в котором РНК-полимераза иммобилизована на твердой поверхности посредством His-метки.
8. Способ по п. 1, в котором представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты является эукариотической.
9. Способ по п. 1, в котором представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты является двухцепочечной.
10. Способ по п. 1, в котором представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты содержится в биологическом образце.
11. Способ по п. 1, в котором представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность промотора РНК-полимеразы.
12. Способ по п. 1, в котором вращающаяся метка содержит первую метку и вторую метку.
13. Способ по п. 12, в котором первая метка является магнитной.
14. Способ по п. 1, в котором стадия детектирования включает испускание света на вращающуюся метку.
15. Способ по п. 14, в котором стадия детектирования дополнительно включает наблюдение характера вращения посредством микроскопа.
16. Способ по п. 1, в котором стадия детектирования дополнительно включает фиксацию характера вращения на КМОП или ПЗС.
17. Способ по п. 1, в котором твердый субстрат представляет собой КМОП или ПЗС.
18. Способ по п. 1, в котором стадия детектирования включает фиксацию характера вращения в виде магнитного изображения.
19. Способ по п. 18, в котором магнитное изображение фиксируют на датчике ГМС или матрице MRAM.
20. Способ по п. 1, в котором стадия детектирования включает фиксацию характера вращения в виде электрического поля.
21. Способ по п. 20, в котором изображение фиксируют на датчике RAM.
22. Способ по п. 1, дополнительно включающий прикладывание направленной силы к представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты.
23. Способ по п. 22, в котором направленную силу получают с помощью магнита или с помощью потока или давления.
24. Способ по п. 1, в котором стадии приведения в контакт и детектирования в первых условиях секвенирования, стадии приведения в контакт и детектирования во вторых условиях секвенирования и стадии приведения в контакт и детектирования в третьих условиях секвенирования осуществляют одновременно.
25. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
предоставление твердого субстрата, на котором иммобилизована РНК-полимераза;
приведение РНК-полимеразы в контакт с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей вращающуюся метку, в четвертых условиях секвенирования, причем четвертые условия секвенирования включают присутствие четырех нуклеозидтрифосфатов, где четвертый нуклеозидтрифосфат из четырех нуклеозидтрифосфатов присутствует в скорость-лимитирующем количестве;
детектирование характера вращения вращающейся метки в четвертых условиях секвенирования; и
определение информации о местоположении четвертого нуклеозидтрифосфата вдоль представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты на основании изменения в характере вращения.
| US 2011008794 A1, 13.01.2011 | |||
| US 2007077575 A1, 05.04.2007 | |||
| US 6872816 B1, 29.03.2005 | |||
| WESTOVER KD, et al., Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center, Cell, 2004, 119 (4), pp.481-489 | |||
| ДМИТРИЕНКО Е.В., и др., Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидных производных | |||
| II | |||
| Изотермическая амплификация сигнала при анализе ДНК методоом мини-секвенирования, Биоорганическая химия, 2010, том 36, No.6, с.802-814 | |||
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) И НАБОР ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ | 1994 |
|
RU2143004C1 |
