КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ CRISPR/CAS9, ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/10 C12Q1/6869 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящей заявкой испрашивается преимущество приоритета предварительной заявки США № 62/873,609, поданной 12 июля 2019 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки для любых целей.

ОПИСАНИЕ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящая заявка относится к способам использования ферментов CRISPR/Cas9, иммобилизованных на твердой подложке, для создания библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, к твердым подложкам, содержащим иммобилизованный фермент CRISPR/Cas9, и к родственным композициям. Иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот можно использовать в качестве матриц, например, в различных областях применения, включая, например, высокопроизводительное, массивно-параллельное и/или мультиплексное секвенирование нуклеиновых кислот.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Существует множество способов и сфер применения, для которых желательно создать библиотеку фрагментированных случайным образом молекул нуклеиновых кислот из целевых молекул двухцепочечных нуклеиновых кислот, таких как целевые молекулы двухцепочечной ДНК (дцДНК). Часто целью является создание меньших молекул нуклеиновых кислот (например, фрагментов нуклеиновых кислот) из более крупных двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот для использования в качестве матриц в реакциях секвенирования нуклеиновых кислот.

[0004] Многие из способов, в настоящее время используемых для фрагментации и мечения двухцепочечных нуклеиновых кислот для использования при секвенировании следующего поколения, являются неэкономными по расходу нуклеиновой кислоты, для фрагментации требуются дорогостоящие инструменты. а процедуры фрагментации, мечения и выделения меченых фрагментов нуклеиновых кислот являются сложными, монотонными, трудоемкими, отнимающими много времени, неэффективными, дорогостоящими, требуют относительно высокого количества нуклеиновых кислот в образце. Кроме того, с помощью многих из этих способов получают фрагменты нуклеиновых кислот, в которых не полностью представлены последовательности, содержащиеся в образце нуклеиновых кислот, из которых они получены. Таким образом, в данной области необходимы способы, которые обеспечивают быстроту и легкость применения при создании библиотек фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и которые можно легко применять в способах анализа нуклеиновых кислот, таких как способы секвенирования следующего поколения и амплификации.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В соответствии с описанием в настоящей заявке описан способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащий: (а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней ферментами CRISPR/Cas9; и (б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом ферментами CRISPR/Cas9, а CRISPR/Cas9 связывается по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0006] В некоторых вариантах осуществления целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.

[0007] В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

[0008] В некоторых вариантах осуществления огРНК содержит (GC)_n или (AT)_n, при этом n составляет 5-20, 10-15 или 10.

[0009] В некоторых вариантах осуществления огРНК содержит от 10 до 40, от 15 до 35 или от 17 до 20 нуклеотидов.

[0010] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков. В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающие белки включают авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент. В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.

[0011] В некоторых вариантах осуществления способ включает промывку твердой подложки с иммобилизованными на ней двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты для удаления любых несвязанных нуклеиновых кислот.

[0012] В некоторых вариантах осуществления способ включает амплификацию двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, иммобилизованных на твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления амплификация включает предоставление полимеразы и праймера для амплификации, соответствующего участку первого полинуклеотида.

[0013] В некоторых вариантах осуществления нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.

[0014] В некоторых вариантах осуществления один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

[0015] В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ ферментов на мм².

[0016] В некоторых вариантах осуществления длины двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты в иммобилизованной библиотеке пропорциональны плотности ферментов CRISPR/Cas9 на твердой подложке.

[0017] В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой гранулы

[0018] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает: (в) нанесение интеркалирующего красителя по меньшей мере на часть иммобилизованной библиотеки двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты для получения набора окрашенных иммобилизованных фрагментов; и получение изображения окрашенных иммобилизованных фрагментов.

[0019] В некоторых вариантах осуществления нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает добавление биологического образца на твердую подложку. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит клеточный лизат. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит цельные клетки. В некоторых вариантах осуществления биологический образец выбирают из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, лимфы, слизи, мокроты, мочи, спермы, спинномозговой жидкости, бронхиального аспирата, фекалий и мацерированной ткани.

[0020] В некоторых вариантах осуществления способ содержит мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0021] В некоторых вариантах осуществления двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки. В некоторых вариантах осуществления домен первой метки содержит область для кластерной амплификации. В некоторых вариантах осуществления домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.

[0022] В некоторых аспектах способ дополнительно содержит высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления высвобождение включает выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплификацию с замещением цепей (SDA), транскрипционно-опосредованную амплификацию (ТМА) и амплификацию на основе нуклеотидной последовательности (NASBA) или другой способ амплификации. В некоторых вариантах осуществления ПЦР включает ПЦР супрессии. В некоторых вариантах осуществления высвобождение включает применение света или тепла.

[0023] В настоящей заявке также описан способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий: (а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан со биотинсвязывающим белком на твердой подложке; и (б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом комплексами CRISPR/Cas9, и комплексы CRISPR/Cas9 связываются по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0024] В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающий белок включаетавидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент. В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.

[0025] В некоторых вариантах осуществления нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО),этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

[0026] В некоторых вариантах осуществления способ содержит мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки. В некоторых вариантах осуществления домен первой метки содержит область для кластерной амплификации. В некоторых вариантах осуществления домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.

[0027] В некоторых аспектах способ дополнительно содержит высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления высвобождение включает выполнение ПЦР или другого способа амплификации. В некоторых вариантах осуществления ПЦР включает ПЦР супрессии. В некоторых вариантах осуществления высвобождение включает применение света или тепла.

[0028] В настоящей заявке также описана твердая подложка, имеющая библиотеку двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, иммобилизованных на ней, полученная в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.

[0029] В настоящей заявке также описана твердая подложка, имеющая иммобилизованные на ней комплексы CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат ферменты CRISPR/Cas9, которые случайным образом фрагментируют целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

[0030] В некоторых вариантах осуществления целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.

[0031] В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

[0032] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке.

[0033] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

[0034] В некоторых вариантах осуществления огРНК содержит (GC)_n или (AT)_n, при этом n составляет 5-20 или 10-15. В некоторых вариантах осуществления n равно 10.

[0035] В некоторых вариантах осуществления огРНК содержит от 10 до 40 или от 15 до 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления огРНК содержит 17 или 20 нуклеотидов.

[0036] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит биотинсвязывающие белки. В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающие белки включают авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент. В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.

[0037] В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ ферментов на мм².

[0038] В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой гранулы

[0039] В заявке также описана композиция, содержащая твердую подложку, описанную в настоящем документе, и один или более реагентов, снижающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО),этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

[0040] В заявке также описана твердая подложка с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке.

[0041] В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающий белок включает авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент. В некоторых вариантах осуществления биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.

[0042] В некоторых вариантах осуществления комплексы CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ ферментов на мм².

[0043] В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой гранулы

[0044] В заявке также описана композиция, содержащая твердую подложку, описанную в настоящем документе, и один или более реагентов, снижающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

[0045] Дополнительные цели и преимущества будут частично изложены в представленном ниже описании и частично будут очевидны из описания или могут быть изучены на практике. Цели и преимущества будут реализованы и достигнуты с помощью элементов и комбинаций, специально указанных в прилагаемой формуле изобретения.

[0046] Следует понимать, что как приведенное выше общее описание, так и последующее подробное описание служат только для примера и разъяснения и не ограничивают формулу изобретения.

[0047] Сопроводительный графический материал, который включен в настоящее описание и является его частью, иллюстрирует один вариант осуществления и вместе с описанием служит для объяснения принципов, описанных в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

[0048] На Фиг. 1 показан один вариант осуществления изобретения. В этом варианте осуществления комплексы CRISPR/Cas9 иммобилизованы на поверхности. Комплексы CRISPR/Cas9 имеют фермент CRISPR/Cas9 (Cas9) и биотинилированный полинуклеотид, содержащий 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК). Целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту наносят на твердую подложку, случайным образом фрагментируют комплексами CRISPR/Cas9, и двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты связываются с комплексами CRISPR/Cas9, иммобилизованными на поверхности. Размер фрагмента нуклеиновой кислоты зависит от расстояния между иммобилизованными на поверхности ферментами CRISPR/Cas9.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0049] В современных протоколах секвенирования образцов нуклеиновых кислот обычно используют процесс приготовления образцов, преобразующий нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, или РНК, или гибрид РНК/ДНК, в библиотеку матриц. Эти способы могут приводить к потере образца нуклеиновой кислоты, и часто для фрагментации требуются дорогостоящие инструменты. Кроме того, способы приготовления образцов часто являются сложными, трудоемкими и неэффективными.

[0050] В стандартных способах получения образца каждая матрица содержит адаптор на каждом конце вставки, и часто требуется несколько этапов как для модификации нуклеиновой кислоты, так и для очистки желаемых продуктов реакций модификации. Данные этапы осуществляют в растворе перед добавлением адаптированных фрагментов в проточную кювету, где они соединяются с поверхностью с помощью реакции достройки праймера, в которой происходит копирование гибридизированного фрагмента на конце праймера, ковалентно связанного с поверхностью. Эти «затравочные» матрицы после нескольких циклов амплификации дают начало моноклональным кластерам скопированных матриц.

[0051] Число этапов, необходимых для преобразования целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, в фрагментированные случайным образом двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты в растворе, приготовленном для формирования кластера и секвенирования, можно свести к минимуму путем использования фрагментации под действием фермента CRISPR/Cas9. После стадии очистки для удаления несвязанных нуклеиновых кислот дополнительные последовательности добавляют к концам фрагментов нуклеиновой кислоты посредством ПЦР.

[0052] Фрагментация на основе раствора имеет недостатки и требует нескольких трудоемких этапов. Кроме того, может быть внесена погрешность во время этапов амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способы и композиции, представленные в настоящем документе, позволяют преодолеть данные недостатки и позволяют производить приготовление образцов без искажений, образование кластеров и секвенирование с минимальными требованиями к манипуляциям или переносу образцов.

[0053] Настоящее описание относится к неожиданному открытию того, что ферменты CRISPR/Cas9, предварительно связанные с поверхностью твердой подложки, такой как проточная кювета, могут быть использованы при определенных условиях для эффективной случайной фрагментации и иммобилизации интактных целевых нуклеиновых кислот на твердой подложке. В конкретных вариантах осуществления одна или более цепей, содержащих ферменты CRISPR/Cas9, прикреплены к поверхности твердой подложки посредством их 5'-конца. Фермент CRISPR/Cas9 также может быть заключен в комплекс, который содержит последовательности, обеспечивающие последующее образование кластеров и секвенирование.

[0054] Способы и композиции, представленные в настоящем документе, обеспечивают ряд преимуществ по сравнению со способами фрагментации на основе раствора и способами менее случайной фрагментации. Например, очищенную, частично очищенную или даже неочищенную интактную целевую нуклеиновую кислоту можно загрузить непосредственно на твердую подложку или проточную кювету для генерации кластеров без предварительной подготовки образца. Кроме того, непрерывность информации о последовательности в исходной интактной нуклеиновой кислоте можно физически сохранить путем близкого расположения фрагментов на поверхности твердой подложки или проточной кюветы. В качестве еще одного преимущества, фрагменты нуклеиновых кислот физически связаны с поверхностью твердой подложки или проточной кюветы, так что очистка реагентов после последующих манипуляций с фрагментами нуклеиновых кислот может быть осуществлена с помощью проточной цитометрии, например, в канале проточной кюветы.

[0055] Кроме того, улучшенная случайная фрагментация целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты позволяет наилучшим образом представить исходный образец в библиотеке фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

I. Случайная фрагментация на твердой подложке

[0056] В соответствии с вышеизложенным в настоящем документе представлены способы получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты и твердые подложки, имеющие иммобилизованную на них библиотеку двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, приготовленные в соответствии с такими способами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы включают: (а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней ферментами CRISPR/Cas9; и (б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом ферментами CRISPR/Cas9, а CRISPR/Cas9 связывается по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0057] В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 иммобилизованы непосредственно на твердой подложке.

[0058] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы включают: (а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке; и (б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом комплексами CRISPR/Cas9, и комплексы CRISPR/Cas9 связываются по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0059] В настоящем документе термин «фрагментированный случайными образом» относится к фрагментации целевой нуклеиновой кислоты случайным образом для получения ряда фрагментов (например, фрагментов, полученных с помощью фрагментации в случайных положениях с точки зрения последовательности). В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота фрагментируется случайным неспецифичным к последовательности образом для получения ряда идентичностей фрагментов. Фрагментация является контролируемой в настоящем изобретении как с точки зрения нормализованных количеств продукта, так и размера фрагмента (т. е. контролируемого выбора размера фрагмента), независимо от количества ДНК на входе. Например, как показано на Фиг. 1, расстояние между соседними ферментами CRISPR/Cas9 на твердых подложках может определять диапазон размеров фрагментов, иммобилизованных на поверхности твердой подложки.

[0060] В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота фрагментирована специфичным для последовательности образом. Например, как описано ниже, два ферментных комплекса CRISPR/Cas9 на одной и той же твердой подложке могут включать пару огРНК, примыкающих к представляющей интерес области целевой нуклеиновой кислоты. В таких вариантах осуществления с помощью каждой пары огРНК получают один фрагмент. В других вариантах осуществления используется множество твердых подложек (например, гранулы), и каждая твердая подложка во множестве твердых подложек может нести разную пару огРНК. Таким образом, разные твердые подложки будут нацелены на разные последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления разные пары огРНК нацелены на разные целевые последовательности в геноме. Эти способы позволяют выполнять мультиплексное таргетирование.

[0061] Используемый в настоящем документе термин «ферменты CRISPR/Cas9» относится в целом к коротким палиндромным повторам, регулярно расположенным группами, (CRISPR) и ферментам CRISPR-ассоциированного белка 9-нуклеазы (Cas9). Cas9, также известный как Csn1, представляет собой CRISPR-ассоциированный белок, содержащий два нуклеазных домена, нуклеазный домен RuvC и нуклеазный домен HNH, запрограммированные малыми РНК на расщепление нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Ферменты CRISPR/Cas9 по существу известны специалистам в данной области, как показано, например, в описании в заявке на патент США публ. № 2019/0202856, содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Например, сконструированные ферменты CRISPR/Cas9 могут быть получены из Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9), Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Cas9 Campylobacter jejuni (CjCas9), Cas9 Francisella novicida (FnCas9) или Cas9 Neisseria cinerea (NcCas9). Специалистам в данной области известны дополнительные варианты Cas9, которые, как известно, расщепляют нуклеиновые кислоты, и включают Cas9 дикого типа или природного происхождения и мутантный или модифицированный Cas9 (например, Cas9D10A). Следует понимать, что любой фермент CRISPR/Cas9, способный фрагментировать или расщеплять целевую нуклеиновую кислоту, может быть использован в настоящем изобретении в условиях, в которых фермент CRISPR/Cas9 способен фрагментировать случайным образом или расщеплять целевую ДНК.

[0062] Используемый в настоящем документе термин «ферментный комплекс CRISPR/Cas9» относится в целом к ферменту CRISPR/Cas9, связанному с первым полинуклеотидом, который направляет фермент CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности или специфичным к последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности или специфичным к последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков. Например, ферментный комплекс CRISPR/Cas9 может содержать фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности или специфичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке.

[0063] Используемый в настоящем документе термин «двухцепочечная нуклеиновая кислота» относится к двухцепочечной ДНК (дцДНК), двухцепочечной РНК (дцРНК) или гибриду двухцепочечной РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК. Хотя в настоящем описании термин «ДНК» используется в связи с целевой молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, следует понимать, что любая подходящая нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты может быть фрагментирована случайным образом.

[0064] Термин «конец CRISPR/Cas9» относится к двухцепочечной нуклеиновой кислоте, демонстрирующей только нуклеотидные последовательности («концевые последовательности CRISPR/Cas9»), необходимые для образования комплекса с ферментом CRISPR/Cas9. Концы CRISPR/Cas9 могут содержать любую нуклеиновую кислоту или аналог нуклеиновой кислоты, подходящий для образования функционального комплекса с ферментом CRISPR/Cas9. Например, конец CRISPR/Cas9 может содержать ДНК, РНК, модифицированные основания, неприродные основания, модифицированный каркас и может содержать одноцепочечные разрывы в одной или обеих цепях.

[0065] При использовании в настоящем документе термины «метка» и «домен метки» относятся к части или домену полинуклеотида, демонстрирующему последовательность для желательной предполагаемой цели или применения. Домены метки могут содержать любую последовательность, предусмотренную для любой желаемой цели. В некоторых вариантах осуществления метка содержит одну или более функциональных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из универсальных последовательностей, последовательностей праймера, индексных последовательностей, последовательностей для захвата, последовательностей штрих-кода (используемых, например, для подсчета или коррекции ошибок), последовательностей расщепления, последовательностей, связанных с секвенированием, последовательностей для обогащения и их комбинаций. Например, в некоторых вариантах осуществления домен метки содержит один или более сайтов распознавания рестрикционной эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления домен метки содержит одну или более областей, подходящих для гибридизации с праймером для реакции кластерной амплификации. В некоторых вариантах осуществления домен метки содержит одну или более областей, подходящих для гибридизации с праймером для реакции секвенирования. Следует понимать, что в домен метки может быть включен любой другой подходящий элемент. В некоторых вариантах осуществления домен метки содержит последовательность, имеющую длину от 5 до 200 т. п. н. В некоторых вариантах осуществления домен метки содержит последовательность, имеющую длину от 10 до 100 т. п. н. В некоторых вариантах осуществления домен метки содержит последовательность, имеющую длину от 20 до 50 т. п. н. В некоторых вариантах осуществления домен метки содержит последовательность, имеющую длину от 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 и 200 т. п. н.

[0066] В способах и композициях, представленных в настоящем документе, ферменты CRISPR/Cas9 иммобилизованы на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 иммобилизованы на подложке посредством одного или более полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более полинуклеотидов, таких как первый полинуклеотид, направляют ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом (т. е. условие, направляющее фермент CRISPR/Cas9 для случайной фрагментации или расщепления целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления один или более полинуклеотидов направляют ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой специфичным к последовательности образом, и фрагментации достигают с использованием множества твердых подложек, причем каждая твердая подложка содержит первый комплекс CRISPR/Cas9, содержащий первый полинуклеотид, направляющий фермент CRISPR/Cas9 для связывания с 3'-концом представляющей интерес последовательности в целевой нуклеиновой кислоте, и второй комплекс CRISPR/Cas9, содержащий второй полинуклеотид, направляющий фермент CRISPR/Cas9 для связывания с 5'-концом представляющей интерес последовательности в целевой нуклеиновой кислоте.

[0067] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет комплекс CRISPR/Cas9, можно иммобилизовать непосредственно или с помощью линкерной молекулы, связывающей фермент CRISPR/Cas9 с твердой подложкой.

[0068] Используемый в настоящем документе термин «одноцепочечная гидовая РНК» или «огРНК» относится к одноцепочечной РНК, способной гибридизироваться с целевой последовательностью в представляющей интерес двухцепочечной нуклеиновой кислоте. ОгРНК взаимодействует с ферментом CRISPR/Cas9 и целевой последовательностью (т. е. протоспейсерной последовательностью) таким образом, что она направляет фермент CRISPR/Cas9 к целевой последовательности в месте, где фермент CRISPR/Cas9 расщепляет целевую последовательность.

[0069] В некоторых вариантах осуществления, в которых ферменты CRISPR/Cas9 направлены неспецифичным к последовательности образом, целевая последовательность не имеет ограничения по последовательности, за исключением того, что последовательность примыкает к мотиву, смежному с протоспейсером (PAM). Например, последовательности PAM для белков Cas9 включают, помимо прочего, 5'-NGG, 5'-NGGNG, 5'-NNAGAAW и 5'-ACAY. В некоторых вариантах осуществления, в которых ферменты CRISPR/Cas9 направлены специфичным к последовательности образом, целевая последовательность имеет ограничение по последовательности.

[0070] В некоторых вариантах осуществления огРНК выбирают таким образом, чтобы направлять CRISPR/Cas9 неспецифичным к последовательности образом так, что фермент CRISPR/Cas9 расщепляет нуклеиновую кислоту случайным образом с получением ряда размеров фрагментов.

[0071] В некоторых вариантах осуществления огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов, от 15 до 30 нуклеотидов или 17 или 20 нуклеотидов. Примеры огРНК включают, помимо прочего, короткие рандомеры или последовательности (GC)_n или (AT)_n, где n составляет от 5 до 20, от 8 до 15 или 10. Специалистам в данной области известны конфигурации и строение огРНК, например. инструменты конструирования огРНК доступны в Интернете или из коммерческих источников. ОгРНК может быть синтезирована химическим путем, ферментативным путем или их комбинацией.

[0072] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид является «биотинилированным», а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков. При использовании в настоящем документе термин «биотинилированный» относится к процессу ковалентного присоединения биотина. Биотинсвязывающие белки хорошо известны обычным специалистам в данной области и включают, помимо прочего, авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитела к биотину, рецепторы биотина и биотинсвязывающие ферменты, такие как биотинидаза, синтаза биотин-голокарбоксилазы и т. п.

[0073] В некоторых вариантах осуществления один или более реагентов, снижающих специфичность связывания с нуклеиновой кислотой ферментов, связывающихся с нуклеиновой кислотой, таких как CRISPR/Cas9, могут быть использованы отдельно или в комбинации с огРНК (т. е. другим условием, направляющим фермент CRISPR/Cas9 для случайной фрагментации или расщепления целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления ферменты CRISPR/Cas9 обрабатывают одним или более реагентами для снижения специфичности связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой и индуцируют случайную фрагментацию, когда на твердую подложку, на которой иммобилизованы обработанные ферменты CRISPR/Cas9, наносят целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту. Реагенты, снижающие специфичность связывания, хорошо известны специалисту в данной области. Примеры снижающих специфичность связывания агентов включают, помимо прочего, бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

[0074] В некоторых вариантах осуществления условие, направляющее фермент CRISPR/Cas9 для случайной фрагментации или расщепления целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, может включать, в дополнение или в качестве альтернативы другим условиям, использование высокой концентрации глицерина (например, > 5% об./об.), высокую концентрацию фермента CRISPR/Cas9/мкг ДНК (например, 100 единиц/мкг), неоптимального буфера (например. с неоптимальными ионной силой или pH), длительного времени реакции и/или использования двухвалентных катионов, отличных от Mg²⁺ (например, Mn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺ и/или Zn²⁺).

[0075] Когда речь идет о иммобилизации молекул (например, нуклеиновых кислот) на твердой подложке, термины «иммобилизованный» и «присоединенный» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, и предполагается, что, если прямо или косвенно из контекста не следует иное, оба термина охватывают прямое или опосредованное, ковалентное или нековалентное присоединение. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ковалентное присоединение может являться предпочтительным, но по существу единственное что требуется - чтобы молекулы (например, нуклеиновые кислоты) оставались иммобилизованными на подложке или присоединенными к ней в условиях, в которых предполагается использовать подложку, например в методиках, требующих амплификации и/или секвенирования нуклеиновых кислот.

[0076] В определенных вариантах осуществления изобретения можно использовать твердые подложки, содержащие инертный субстрат или матрикс (например, стеклянные пластины, полимерные гранулы и т. д.), которые были «функционализированы», например, посредством нанесения слоя или покрытия из промежуточного материала, содержащего реакционноспособные группы, которые обеспечивают ковалентное связывание с биомолекулами, такими как полинуклеотиды. Примеры таких подложек включают, помимо прочего, полиакриламидные гидрогели, нанесенные на инертный субстрат, такой как стекло, в частности, полиакриламидные гидрогели, описанные в WO 2005/065814 и US 2008/0280773, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В таких вариантах осуществления биомолекулы (например, полинуклеотиды) могут напрямую ковалентно присоединяться к промежуточному материалу (например, гидрогелю), но промежуточный материал сам по себе может быть нековалентно присоединен к субстрату или матриксу (например, стеклянному субстрату). Термин «ковалентное присоединение к твердой подложке» следует интерпретировать, соответственно, как охватывающий данный тип размещения.

[0077] Термины «твердая поверхность», «твердая подложка» и другие грамматические эквиваленты относятся к любому материалу, подходящему или выполненному с возможностью присоединения ферментов CRISPR/Cas9 и комплексов CRISPR/Cas9. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит микрочастицы, такие как гранулы, структурированную поверхность или лунки. Как будет понятно специалистам в данной области, имеется очень большое количество возможных подложек. Возможные подложки включают, помимо прочего, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, пластмассы (включая акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, тефлон и т. п.), полисахариды, нейлон или нитроцеллюлозу, керамику, смолы, кремнезем или материалы на основе кремнезема, в том числе кремний и модифицированный кремний, углерод, металлы, неорганические стекла, пластмассы, оптоволоконные жгуты, гранулы, парамагнитные гранулы и множество других полимеров. Особенно подходящие твердые подложки и твердые поверхности в некоторых вариантах осуществления изобретения расположены внутри устройства проточной кюветы. Иллюстративные проточные кюветы подробно описаны ниже.

[0078] В некоторых вариантах осуществления твердая подложка имеет структурированную поверхность, подходящую для иммобилизации ферментов CRISPR/Cas9 или комплексов в виде упорядоченной структуры. Термин «структурированная поверхность» относится к расположению разных областей в открытом слое твердой подложки или на нем. Например, одна или более областей могут являться элементами, в которых присутствуют один или более ферментов или комплексов CRISPR/Cas9. Элементы могут быть разделены промежуточными областями, в которых отсутствуют ферменты или комплексы CRISPR/Cas9. В некоторых вариантах осуществления рельеф может иметь координатный формат из x-y элементов, расположенных в строках и столбцах. В некоторых вариантах осуществления рельеф может иметь повторяющееся расположение элементов и/или промежуточных областей. В некоторых вариантах осуществления рельеф может иметь случайное расположение элементов и/или промежуточных областей. В некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 случайным образом распределены на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 распределены по структурированной поверхности. Примеры структурированных поверхностей, которые можно использовать в способах и композициях, описанных в настоящем документе, приведены в заявках на патент США публ. 2012/0316086 A1 или 2013/0116153 A1, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки.

[0079] В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит матрицу из лунок или углублений на поверхности. Такую подложку можно изготовить с использованием различных методик, известных в данной области, в том числе, без ограничений, фотолитографии, методик штамповки, методик литья и методик микротравления. Специалистам в данной области будет понятно, что методика зависит от состава и формы субстрата матрицы.

[0080] Состав и геометрия твердой подложки могут варьироваться в зависимости от ее применения. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой плоскую структуру, такую как предметное стекло, чип, микрочип и/или матрица. Таким образом, поверхность подложки может иметь форму плоского слоя. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит одну или более поверхностей проточной кюветы. В настоящем документе термин «проточная кювета» относится к камере, содержащей твердую поверхность, через которую могут протекать один или более жидких реагентов. Примеры проточных кювет и связанных с ними систем для работы с жидкостями и платформ для обнаружения, которые можно легко использовать в способах настоящего изобретения, описаны, например, в публикациях Bentley и соавт., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281 и US 2008/0108082, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки.

[0081] В некоторых вариантах осуществления твердая подложка или ее поверхность являются неплоской, например, внутренней или наружной поверхностью трубки или резервуара. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит микросферы или гранулы. Под «микросферами», или «гранулами», или «частицами», или грамматическими эквивалентами в настоящем документе понимают дискретные частицы малого размера. Подходящие композиции на основе гранул включают, помимо прочего, пластмассы, керамику, стекло, полистирол, метилстирол, акриловые полимеры, парамагнитные материалы, золь тория, углерод в форме графита, диоксид титана, латекс или поперечносшитые декстраны, такие как сефароза, целлюлоза, нейлон, поперечносшитые мицеллы и тефлон, а также любые другие материалы, описанные в настоящем документе применительно к твердым подложкам, которые могу быть использованы. «Microsphere Detection Guide» (Руководство по обнаружению микросфер) от компании Bangs Laboratories является полезным руководством. В определенных вариантах осуществления микросферы представляют собой магнитные микросферы или гранулы.

[0082] Гранулы необязательно должны быть сферическими; могут быть использованы частицы нерегулярной формы. В качестве альтернативы или дополнительно гранулы могут быть пористыми. Размеры гранул варьируются от нанометров, т.е. 100 нм, до миллиметров, т.е. 1 мм, предпочтительно от 0,2 микрон до 200 микрон и особенно предпочтительно от 0,5 до 5 микрон, несмотря на то, что в некоторых вариантах осуществления можно применять гранулы меньшего или большего размера.

[0083] На Фиг. 1 в целом представлен способ в соответствии с одним вариантом осуществления. Комплексы CRISPR/Cas9 иммобилизованы на поверхности. Комплексы CRISPR/Cas9 имеют фермент CRISPR/Cas9 (Cas9) и биотинилированный полинуклеотид, содержащий 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК). Целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту наносят на твердую подложку, случайным образом фрагментируют комплексами CRISPR/Cas9, и двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты связываются с комплексами CRISPR/Cas9, иммобилизованными на поверхности. Размер фрагмента нуклеиновой кислоты зависит от расстояния между иммобилизованными на поверхности ферментами CRISPR/Cas9. В качестве примера, в некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵, или по меньшей мере 10⁶ комплексов на мм².

[0084] При нанесении целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку ферменты CRISPR/Cas9 будут фрагментировать целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, таким образом создавая фрагментированные случайным образом двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты, присоединенные на обоих концах к поверхности твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления длина двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты может быть изменена с помощью изменения плотности ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 на поверхности. В некоторых вариантах осуществления длины двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты в иммобилизованной библиотеке пропорциональны плотности ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 на твердой подложке. В определенных вариантах осуществления длина полученных двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты составляет менее чем 100 т. п. н., 200 т. п. н., 300 т. п. н., 400 т. п. н., 500 т. п. н., 600 т. п. н., 700 т. п. н., 800 т. п. н., 900 т. п. н., 1000 т. п. н., 1100 т. п. н., 1200 т. п. н., 1300 т. п. н., 1400 т. п. н., 1500 т. п. н., 1600 т. п. н., 1700 т. п. н., 1800 т. п. н., 1900 т. п. н., 2000 т. п. н., 2100 т. п. н., 2200 т. п. н., 2300 т. п. н., 2400 т. п. н., 2500 т. п. н., 2600 т. п. н., 2700 т. п. н., 2800 т. п. н., 2900 т. п. н., 3000 т. п. н., 3100 т. п. н., 3200 т. п. н., 3300 т. п. н., 3400 т. п. н., 3500 т. п. н., 3600 т. п. н., 3700 т. п. н., 3800 т. п. н., 3900 т. п. н., 4000 т. п. н., 4100 т. п. н., 4200 т. п. н., 4300 т. п. н., 4400 т. п. н., 4500 т. п. н., 4600 т. п. н., 4700 т. п. н., 4800 т. п. н., 4900 т. п. н., 5000 т. п. н., 10 000 т. п. н., 30 000 т. п. н. или менее чем 100 000 т. п. н. В таких вариантах осуществления двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты могут быть затем амплифицированы в кластеры с использованием стандартной химии кластеров, как показано, например, в описании патентов США №№ 7,985,565 и 7,115,400, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0085] В некоторых вариантах осуществления длина матриц превышает длину матриц, которую можно надлежащим образом амплифицировать с использованием стандартной химии кластеров. Например в некоторых вариантах осуществления длина матриц превышает 100 т. п. н., 200 т. п. н., 300 т. п. н., 400 т. п. н., 500 т. п. н., 600 т. п. н., 700 т. п. н., 800 т. п. н., 900 т. п. н., 1000 т. п. н., 1100 т. п. н., 1200 т. п. н., 1300 т. п. н., 1400 т. п. н., 1500 т. п. н., 1600 т. п. н., 1700 т. п. н., 1800 т. п. н., 1900 т. п. н., 2000 т. п. н., 2100 т. п. н., 2200 т. п. н., 2300 т. п. н., 2400 т. п. н., 2500 т. п. н., 2600 т. п. н., 2700 т. п. н., 2800 т. п. н., 2900 т. п. н., 3000 т. п. н., 3100 т. п. н., 3200 т. п. н., 3300 т. п. н., 3400 т. п. н., 3500 т. п. н., 3600 т. п. н., 3700 т. п. н., 3800 т. п. н., 3900 т. п. н., 4000 т. п. н., 4100 т. п. н., 4200 т. п. н., 4300 т. п. н., 4400 т. п. н., 4500 т. п. н., 4600 т. п. н., 4700 т. п. н., 4800 т. п. н., 4900 т. п. н., 5000 т. п. н., 10 000 т. п. н., 30 000 т. п. н.или более чем 100 000 т. п. н. В конкретных вариантах осуществления длина матрицы может находиться в диапазоне, определяемом верхним и нижним пределами, выбранными из примеров, приведенных выше.

[0086] В определенных вариантах осуществления перед генерацией кластера можно получить изображения двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, иммобилизованных на поверхности твердой подложки. Например, интеркалирующий краситель можно нанести по меньшей мере на часть иммобилизованной библиотеки двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты с получением набора окрашенных иммобилизованных фрагментов, которые можно визуализировать для сохранения записи положения остова молекулы нуклеиновой кислоты на поверхности. После генерации и секвенирования кластеров координаты кластеров могут быть соотнесены с их положением в исходной основной цепи, что способствует выравниванию прочтений молекулы и сборке генома.

[0087] В некоторых вариантах осуществления этап нанесения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает добавление биологического образца на твердую подложку. Биологический образец может представлять собой любой тип, который содержит нуклеиновую кислоту и который может быть нанесен на твердую поверхность для фрагментации. Например, целевая нуклеиновая кислота может находиться в различных состояниях очистки, включая очищенную нуклеиновую кислоту. Однако образец не обязательно должен быть полностью очищен и может содержать, например, нуклеиновую кислоту, смешанную с белком, другими видами нуклеиновых кислот, другими клеточными компонентами и/или любым другим загрязняющим веществом. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит смесь ДНК, белка, других видов нуклеиновых кислот, других клеточных компонентов и/или любого другого загрязняющего вещества, приблизительно в той же пропорции, что и in vivo. Например, в некоторых вариантах осуществления компоненты находятся в той же пропорции, что и в интактной клетке. В некоторых вариантах осуществления соотношение 260/280 биологического образца составляет менее 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7 или менее 0,60. В некоторых вариантах осуществления соотношение 260/280 биологического образца составляет по меньшей мере 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7 или по меньшей мере 0,60. Поскольку предложенные в настоящем документе способы позволяют связывать нуклеиновую кислоту с твердой подложкой, другие несвязанные нуклеиновые кислоты или другие загрязняющие вещества могут быть удалены посредством промывки твердой подложки после осуществления фрагментации связанных с поверхностью молекул. Биологический образец может содержать, например, неочищенный клеточный лизат или цельные клетки. Например, неочищенный клеточный лизат, нанесенный на твердую подложку посредством способа, описанного в настоящем документе, необязательно необходимо подвергнуть одной или более стадиям разделения, которые традиционно применяют для выделения нуклеиновых кислот из других клеточных компонентов. Примеры стадий разделения представлены в публикации Maniatis и соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, и Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, и соавт., включенные в настоящий документ путем ссылки.

[0088] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления биологический образец может содержать например, кровь, плазму, сыворотку крови, лимфу, слизь, мокроту, мочу, сперму, спинномозговую жидкость, бронхиальный аспират, фекалии и мацерированную ткань или их лизат, или любой другой биологический препарат, содержащий нуклеиновую кислоту. Одним из преимуществ способов и композиций, представленных в настоящем документе, является то, что биологический образец может быть добавлен в проточную кювету и последующие этапы лизиса и очистки могут происходить в проточной кювете без дополнительных этапов переноса или обработки, просто с помощью добавления необходимых реагентов в проточную кювету.

[0089] В настоящем документе также представлены твердые подложки, имеющие библиотеку иммобилизованных на них фрагментов нуклеиновой кислоты, полученных в соответствии с вышеописанными способами.

II. Физические карты иммобилизованных полинуклеотидных молекул

[0090] В настоящем документе также представлены способы построения физической карты иммобилизованных полинуклеотидов. Способы могут быть преимущественно использованы для идентификации кластеров, которые могут содержать связанные последовательности (т. е. первую и вторую части одной и той же целевой полинуклеотидной молекулы). Таким образом, относительная близость любых двух кластеров, полученных из иммобилизованного полинуклеотида, предоставляет информацию, подходящую для выравнивания информации о последовательностях, полученной от двух кластеров. В частности, расстояние между любыми двумя конкретными кластерами на твердой поверхности положительно согласуется с вероятностью того, что два кластера происходят от одной и той же целевой полинуклеотидной молекулы, как более подробно описано в материалах WO 2012/025250, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

[0091] Например, в некоторых вариантах осуществления длинные молекулы дцДНК, протягивающиеся по поверхности проточной кюветы, фрагментируются in situ, что приводит к образованию линии соединенных мостиков дцДНК по поверхности проточной кюветы. Далее можно создать физическую карту иммобилизованной ДНК. Таким образом, физическая карта соотносится с физической взаимозависимостью кластеров после амплификации иммобилизованной ДНК. В частности, физическую карту используют для расчета вероятности того, что данные последовательности, полученные из любых двух кластеров, связаны, как описано во включенных материалах WO 2012/025250.

[0092] В некоторых вариантах осуществления физическую карту создают посредством визуализации нуклеиновой кислоты для установления положения иммобилизованных молекул нуклеиновой кислоты на твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления иммобилизованную нуклеиновую кислоту визуализируют путем добавления визуализирующего агента к твердой подложке и обнаружения сигнала от визуализирующего агента. В некоторых вариантах осуществления антитело может представляет собой обнаруживаемую метку. Подходящие обнаруживаемые метки включают, помимо прочего, протоны, гаптены, радионуклиды, ферменты, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки и/или хромогенные агенты. Например, в некоторых вариантах осуществления визуализирующий агент представляет собой интеркалирующий краситель или неинтеркалирующий агент, связывающий нуклеиновую кислоту. Можно использовать любой подходящий интеркалирующий краситель или неинтеркалирующий агент, связывающий нуклеиновую кислоту, известные в данной области, включая, помимо прочего, описанные в патенте США № 2012/0282617, содержание которого полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0093] В некоторых вариантах осуществления иммобилизованные двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты перед генерацией кластера дополнительно фрагментируют для высвобождения свободного конца. Расщепляющие мостиковые структуры могут быть выполнены с использованием любой подходящей методики, известной в данной области техники, пример которой приведен во включенных в настоящий документ материалах WO 2012/025250. Например, расщепление может происходить посредством встраивания модифицированного нуклеотида, такого как урацил, как описано в WO 2012/025250, посредством встраивания рестрикционного эндонуклеазного сайта или посредством нанесения ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 на мостиковые структуры нуклеиновых кислот в жидкой фазе, как описано в других разделах настоящего документа.

[0094] В определенных вариантах осуществления множество целевых молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты наливают в проточную кювету, содержащую множество наноканалов, причем наноканал имеет множество иммобилизованных на нем ферментов или комплексов CRISPR/Cas9. Используемый в настоящем документе термин «наноканал» относится к узкому каналу, в который втекает длинная линейная молекула нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или не более чем 1000 отдельных длинных цепей целевой нуклеиновой кислоты втекают в каждый наноканал. В некоторых вариантах осуществления отдельные наноканалы разделены физическим барьером, который предотвращает взаимодействие отдельных длинных цепей целевой нуклеиновой кислоты со множеством наноканалов. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка содержит по меньшей мере 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 3000, 5000, 10 000, 30 000, 50 000, 80 000 или по меньшей мере 100 000 наноканалов. В некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 связываются с поверхностью наноканального фрагмента нуклеиновой кислоты. Затем может выполнено картрирование непрерывности, например, отслеживая кластеры вниз по длине одного из этих каналов. В некоторых вариантах осуществления длинная цепь целевой нуклеиновой кислоты может составлять по меньшей мере 0,1 т. п. н., 1 т. п. н., 2 т. п. н., 3 т. п. н., 4 т. п. н., 5 т. п. н., 6 т. п. н., 7 т. п. н., 8 т. п. н., 9 т. п. н., 10 т. п. н., 15 т. п. н., 20 т. п. н., 25 т. п. н., 30 т. п. н., 35 т. п. н., 40 т. п. н., 45 т. п. н., 50 т. п. н., 55 т. п. н., 60 т. п. н., 65 т. п. н., 70 т. п. н., 75 т. п. н., 80 т. п. н., 85 т. п. н., 90 т. п. н., 95 т. п. н., 100 т. п. н., 150 т. п. н., 200 т. п. н., 250 т. п. н., 300 т. п. н., 350 т. п. н., 400 т. п. н., 450 т. п. н., 500 т. п. н., 550 т. п. н., 600 т. п. н., 650 т. п. н., 700 т. п. н., 750 т. п. н., 800 т. п. н., 850 т. п. н., 900 т. п. н., 950 т. п. н., 1000 т. п. н., 5000 т. п. н., 10 000 т. п. н., 20 000 т. п. н., 30 000 т. п. н. или по меньшей мере 50 000 т. п. н. В некоторых вариантах осуществления длинная цепь целевой нуклеиновой кислоты составляет не более чем 0,1 т. п. н., 1 т. п. н., 2 т. п. н., 3 т. п. н., 4 т. п. н., 5 т. п. н., 6 т. п. н., 7 т. п. н., 8 т. п. н., 9 т. п. н., 10 т. п. н., 15 т. п. н., 20 т. п. н., 25 т. п. н., 30 т. п. н., 35 т. п. н., 40 т. п. н., 45 т. п. н., 50 т. п. н., 55 т. п. н., 60 т. п. н., 65 т. п. н., 70 т. п. н., 75 т. п. н., 80 т. п. н., 85 т. п. н., 90 т. п. н., 95 т. п. н., 100 т. п. н., 150 т. п. н., 200 т. п. н., 250 т. п. н., 300 т. п. н., 350 т. п. н., 400 т. п. н., 450 т. п. н., 500 т. п. н., 550 т. п. н., 600 т. п. н., 650 т. п. н., 700 т. п. н., 750 т. п. н., 800 т. п. н., 850 т. п. н., 900 т. п. н., 950 т. п. н. или не более 1000 т. п. н. В качестве примера проточную кювету, имеющую 1000 или более наноканалов с картированными иммобилизированными продуктами фрагментации, можно использовать для секвенирования генома организма с помощью коротких «позиционированных» прочтений. В некоторых вариантах осуществления картрированные иммобилизованные продукты фрагментации в наноканалах могут быть использованы для разделения гаплотипов. В некоторых вариантах осуществления картированные иммобилизованные продукты фрагментации в наноканалах могут быть использованы для решения проблем фазирования.

III. Амплификация и секвенирование иммобилизованных фрагментов нуклеиновых кислот

[0095] Амплификация. Настоящее описание дополнительно относится к амплификации иммобилизованных фрагментов нуклеиновых кислот, полученных в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе. Иммобилизованные фрагменты нуклеиновых кислот, полученные путем связанной с поверхностью фрагментации под действием фермента CRISPR/Cas9, могут быть амплифицированы в соответствии с любой подходящей методикой амплификации, известной в данной области. В некоторых вариантах осуществления иммобилизованные фрагменты ДНК амплифицируют на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой ту же твердую подложку, на которой происходит связанная с поверхностью фрагментация. В таких вариантах осуществления предложенные в настоящем документе способы и композиции позволяют производить подготовку образца на той же твердой подложке, что и на этапе введения первоначального образца, с помощью амплификации и необязательно с помощью этапа секвенирования.

[0096] Например, в некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты амплифицируют с использованием методологий кластерной амплификации, представленных в описаниях патентов США № 7,985,565 и 7,115,400, содержание которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Включенные материалы патентов США № 7,985,565 и 7,115,400 описывают способы амплификации нуклеиновых кислот, обеспечивающие иммобилизацию продуктов амплификации на твердой подложке для формирования матриц, состоящих из кластеров или «колоний» иммобилизованных молекул нуклеиновых кислот. Каждый кластер или колония на такой матрице формируется из множества идентичных иммобилизованных полинуклеотидных цепей и множества идентичных иммобилизованных комплементарных полинуклеотидных цепей. Сформированные таким образом матрицы в настоящем документе по существу называют «кластерными матрицами». Продукты реакций твердофазной амплификации, такие как описанные в патентах США № 7,985,565 и 7,115,400, представляют собой так называемые «мостиковые» структуры, образованные путем отжига пар иммобилизованных полинуклеотидных цепей и иммобилизованных комплементарных цепей, причем обе цепи иммобилизованы на твердой подложке на 5′-конце, предпочтительно посредством ковалентного присоединения. Методологии кластерной амплификации представляют собой примеры способов, в которых для получения иммобилизованных ампликонов используют матрицу иммобилизованных нуклеиновых кислот. Для получения иммобилизованных ампликонов из иммобилизованных фрагментов нуклеиновой кислоты, полученных в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе, также можно использовать другие приемлемые методологии. Например, посредством твердофазной ПЦР можно сформировать один или более кластеров или колоний, где иммобилизованы один или оба праймера каждой пары праймеров для амплификации.

[0097] В других вариантах осуществления иммобилизованные фрагменты нуклеиновых кислот амплифицируют в растворе. Например, в некоторых вариантах осуществления иммобилизованные фрагменты нуклеиновых кислот отщепляют или иным образом высвобождают от твердой подложки, после чего праймеры для амплификации гибридизируют в растворе с высвобождаемыми молекулами. В других вариантах осуществления праймеры для амплификации гибридизируют с иммобилизованными фрагментами нуклеиновых кислот для одного или более первоначальных этапов амплификации, за которыми следуют последующие этапы амплификации в растворе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для получения ампликонов в жидкой фазе может быть использована иммобилизованная матрица нуклеиновой кислоты.

[0098] Следует понимать, что для амплификации фрагментов нуклеиновых кислот можно использовать любую из методологий амплификации, описанную в настоящем документе или по существу известных в данной области, с универсальными или специфичными для мишени праймерами. Подходящие способы амплификации включают, помимо прочего, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию с замещением цепей (SDA), транскрипционно опосредованную амплификацию (ТМА) и амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), как описано в патенте США № 8,003,354, содержание которого полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Вышеуказанные способы амплификации можно использовать для амплификации одной или более интересующих нуклеиновых кислот. Например, для амплификации иммобилизованных фрагментов нуклеиновых кислот можно использовать ПЦР, включая мультиплексную ПЦР, SDA, ТМА, NASBA и т. п. В некоторых вариантах осуществления в реакцию амплификации включены праймеры, специфично нацеленные на интересующую нуклеиновую кислоту.

[0099] Другие подходящие способы амплификации нуклеиновых кислот могут включать удлинение и лигирование олигонуклеотидов, амплификацию по типу катящегося кольца (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998), который включен в настоящий документ путем ссылки) и технологии метода лигирования олигонуклеотидных зондов (OLA) (см. в основном патенты США № 7,582,420, 5,185,243, 5,679,524 и 5,573,907; EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439 182 B1; WO 90/01069 WO 89/12696 и WO 89/09835, все из которых включены в настоящий документ путем ссылки). Следует понимать, что данные методологии амплификации могут быть выполнены с возможностью амплификации иммобилизованных фрагментов нуклеиновых кислот. Например, в некоторых вариантах осуществления способ амплификации может включать реакции амплификации с лигирующим зондом или метода лигирования олигонуклеотидных зондов (OLA), которые включают праймеры, конкретно нацеленные на интересующую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления способ амплификации может включать в себя реакцию удлинения праймеров - лигирования, которая содержит праймеры, напрямую нацеленные на интересующую нуклеиновую кислоту. В качестве не имеющего ограничительного характера примера праймеров для удлинения и лигирования, которые могут быть специально выполнены с возможностью амплификации интересующей нуклеиновой кислоты, амплификация может включать праймеры, используемые для анализа GoldenGate (Illumina, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния, США), как показано в патентах США № 7,582,420 и 7,611,869, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0100] Примеры способов изотермической амплификации, которые могут быть использованы в способе настоящего изобретения, включают в себя, помимо прочего, амплификацию с множественным вытеснением (MDA), пример которой приведен в публикации Dean и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002), или амплификацию нуклеиновых кислот с изотермическим замещением цепей, пример которой приведен в патенте США № 6,214,587, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Другие способы, не основанные на ПЦР, которые можно использовать в настоящем описании, включают, например, амплификацию с замещением цепей (SDA), описанную, например, в Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; патентах США №№ 5,455,166 и 5,130,238 и публикации Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992), или амплификацию с замещением гиперразветвленных цепей, описанную, например, в Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003), каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Например, для амплификации геномной ДНК со случайным праймером можно применять способы изотермической амплификации с полимеразой Phi 29, которая замещает цепи, или крупным фрагментом ДНК-полимеразы Bst, 5′-> 3′ экзо-. Полимеразы позволяют использовать преимущества, которые дает их высокая процессивность и активность по замещению цепей. Высокая процессивность позволяет полимеразам производить фрагменты длиной 10-20 тыс. п. н. Как указано выше, более мелкие фрагменты могут быть получены в изотермических условиях с использованием полимераз, обладающих низкой процессивностью и активностью замещения цепей, например полимеразы Кленова. Дополнительное описание реакций, условий и компонентов амплификации подробно изложено в описании патента США № 7,670,810, содержание которого полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0101] Другим способом амплификации нуклеиновых кислот, используемым в настоящем описании, является ПЦР с мечением, в которой используют популяцию двухдоменных праймеров, имеющих константную область 5′-области, за которой следует случайная 3′-область, как описано, например, в публикации Grothues, и соавт. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993), которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. Первые циклы амплификации выполняют для обеспечения множества инициаций на денатурированной нагреванием нуклеиновой кислоте на основе индивидуальной гибридизации со случайно синтезированной 3’-областью. Вследствие характера 3’-области предполагается, что сайты инициации случайно распределены по всему геному. После этого несвязанные праймеры можно удалять и проводить дальнейшую репликацию с использованием праймеров, комплементарных константной 5′-области.

[0102] Секвенирование. Настоящее описание дополнительно относится к секвенированию иммобилизованных фрагментированных случайным образом фрагментов двухцепочечных нуклеиновых кислот, полученных в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе. Иммобилизованные двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты, полученные в результате связанной с поверхностью фрагментации под действием фермента CRISPR/Cas9, могут быть секвенированы в соответствии с любой подходящей методикой секвенирования, такой как прямое секвенирование, включая секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования, секвенирование путем гибридизации, секвенирование через нанопоры и т. п. В некоторых вариантах осуществления иммобилизованные фрагменты нуклеиновой кислоты секвенируют на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка для секвенирования представляет собой ту же твердую подложку, на которой происходит связанная с поверхностью фрагментация. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка для секвенирования представляет собой ту же твердую подложку, на которой происходит амплификация. В некоторых вариантах осуществления первую твердую подложку используют для фрагментации, а вторую твердую подложку используют для амплификации и секвенирования.

[0103] Одной из предпочтительных методик секвенирования является секвенирование путем синтеза (SBS). При SBS отслеживают удлинение праймера нуклеиновой кислоты вдоль матрицы нуклеиновой кислоты (например, целевой нуклеиновой кислоты или ее ампликона) для определения последовательности нуклеотидов в матрице. Лежащим в основе химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой). В конкретном варианте осуществления SBS на основе полимеразы к праймеру добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды (посредством чего праймер удлиняется) зависимым от матрицы образом, так чтобы для определения последовательности матрицы можно было использовать обнаружение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру.

[0104] Проточные кюветы обеспечивают удобную твердую подложку для размещения амплифицированных фрагментов нуклеиновых кислот, полученных способами по настоящему описанию. Один или более амплифицированных фрагментов нуклеиновых кислот могут быть подвергнуты воздействию SBS или другой методики обнаружения, которая включает повторную доставку реагентов по циклам. Например, для запуска первого цикла SBS, может быть обеспечено протекание одного или более меченых нуклеотидов, нуклеиновой кислоты или ДНК-полимеразы и т. д. в проточную кювету (или через нее), содержащую одну или более амплифицированных молекул нуклеиновой кислоты. Можно выявлять те сайты, где удлинение праймера приводит к встраиванию меченого нуклеотида. Нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое завершает дополнительное удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру. Например, в праймер можно добавлять нуклеотидный аналог, имеющий фрагмент обратимого терминатора, так чтобы последующее удлинение не могло происходить до тех пор, пока не будет доставлен блокирующий агент для удаления фрагмента. Таким образом, для вариантов осуществления с обратимой терминацией в проточную кювету можно подавать разблокирующий реагент (до или после обнаружения). В промежутке между различными стадиями доставки можно проводить промывки. Затем цикл можно повторять n раз для удлинения праймера на n нуклеотидов, тем самым устанавливая последовательность длиной n. Примерные процедуры SBS, жидкостные системы и платформы обнаружения, которые можно без особенных усилий адаптировать для использования с ампликонами, полученными способами настоящего описания, приведены, например, в Bentley и соавт., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281 и US 2008/0108082, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки.

[0105] Можно использовать и другие процедуры секвенирования, в которых применяют циклические реакции, например пиросеквенирование. В ходе пиросеквенирования обнаруживают высвобождение неорганического пирофосфата (PPi) по мере включения конкретных нуклеотидов в растущую цепь нуклеиновой кислоты (Ronaghi, и соавт., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi и соавт. Science 281(5375), 363 (1998); US 6,210,891; № 6,258,568 и US. 6,274,320, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки. В процессе пиросеквенирования высвобождающийся PPi может обнаруживать при его немедленном превращении в аденозинтрифосфат (АТФ) под действием АТФ-сульфурилазы, а уровень образующегося АТФ можно обнаруживать по фотонам, испускаемым люциферазой. Таким образом, реакцию секвенирования можно отслеживать с помощью системы обнаружения люминесценции. Для процедур пиросеквенирования нет необходимости использовать источники возбуждающего излучения, применяемые в системах обнаружения флуоресценции. Подходящие жидкостные системы, детекторы и процедуры, которые могут быть адаптированы для применения пиросеквенирования к ампликонам, полученным в соответствии с настоящим описанием, приведены, например, в заявке на патент WIPO № PCT/US11/57111, US 2005/0191698 A1, патенте США № 7,595,883 и патенте США № 7,244,559, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0106] В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы способы, включающие мониторинг активности нуклеиновой кислоты или ДНК-полимеразы в реальном времени. Например, включение нуклеотидов может быть обнаружено за счет взаимодействий по механизму резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между содержащей флуорофор полимеразой и нуклеотидами с γ-фосфатной меткой или с помощью волноводов с нулевой модой (ZMW). Методики и реагенты для секвенирования на основе FRET описаны, например, в публикации Levene и соавт. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist и соавт. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach и соавт. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки.

[0107] Некоторые варианты осуществления SBS включают в себя обнаружение протона, высвобождаемого при встраивании нуклеотида в продукт удлинения. Например, при секвенировании на основе обнаружения высвобожденных протонов может быть использован электрический детектор и связанные с ним методики, которые коммерчески доступны в линейке продуктов Ion Torrent от компании Thermo Fisher Scientific, или способы и системы секвенирования, описанные в публикациях US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; US 2010/0282617 A1, каждая из которых включен в настоящий документ путем ссылки. Описанные в настоящем документе способы амплификации целевых нуклеиновых кислот с использованием кинетического исключения могут быть легко применены к субстратам, используемым для обнаружения протонов. Более конкретно, способы, изложенные в настоящем документе, можно использовать для получения клональных популяций ампликонов, используемых для обнаружения протонов.

[0108] Другой методикой секвенирования является секвенирование через нанопоры (см., например, Deamer и соавт. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer и соавт. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li и соавт. Nat. Mater. 2:611-615 (2003), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки). В некоторых вариантах осуществления с нанопорами целевая нуклеиновая кислота или отдельные нуклеотиды удаляются при прохождении целевой нуклеиновой кислоты через нанопору. По мере прохождения нуклеиновой кислоты или нуклеотида через нанопору каждый тип нуклеотида может быть идентифицирован по результатам измерения колебаний электрической проводимости поры (патент США № 7,001,792; Soni и соавт. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft и соавт. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки).

[0109] Примеры способов экспрессии на основе матрицы и анализа генотипированием, которые можно применять для обнаружения в соответствии с настоящим описанием, описаны в патенте США № 7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 или 6,355,431 или патентной публикации США № 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 или US 2005/0181440 A1, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0110] Преимущество способов, описанных в настоящем документе, заключается в том, что они обеспечивают быстрое и эффективное обнаружение множества нуклеиновых кислот параллельно. Соответственно, в настоящем описании предложены интегрированные системы, способные подготавливать и обнаруживать нуклеиновые кислоты с использованием методик, известных в данной области, например, как в примерах, приведенных выше. Таким образом, интегрированная система по настоящему изобретению может включать компоненты для работы с жидкостями, способные доставлять реагенты для амплификации и/или реагенты для секвенирования к одному или более иммобилизованным фрагментам ДНК, причем система содержит такие компоненты, как насосы, клапаны, резервуары, магистрали для жидкости и т. п. Проточная кювета может быть выполнена и/или использована в интегрированной системе для обнаружения целевых нуклеиновых кислот. Примеры проточных кювет описаны, например, в US 2010/0111768 А1 и US сер. № 13/273,666; каждый из этих документов включен в настоящий документ путем ссылки. Как показано в примере проточных кювет, один или более компонентов для работы с жидкостями интегрированной системы можно использовать для способа амплификации и для способа обнаружения. Если взять в качестве примера вариант осуществления секвенирования нуклеиновых кислот, то один или более компонентов для работы с жидкостями интегрированной системы можно использовать для способа амплификации, описанного в настоящем документе, и для доставки реагентов для секвенирования в способе секвенирования, таком как описанный в примерах выше. В альтернативном варианте интегрированная система может включать отдельные системы для работы с жидкостями для реализации способов амплификации и для реализации способов обнаружения. Примеры интегрированных систем секвенирования, способных создавать амплифицированные нуклеиновые кислоты и также определять последовательность нуклеиновых кислот, включают, помимо прочего, платформу MiSeq^TM (компания Illumina, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния, США) и устройства, описанные в патенте США сер. № 13/273,666, содержание которого включено в настоящий документ путем ссылки.

IV. Твердые подложки с иммобилизованными комплексами CRISPR/Cas9 и способы получения

[0111] Другие варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают твердые подложки, такие как гранулы, на которых иммобилизованы ферменты CRISPR/Cas9. В определенных вариантах осуществления твердые подложки имеют иммобилизованные на них комплексы CRISPR/Cas9, которые содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом. В определенных других вариантах осуществления твердые подложки имеют иммобилизованные на них комплексы CRISPR/Cas9, которые содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой специфичным к последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления разные твердые подложки направляют ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой с разными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления первый фермент CRISPR/Cas9 на твердой подложке связан с первым полинуклеотидом, который направляет первый фермент CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой 3’ представляющей интерес последовательности, а второй фермент CRISPR/Cas9 на твердой подложке связан со вторым полинуклеотидом, который направляет второй фермент CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой 5’ представляющей интерес последовательности. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом (или специфичным к последовательности образом во множестве твердых подложек, нацеленных на разные последовательности, при этом каждая твердая подложка необязательно содержит пару фланкирующих областей огРНК, нацеленных на огРНК, вокруг интересующей последовательности). В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков. Плотность этих связанных с поверхностью ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 может варьироваться. Например, в некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵ или по меньшей мере 10⁶ ферментов или комплексов на мм².

V. Фрагментация с использованием микрочастиц CRISPR/Cas9

[0112] Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой множество микрочастиц (например, гранул), имеющих иммобилизованные на них ферменты или комплексы CRISPR/Cas9. Применение твердой подложки, такой как гранулы, может обеспечить несколько преимуществ по сравнению с фрагментацией на основе раствора. Например, при стандартной фрагментации на основе раствора сложно контролировать конечный размер фрагмента реакции фрагментации. Размер фрагмента зависит от отношения CRISPR/Cas9s к количеству и размеру нуклеиновой кислоты и продолжительности реакции. Даже при контроле этих параметров обычно требуется фракционирование с выбором размеров в качестве дополнительного этапа для удаления лишних мелких фрагментов, которые короче длины объединенных парных прочтений. Способы, предложенные в настоящем документе, позволяют избежать этих недостатков. В частности, иммобилизованные на гранулах ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 позволяют отбирать конечный размер фрагмента в зависимости от пространственного разделения связанных ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 независимо от количества гранул CRISPR/Cas9, добавленных в реакцию фрагментации. Дополнительным ограничением фрагментации на основе раствора является то, что, как правило, необходимо выполнить некоторую форму очистки продуктов реакции фрагментации как до, так и после ПЦР-амплификации. Для этого, как правило, требуется некоторый перенос реакций из пробирки в пробирку. Напротив, продукты фрагментации на гранулах на основе CRISPR/Cas9s можно промывать, а затем высвобождать для амплификации или другой последующей обработки, тем самым избегая необходимости в переносе образца. Например, в вариантах осуществления, в которых ферменты или комплексы CRISPR/Cas9s собирают на парамагнитных гранулах, очистку продуктов реакции фрагментации можно легко выполнять путем иммобилизации гранул с помощью магнитов и промывки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фрагментацию и другую дальнейшую обработку, такую как ПЦР-амплификация, можно выполнять в одной пробирке, сосуде, капле или другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления фрагментация и последующая обработка образцов происходят на капельном микрофлюидном устройстве, как описано в публикации США № 2013/0116128, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Например, в капельном микрофлюидном устройстве, капля, содержащая целевую нуклеиновую кислоту, промывочный буфер или другие реагенты, может проходить по поверхности, содержащей иммобилизованные ферменты или комплексы CRISPR/Cas9. Аналогичным образом, каплю, содержащую гранулы, имеющие иммобилизованные на них ферменты или комплексы CRISPR/Cas9s, можно приводить в контакт с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой, промывочным буфером или другими реагентами в капельном микрофлюидном устройстве.

[0113] При добавлении гранул CRISPR/Cas9 к раствору целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты в буфере для фрагментации происходит случайная фрагментация, связывая целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту с поверхностью гранул. Получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0114] В некоторых вариантах осуществления длина мостиковых фрагментов может быть обусловлена плотностью ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 на поверхности гранулы. После завершения фрагментации двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты могут быть высвобождены с поверхности гранулы любым подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления продукты фрагментации высвобождаются из гранул с помощью способа амплификации, такого как ПЦР супрессии, ПЦР «с выходом наружу» и т. п. В некоторых вариантах осуществления продукты фрагментации высвобождаются из гранул путем расщепления. Расщепление может быть, например, химическим, ферментативным, фотохимическим или их комбинацией. Следует понимать, что в предложенных в настоящем документе способах может быть использован любой подходящий способ высвобождения одного или более продуктов фрагментации с твердой подложки.

[0115] Нуклеиновые кислоты могут эффективно контактировать со связанными с поверхностью ферментами или комплексами CRISPR/Cas9 с использованием любого подходящего способа для повышения вероятности контакта. Например, в некоторых вариантах осуществления осаждение нуклеиновой кислоты на твердую поверхность может быть использовано для увеличения контакта между целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой и ферментами или комплексами CRISPR/Cas9 на твердой поверхности. Можно использовать любой из ряда известных в данной области способов для осуществления контакта нуклеиновых кислот с твердой подложкой, пример которого приведен в описании публикации WO 2010/115122, которое полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Как будет понятно специалисту в данной области, нуклеиновую кислоту можно осаждать на твердую подложку путем добавления ПЭГ, этанола или любого из множества других агентов, известных своей способностью осаждать нуклеиновую кислоту на поверхности, включая, например, любой из ряда буферов, используемых в технологии обратимой иммобилизации на твердой фазе (SPRI).

[0116] В некоторых вариантах осуществления множество гранул, несущих иммобилизованные ферменты или комплексы CRISPR/Cas9, можно смешивать с избытком гранул, не несущих ферменты, комплексы CRISPR/Cas9s или олигонуклеотиды для CRISPR/Cas9s, таким образом снижая вероятность фрагментации на двух или более различных гранулах. Другой способ снижения вероятности фрагментации на двух или более различных гранулах включает иммобилизацию гранул, так что контакт между гранулами сводится к минимуму. Иммобилизацию гранул можно осуществлять с помощью любой из ряда методик, известных в данной области, включая, например, иммобилизацию гранул с помощью магнетизма на сторонах твердой поверхности, такой как в микроцентрифужной пробирке, или любой другой методики иммобилизации, как описано, например, во включенных материалах из публикации WO 2010/115122.

[0117] В некоторых вариантах осуществления гранулы CRISPR/Cas9 могут быть использованы для выделения и идентификации нуклеиновых кислот из одной клетки, такой как прокариотическая или эукариотическая клетка. Например, в некоторых вариантах осуществления такие частицы, как гранулы, покрывают индексированными ферментами или комплексами CRISPR/Cas9, которые имеют один и тот же индекс (все ферменты или комплексы CRISPR/Cas9s, присутствующие на конкретной грануле, переносят один и тот же индекс, который отличается от индекса, присутствующего на другой грануле). Затем гранулы могут быть помещены внутрь клеток с помощью любой из множества методик, известных в данной области. Например, способы доставки гранул внутрь клеток включают, помимо прочего, генные пушки, фототермические нанолопасти (Wu и соавт. Anal Chem. (2011) 4:1321-7), и пептиды, используемые в сочетании с веществами для пермеабилизации клеток (Nitin и соавт. Ann Biomed Eng. (2009) 37:2018-2027) и т. п. Следует понимать, что в способах, представленных в настоящем документе, может быть использован любой подходящий способ ассоциирования нуклеиновой кислоты из одной клетки с частицей, несущей индексированные ферменты или комплексы CRISPR/Cas9.

[0118] В некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 могут быть ковалентно присоединены к гранулам, как подробно описано выше. В дополнение или в альтернативном варианте ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 могут высвобождаться из гранул при применении химического или физического стимула. Некоторые примеры стимулов, которые могут инициировать высвобождение ферментов или комплексов CRISPR/Cas9 с твердой подложки, включают изменения света и/или температуры (например, нагревание). В некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 высвобождают с твердой подложки с использованием активности фермента, такого как рестрикционная эндонуклеаза. В некоторых вариантах осуществления ферменты или комплексы CRISPR/Cas9 могут быть отделены от гранул и свободно перемещаться внутри клетки. При контакте гранул (или в альтернативном варианте высвобожденных ферментов или комплексов CRISPR/Cas9) с хроматином или нуклеиновой кислотой происходит фрагментация. Следует понимать, что в эукариотических и прокариотических системах не вся геномная ДНК будет всегда доступна и/или пригодна для фрагментации. В некоторых вариантах осуществления вплоть до 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% или более того, что 99% всей нуклеиновой кислоты в клетке фрагментировано ферментами или комплексами CRISPR/Cas9.

[0119] В некоторых вариантах осуществления фрагменты двухцепочечной нуклеиновой кислоты помечены, например, первой меткой, содержащей первый домен метки. В некоторых вариантах осуществления домен первой метки может содержать область для кластерной амплификации и/или область для праймирования реакции секвенирования. Мечение фрагментов позволяет идентифицировать считываемые данные из одной и той же клетки или другого биологического образца путем группирования считываний, имеющих одну и ту же метку. Эти считывания можно рассматривать как полученные из одной и той же твердой подложки или гранулы (и, следовательно, из одной и той же клетки или биологического образца).

[0120] В некоторых вариантах осуществления может быть использован подход, гарантирующий, что отдельный биологический образец или целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота не будет фрагментирована множеством твердых подложек или гранул. Например, одним из подходов является использование гранул такого размера, который аналогичен размеру клетки. Это гарантирует, что клетка не сможет вмещать множество гранул. Дополнительно или в качестве альтернативы другой подход заключается в использовании соотношения между клетками и гранулами, которое способствует нацеливанию на одиночный элемент. Например, если количество клеток намного больше, чем количество гранул, то распределение гранул по Пуассону внутри клеток означает, что количество клеток, захвативших одну гранулу, значительно превосходит количество клеток, захвативших две или более гранул.

[0121] В некоторых вариантах осуществления описанный выше подход на основе одиночной клетки можно использовать для определения наличия в одной и той же клетке двух однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или структурных перестроек. Например, в случае неоднородных популяций раковых клеток знание того, присутствуют ли два ОНП в одной клетке или в разных клетках, может помочь в реализации правильной противораковой терапии.

[0122] В некоторых вариантах осуществления описанный выше подход на основе одиночной клетки можно использовать для исследования РНК. Например, путем покрытия гранул подходящими ферментами (т. е. обратной транскриптазой) и олигонуклеотидами для этапа обратной транскрипции можно анализировать экспрессию генов на уровне одной клетки. В одном варианте осуществления после введения гранул, покрытых обратной транскриптазой, олигонуклеотидами и ферментами CRISPR/Cas9, цитоплазматическая РНК может быть преобразована в кДНК, мечена и приготовлена внутри клеток.

VI Способы сборки длинных прочтений с использованием иммобилизованных ферментов CRISPR/Cas9

[0123] Сборка фрагментов нуклеиновых кислот позволяет выделять отдельные длинные молекулы нуклеиновых кислот в популяции молекул нуклеиновых кислот и преобразовывать каждую нуклеиновую кислоту в библиотеку фрагментов. Если библиотека фрагментов нуклеиновых кислот помечена и секвенирована, фрагменты нуклеиновых кислот можно собрать обратно в их исходную длинную молекулу, например, путем сравнения с метками, которые они содержат.

[0124] Целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота может эффективно контактировать со связанным с поверхностью CRISPR/Cas9s с использованием любого подходящего способа повышения вероятности контакта, как описано выше в настоящем документе.

[0125] Способы можно осуществлять с применением любого из множества известных форматов, например, с использованием комбинации реагентов для фрагментации и матрицы гранул для подготовки библиотеки с последующим проведением индексированного секвенирования и специализированного анализа данных. Для фрагментации поверхности и индексирования образцов можно применять любой другой подходящий способ, который удерживает гранулы в статическом разделении друг от друга. Например, физические конфигурации, такие как лунки или небольшие углубления в подложке, которые могут удерживать гранулы, так что микросфера может оставаться в лунке, или применение других сил (магнитных или сжатия), или химически измененные или активные участки, такие как химически функционализированные участки, электростатически измененные участки, гидрофобно и/или гидрофильно функционализированные участки или участки с адгезивом.

[0126] В некоторых вариантах осуществления микросферы нековалентно связаны с лунками, хотя лунки могут дополнительно быть химически функционализированы, как по существу описано ниже, могут быть использованы поперечносшивающие агенты или может быть использован физический барьер, например, пленка или мембрана над гранулами.

[0127] В определенных вариантах осуществления поверхность подложки модифицирована так, что она содержит химически модифицированные участки, которые можно использовать для ковалентного или нековалентного присоединения микросфер по настоящему изобретению к дискретным участкам или местоположениям на подложке. Термин «химически модифицированные участки» в данном контексте включает, помимо прочего, добавление структуры химических функциональных групп, включая аминогруппы, карбоксильные группы, оксогруппы и тиоловые группы, которые могут быть использованы для ковалентного присоединения микросфер, которые по существу также содержат соответствующие реакционноспособные функциональные группы; добавление контура адгезива, который может быть использован для связывания микросфер (либо с помощью предварительной химической функционализации при добавлении адгезива, либо путем непосредственного добавления адгезива); добавление структуры заряженных групп (аналогичных химическим функциональным группам) для электростатического присоединения микросфер, например, если микросферы содержат заряженные группы, противоположные участкам; добавление структуры химических функциональных групп, делающих участки дифференциально гидрофобными или гидрофильными, так что добавление сходных гидрофобных или гидрофильных микросфер в подходящих экспериментальных условиях приводит к связыванию микросфер с участками на основе гидроаффинности. Например, использование гидрофобных участков с гидрофобными гранулами в водной системе способствует предпочтительному связыванию гранул с этими участками. Как указано выше, «контур» в этом смысле включает в себя применение равномерной обработки поверхности для обеспечения прикрепления гранул к отдельным участкам, а также обработку поверхности, приводящую к образованию отдельных участков. Специалистам в данной области будет понятно, что это можно осуществить различными способами.

[0128] В некоторых вариантах осуществления при нанесении целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота многократно фрагментируется случайным образом ферментами или комплексами CRISPR/Cas9 на твердой подложке. Каждый фрагмент иммобилизируется на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой гранулу, а физическое разделение гранул на чипе матрицы препятствует попаданию молекулы нуклеиновой кислоты между двумя гранулами. В других вариантах осуществления гранулы находятся в тесном контакте, и одна или более молекул нуклеиновой кислоты могут растягиваться между двумя или более твердыми подложками. В некоторых вариантах осуществления на одной твердой подложке могут быть фрагментированы более одной целевой молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Вероятность фрагментации двух аллелей на одной и той же твердой подложке или грануле низкая и зависит от концентрации добавленной нуклеиновой кислоты и числа твердых подложек или гранул. Например, чтобы избежать появления двух аллелей в одной лунке, необходимо загрузить 0,1x гаплом-эквивалентов (50 000 геном-эквивалентов ) в 1 миллионов гранул.

[0129] В некоторых вариантах осуществления двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены любым из известных способов мечения. Двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты могут быть помечены, например, первой меткой, содержащей домен первой метки. В некоторых вариантах осуществления домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования. После завершения фрагментации и необязательного мечения двухцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты может быть перенесен с поверхности твердой подложки в раствор так, что отдельные двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты могут быть объединены и подготовлены к следующим этапам, таким как секвенирование.

[0130] Высвобождение или выделение иммобилизованных двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты с твердой подложки в растворы может быть достигнуто с использованием любой подходящей методики, известной в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления фрагментированные молекулы могут быть высвобождены с помощью отщепления от поверхности гранул, например, посредством расщепляющей функциональной группы, присутствующей на 5'-конце связанных с поверхностью олигонуклеотидов. Расщепляющая функциональная группа может представлять собой любую функциональную группу, подходящую для отщепления цепи нуклеиновой кислоты от твердой подложки. Примеры способов, в которых используется расщепляющая функциональная группа, включают, помимо прочего, рестрикционное эндонуклеазное расщепление, химическое расщепление, расщепление РНазой, фотохимическое расщепление и т. п., включая способы расщепления и расщепляющие функциональные группы, представленные в публикации WO 2006/064199, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0131] Метки могут включать участки «праймера», которые можно использовать в качестве точек гибридизации для гибридизации праймеров ПЦР «с выходом наружу», позволяющих добавлять дополнительные последовательности, такие как праймеры для амплификации и секвенирования. Например, можно добавлять праймеры для амплификации P5 и P7. После добавления можно использовать ПЦР супрессии, например, для обогащения молекул, имеющих адапторы Р5 на одном конце и Р7 на другом конце. В некоторых вариантах осуществления амплификацию можно проводить непосредственно с твердой подложки (например, гранулами) с помощью праймеров «с выходом наружу», которые добавляют последовательности адаптора P5 и P7 с помощью ПЦР супрессии.

[0132] В другом варианте осуществления каждая твердая подложка может иметь два типа поверхностно-привитых олигонуклеотидов, где последовательность праймера представляет собой праймер для секвенирования P5-Read1 или праймер для секвенирования P7-Read 2. Это приводит к получению смешанных ферментов или комплексов P5-P7 CRISPR/Cas9. Они могут быть либо отщеплены от твердой подложки с последующей ПЦР супрессии для обогащения молекул P5/P7, либо амплифицированы непосредственно с твердой подложки, как описано выше.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[0133] Приведенная выше письменная спецификация считается достаточной для того, чтобы специалист в данной области мог реализовать на практике варианты осуществления. Предшествующее описание и примеры подробно описывают определенные варианты осуществления и описывают наилучший способ, предусмотренный авторами изобретения. Однако следует понимать, что независимо от того, насколько подробно это изложено выше в тексте, вариант осуществления может быть реализован различными способами и его необходимо толковать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

[0134] Предполагается, что термин «содержащий» в настоящем документе не имеет ограничительного характера, включая не только указанные элементы, но также охватывая любые дополнительные элементы.

[0135] Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» относится к числовому значению, включающему, например, целые числа, фракции и процентные доли, независимо от того, указано ли это явно или нет. Термин « приблизительно » в целом относится к диапазону числовых значений (например, +/-5-10% от указанного диапазона), который специалист в данной области считает эквивалентным указанному значению например, с такой же функцией или результатом). Когда термины, такие как по «меньшей мере» и «приблизительно» предшествуют перечню численных значений или диапазонов, термины изменяют все значения или диапазоны, приведенные в перечне. В некоторых случаях термин «приблизительно» может включать числовые значения, округленные до ближайшего значимого числа.

[0136] В тексте настоящей заявки приведены ссылки на различные публикации, патенты или заявки на патенты. Описание этих публикаций полностью включено в настоящую заявку путем ссылки.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, а также к твердым подложкам для использования в вышеуказанных способах. Также раскрыта композиция для применения в вышеуказанных способах, содержащая твердую подложку и один или более реагентов, уменьшающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой. Изобретение может быть использовано для создания фрагментов нуклеиновых кислот для применения в различных процессах, включая массивно-параллельное секвенирование нуклеиновых кислот. 6 н. и 69 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий:

(а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней ферментами CRISPR/Cas9; и

(б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом ферментами CRISPR/Cas9, а CRISPR/Cas9 связывается по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, где ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который иммобилизован на указанной твердой подложке.

2. Способ по п. 1, в котором целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК.

3. Способ по п. 1, в котором целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором первый полинуклеотид направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

5. Способ по п. 4, в котором первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

6. Способ по п. 5, в котором огРНК содержит (GC)_n или (AT)_n, при этом n составляет 5-20.

7. Способ по п. 6, в котором n составляет 10.

8. Способ по п. 5, в котором огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов.

9. Способ по п. 8, в котором огРНК содержит от 17 до 20 нуклеотидов.

10. Способ по любому из пп. 4-9, в котором первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков.

11. Способ по п. 10, в котором биотинсвязывающие белки содержат авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.

12. Способ по п. 11, в котором биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.

13. Способ по любому из пп. 1-12, включающий промывку твердой подложки с иммобилизованными на ней двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты для удаления любых несвязанных нуклеиновых кислот.

14. Способ по любому из пп. 4-13, включающий амплификацию двухцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердой поверхности.

15. Способ по п. 14, в котором амплификация включает предоставление полимеразы и праймера для амплификации, соответствующего части первого полинуклеотида.

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.

17. Способ по п. 16, в котором один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶ ферментов на мм².

19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором длины двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты в иммобилизованной библиотеке пропорциональны плотности ферментов CRISPR/Cas9 на твердой подложке.

20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором твердая подложка содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.

21. Способ по п. 20, в котором микрочастицы представляют собой гранулы.

22. Способ по любому из пп. 1-21, включающий: (в) нанесение интеркалирующего красителя по меньшей мере на часть иммобилизованной библиотеки двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты для получения набора окрашенных иммобилизованных фрагментов; и получение изображения окрашенных иммобилизованных фрагментов.

23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает добавление биологического образца на твердую подложку.

24. Способ по п. 23, в котором биологический образец содержит клеточный лизат.

25. Способ по п. 23, в котором биологический образец содержит цельные клетки.

26. Способ по п. 23, в котором биологический образец выбирают из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, лимфы, слизи, мокроты, мочи, спермы, спинномозговой жидкости, бронхиального аспирата, фекалий и мацерированной ткани.

27. Способ по любому из пп. 1-26, включающий мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

28. Способ по п. 27, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки.

29. Способ по п. 28, в котором домен первой метки содержит область для кластерной амплификации.

30. Способ по п. 28 или 29, в котором домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.

31. Способ по любому из пп. 1-30, включающий высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов.

32. Способ по п. 31, в котором высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки.

33. Способ по п. 31, в котором высвобождение включает выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплификации с замещением цепей (SDA), опосредованной транскрипцией амплификации (ТМА) и амплификации на основе нуклеотидной последовательности (NASBA) или другого процесса амплификации.

34. Способ по п. 33, в котором ПЦР содержит ПЦР супрессии.

35. Способ по п. 31, в котором высвобождение содержит применение света или тепла.

36. Способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий:

(а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке; и

(б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом комплексами CRISPR/Cas9, а комплексы CRISPR/Cas9 связываются по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

37. Способ по п. 36, в котором биотинсвязывающий белок содержит авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.

38. Способ по п. 37, в котором биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.

39. Способ по п. 37 или 38, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.

40. Способ по п. 39, в котором один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

41. Способ по любому одному из пп. 36-40, содержащий мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.

42. Способ по п. 41, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки.

43. Способ по п. 42, в котором домен первой метки содержит область для кластерной амплификации.

44. Способ по п. 42 или 43, в котором домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.

45. Способ по любому из пп. 36-44, дополнительно содержащий высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов.

46. Способ по п. 45, в котором высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки.

47. Способ по п. 46, в котором высвобождение включает выполнение ПЦР или другого процесса амплификации.

48. Способ по п. 47, в котором ПЦР включает ПЦР супрессии.

49. Способ по п. 47, в котором высвобождение включает применение света или тепла.

50. Твердая подложка для применения в способе по любому из пп. 1-44, имеющая иммобилизованные на ней комплексы CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат ферменты CRISPR/Cas9, которые случайным образом фрагментируют целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, где указанные ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который иммобилизован на указанной твердой подложке.

51. Твердая подложка по п. 50, в которой целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК.

52. Твердая подложка по п. 51, в которой целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.

53. Твердая подложка по любому из пп. 50-52, в которой ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

54. Твердая подложка по п. 53, в которой первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке.

55. Твердая подложка по п. 53 или 54, в которой первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

56. Твердая подложка по п. 55, в которой огРНК содержит (GC)_n или (AT)_n, при этом n составляет 5-20.

57. Твердая подложка по п. 56, в которой n составляет 10.

58. Твердая подложка по п. 55, в которой огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов.

59. Твердая подложка по п. 58, в которой огРНК содержит от 17 до 20 нуклеотидов.

60. Твердая подложка по любому из пп. 53-59, в которой первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит биотинсвязывающие белки.

61. Твердая подложка по п. 60, в которой биотинсвязывающие белки содержат авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.

62. Твердая подложка по п. 61, в которой биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.

63. Твердая подложка по любому из пп. 50-62, в которой ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶ ферментов на мм².

64. Твердая подложка по любому из пп. 50-63, которая содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.

65. Твердая подложка по п. 64, в которой микрочастицы представляют собой гранулы.

66. Композиция для применения в способе по любому из пп. 1-44, содержащая твердую подложку по любому из пп. 50-65 и один или более реагентов, уменьшающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.

67. Композиция по п. 66, в которой один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.

68. Твердая подложка для применения в способе по любому из пп. 1-44, имеющая иммобилизованные на ней комплексы CRISPR/Cas9, причем (i) комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, который иммобилизован на указанной твердой подложке; (ii) указанный биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на указанной твердой подложке; и (iii) указанный биотинилированный первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.

69. Твердая подложка по п. 68, в которой биотинсвязывающий белок содержит авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.

70. Твердая подложка по п. 69, в которой биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.

71. Твердая подложка по любому из пп. 68-70, в которой комплексы CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ комплексов на мм².

72. Твердая подложка по любому из пп. 68-71, которая содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.

73. Твердая подложка по п. 72, в которой микрочастицы представляют собой гранулы.

74. Композиция для применения в способе по любому из пп. 1-44, содержащая твердую подложку по любому из пп. 68-73 и один или более реагентов, снижающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.

75. Композиция по п. 74, в которой один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.