ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка представляет собой международную заявку, поданную в соответствии с Договором о международной патентной кооперации, которая испрашивает преимущество приорита по предварительной заявке на патент США № 62/952,799, поданной 23 декабря 2019 г., и предварительной заявке на патент США № 62/952,866, поданной 23 декабря 2019 г., содержание которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, созданный 16 декабря 2020 г.; файл в формате ASCII обозначен как 1912732.txt и имеет размер 3,2 Кбайт. Файл полностью включен в настоящую заявку путем ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Многие существующие платформы секвенирования для обнаружения используют технологию «секвенирование путем синтеза» (SBS) и способы обнаружения, основанные на флуоресценции. В некоторых примерах множество целевых полинуклеотидов, выделенных из библиотеки, представляющей собой последовательности, или матричных полинуклеотидов присоединяют к поверхности субстрата в процессе, известном как затравка. Затем множество копий матричных полинуклеотидов можно синтезировать при присоединении к поверхности вблизи места затравки матричного полинуклеотида, который копируется, в процессе, называемом кластеризацией. Впоследствии зарождающиеся копии кластеризованных полинуклеотидов синтезируют в условиях, в которых они испускают сигнал, идентифицирующий каждый нуклеотид по мере его присоединения к зарождающейся цепи. Кластеризация множества копий затравленного матричного полинуклеотида в непосредственной близости от места первоначальной затравки приводит к усилению сигнала, генерируемого во время визуализируемой полимеризации, улучшая обнаружение.
[0004] Затравка и кластеризация для SBS успешно проходят, когда как можно больше доступной поверхности субстрата засевают матричными полинуклеотидами, что может максимально увеличить количество информации о секвенировании, которую можно получить в ходе прогона секвенирования. Напротив, в случае по существу менее доступной площади поверхности субстрата, используемого для затравки и кластеризации, процесс SBS может проходить менее эффективно, что приводит к увеличению времени, количества реагентов, расходов и сложной обработке данных для получения заданного объема информации о секвенировании для данной библиотеки.
[0005] Затравка и кластеризация также успешно проходят, когда матричные полинуклеотиды из библиотеки с последовательностями, которые отличаются друг от друга, затравливаются на достаточно удаленные друг от друга участки поверхности, или прикрепляются к ним, таким образом, что кластеризация приводит к получению пространственно отличающихся кластеров скопированных полинуклеотидов, каждый из которых получен в результате затравки одного матричного полинуклеотида, причем такое условие обычно называют моноклональностью. Таким образом, библиотека матричных полинуклеотидов может по существу включать большое число молекул матричных полинуклеотидов, нуклеотидные последовательности которых отличаются друг от друга. Если два таких матричных полинуклеотида затравливаются слишком близко друг к другу на поверхности субстрата, кластеризация может приводить к образованию пространственно объединенных популяций скопированных полинуклеотидов, некоторые из которых имеют последовательность одного из матричных полинуклеотидов, которые затравлены рядом, а другие имеют последовательность другого матричного полинуклеотида, который также затравлен рядом на поверхности. Или же два кластера, образованных из двух различных матричных полинуклеотидов, которые затравлены слишком близко друг к другу, могут быть слишком близкими или смежными друг к другу таким образом, что система визуализации, используемая в процессе SBS, может оказаться не в состоянии различать их как отдельные кластеры, даже в случае отсутствия или минимального пространственного объединения присоединенных к субстрату последовательностей между кластерами. Такое неблагоприятное состояние может по существу называться поликлональностью. Это может быть более сложным, занимающим много времени, дорогостоящим и менее эффективным, при этом требуется более сложная аналитическая обработка данных для получения однозначной информации о последовательности из поликлонального кластера при его наличии.
[0006]
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Таким образом, желательно выполнять SBS в условиях, в которых насколько возможно больше доступной площади поверхности субстрата используют для затравки и кластеризации, при этом также способствуя разделению затравленных матричных полинуклеотидов, чтобы насколько возможно максимально увеличить моноклональность кластеров и насколько возможно свести к минимуму поликлональные кластеры. В настоящем документе описаны композиции и способы, которые можно использовать для преимущественного увеличения плотности затравки и моноклональной кластеризации в SBS.
[0008] В одном аспекте предложена наночастица, содержащая каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, выбранный из матричного сайта для ковалентного связывания и матричного сайта для нековалентного связывания, и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом, выбранных из вспомогательных сайтов для ковалентного связывания олигонуклеотидов и вспомогательных сайтов для нековалентного связывания олигонуклеотидов, причем каркас представляет собой соединение формулы I:
,
каждый X представляет собой соединение формулы II:
,
где R2 выбирают из формулы IIIa:
,
где R5 выбирают из 
, 
, 
, 
и 
,
x представляет собой целое число в диапазоне 1-2000, y представляет собой целое число в диапазоне 1-10 000, и соотношение x : y может составлять от около 10 : 90 до около 1 : 99, и где каждый Rz независимо представляет собой H или C1-4 алкил, и формулы IIIb:
,
где R5 выбирают из , , , и ,
y представляет собой целое число в диапазоне 1-2000, а x и z представляют собой целые числа, сумма которых находится в диапазоне от 1-10 000, и соотношение (x : y): z может составлять от приблизительно (85) : 15 до приблизительно (95) : 5, и где каждый Rz независимо представляет собой H или C1-4 алкил, R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из необязательно замещенного C1-C20 алкила, необязательно замещенного C1-C20 алкенила, необязательно замещенного C1-C20 алкинила, необязательно замещенного C1-C20 оксаалкила, необязательно замещенного C1-C20 тиаалкила и необязательно замещенного C1-C20 азаалкила, где замещение включает замещение одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов.
[0009] В одном примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для ковалентного связывания. В другом примере матричный сайт для ковалентного связывания выбирают из сайта связывания амин-NHS сложного эфира, сайта связывания амин-сложного имидоэфира, сайта связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайта связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайта связывания карбоксил-карбодиимида, сайта связывания тиол-малеимида, сайта связывания тиол-галогенацетила, сайта связывания тиол-пиридил дисульфида, сайта связывания тиол-тиосульфоната, сайта связывания тиол-винилсульфона, сайта связывания альдегид-гидразида, сайта связывания альдегид-алкоксиамина, сайта связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайта связывания гидрокси-изоцианата, сайта связывания азид-алкина, сайта связывания азид-фосфина, сайта связывания трансциклооктен-тетразина, сайта связывания норборнен-тетразина, сайта связывания азид-циклооктина, сайта связывания азид-норборнена, сайта связывания оксима, сайта связывания SpyTag-SpyCatcher, сайта связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайта связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайта связывания присоединения сортазы.
[0010] В другом примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для нековалентного связывания. В еще одном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт гибридизации полинуклеотидов. В еще одном дополнительном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт для нековалентного связывания пептидов, а сайт для нековалентного связывания пептидов выбирают из сайта связывания с суперспиралью и сайта связывания авидина с биотином.
[0011] В другом примере множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом включает в себя вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов выбирают из сайтов связывания амин-NHS сложного эфира, сайтов связывания амин-сложного имидоэфира, сайтов связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайтов связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайтов связывания карбоксил-карбодиимида, сайтов связывания тиол-малеимида, сайтов связывания тиол-галогенацетила, сайтов связывания тиол-пиридил дисульфида, сайтов связывания тиол-тиосульфоната, сайтов связывания тиол-винилсульфона, сайтов связывания альдегид-гидразида, сайтов связывания альдегид-алкоксиамина, сайтов связывания гидрокси-изоцианата, сайтов связывания азид-алкина, сайтов связывания азид-фосфина, сайтов связывания трансциклооктен-тетразина, сайтов связывания норборнен-тетразина, сайтов связывания азид-циклооктина, сайтов связывания азид-норборнена, сайтов связывания оксима, сайтов связывания SpyTag-SpyCatcher, сайтов связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайтов связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайтов связывания присоединения сортазы, а также любой комбинации двух или более из приведенных выше.
[0012] В другом примере вспомогательные сайты для связывания олигонуклеотидов включают в себя вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты гибридизации полинуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты для нековалентного связывания пептидов, а сайты для нековалентного связывания пептидов выбрирают из одного или обоих сайтов связывания с суперспиралью и сайтов связывания авидина с биотином.
[0013] В другом примере наночастица дополнительно содержит один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом. В еще одном примере каркас дополнительно содержит множество вспомогательных олигонуклеотидов, связанных со множеством вспомогательных сайтов.
[0014] В другом примере наночастица имеет диаметр по меньшей мере 10 нм, диаметр по меньшей мере 20 нм, диаметр по меньшей мере 30 нм, диаметр по меньшей мере около 40 нм, диаметр по меньшей мере около 50 нм, диаметр по меньшей мере около 60 нм, диаметр по меньшей мере около 70 нм, диаметр по меньшей мере около 80 нм, диаметр по меньшей мере около 90 нм, диаметр по меньшей мере около 100 нм, диаметр по меньшей мере около 125 нм, диаметр по меньшей мере около 150 нм, диаметр по меньшей мере около 175 нм, диаметр по меньшей мере около 200 нм, диаметр по меньшей мере около 225 нм, диаметр по меньшей мере около 250 нм, диаметр по меньшей мере около 275 нм, диаметр по меньшей мере около 300 нм, диаметр по меньшей мере около 325 нм, диаметр по меньшей мере около 350 нм, диаметр по меньшей мере около 375 нм, диаметр по меньшей мере около 400 нм, диаметр по меньшей мере около 425 нм, диаметр по меньшей мере около 450 нм, диаметр по меньшей мере около 475 нм, диаметр по меньшей мере около 500 нм, диаметр по меньшей мере около 550 нм, диаметр по меньшей мере около 600 нм, диаметр по меньшей мере около 650 нм, диаметр по меньшей мере около 700 нм, диаметр по меньшей мере около 750 нм, диаметр по меньшей мере около 800 нм, диаметр по меньшей мере около 850 нм, диаметр по меньшей мере около 900 нм или диаметр по меньшей мере около 950 нм.
[0015] В другом аспекте предложен способ, включающий связывание одного матричного полинуклеотида с одним матричным сайтом наночастицы. В еще одном аспекте предложен способ, включающий связывание множества вспомогательных олигонуклеотидов со множеством вспомогательных сайтов наночастицы. Еще в одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к каркасу копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к каркасу копии отходят от вспомогательных олигонуклеотидов. Еще в одном примере способ дополнительно включает присоединение каркаса к субстрату, причем присоединение включает гибридизацию вспомогательных олигонуклеотидов с олигонуклеотидами, присоединенными к субстрату.
[0016] В одном примере субстрат содержит множество нанолунок, а олигонуклеотиды, присоединенные к субстрату, присоединены во множестве нанолунок. В другом примере в любой из нанолунок связывается не более одного каркаса. В еще одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к субстрату копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к субстрату копии отходят от олигонуклеотидов, присоединенных к субстрату. В еще одном примере способ дополнительно включает секвенирование по меньшей мере одной из присоединенных к каркасу копий и присоединенных к субстрату копий, причем секвенирование включает секвенирование путем синтеза.
[0017] В другом аспекте предложена наночастица, содержащая каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, выбранный из матричного сайта для ковалентного связывания и матричного сайта для нековалентного связывания, и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом, выбранных из вспомогательных сайтов для ковалентного связывания олигонуклеотидов и вспомогательных сайтов для нековалентного связывания олигонуклеотидов, причем каркас содержит дендример, причем дендример содержит от 2 до 10 поколений конститутивных повторяющихся звеньев, причем конститутивные повторяющиеся звенья содержат лизин, причем лизин вышележащего поколения образует пептидную связь с первым лизином непосредственно нижележащего поколения и изопептидную связь со вторым лизином непосредственно нижележащего поколения, причем один матричный сайт отходит от С-концевой области лизина первого поколения дендримера, а множество вспомогательных сайтов отходит от NH2 групп лизинов последнего поколения дендримера.
[0018] В одном примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для ковалентного связывания. В другом примере матричный сайт для ковалентного связывания выбирают из сайта связывания амин-NHS сложного эфира, сайта связывания амин-сложного имидоэфира, сайта связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайта связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайта связывания карбоксил-карбодиимида, сайта связывания тиол-малеимида, сайта связывания тиол-галогенацетила, сайта связывания тиол-пиридил дисульфида, сайта связывания тиол-тиосульфоната, сайта связывания тиол-винилсульфона, сайта связывания альдегид-гидразида, сайта связывания альдегид-алкоксиамина, сайта связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайта связывания гидрокси-изоцианата, сайта связывания азид-алкина, сайта связывания азид-фосфина, сайта связывания трансциклооктен-тетразина, сайта связывания норборнен-тетразина, сайта связывания азид-циклооктина, сайта связывания азид-норборнена, сайта связывания оксима, сайта связывания SpyTag-SpyCatcher, сайта связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайта связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайта связывания присоединения сортазы.
[0019] В другом примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для нековалентного связывания. В еще одном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт гибридизации полинуклеотидов. В еще одном дополнительном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт для нековалентного связывания пептидов, а сайт для нековалентного связывания пептидов выбирают из сайта связывания с суперспиралью и сайта связывания авидина с биотином.
[0020] В другом примере множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом включает в себя вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов выбирают из сайтов связывания амин-NHS сложного эфира, сайтов связывания амин-сложного имидоэфира, сайтов связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайтов связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайтов связывания карбоксил-карбодиимида, сайтов связывания тиол-малеимида, сайтов связывания тиол-галогенацетила, сайтов связывания тиол-пиридил дисульфида, сайтов связывания тиол-тиосульфоната, сайтов связывания тиол-винилсульфона, сайтов связывания альдегид-гидразида, сайтов связывания альдегид-алкоксиамина, сайтов связывания гидрокси-изоцианата, сайтов связывания азид-алкина, сайтов связывания азид-фосфина, сайтов связывания трансциклооктен-тетразина, сайтов связывания норборнен-тетразина, сайтов связывания азид-циклооктина, сайтов связывания азид-норборнена, сайтов связывания оксима, сайтов связывания SpyTag-SpyCatcher, сайтов связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайтов связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайтов связывания присоединения сортазы, а также любой комбинации двух или более из приведенных выше.
[0021] В другом примере вспомогательные сайты для связывания олигонуклеотидов включают в себя вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты гибридизации полинуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты для нековалентного связывания пептидов, а сайты для нековалентного связывания пептидов выбрирают из одного или обоих сайтов связывания с суперспиралью и сайтов связывания авидина с биотином.
[0022] В другом примере наночастица дополнительно содержит один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом. В еще одном примере каркас дополнительно содержит множество вспомогательных олигонуклеотидов, связанных со множеством вспомогательных сайтов.
[0023] В другом примере наночастица имеет диаметр по меньшей мере 10 нм, диаметр по меньшей мере 20 нм, диаметр по меньшей мере 30 нм, диаметр по меньшей мере около 40 нм, диаметр по меньшей мере около 50 нм, диаметр по меньшей мере около 60 нм, диаметр по меньшей мере около 70 нм, диаметр по меньшей мере около 80 нм, диаметр по меньшей мере около 90 нм, диаметр по меньшей мере около 100 нм, диаметр по меньшей мере около 125 нм, диаметр по меньшей мере около 150 нм, диаметр по меньшей мере около 175 нм, диаметр по меньшей мере около 200 нм, диаметр по меньшей мере около 225 нм, диаметр по меньшей мере около 250 нм, диаметр по меньшей мере около 275 нм, диаметр по меньшей мере около 300 нм, диаметр по меньшей мере около 325 нм, диаметр по меньшей мере около 350 нм, диаметр по меньшей мере около 375 нм, диаметр по меньшей мере около 400 нм, диаметр по меньшей мере около 425 нм, диаметр по меньшей мере около 450 нм, диаметр по меньшей мере около 475 нм, диаметр по меньшей мере около 500 нм, диаметр по меньшей мере около 550 нм, диаметр по меньшей мере около 600 нм, диаметр по меньшей мере около 650 нм, диаметр по меньшей мере около 700 нм, диаметр по меньшей мере около 750 нм, диаметр по меньшей мере около 800 нм, диаметр по меньшей мере около 850 нм, диаметр по меньшей мере около 900 нм или диаметр по меньшей мере около 950 нм.
[0024] В другом аспекте предложен способ, включающий связывание одного матричного полинуклеотида с одним матричным сайтом наночастицы. В еще одном аспекте предложен способ, включающий связывание множества вспомогательных олигонуклеотидов со множеством вспомогательных сайтов наночастицы. Еще в одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к каркасу копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к каркасу копии отходят от вспомогательных олигонуклеотидов. Еще в одном примере способ дополнительно включает присоединение каркаса к субстрату, причем присоединение включает гибридизацию вспомогательных олигонуклеотидов с олигонуклеотидами, присоединенными к субстрату.
[0025] В одном примере субстрат содержит множество нанолунок, а олигонуклеотиды, присоединенные к субстрату, присоединены во множестве нанолунок. В другом примере в любой из нанолунок связывается не более одного каркаса. В еще одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к субстрату копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к субстрату копии отходят от олигонуклеотидов, присоединенных к субстрату. В еще одном примере способ дополнительно включает секвенирование по меньшей мере одной из присоединенных к каркасу копий и присоединенных к субстрату копий, причем секвенирование включает секвенирование путем синтеза.
[0026] В другом аспекте предложена наночастица, содержащая каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, выбранный из матричного сайта для ковалентного связывания и матричного сайта для нековалентного связывания, и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом, выбранных из вспомогательных сайтов для ковалентного связывания олигонуклеотидов и вспомогательных сайтов для нековалентного связывания олигонуклеотидов, причем каркас представляет собой соединение формулы IV:
,
каждый X представляет собой соединение формулы V:
,
где R2 выбирают из формулы VIa:
и формулы VIb:
,
где p представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, а R5 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов, R3 выбирают из прямой связи, 
, 
, 
, 
, 
и 
,
m представляет собой целое число от 1 до 2000, а n представляет собой целое число от 1 до 10 000, R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из необязательно замещенного C1-C20 алкила, необязательно замещенного C1-C20 алкенила, необязательно замещенного C1-C20 алкинила, необязательно замещенного C1-C20 оксаалкила, необязательно замещенного C1-C20 тиаалкила и необязательно замещенного C1-C20 азаалкила, где замещение включает замещение одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов. В любом из приведенных выше примеров тритиокарбонатная группа 
может быть необязательно замещена прямой связью, -CH2- связью, -S- связью, -N- связью или -O- связью.
[0027] В одном примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для ковалентного связывания. В другом примере матричный сайт для ковалентного связывания выбирают из сайта связывания амин-NHS сложного эфира, сайта связывания амин-сложного имидоэфира, сайта связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайта связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайта связывания карбоксил-карбодиимида, сайта связывания тиол-малеимида, сайта связывания тиол-галогенацетила, сайта связывания тиол-пиридил дисульфида, сайта связывания тиол-тиосульфоната, сайта связывания тиол-винилсульфона, сайта связывания альдегид-гидразида, сайта связывания альдегид-алкоксиамина, сайта связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайта связывания гидрокси-изоцианата, сайта связывания азид-алкина, сайта связывания азид-фосфина, сайта связывания трансциклооктен-тетразина, сайта связывания норборнен-тетразина, сайта связывания азид-циклооктина, сайта связывания азид-норборнена, сайта связывания оксима, сайта связывания SpyTag-SpyCatcher, сайта связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайта связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайта связывания присоединения сортазы.
[0028] В другом примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для нековалентного связывания. В еще одном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт гибридизации полинуклеотидов. В еще одном дополнительном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт для нековалентного связывания пептидов, а сайт для нековалентного связывания пептидов выбирают из сайта связывания с суперспиралью и сайта связывания авидина с биотином.
[0029] В другом примере множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом включает в себя вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов выбирают из сайтов связывания амин-NHS сложного эфира, сайтов связывания амин-сложного имидоэфира, сайтов связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайтов связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайтов связывания карбоксил-карбодиимида, сайтов связывания тиол-малеимида, сайтов связывания тиол-галогенацетила, сайтов связывания тиол-пиридил дисульфида, сайтов связывания тиол-тиосульфоната, сайтов связывания тиол-винилсульфона, сайтов связывания альдегид-гидразида, сайтов связывания альдегид-алкоксиамина, сайтов связывания гидрокси-изоцианата, сайтов связывания азид-алкина, сайтов связывания азид-фосфина, сайтов связывания трансциклооктен-тетразина, сайтов связывания норборнен-тетразина, сайтов связывания азид-циклооктина, сайтов связывания азид-норборнена, сайтов связывания оксима, сайтов связывания SpyTag-SpyCatcher, сайтов связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайтов связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайтов связывания присоединения сортазы, а также любой комбинации двух или более из приведенных выше.
[0030] В другом примере вспомогательные сайты для связывания олигонуклеотидов включают в себя вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты гибридизации полинуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты для нековалентного связывания пептидов, а сайты для нековалентного связывания пептидов выбрирают из одного или обоих сайтов связывания с суперспиралью и сайтов связывания авидина с биотином.
[0031] В другом примере наночастица дополнительно содержит один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом. В еще одном примере каркас дополнительно содержит множество вспомогательных олигонуклеотидов, связанных со множеством вспомогательных сайтов.
[0032] В другом примере наночастица имеет диаметр по меньшей мере 10 нм, диаметр по меньшей мере 20 нм, диаметр по меньшей мере 30 нм, диаметр по меньшей мере около 40 нм, диаметр по меньшей мере около 50 нм, диаметр по меньшей мере около 60 нм, диаметр по меньшей мере около 70 нм, диаметр по меньшей мере около 80 нм, диаметр по меньшей мере около 90 нм, диаметр по меньшей мере около 100 нм, диаметр по меньшей мере около 125 нм, диаметр по меньшей мере около 150 нм, диаметр по меньшей мере около 175 нм, диаметр по меньшей мере около 200 нм, диаметр по меньшей мере около 225 нм, диаметр по меньшей мере около 250 нм, диаметр по меньшей мере около 275 нм, диаметр по меньшей мере около 300 нм, диаметр по меньшей мере около 325 нм, диаметр по меньшей мере около 350 нм, диаметр по меньшей мере около 375 нм, диаметр по меньшей мере около 400 нм, диаметр по меньшей мере около 425 нм, диаметр по меньшей мере около 450 нм, диаметр по меньшей мере около 475 нм, диаметр по меньшей мере около 500 нм, диаметр по меньшей мере около 550 нм, диаметр по меньшей мере около 600 нм, диаметр по меньшей мере около 650 нм, диаметр по меньшей мере около 700 нм, диаметр по меньшей мере около 750 нм, диаметр по меньшей мере около 800 нм, диаметр по меньшей мере около 850 нм, диаметр по меньшей мере около 900 нм или диаметр по меньшей мере около 950 нм.
[0033] В другом аспекте предложен способ, включающий связывание одного матричного полинуклеотида с одним матричным сайтом наночастицы. В еще одном аспекте предложен способ, включающий связывание множества вспомогательных олигонуклеотидов со множеством вспомогательных сайтов наночастицы. Еще в одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к каркасу копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к каркасу копии отходят от вспомогательных олигонуклеотидов. Еще в одном примере способ дополнительно включает присоединение каркаса к субстрату, причем присоединение включает гибридизацию вспомогательных олигонуклеотидов с олигонуклеотидами, присоединенными к субстрату.
[0034] В одном примере субстрат содержит множество нанолунок, а олигонуклеотиды, присоединенные к субстрату, присоединены во множестве нанолунок. В другом примере в любой из нанолунок связывается не более одного каркаса. В еще одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к субстрату копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к субстрату копии отходят от олигонуклеотидов, присоединенных к субстрату. В еще одном примере способ дополнительно включает секвенирование по меньшей мере одной из присоединенных к каркасу копий и присоединенных к субстрату копий, причем секвенирование включает секвенирование путем синтеза.
[0035] В другом аспекте предложена наночастица, содержащая каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, выбранный из матричного сайта для ковалентного связывания и матричного сайта для нековалентного связывания, и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом, выбранных из вспомогательных сайтов для ковалентного связывания олигонуклеотидов и вспомогательных сайтов для нековалентного связывания олигонуклеотидов, причем каркас представляет собой соединение формулы VII:
,
каждый X представляет собой соединение формулы VIII:
,
где y представляет собой целое число от 1 до 20, R2 выбирают из формулы IXa:
и формулы IXb:
,
где p представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, а R5 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов, R3 выбирают из прямой связи, , , , , и ,
m представляет собой целое число от 1 до 2000, а n представляет собой целое число от 1 до 10 000, R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из необязательно замещенного C1-C20 алкила, необязательно замещенного C1-C20 алкенила, необязательно замещенного C1-C20 алкинила, необязательно замещенного C1-C20 оксаалкила, необязательно замещенного C1-C20 тиаалкила и необязательно замещенного C1-C20 азаалкила, где замещение включает замещение одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов. В любом из приведенных выше примеров тритиокарбонатная группа может быть необязательно замещена прямой связью, -CH2- связью, -S- связью, -N- связью или -O- связью.
[0036] В одном примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для ковалентного связывания. В другом примере матричный сайт для ковалентного связывания выбирают из сайта связывания амин-NHS сложного эфира, сайта связывания амин-сложного имидоэфира, сайта связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайта связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайта связывания карбоксил-карбодиимида, сайта связывания тиол-малеимида, сайта связывания тиол-галогенацетила, сайта связывания тиол-пиридил дисульфида, сайта связывания тиол-тиосульфоната, сайта связывания тиол-винилсульфона, сайта связывания альдегид-гидразида, сайта связывания альдегид-алкоксиамина, сайта связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайта связывания гидрокси-изоцианата, сайта связывания азид-алкина, сайта связывания азид-фосфина, сайта связывания трансциклооктен-тетразина, сайта связывания норборнен-тетразина, сайта связывания азид-циклооктина, сайта связывания азид-норборнена, сайта связывания оксима, сайта связывания SpyTag-SpyCatcher, сайта связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайта связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайта связывания присоединения сортазы.
[0037] В другом примере один матричный сайт включает в себя матричный сайт для нековалентного связывания. В еще одном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт гибридизации полинуклеотидов. В еще одном дополнительном примере матричный сайт для нековалентного связывания включает в себя сайт для нековалентного связывания пептидов, а сайт для нековалентного связывания пептидов выбирают из сайта связывания с суперспиралью и сайта связывания авидина с биотином.
[0038] В другом примере множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом включает в себя вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов выбирают из сайтов связывания амин-NHS сложного эфира, сайтов связывания амин-сложного имидоэфира, сайтов связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайтов связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайтов связывания карбоксил-карбодиимида, сайтов связывания тиол-малеимида, сайтов связывания тиол-галогенацетила, сайтов связывания тиол-пиридил дисульфида, сайтов связывания тиол-тиосульфоната, сайтов связывания тиол-винилсульфона, сайтов связывания альдегид-гидразида, сайтов связывания альдегид-алкоксиамина, сайтов связывания гидрокси-изоцианата, сайтов связывания азид-алкина, сайтов связывания азид-фосфина, сайтов связывания трансциклооктен-тетразина, сайтов связывания норборнен-тетразина, сайтов связывания азид-циклооктина, сайтов связывания азид-норборнена, сайтов связывания оксима, сайтов связывания SpyTag-SpyCatcher, сайтов связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайтов связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайтов связывания присоединения сортазы, а также любой комбинации двух или более из приведенных выше.
[0039] В другом примере вспомогательные сайты для связывания олигонуклеотидов включают в себя вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты гибридизации полинуклеотидов. В еще одном примере вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов включают в себя сайты для нековалентного связывания пептидов, а сайты для нековалентного связывания пептидов выбрирают из одного или обоих сайтов связывания с суперспиралью и сайтов связывания авидина с биотином.
[0040] В другом примере наночастица дополнительно содержит один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом. В еще одном примере каркас дополнительно содержит множество вспомогательных олигонуклеотидов, связанных со множеством вспомогательных сайтов.
[0041] В другом примере наночастица имеет диаметр по меньшей мере 10 нм, диаметр по меньшей мере 20 нм, диаметр по меньшей мере 30 нм, диаметр по меньшей мере около 40 нм, диаметр по меньшей мере около 50 нм, диаметр по меньшей мере около 60 нм, диаметр по меньшей мере около 70 нм, диаметр по меньшей мере около 80 нм, диаметр по меньшей мере около 90 нм, диаметр по меньшей мере около 100 нм, диаметр по меньшей мере около 125 нм, диаметр по меньшей мере около 150 нм, диаметр по меньшей мере около 175 нм, диаметр по меньшей мере около 200 нм, диаметр по меньшей мере около 225 нм, диаметр по меньшей мере около 250 нм, диаметр по меньшей мере около 275 нм, диаметр по меньшей мере около 300 нм, диаметр по меньшей мере около 325 нм, диаметр по меньшей мере около 350 нм, диаметр по меньшей мере около 375 нм, диаметр по меньшей мере около 400 нм, диаметр по меньшей мере около 425 нм, диаметр по меньшей мере около 450 нм, диаметр по меньшей мере около 475 нм, диаметр по меньшей мере около 500 нм, диаметр по меньшей мере около 550 нм, диаметр по меньшей мере около 600 нм, диаметр по меньшей мере около 650 нм, диаметр по меньшей мере около 700 нм, диаметр по меньшей мере около 750 нм, диаметр по меньшей мере около 800 нм, диаметр по меньшей мере около 850 нм, диаметр по меньшей мере около 900 нм или диаметр по меньшей мере около 950 нм.
[0042] В другом аспекте предложен способ, включающий связывание одного матричного полинуклеотида с одним матричным сайтом наночастицы. В еще одном аспекте предложен способ, включающий связывание множества вспомогательных олигонуклеотидов со множеством вспомогательных сайтов наночастицы. Еще в одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к каркасу копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к каркасу копии отходят от вспомогательных олигонуклеотидов. Еще в одном примере способ дополнительно включает присоединение каркаса к субстрату, причем присоединение включает гибридизацию вспомогательных олигонуклеотидов с олигонуклеотидами, присоединенными к субстрату.
[0043] В одном примере субстрат содержит множество нанолунок, а олигонуклеотиды, присоединенные к субстрату, присоединены во множестве нанолунок. В другом примере в любой из нанолунок связывается не более одного каркаса. В еще одном примере способ дополнительно включает синтез одной или более присоединенных к субстрату копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к субстрату копии отходят от олигонуклеотидов, присоединенных к субстрату. В еще одном примере способ дополнительно включает секвенирование по меньшей мере одной из присоединенных к каркасу копий и присоединенных к субстрату копий, причем секвенирование включает секвенирование путем синтеза.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0044] Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут более понятными при ознакомлении с представленным ниже подробным описанием со ссылкой на прилагаемые рисунки, где:
[0045] На ФИГ. 1 показан пример наночастицы в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0046] На ФИГ. 2 показан пример участков каркаса наночастицы в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0047] На ФИГ. 3 показан пример одного сайта матричного полинуклеотида и вспомогательных сайтов присоединения наночастицы в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0048] На ФИГ. 4 показан пример метода синтеза наночастицы в соответствии с настоящим изобретением.
[0049] На ФИГ. 5 показан пример наночастицы, имеющей дендримерную структуру с конститутивными повторяющимися звеньями, содержащими лизин.
[0050] На ФИГ. 6 показан метод синтеза для синтезирования примеров наночастицы в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0051] На ФИГ. 7 показаны примеры присоединения матрицы к наночастице в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0052] На ФИГ. 8 представлен пример нековалентного присоединения матричного полинуклеотида к наночастице путем гибридизации в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0053] На ФИГ. 9 показан пример нековалентного присоединения матричного полинуклеотида к наночастице посредством сайта связывания пептида с суперспиралью в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0054] На ФИГ. 10 представлен график, на котором показано количество наночастиц на нанолунку в соответствии с площадью поверхности нанолунки в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0055] На ФИГ. 11A-11C показан пример затравки субстрата матричными полинуклеотидами с использованием каркаса в соответствии с аспектами настоящего описания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0056] Ссылка во всем описании на «один пример», «другой пример», «пример» и так далее означает, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), описанный в связи с примером, включен по меньшей мере, в один пример, описанный в данном документе, и может присутствовать или не присутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы любого примера можно комбинировать любым подходящим способом с разными примерами, если из контекста явно не следует иное.
[0057] Настоящее описание относится к композициям и способам повышения уровня моноклональной кластеризации при SBS. В одном примере принципы исключения по размерам применяются для предотвращения затравки отдельных матричных полинуклеотидов и, следовательно, стимулирования кластеризации слишком близко друг к другу. Путем связывания каждого отдельного матричного полинуклеотида с наночастицей заданного достаточного пространственного размера можно индуцировать присоединение матричных полинуклеотидов к поверхности субстрата, достаточно удаленных друг от друга, чтобы уменьшить образование поликлональных кластеров и увеличить образование моноклональных кластеров. Наночастица может содержать сайт для связывания матричного полинуклеотида. Наночастица может иметь только один единственный сайт для присоединения матричного полинуклеотида. Таким образом, один и только один матричный полинуклеотид может быть способен присоединяться к наночастице таким образом, что присоединение матричного полинуклеотида к каркасу предотвращает присоединение второго матричного полинуклеотида к той же наночастице, причем присоединенный матричный полинуклеотид занимает его один сайт для связывания матричного полинуклеотида. Прикрепление только одного матричного полинуклеотида на каждую наночастицу и итоговое пространственное распределение матричных полинуклеотидов, присоединенных к таким наночастицам, друг от друга в зависимости, непосредственно или опосредованно, от размеров присоединенных наночастиц снижает образование поликлональных кластеров.
[0058] Наночастица может также содержать другие типы одного или более сайтов для связывания для присоединения наночастицы к композициям или поверхностям, в дополнение к матричному полинуклеотиду, которые в настоящем документе называется вспомогательными сайтами для связывания. Например, в дополнение к одному сайту для связывания матричного полинуклеотида наночастица может содержать вспомогательные сайты для связывания, которые позволяют прикреплять наночастицу к поверхности субстрата для использования в процессе SBS. В другом примере наночастица может иметь один или более вспомогательных сайтов для связывания для присоединения к наночастице одного или более поверхностных полимеров. В другом примере наночастица может содержать один или более вспомогательных сайтов связывания для присоединения вспомогательного олигонуклеотида к наночастице, причем олигонуклеотид может связываться с концом матричного полинуклеотида или его копии во время процесса кластеризации, как более подробно описано ниже. В другом примере такие вспомогательные олигонуклеотиды могут быть гибридизуемыми с олигонуклеотидами, присоединенными к поверхности субстрата, для использования в процессе SBS таким образом, что наночастица с присоединенным к ней одним матричным полинуклеотидом может прикрепляться к такой поверхности субстрата.
[0059] В то время как каркас может содержать один сайт для связывания для матричного полинуклеотида и один или более вспомогательных сайтов для присоединения, например, вспомогательного олигонуклеотида, один сайт для связывания матричного полинуклеотида может иметь химический состав или структуру, отличную от структуры вспомогательных сайтов для связывания. Из всех сайтов для связывания один сайт для связывания матричных полинуклеотидов может быть единственным сайтом, имеющим химический состав или структуру, выполненную с возможностью присоединения к матричному полинуклеотиду с соответствующим химическим составом или структурой для присоединения к нему. Для сравнения, один или более вспомогательных сайтов для связывания могут иметь другой химический состав или структуру, которая не совместима со связыванием или присоединением к матричному полинуклеотиду. Вместо этого один или более вспомогательных сайтов для связывания могут иметь химический состав или структуру, совместимую для связывания или присоединения к другим композициям или структурам, с которыми должны связываться вспомогательные сайты для связывания, например вспомогательные олигонуклеотиды, полимеры и т. п., и несовместимую со связыванием или присоединением к матричному полинуклеотиду. Таким образом, матричный полинуклеотид не способен связываться или присоединяться к одному или более вспомогательным сайтам для связывания, что приводит к присоединению только одного матричного полинуклеотида на каждую наночастицу, на один сайт для связывания матричного полинуклеотида наночастицы.
[0060] Матричный полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, полученный из образца, такой как полидезоксирибонуклеиновая кислота, выделенная из образца, или молекулу кДНК, скопированную из молекулы мРНК, полученной из образца. Процесс SBS может быть выполнен, например, для определения нуклеотидной последовательности матричного полинуклеотида или для идентификации одного или более полиморфизмов или альтераций в генетической последовательности матричного полинуклеотида по сравнению с эталонной последовательностью. Библиотеку можно получить из одного или более образцов, причем библиотека содержит множество матричных полинуклеотидов, полученных из одного или более образцов. Матричные полинуклеотиды могут быть получены путем получения полинуклеотидных последовательностей, которые представляют собой участки последовательностей, присутствующих в образце или скопированных из образца. Путем секвенирования множества матричных полинуклеотидов в процессе SBS в отношении матричных полинуклеотидов можно определить последовательность, генотип или другую информацию, связанную с последовательностью, а также информацию об образце, из которого была получена библиотека, во время сбора и анализа информации о последовательности множества матричных полинуклеотидов в библиотеке.
[0061] Матричный полинуклеотид может быть обработан в ходе процесса получения матричного полинуклеотида из образца. Часть обработки может включать добавление полинуклеотидных последовательностей, например, к 5-штрих, 3-штрих или к обоим концам матрицы, чтобы способствовать обработке SBS субпоследовательностей. Как дополнительно описано в настоящем документе, матричный полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован путем добавления элементов, стимулирующих или допускающих образование связи с сайтом на наночастице.
[0062] Матричный полинуклеотид может иметь любую заданную длину, подходящую для получения информации о секвенировании в процессе SBS. Например, матричный полинуклеотид может иметь длину около 50 нуклеотидов, длину около 75 нуклеотидов, длину около 100 нуклеотидов, длину около 125 нуклеотидов, длину около 150 нуклеотидов, длину около 175 нуклеотидов, длину около 200 нуклеотидов, длину около 225 нуклеотидов, длину около 250 нуклеотидов, длину около 275 нуклеотидов, длину около 300 нуклеотидов, длину около 325 нуклеотидов, длину около 350 нуклеотидов, длину около 375 нуклеотидов, длину около 400 нуклеотидов, длину около 425 нуклеотидов, длину около 450 нуклеотидов, длину около 475 нуклеотидов, длину около 500 нуклеотидов, длину около 525 нуклеотидов, длину около 550 нуклеотидов, длину около 575 нуклеотидов, длину около 600 нуклеотидов, длину около 625 нуклеотидов, длину около 650 нуклеотидов, длину около 675 нуклеотидов, длину около 700 нуклеотидов, длину около 725 нуклеотидов, длину около 750 нуклеотидов, длину около 775 нуклеотидов, длину около 800 нуклеотидов, длину около 825 нуклеотидов, длину около 850 нуклеотидов, длину около 875 нуклеотидов, длину около 900 нуклеотидов, длину около 925 нуклеотидов, длину около 950 нуклеотидов, длину около 975 нуклеотидов, длину около 1000 нуклеотидов, длину около 1025 нуклеотидов, длину около 1050 нуклеотидов, длину около 1075 нуклеотидов, длину около 1100 нуклеотидов, длину около 1125 нуклеотидов, длину около 1150 нуклеотидов, длину около 1175 нуклеотидо, длину около 1200 нуклеотидов, длину около 1225 нуклеотидов, длину около 1250 нуклеотидов, длину около 1275 нуклеотидов, длину около 1300 нуклеотидов, длину около 1325 нуклеотидов, длину около 1350 нуклеотидов, длину около 1375 нуклеотидов, длину около 1400 нуклеотидов, длину около 1425 нуклеотидов, длину около 1450 нуклеотидов, длину около 1475 нуклеотидов, длину около 1500 нуклеотидов или более.
[0063] В некоторых примерах на наночастице могут присутствовать две или более разных популяций вспомогательных сайтов для связывания, некоторые из которых имеют один тип химического состава или структуры, совместимый со связыванием или присоединением к одной популяции композиций или структур, а другие имеют второй тип химического состава или структуры, совместимый со связыванием или присоединением к другой популяции композиций или структур. Например, одна популяция вспомогательных сайтов может иметь химический состав или структуру, совместимую со связыванием со вспомогательными олигонуклеотидами, которые могут связываться с копиями матричных полинуклеотидов, участвующих, например, в кластеризации матричного полинуклеотида на наночастице, как более подробно описано ниже, в то время как другие вспомогательные сайты могут иметь другой химический состав или структуру, совместимую со связыванием или присоединением к поверхности субстрата для выполнения SBS.
[0064] Наночастица может содержать каркас. Каркас представляет собой структурный компонент наночастицы, занимающий объем в соответствии с минимальной требуемой величиной расстояния между матричными наночастицами или максимальной плотностью матричных наночастиц, присоединенных к наночастицам в соответствии с необходимостью для данного применения. Каркас может содержать вышеупомянутые сайты связывания, как в одном сайте связывания матричных полинуклеотидов, так и в одном или более вспомогательных сайтах связывания. Каркас с сайтами для связывания вместе могут представлять собой наночастицу. Каркас может быть синтезирован таким образом, чтобы включать в себя, и может включать в себя после синтеза, более одного типа химического состава или структуры для присоединения. Это означает, что он может быть синтезирован таким образом, чтобы включать или быть модифицированным чтобы включать один сайт присоединения к матричному полинуклеотиду плюс один или более добавочных сайтов для связывания с химическим составом или структурой, отличными от одного сайта для связывания матричного полинуклеотида, соответствующего вспомогательным сайтам для связывания.
[0065] Каркас может содержать асимметричный полимер, причем несколько полимерных цепей отходят от ядра каркаса, которое также содержит другой сайт связывания для матричного полинуклеотида. Полимерные цепи, линейные или разветвленные, могут отходить от ядра каркаса с вспомогательными сайтами связывания на полимерах, а другой сайт связывания с химической структурой связывания, ортогональной по отношению к химической структуре связывания вспомогательных сайтов связывания, находится на ядре каркаса для связывания с одним матричным полинуклеотидом. В одном примере каркас может содержать ядро, от которого отходят гетерополимеры или гомополимеры, содержащие акриламидный мономер, включая вспомогательные сайты связывания, и другой сайт связывания с другой химической структурой связывания для связывания матричного полинуклеотида. В одном примере ядро каркаса может содержать точки присоединения для двух или трех линейных или разветвленных полимеров.
[0066] В одном примере ядро может содержать два или три линейных или разветвленных полимера, по отдельности связанных с ядром каркаса. Не имеющим ограничительного характера примером каркаса является соединение формулы I:
,
каждый X представляет собой соединение формулы II:
,
где R2 выбирают из формулы IIIa:
,
где R5 выбирают из , , , и , x представляет собой целое число в диапазоне 1-2000, y представляет собой целое число в диапазоне 1-10 000, и соотношение x : y может составлять от около 10 : 90 до около 1 : 99, и где каждый Rz независимо представляет собой H или C1-4 алкил, и формулы IIIb:
[0067] ,
где R5 выбирают из , , , и , y представляет собой целое число в диапазоне 1-2000, а x и z представляют собой целые числа, сумма которых находится в диапазоне от 1-10 000, и соотношение (x : y): z может составлять от приблизительно (85) : 15 до приблизительно (95) : 5, и где каждый Rz независимо представляет собой H или C1-4 алкил, R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из необязательно замещенного C1-C20 алкила, необязательно замещенного C1-C20 алкенила, необязательно замещенного C1-C20 алкинила, необязательно замещенного C1-C20 оксаалкила, необязательно замещенного C1-C20 тиаалкила и необязательно замещенного C1-C20 азаалкила, где замещение включает замещение одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов. В любом из приведенных выше примеров тритиокарбонатная группа может быть необязательно замещена прямой связью, -CH2- связью, -S- связью, -N- связью или -O- связью.
[0068] В другом примере, где R2 представляет собой соединение формулы IIIa
,
y может быть равно 0, а x может быть целым числом от 1 до 2000.
[0069] В одном примере R1 включает в себя сайт связывания амин-NHS сложного эфира, сайт связывания амин-сложного имидоэфира, сайт связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайт связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайт связывания карбоксил-карбодиимида, сайт связывания тиол-малеимида, сайт связывания тиол-галогенацетила, сайт связывания тиол-пиридил дисульфида, сайт связывания тиол-тиосульфоната, сайт связывания тиол-винилсульфона, сайт связывания альдегид-гидразида, сайт связывания альдегид-алкоксиамина, сайт связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайт связывания гидрокси-изоцианата, сайт связывания азид-алкина, сайт связывания азид-фосфина, сайт связывания трансциклооктен-тетразина, сайт связывания норборнен-тетразина, сайт связывания азид-циклооктина, сайт связывания азид-норборнена, сайт связывания оксима, сайт связывания SpyTag-SpyCatcher, сайт связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайт связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина или сайт связывания присоединения сортазы. В конкретном не имеющем ограничительного характера примере R1 включает в себя аминогруппу, тетразиновую группу или дибензоциклооктеновую группу.
[0070] В одном примере каждый R3 может включать в себя сайт связывания амин-NHS сложного эфира, сайт связывания амин-сложного имидоэфира, сайт связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайт связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайт связывания карбоксил-карбодиимида, сайт связывания тиол-малеимида, сайт связывания тиол-галогенацетила, сайт связывания тиол-пиридил дисульфида, сайт связывания тиол-тиосульфоната, сайт связывания тиол-винилсульфона, сайт связывания альдегид-гидразида, сайт связывания альдегид-алкоксиамина, сайт связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайт связывания гидрокси-изоцианата, сайт связывания азид-алкина, сайт связывания азид-фосфина, сайт связывания трансциклооктен-тетразина, сайт связывания норборнен-тетразина, сайт связывания азид-циклооктина, сайт связывания азид-норборнена, сайт связывания оксима, сайт связывания SpyTag-SpyCatcher, сайт связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайт связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайт связывания присоединения сортазы. В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каждый R3 включает в себя азидную группу.
[0071] В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0072] В другом примере Х может включать в себя
.
В другом примере Х может включать в себя
.
В другом примере Х может включать в себя
.
[0073] В другом примере R1 связан с матричным полинуклеотидом, а один или более R3 связаны со вспомогательным веществом, таким как вспомогательный олигонуклеотид. В другом примере вспомогательный олигонуклеотид присоединен к нуклеотидной последовательности, которая представляет собой копию матричного полинуклеотида или является комплементарной матричному полинуклеотиду.
[0074] Другим не имеющим ограничительного характера примером каркаса является соединение формулы IV
,
каждый X представляет собой соединение формулы V:
,
где R2 выбирают из формулы VIa:
и формулы VIb:
,
где p представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, а R5 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов, R3 выбирают из прямой связи, , , , , и , m представляет собой целое число от 1 до 2000, а n представляет собой целое число от 1 до 10 000, R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из необязательно замещенного C1-C20 алкила, необязательно замещенного C1-C20 алкенила, необязательно замещенного C1-C20 алкинила, необязательно замещенного C1-C20 оксаалкила, необязательно замещенного C1-C20 тиаалкила и необязательно замещенного C1-C20 азаалкила, где замещение включает замещение одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов. В любом из приведенных выше примеров тритиокарбонатная группа может быть необязательно замещена прямой связью, -CH2- связью, -S- связью, -N- связью или -O- связью.
[0075] В одном примере R1 включает в себя сайт связывания амин-NHS сложного эфира, сайт связывания амин-сложного имидоэфира, сайт связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайт связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайт связывания карбоксил-карбодиимида, сайт связывания тиол-малеимида, сайт связывания тиол-галогенацетила, сайт связывания тиол-пиридил дисульфида, сайт связывания тиол-тиосульфоната, сайт связывания тиол-винилсульфона, сайт связывания альдегид-гидразида, сайт связывания альдегид-алкоксиамина, сайт связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайт связывания гидрокси-изоцианата, сайт связывания азид-алкина, сайт связывания азид-фосфина, сайт связывания трансциклооктен-тетразина, сайт связывания норборнен-тетразина, сайт связывания азид-циклооктина, сайт связывания азид-норборнена, сайт связывания оксима, сайт связывания SpyTag-SpyCatcher, сайт связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайт связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина или сайт связывания присоединения сортазы. В другом примере R1 включает в себя сайт связывания с суперспиралью или сайт связывания авидина с биотином. В конкретном не имеющем ограничительного характера примере R1 включает в себя аминогруппу, тетразиновую группу или дибензоциклооктеновую группу.
[0076] В одном примере каждый R5 может включать в себя сайт связывания амин-NHS сложного эфира, сайт связывания амин-сложного имидоэфира, сайт связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайт связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайт связывания карбоксил-карбодиимида, сайт связывания тиол-малеимида, сайт связывания тиол-галогенацетила, сайт связывания тиол-пиридил дисульфида, сайт связывания тиол-тиосульфоната, сайт связывания тиол-винилсульфона, сайт связывания альдегид-гидразида, сайт связывания альдегид-алкоксиамина, сайт связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайт связывания гидрокси-изоцианата, сайт связывания азид-алкина, сайт связывания азид-фосфина, сайт связывания трансциклооктен-тетразина, сайт связывания норборнен-тетразина, сайт связывания азид-циклооктина, сайт связывания азид-норборнена, сайт связывания оксима, сайт связывания SpyTag-SpyCatcher, сайт связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайт связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина или сайт связывания присоединения сортазы. В другом примере каждый R5 включает в себя сайт связывания с суперспиралью или сайт связывания авидина с биотином. В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каждый R5 включает в себя азидную группу.
[0077] В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0078] В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
где R6 выбирают из
, , , и .
[0079] В другом конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0080] В другом конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0081] В другом примере R1 связан с матричным полинуклеотидом, а один или более R5 связаны со вспомогательным веществом, таким как вспомогательный олигонуклеотид. В другом примере вспомогательный олигонуклеотид присоединен к нуклеотидной последовательности, которая представляет собой копию матричного полинуклеотида или является комплементарной матричному полинуклеотиду.
[0082] В другом примере ядро каркаса может представлять собой или может быть получено из молекулы-предшественника триазина. Не имеющим ограничительного характера примером каркаса является соединение формулы IV:
,
каждый X представляет собой соединение формулы VIII:
,
где y представляет собой целое число от 1 до 20, R2 выбирают из формулы IXa:
и формулы IXb:
,
где p представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, а R5 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов, R3 выбирают из прямой связи, , , , , и , m представляет собой целое число от 1 до 2000, а n представляет собой целое число от 1 до 10 000, R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из необязательно замещенного C1-C20 алкила, необязательно замещенного C1-C20 алкенила, необязательно замещенного C1-C20 алкинила, необязательно замещенного C1-C20 оксаалкила, необязательно замещенного C1-C20 тиаалкила и необязательно замещенного C1-C20 азаалкила, где замещение включает замещение одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов. В любом из приведенных выше примеров тритиокарбонатная группа может быть необязательно замещена прямой связью, -CH2- связью, -S- связью, -N- связью или -O- связью.
[0083] В одном примере R1 включает в себя сайт связывания амин-NHS сложного эфира, сайт связывания амин-сложного имидоэфира, сайт связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайт связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайт связывания карбоксил-карбодиимида, сайт связывания тиол-малеимида, сайт связывания тиол-галогенацетила, сайт связывания тиол-пиридил дисульфида, сайт связывания тиол-тиосульфоната, сайт связывания тиол-винилсульфона, сайт связывания альдегид-гидразида, сайт связывания альдегид-алкоксиамина, сайт связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайт связывания гидрокси-изоцианата, сайт связывания азид-алкина, сайт связывания азид-фосфина, сайт связывания трансциклооктен-тетразина, сайт связывания норборнен-тетразина, сайт связывания азид-циклооктина, сайт связывания азид-норборнена, сайт связывания оксима, сайт связывания SpyTag-SpyCatcher, сайт связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайт связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина или сайт связывания присоединения сортазы. В другом примере R1 включает в себя сайт связывания с суперспиралью или сайт связывания авидина с биотином. В конкретном не имеющем ограничительного характера примере R1 включает в себя аминогруппу, тетразиновую группу или дибензоциклооктеновую группу.
[0084] В одном примере каждый R5 может включать в себя сайт связывания амин-NHS сложного эфира, сайт связывания амин-сложного имидоэфира, сайт связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайт связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайт связывания карбоксил-карбодиимида, сайт связывания тиол-малеимида, сайт связывания тиол-галогенацетила, сайт связывания тиол-пиридил дисульфида, сайт связывания тиол-тиосульфоната, сайт связывания тиол-винилсульфона, сайт связывания альдегид-гидразида, сайт связывания альдегид-алкоксиамина, сайт связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайт связывания гидрокси-изоцианата, сайт связывания азид-алкина, сайт связывания азид-фосфина, сайт связывания трансциклооктен-тетразина, сайт связывания норборнен-тетразина, сайт связывания азид-циклооктина, сайт связывания азид-норборнена, сайт связывания оксима, сайт связывания SpyTag-SpyCatcher, сайт связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайт связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина или сайт связывания присоединения сортазы. В другом примере каждый R5 включает в себя сайт связывания с суперспиралью или сайт связывания авидина с биотином. В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каждый R5 включает в себя азидную группу.
[0085] В конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0086] В другом конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
где R6 выбирают из
, , , и .
[0087] В другом конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0088] В другом конкретном не имеющем ограничительного характера примере каркас содержит следующую структуру (в которой для простоты только один X показан полностью, но два других X имеют такую же структуру, что и полностью показанный X):
[0089] В другом примере R1 связан с матричным полинуклеотидом, а один или более R5 связаны со вспомогательным веществом, таким как вспомогательный олигонуклеотид. В другом примере вспомогательный олигонуклеотид присоединен к нуклеотидной последовательности, которая представляет собой копию матричного полинуклеотида или является комплементарной матричному полинуклеотиду.
[0090] Полимерные цепи могут быть выращены из ядра каркаса с использованием способов контролируемой радикальной полимеризации (CRP; controlled radical polymerization). Полимер может быть выращен из ядра каркаса с помощью способа полимеризации с обратимой передачей цепи по механизму присоединения-фрагментации (RAFT; Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer), способа радикальной полимеризации с переносом атома (ATRP; Atom Transfer Radical Polymerization) или способа нитроксид-опосредованной радикальной полимеризации (NMP; nitroxide-mediated radical polymerization). В другом примере полимер можно синтезировать, а затем связать с ядром каркаса. Способ CRP может включать жесткий контроль степени полимеризации (DP; degree of polymerization) полимеров, присоединенных к ядру каркаса, и, следовательно, контроль молекулярной массы полимера и размера наночастиц. Например, DP около 100 на цепь, около 150 на цепь, около 200 на цепь, около 250 на цепь, около 300 на цепь, около 350 на цепь, около 400 на цепь, около 450 на цепь, около 500 на цепь, можно использовать около 550 на цепь, около 600 на цепь, около 650 на цепь, около 700 на цепь, около 750 на цепь, около 800 на цепь, около 850 на цепь, около 900 на цепь, около 950 на цепь, около 1000 на цепь, около 1050 на цепь, около 1100 на цепь, около 1150 на цепь, около 1200 на цепь, около 1250 на цепь, около 1300 на цепь, около 1350 на цепь, около 1400 на цепь, около 1450 на цепь, около 1500 на цепь, около 1550 на цепь, около 1600 на цепь, около 1650 на цепь, около 1700 на цепь, около 1750 на цепь, около 1800 на цепь, около 1850 на цепь, около 1900 на цепь, около 1950 или около 2000 на цепь. В некоторых примерах после выращивания первого такого полимера из ядра каркаса второй такой полимер может быть дополнительно получен из первого полимера с помощью RAFT-процесса в виде «живого» RAFT-процесса полимеризации.
[0091] В другом примере каркас может содержать дендрон, в котором конститутивное повторяющееся звено содержит аминокислоту лизина, и в котором лизин представляет собой точку ветвления, причем полимеризация происходит путем образования пептидной связи между карбоновой кислотой аминокислоты альфа-аминогруппы лизина непосредственно вышележащего поколения, и изопептидной связи между эпсилон-аминоконцом лизина непосредственно вышележащего поколения. Таким образом, лизин функционирует в дендримерной структуре в качестве точки ветвления. В одном примере звено ядра дендримера может содержать лизин. Например, карбоновая кислота лизина звена ядра может присоединяться к одному сайту для связывания матричного полинуклеотида, тогда как альфа- и эпсилон- аминогруппы могут ответвляться и присоединяться к нижележащим аминокислотам. Например, цистеин может быть присоединен к лизину ядра, обеспечивая один сайт для связывания тиолового матричного полинуклеотида. В других примерах другие аминокислоты, модифицированные аминокислоты или другие структуры могут отходить от лизина ядра с образованием одного сайта для связывания матричного полинуклеотида. Концевые группы большинства нижележащих ветвей дендронов могут содержать вспомогательные сайты связывания. Например, вспомогательные сайты связывания могут включать в себя лизильные альфа- и эпсилон- аминогруппы концевых поколений дендрона. В настоящем документе термины «нижележащий» и «вышележащий» относятся к направлениям вдоль цепи ответвления по отношению к коровой области дендрона, при этом термин «вышележащий» означает «в направлении коровой области» и «нижележащий» означает «в направлении концевых звеньев разветвленных цепей». Дендрон может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 или более поколений.
[0092] В одном примере вышележащий лизин, присоединен к двум нижележащим лизинам посредством его альфа- и эпсилон- аминогрупп. Каждый такой нижележащий лизин может аналогичным образом присоединяться к двум дополнительным лизинам посредством образования пептидных и изопептидных связей с их альфа- и эпсилон- аминогруппами, что приводит к образованию дендрона конститутивных повторяющихся звеньев лизинов, каждое из которых присоединено посредством их вышележащей карбоновой кислоты к аминогруппе вышележащего лизина и двум нижележащим лизинам посредством их аминогрупп.
[0093] В другом примере каркас может содержать первую полипептидную последовательность, содержащую один или более остатков лизина в полипептиде. Один или более таких лизинов могут образовывать изопептидную связь со следующим полипептидом посредством его эпсилон-аминогруппы, а также пептидную связь со смежной аминокислотой в полипептиде посредством его альфа-аминогруппы. Такой следующий полипептид может также представлять собой или включать в себя один или более лизинов, и один или более таких лизинов следующего полипептида могут образовывать изопептидную связь с добавочным полипептидом посредством его эпсилон-аминогруппы, а также пептидную связь со смежной аминокислотой в следующем полипептиде посредством его альфа-аминогруппы. Такой добавочный полипептид также может содержать один или более лизинов, образующих одну или более изопептидных связей с одним или более дополнительными полипептидами и т. п. Могут быть дополнительно включены последовательные полинуклеотиды с последовательными точками ветвления лизина. В данном примере каркас содержит полипептиды, присоединенные друг к другу в разветвленном образовании, соединенные остатками лизина. Первая полипептидная последовательность может содержать один сайт для связывания матричного полинуклеотида или быть присоединена к нему, а последние полипептиды (например, следующий, добавочный, дополнительный или последующий полипептид, который не содержит лизина, образующего изопептидную связь с последовательным полипептидом) могут содержать вспомогательные сайты связывания (такие как, например, на концевой аминогруппе N-концевой аминокислоты, эпсилон-аминокислоты лизина последних полипептидов или и то и другое) последних полипептидов.
[0094] Матричный полинуклеотид для присоединения к каркасу может иметь любую подходящую длину, включая для секвенирования в процессе SBS. Например, матричный полинуклеотид может иметь длину около 50 нуклеотидов, длину около 75 нуклеотидов, длину около 100 нуклеотидов, длину около 125 нуклеотидов, длину около 150 нуклеотидов, длину около 175 нуклеотидов, длину около 200 нуклеотидов, длину около 225 нуклеотидов, длину около 250 нуклеотидов, длину около 275 нуклеотидов, длину около 300 нуклеотидов, длину около 325 нуклеотидов, длину около 350 нуклеотидов, длину около 375 нуклеотидов, длину около 400 нуклеотидов, длину около 425 нуклеотидов, длину около 450 нуклеотидов, длину около 475 нуклеотидов, длину около 500 нуклеотидов, длину около 525 нуклеотидов, длину около 550 нуклеотидов, длину около 575 нуклеотидов, длину около 600 нуклеотидов, длину около 625 нуклеотидов, длину около 650 нуклеотидов, длину около 675 нуклеотидов, длину около 700 нуклеотидов, длину около 725 нуклеотидов, длину около 750 нуклеотидов, длину около 775 нуклеотидов, длину около 800 нуклеотидов, длину около 825 нуклеотидов, длину около 850 нуклеотидов, длину около 875 нуклеотидов, длину около 900 нуклеотидов, длину около 925 нуклеотидов, длину около 950 нуклеотидов, длину около 975 нуклеотидов, длину около 1000 нуклеотидов, длину около 1100 нуклеотидов, длину около 1200 нуклеотидов, длину около 1300 нуклеотидов, длину около 1400 нуклеотидов, длину около 1500 нуклеотидов, длину около 1600 нуклеотидов, длину около 1700 нуклеотидов, длину около 1800 нуклеотидов, длину около 1900 нуклеотидов, длину около 2000 нуклеотидов или более.
[0095] Прикрепление одного матричного полинуклеотида или вспомогательного вещества (например, вспомогательного олигонуклеотида, вспомогательной композиции или вспомогательной структуры) к каркасу можно осуществить путем включения функциональных групп или структур на каркасе и матричном полинуклеотиде или вспомогательном веществе, комплементарных друг другу, причем это означает, что они выполнены с возможностью связывания друг с другом ковалентно или нековалентно с образованием соединения между ними. Они могут быть комплементарными для ковалентного связывания или комплементарными для нековалентного связывания. Каркас может содержать один матричный сайт с функциональной группой или структурой, которая является комплементарной функциональной группе или структуре (один матричный сайт), присоединенной к матричному полинуклеотиду. Каркас может также содержать или быть присоединен к другим функциональным группам или структурам, которые являются комплементарными или содержат функциональную группу или структуру (вспомогательные сайты), присоединенную к вспомогательному веществу. Следует избегать перекрестной реактивности между фрагментом или структурой, присоединенной к матричному полинуклеотиду, и функциональной группой или структурой вспомогательного сайта во избежание присоединения к каркасу более одного матричного полинуклеотида. Также следует избегать перекрестной реактивности между функциональной группой или структурой, присоединенной к вспомогательному веществу, и функциональной группой или структурой одного матричного сайта, чтобы предотвратить заполнение одного матричного сайта вспомогательными веществами, которые препятствуют присоединению к ним одного матричного полинуклеотида. В некоторых примерах такую перекрестную реактивность можно предотвратить путем химического блокирования одного матричного сайта или вспомогательных сайтов, когда вспомогательные вещества связываются с вспомогательными сайтами или с одним матричным полинуклеотидом, присоединенными к одному матричному сайту соответственно, а затем разблокирования незаполненного сайта, чтобы обеспечить присоединение к нему одного матричного полинуклеотида или вспомогательного полинуклеотида.
[0096] Неисключительный перечень партнеров по комплементарному связыванию представлен в таблице 1.
или BCN (бицикло[6.1.0]нонин)
MKGSSHHHHHHVDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATK (SEQ ID NO:2)
[0097] Любое из вышеперечисленного может быть добавлено к каркасу или включено в него, как описано в настоящем документе, для присоединения к матричному полинуклеотиду или вспомогательным веществам, таким как вспомогательные олигонуклеотиды, причем матричный полинуклеотид или вспомогательное вещество могут включать в себя или могут быть модифицированы, чтобы включать комплементарную функциональную группу или структуру вышеуказанных пар для связывания с каркасом.
[0098] Можно использовать любые подходящие способы биоконъюгации для добавления или образования связей между такими парами комплементарных функциональных групп или структур. Модифицированные нуклеотиды могут быть коммерчески доступными, обладая примерами тех или иных примеров таких пар комплементарных функциональных групп или структур, а также известны способы включения одного или более из таких примеров функциональных групп или структур в полимер, нуклеотид или полинуклеотид или их присоединения к ним или включения в них. Также коммерчески доступными могут быть бифункциональные линкерные молекулы с функциональной группой или структурой из одной комплементарной пары партнеров по связыванию, перечисленных в таблице 1, на одном конце и функциональной группой или структурой из другой комплементарной пары партнеров по связыванию, перечисленных в таблице 1. Функциональная группа или структура каркаса, матричный полинуклеотид, или вспомогательное вещество, или олигонуклеотид, или полипептид, присоединенные к любому из вышеуказанных элементов таким образом, чтобы обеспечить функциональную группу или структуру для связывания между любыми из таких вышеуказанных элементов, могут быть связаны с одним концом такого линкера, что приводит к тому, что исходную функциональную группу или структуру эффективно замещают другой, т. е. функциональной группой или структурой, присутствующей на другом конце линкера.
[0099] Модифицированные аминокислоты могут быть коммерчески доступными, обладая примерами тех или иных примеров таких пар комплементарных функциональных групп или структур, а также известны способы включения одного или более из таких примеров функциональных групп или структур в аминокислоту или полипептид или их присоединение к ним. Известны способы образования связей между членами таких пар комплементарных функциональных групп или структур. Таким образом, такие комплементарные функциональные группы или структуры могут быть добавлены или включены в каркас и матричный полинуклеотид или каркас и вспомогательное вещество для образования сайтов связывания и обеспечения соединения между ними.
[0100] Используемый в настоящем документе термин «полипептид» означает цепь аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Термины «белок» и «полипептид» могут использоваться взаимозаменяемо. Полипептид может включать в себя последовательность из ряда аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями, при этом число аминокислот может составлять около 2 или более, около 5 или более, около 10 или более, около 15 или более, около 20 или более, около 25 или более, около 30 или более, около 35 или более, около 40 или более, около 45 или более, около 50 или более, около 55 или более, около 60 или более, около 65 или более, около 70 или более, около 75 или более, около 80 или более, около 85 или более, около 90 или более, около 95 или более, около 100 или более, около 110 или более, около 120 или более, около 130 или более, приблизительно 140 или более, около 150 или более, около 160 или более, около 170 или более, около 180 или более, около 190 или более, около 200 или более, около 225 или более, около 250 или более, около 275 или более, около 300 или более, около 325 или более, около 350 или более, около 375 или более, около 400 или более, около 425 или более, около 450 или более, около 475 или более, около 500 или более, около 550 или более, около 600 или более, около 650 или более, около 700 или более, около 750 или более, около 800 или более, около 850 или более, около 900 или более, около 950 или более, около 1000 или более.
[0101] В некоторых случаях полипептид или белок может принимать структуру или трехмерную конформацию, способствующую или допускающую связывание с другим партнером по связыванию, таким как другой полипептид, который также принимает трехмерную структуру, способствующую такому связыванию, или другими партнерами по небелковому связыванию. Полипептид также может принимать трехмерную конформацию, способствующую выполнению ферментативных реакций на других полипептидах субстрата или других молекулах, или таким образом, чтобы служить субстратом для другой ферментативной или другой реакции. Полипептид также может принимать трехмерную конформацию, так что сайт или сайты, такие как аминоконец, карбоксильный конец, боковая группа аминокислоты или модификация аминокислоты, могут быть доступны для связывания с другой молекулой.
[0102] Для присоединения матричного полинуклеотида к каркасу можно использовать различные химические соединения для биоконъюгации. Химическая функциональная группа может быть включена в такой сайт или присоединена к нему с возможностью образования ковалентной конъюгации с комплементарной химической функциональной группой, причем комплементарная функциональная группа может быть присоединена или включена в матричный полинуклеотид. Затем матричный полинуклеотид может быть конъюгирован с каркасом, например, посредством ковалентного соединения между комплементарными химическими функциональными группами.
[0103] В другом примере каркас может содержать или быть присоединен, в качестве одного матричного сайта, к полипептидной последовательности, способной образовывать ковалентное соединение с другой полипептидной последовательностью или другой химической функциональной группой. Затем такой другой полипептид или другая химическая функциональная группа может быть включена в матричный полинуклеотид или присоединена к нему таким образом, что один матричный сайт каркаса и матричный полинуклеотид могут ковалентно связываться друг с другом. В альтернативном варианте осуществления матричный полинуклеотид может иметь первую такую полипептидную последовательность, а один матричный сайт каркаса может иметь другую полипептидную последовательность или другую химическую функциональную группу, способную ковалентно связываться с полипептидной последовательностью матричного полинуклеотида. Не имеющие ограничительного характера примеры таких пар включают в себя систему SpyTag/SpyCatcher, систему Snap-тег/O6-бензилгуанин и систему CLIP-тег/O2-бензилцитозин.
[0104] Могут быть доступны аминокислотные последовательности для комплементарных пар системы SpyTag/SpyCatcher и кодирующих их полинуклеотидов. Примеры последовательностей представлены в таблице 1. Для включения в рекомбинантные полипептиды может быть доступно несколько мутаций сайта аминокислот для последовательности SpyTag и для последовательности SpyCatcher. Snap-тег представляет собой функциональную O-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазу, а CLIP-тег представляет собой модифицированную версию Snap-тега. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Snap-тег, CLIP-тег, SpyCatcher, могут быть коммерчески доступными для субклонирования и включения в сконструированные полипептидные последовательности.
[0105] В альтернативном варианте осуществления комплементарные пары для ковалентного присоединения к одному матричному сайту каркаса и матричному полинуклеотиду могут быть ковалентно присоединены друг к другу посредством ферментативно катализируемого образования ковалентной связи. Например, один матричный сайт каркаса и матричный полинуклеотид могут включать мотивы, способные к ковалентному соединению друг с другом посредством опосредованного сортазой присоединения, например аминокислотную последовательность LPXTG на одной и олигоглициновую нуклеофильную последовательность на другой (с повтором, например, от 3 до 5 глицинов). Затем можно провести опосредованную сортазой транспептидацию, что приводит к ковалентному присоединению каркаса и матричного полинуклеотида к одному матричному сайту.
[0106] В другом примере каркас может содержать участок для нековалентного присоединения одного матричного полинуклеотида к одному матричному сайту. Например, каркас может содержать олигонуклеотид для гибридизации с концом матричного полинуклеотида посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику. В другом примере каркас и матричный полинуклеотид могут содержать комплементарные сайты связывания пептида или могут быть присоединены к ним. Например, каркас и матричный полинуклеотид могут содержать пептидные последовательности, которые могут связываться друг с другом как комплементарные пары суперспирального мотива. Суперспиральный мотив является структурным элементом некоторых полипептидов, в котором каждая из двух или более полипептидных цепей образует вторичную альфа-спиральную структуру, а альфа-спирали скручиваются вместе с образованием плотной нековалентной связи. Суперспиральная последовательность может содержать гептадный повтор, повторяющуюся структуру из семи аминокислот HPPHCPC (где H обозначает гидрофобную аминокислоту, C обычно обозначает заряженную аминокислоту, а P обозначает полярную, гидрофильную аминокислоту). Пример повтора гептада можно найти в суперспирали «лейциновая застежка», в которой четвертая аминокислота гептада часто представляет собой лейцин.
[0107] Каркас может содержать одну аминокислотную последовательность, которая образует часть пары связывания суперспирали, или быть присоединен к ней, а матричный полинуклеотид может быть присоединен к другой аминокислотной последовательности, которая образует другую часть пары связывания суперспирали, комплементарной последовательности, которая расположена или присоединена к каркасу таким образом, что обе присоединяются друг к другу. Например, каркас может быть ковалентно присоединен к одной аминокислотной последовательности, которая образует часть пары связывания суперспирали, а матричный полинуклеотид может быть присоединен к другой аминокислотной последовательности, которая образует другую часть пары связывания суперспирали, комплементарной последовательности, которая расположена или присоединена к каркасу таким образом, что обе присоединяются друг к другу.
[0108] В другом примере каждый из каркаса и матричного полинуклеотида может содержать или быть присоединен к другим комплементарным партнерам пар пептидов, которые нековалентно связываются друг с другом. Пример включает в себя пару связывания биотин-авидин. Пептиды биотина и авидина (такие как авидин, стрептавидин и нейтравидин, все из которых в настоящем документе вместе называются «авидином», если конкретно не указано иное) образуют сильные нековалентные связи друг с другом. Одна часть такой пары, независимо от того, относится ли она к связывающей части биотина или авидина, может быть частью или быть присоединена либо к каркасу, либо к матричному полинуклеотиду, причем комплементарная часть соответственно является частью или присоединена к каркасу или матричному полинуклеотиду, обеспечивая нековалентное соединение между ними.
[0109] Доступно множество способов включения одной или более биотиновых функциональных групп в молекулу ДНК или добавления одной или более биотиновых функциональных групп к молекуле ДНК, матричному полинуклеотиду, каркасу, олиго-ДНК, другому полипептиду или другой композиции для связывания молекул вместе, как описано в настоящем документе (например, матричных полинуклеотидов с каркасом или вспомогательных веществ с каркасом). Например, биотинилированные нуклеотиды являются коммерчески доступными для включения в молекулу ДНК посредством полимеразы, а наборы коммерчески доступны для добавления биотиновой функциональной группы к полинуклеотиду или полипептиду. Остатки биотина также можно добавлять к аминокислотам, или модифицированным аминокислотам, или нуклеотидам, или модифицированным нуклеотидам. Химические связывающие соединения, показанные в таблице 1, также можно использовать для добавления биотиновой группы к белкам, таким как карбоксильные группы, аминогруппы или тиольные группы. Для ферментативно нацеленного биотинилирования также доступно несколько биотин-лигазных ферментов, таких как полипептиды (например, лизиновый остаток аминокислотной последовательности AviTag GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:3), включенной в полипептид). Также доступна генетически сконструированная аскорбатпероксидаза (APEX; ascorbate peroxidase) для модификации биотина, позволяющая биотинилировать электронодонорные аминокислоты, такие как тирозин, и, возможно, триптофан, цистеин или гистидин.
[0110] В другом примере полипептид, включающий аминокислотную последовательность DSLEFIASKLA (SEQ ID NO:4), может быть биотинилирован (на большем N-конце из двух S остатков, присутствующих в последовательности), который представляет собой субстрат для катализируемого Sfp фосфопантетеин-трансферазой ковалентного присоединения к нему с малыми молекулами, конъюгированными с коферментом A (CoA). Например, полипептид, включающий эту последовательность, может быть биотинилирован посредством ковалентного присоединения к нему с помощью конъюгата CoA-биотин. Данную систему также можно использовать для присоединения многих других типов связывающих функциональных групп или структур, указанных в таблице 1, для использования при создании сайтов связывания для связывания каркаса с молекулой ДНК, или полипептидом, или другой молекулой, как описано в настоящем документе. Например, CoA, конъюгированный с любой из реакционноспособных пар функциональных групп, указанных в таблице 1, может быть ковалентно присоединен к полипептиду, содержащему идентифицированную выше последовательность, посредством Sfp фосфопантетеин-трансферазы, тем самым допуская связывание с ней другой композиции, которая включает в себя комплементарный партнер по связыванию.
[0111] Для добавления связывающей функциональной группы к полипептиду можно использовать другие ферменты. Например, фермент лигаза липоевой кислоты может добавлять молекулу липоевой кислоты или модифицированную молекулу липоевой кислоты, включающую связывающую функциональную группу, указанную в таблице 1, такую как алкиновая или азидная группа, может быть ковалентно связан с амином боковой группы лизинового остатка в аминокислотной последовательности DEVLVEIETDKAVLEVPGGEEE (SEQ ID NO:5) или GFEIDKVWYDLDA (SEQ ID NO:6), включенных в полипептид. В другом примере каркас, матричный полинуклеотид или другой полипептид или включенная в него или предназначенная для связывания с ним молекула ДНК может включать в себя активный фермент серингидролазы или может быть присоединена к нему. Фторфосфонатные молекулы становятся ковалентно связанными с остатками серина в активном сайте ферментов серингидролазы. Коммерчески доступны аналоги фторфосфонатных молекул, включая связывающие функциональные группы, идентифицированные в таблице 1, такие как азидная группа или дезтиобиотиновая группа (аналог биотина, который может связываться с авидином). Таким образом, такие группы могут быть ковалентно присоединены к ферменту серингидролаза, включенному в полипептид или присоединенному к нему, или молекуле ДНК, используемой в каркасе, или присоединенной к нему, как описано в настоящем документе, причем такая связывающая функциональная группа или структура могут быть ковалентно добавлены к нему путем присоединения подходящей модифицированной молекулы фторфосфоната для создания сайта связывания на таком белке для комплементарного партнера по связыванию из таблицы 1 (например, для азид-алкина, азид-фосфина, азид-циклооктина, азид-норборнена или дезтиобиотин-авидина).
[0112] Любой из вышеуказанных способов биотинилирования композиций для стимуляции связывания с полипептидом, включающим авидиновую последовательность (такую как авидиновый полипептид, включенный в другую композицию или присоединенный к ней), или иное добавление функциональных групп к полипептидам в составе каркаса, присоединенным к каркасу, части вспомогательных веществ или присоединенным к вспомогательному веществу или матричному полинуклеотиду для связывания между каркасом и матричным полинуклеотидом или между каркасом и вспомогательным веществом, можно использовать для обеспечения или стимулирования связывания между такими компонентами, как описано в настоящем документе.
[0113] Для прикрепления к одному матричному сайту каркаса матричный полинуклеотид может иметь комплементарную соединительную функциональную группу или структуру, добавленную к нему. В одном примере во время получения образца библиотеки для секвенирования можно получить множество матричных полинуклеотидов. Как правило, во время такого получения образца матричные полинуклеотиды образца библиотеки модифицируют так, чтобы они включали в себя конкретные нуклеотидные последовательности в дополнение к уже включенным в них последовательностям, которые необходимо секвенировать. Такие добавленные нуклеотидные последовательности могут выполнять любую из различных функций, включая последующую идентификацию матричного полинуклеотида или прикрепление к поверхности субстрата SBS в рамках процесса затравки. В соответствии с настоящим изобретением такое получение матричных полинуклеотидов также может включать комплементарную соединительную функциональную группу или структуру, прикрепляемые к ним или включенные в них.
[0114] Например, получение матричного полинуклеотида может включать присоединение нуклеотидной последовательности в матричном полинуклеотиде, например, удлинение от одного из его концов, причем последовательность является комплементарной другой последовательности, в которую другая последовательность включена или присоединена к одному матричному сайту каркаса. Гибридизация посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику приводит к связыванию между ними. В другом примере вспомогательное вещество, такое как вспомогательный олигонуклеотид, может быть модифицировано таким образом, чтобы обеспечить ковалентное присоединение к нему функциональной группы или структуры, которая является комплементарной ему. Например, могут быть включены модификации нуклеотида, включенного во вспомогательное вещество, такие как вспомогательный олигонуклеотид, например на фосфатной группе, основании или сахаре, с образованием сайта для ковалентного присоединения к вспомогательным сайтам каркаса. Вспомогательные сайты каркаса могут, в свою очередь, включать комплементарную функциональную группу или структуру, обеспечивающие присоединение к вспомогательным веществам, таким как вспомогательные вещества олиго-ДНК. В одном примере в процессе получения образца к матричному полинуклеотиду добавляют нуклеотиды, модифицированные для включения соединительной функциональной группы, с которой в полинуклеотидную последовательность включена комплементарная функциональная группа вспомогательного сайта связывания каркаса. Множество модифицированных нуклеотидов, содержащих такие химические функциональные группы, являются коммерчески доступными для ковалентного присоединения композиций к молекулам ДНК, в которые включены такие модифицированные нуклеотиды.
[0115] В другом примере матричный полинуклеотид может быть модифицирован, например, во время получения образца, путем присоединения к нему полипептида. Такой полипептид может иметь аминокислотную последовательность и/или структуру, комплементарную структуре аминокислоты одного матричного сайта каркаса таким образом, что матричный полинуклеотид может присоединяться посредством присоединенного к нему полипептида к одному матричному сайту каркаса. Примеры пар полипептидов для ковалентного или нековалентного связывания между одним матричным сайтом каркаса и матричным полинуклеотидом представлены выше и включают в себя, в качестве не имеющих ограничительного характера примеров, альфа-спиральные аминокислотные последовательности с гептадными повторами для формирования присоединения суперспиралей друг к другу, пар связывания биотин-авидин, системы SpyTag/SpyCatcher, нуклеофильных пары LPXTG/олигоглицин для опосредованного сортазой связывания транспептидирования. В другом примере матричный полинуклеотид может быть модифицирован в процессе получения образца таким образом, чтобы содержать одно из следующего: последовательность Snap-тег или O6-бензилгуанин, а один матричный сайт каркаса может содержать другое из двух, чтобы обеспечить ковалентную связь между ними в соответствии с системой Snap-тег/O6-бензилгуанин. В другом примере матричный полинуклеотид может быть модифицирован в процессе получения образца таким образом, чтобы содержать одно из следующего: последовательность CLIP-тег или O2-бензилцитозин, а один матричный сайт каркаса может содержать другое из двух, чтобы обеспечить ковалентную связь между ними в соответствии с системой CLIP-тег/O2-бензилцитозин. и систему CLIP-тег/O2-бензилцитозин.
[0116] Любой из вышеприведенных примеров также может быть использован для присоединения одного или более вспомогательных веществ к одному или более вспомогательным сайтам на каркасе. Для присоединения к вспомогательному сайту ДНК-каркаса или полипептидного каркаса вспомогательное вещество (такое как вспомогательная олиго-ДНК) может иметь добавленный к нему комплементарный крепежный фрагмент или структуру. В одном примере нуклеотидная последовательность может быть включена во вспомогательное вещество или присоединена к нему и может содержать комплементарную соединительную функциональную группу или структуру, присоединяемую к ней или включенную в нее.
[0117] В другом примере вспомогательное вещество (такое как вспомогательная олиго-ДНК) может включать в себя нуклеотидную последовательность, например, отходящую от одного из ее концов в случае вспомогательной олиго-ДНК, и последовательность, которая является комплементарной другой последовательности, причем другая последовательность включена во вспомогательные сайты каркаса или присоединена к ним. Спаривание оснований по Уотсону-Крику между комплементарными последовательностями приводит к гибридизации и связыванию между ними и, таким образом, присоединению вспомогательных веществ к вспомогательным сайтам связывания. В другом примере вспомогательное вещество может содержать соответствующую ковалентную модификацию, чтобы обеспечить ковалентное присоединение к нему функциональной группы или структуры, которая является комплементарной ему. Например, могут быть включены модификации нуклеотида, включенного в матричный полинуклеотид, например на фосфатной группе, основании или сахаре, с образованием сайта для ковалентного присоединения к вспомогательному сайту каркаса. Вспомогательные сайты каркаса могут, в свою очередь, включать комплементарную функциональную группу или структуру, обеспечивающие присоединение к вспомогательным веществам, таким как вспомогательные вещества олиго-ДНК. В одном примере нуклеотиды модифицированы для включения соединительной функциональной группы, с которой в полинуклеотидную последовательность может быть включена комплементарная функциональная группа вспомогательного сайта связывания каркаса, добавленная к вспомогательному веществу, такому как вспомогательная олиго-ДНК, или включена в него для обеспечения возможности связывания между ними. Множество модифицированных нуклеотидов, содержащих такие химические функциональные группы, являются коммерчески доступными для ковалентного присоединения композиций к молекулам ДНК, в которые включены такие модифицированные нуклеотиды.
[0118] В другом примере вспомогательное вещество может быть модифицировано путем присоединения к нему полипептида. Такой полипептид может иметь аминокислотную последовательность и структуру, комплементарную структуре аминокислоты вспомогательного сайта каркаса таким образом, что вспомогательные вещества могут присоединяться посредством присоединенных к ним полипептидов к вспомогательным сайтам каркаса. Примеры пар полипептидов для ковалентного или нековалентного связывания между вспомогательными сайтами и вспомогательными веществами представлены выше и включают в себя, в качестве не имеющих ограничительного характера примеров, альфа-спиральные аминокислотные последовательности с гептадными повторами для формирования присоединения суперспиралей друг к другу, пар связывания биотин-авидин, системы SpyTag/SpyCatcher, нуклеофильных пар LPXTG/олигоглицин для опосредованного сортазой связывания транспептидирования. В другом примере вспомогательное вещество, такое как вспомогательная олиго-ДНК, может быть модифицировано, чтобы содержать одно из следующего: последовательность Snap-тег или O6-бензилгуанин, а вспомогательные сайты каркаса могут содержать другое из двух, чтобы обеспечить ковалентную связь между ними в соответствии с системой Snap-тег/O6-бензилгуанин. В другом примере вспомогательное вещество может быть включено в одно из следующего: последовательность CLIP-тег или O2-бензилцитозин, а вспомогательные сайты каркаса могут содержать другое из двух, чтобы обеспечить ковалентную связь между ними в соответствии с системой CLIP-тег/O2-бензилцитозин.
[0119] В одном примере один матричный полинуклеотид может быть связан с одним матричным сайтом каркаса, а множество вспомогательных нуклеотидов, таких как вспомогательные молекулы олиго-ДНК, могут быть связаны со вспомогательными сайтами каркаса. Примерами таких молекул олиго-ДНК могут быть праймеры для выполнения кластеризации на каркасе. В рамках традиционного процесса кластеризации копии матричного полинуклеотида или его комплемента изготавливают на поверхности субстрата. Как объяснено выше, в некоторых случаях такая кластеризация на поверхности может неблагоприятно приводить к образованию одного или более поликлональных кластеров. Как описано в настоящем документе, кластеризацию можно выполнять на каркасе, например, в растворе, без предварительного прикрепления каркаса к поверхности. В других примерах каркас с присоединенным одним матричным полинуклеотидом может быть прикреплен к поверхности субстрата, а затем кластеризация может быть выполнена на поверхности субстрата, на каркасе или на каркасе и на поверхности субстрата.
[0120] Для процедуры кластеризации можно выполнить модификацию матричного полинуклеотида, например, во время получения образца, с включением одной или более нуклеотидных последовательностей на одном или обоих из его 3-штрих и 5-штрих концов. Затем копию или копии матричных нуклеотидных и нуклеотидных последовательностей, комплементарных матричному нуклеотиду, можно синтезировать на каркасе, как описано в настоящем документе, образуя кластер. Такая кластеризация на каркасе может приводить к образованию моноклонального кластера.
[0121] Например, матричный полинуклеотид может связываться с одним матричным сайтом связывания, причем его 5-штрих конец ориентирован по направлению к каркасу, а его 3-штрих конец ориентирован по направлению от сайта связывания с каркасом. 3-штрих конец может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, включенной в первый праймер. «Праймер» определяется как одноцепочечная нуклеотидная последовательность (например, одноцепочечная ДНК или одноцепочечная РНК), которая служит начальной точкой для синтеза ДНК или РНК. Праймер может представлять собой любое число оснований и может включать множество нуклеотидов искусственного происхождения. В одном примере праймер представляет собой короткую нить, которая находится в диапазоне 20-40 оснований или 10-20 оснований. Копии праймеров, комплементарных 3-штрих концу матричного полинуклеотида, можно дополнительно присоединить к вспомогательным сайтам каркаса.
[0122] Затем можно провести реакцию полимеризации, в которой 3-штрих конец матричного полинуклеотида гибридизуется посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с комплементарным ему первым праймером, связанным с каркасом. Полимераза в реакции полимеризации может создавать зарождающуюся цепь, комплементарную матричному полинуклеотиду, присоединенному к каркасу, инициированную из присоединенного к каркасу праймера, с которым гибридизуется 3-штрих конец матричного полинуклеотида. Затем матричный полинуклеотид и его комплемент можно дегибридизовать.
[0123] Комплемент матричного полинуклеотида на 3-штрих конце комплемента может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную второй праймерной последовательности. Копии вторых праймеров, комплементарных 3-штрих концу комплемента к матричному полинуклеотиду, можно дополнительно присоединить к вспомогательным сайтам каркаса. Затем можно провести вторую реакцию полимеризации, в которой 3-штрих конец матричного полинуклеотида гибридизуется посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с комплементарным ему первым праймером, связанным с каркасом, а 3-штрих конец комплемента с матричным полинуклеотидом гибридизуется посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с комплементарным ему вторым праймером, связанным с каркасом. Полимераза во второй реакции полимеризации может создавать другую зарождающуюся цепь, комплементарную матричному полинуклеотиду, присоединенному к каркасу, инициированную из присоединенного к каркасу первого праймера, с которым гибридизуется 3-штрих конец матричного полинуклеотида. А полимераза во второй реакции полимеризации может дополнительно создавать копию растущей цепи матричного полинуклеотида, как присоединенную к каркасу, инициированную из присоединенного к каркасу второго праймера, с которым гибридизуется 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида, полимеризованного в предыдущей реакции полимеризации. Затем матричный полинуклеотид и его копию, а также его комплементы можно дегибридизовать.
[0124] Последующие реакции полимеризации можно затем проводить в итерационном процессе. 3-штрих концы связанного с каркасом матричного полинуклеотида и его копий гибридизуются с комплементарными ему связанными с каркасом первыми праймерами, а 3-штрих концы связанных с каркасом комплементов матричного полинуклеотида гибридизуются с комплементарными ему связанными с каркасом вторыми праймерами. Растущие цепи полимеризуются с помощью полимеразы, инициируются в связанных с каркасом первом и втором праймерах, с которыми гибридизуются связанный с каркасом матричный полинуклеотид, и комплементы, и его копии. После дегибридизации цепей после полимеризации проводят последовательные реакции полимеризации, тем самым умножая число копий матричного полинуклеотида и его комплементов, присоединенных к каркасу. Таким образом, копии и комплементы к матричному полинуклеотиду амплифицируются, причем амплифицированные копии связаны с каркасом, образуя кластер. Как описано в настоящем документе, этот процесс кластеризации можно выполнять на каркасе, например, в растворе, в отличие от традиционной кластеризации, выполняемой на поверхности субстрата в ходе традиционного процесса SBS. Поскольку присутствуют копии и комплементы только к одному матричному полинуклеотиду, кластеризованному на каркасе, на каркасе присутствует моноклональный кластер.
[0125] В таком примере, где последовательность, расположенная на 5-штрих конце матричного полинуклеотида или присоединенная к нему, связывается с одним матричным сайтом, ориентируя 3-штрих конец матричного полинуклеотида в направлении от каркаса, матричный полинуклеотид может связываться с одним матричным сайтом каркаса путем гибридизации с последовательностью праймера, называемого праймером матричного сайта, присоединенной к одному матричному сайту или его части. В одном примере матричный полинуклеотид, полученный в процессе получения образца, может иметь на 5-штрих конце нуклеотидную последовательность, комплементарную праймеру матричного сайта, или присоединенную к нему. 3-штрих конец для такой нуклеотидной последовательности является комплементарным праймеру матричного сайта, причем матричный полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая соответствует нуклеотидной последовательности вышеописанного второго праймера (второй праймер представляет собой присоединенный к каркасу праймер, с которым может гибридизоваться 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида путем комплементарного спаривания оснований по Уотсону-Крику). Включение такой последовательности в матричный полинуклеотид означает, что комплемент матричного полинуклеотида, синтезированного на стадии полимеризации, будет иметь в направлении его 3-штрих конца полинуклеотидную последовательность, которая является комплементарной последовательности такого второго праймера. Наличие такой последовательности по направлению к 3-штрих концу комплемента матричного полинуклеотида позволяет гибридизовать 3-штрих конец комплемента такого второго праймера во время последующей реакции полимеризации при кластеризации.
[0126] На 3-штрих конце матричного полинуклеотида, ориентированного в сторону от 5-штрих конца матричного полинуклеотида, связанного с одним матричным сайтом, матричный полинуклеотид может содержать последовательность, комплементарную первому праймеру, как описано выше. Во время первой стадии полимеризации, как описано выше, такая нуклеотидная последовательность на 3-штрих конце матричного полинуклеотида может гибридизоваться с первым праймером с последующей полимеризацией растущего комплемента матричного полинуклеотида. Преимуществом может быть прекращение полимеризации комплемента матричного полинуклеотида между участком матричного полинуклеотида, гибридизованным с праймером матричного сайта, и нуклеотидной последовательностью, расположенной на 3-штрих конце в матричном полинуклеотиде, которая содержит последовательность второго праймера. Таким образом, может быть предпочтительно, чтобы комплемент матричного полинуклеотида имел на своем 3-штрих конце последовательность, комплементарную второму праймеру. Однако в случае отсутствия прекращения полимеризации после добавления к растущему комплементу матричного полинуклеотида нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности, соответствующей второму праймеру, 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида там не заканчивается.
[0127] Например, если нуклеотидная последовательность, комплементарная праймеру матричного сайта, представляет собой 5-штрих конец к последовательности, комплементарной второму праймеру, и связана с ней, 3-штрих конец синтезированного комплемента матричного полинуклеотида может содержать нуклеотидную последовательность, включенную в праймер матричного сайта. Например, при полимеризации комплемента матричного полинуклеотида ДНК-полимераза может вытеснять праймер матричного сайта из гибридизации к 5-штрих концу матричного полинуклеотида и полимеризовать присоединение соответствующей ему нуклеотидной последовательности к 3-штрих концу комплемента матричного полинуклеотида. Такой результат может быть нежелательным, если он нарушил способность 3-штрих конца комплемента матричного полинуклеотида гибридизоваться с вышеописанным вторым праймером на вспомогательном сайте.
[0128] Таким образом, в одном примере может быть желательно включать прекращение полимеризации 3-штрих конца с 5-штрих концом матричного полинуклеотида, где такой 5-штрих конец матричного полинуклеотида связывается с одним матричным сайтом путем гибридизации с праймером матричного сайта. Например, для соединения нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с праймером сайта матрицы, с 5-штрих концом матричного полинуклеотида, может быть включен линкер, такой как PEG-линкер, алкильный линкер или другая химическая функциональная группа. Наличие такого линкера вместо непрерывного соединения нуклеотидной последовательности предотвратит добавление полимеразы к нуклеотидной последовательности, соответствующей праймеру матричного сайта, к 3-штрих концу комплемента матричного полинуклеотида, а вместо этого будет заканчиваться нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности второго праймера, что может быть желательно.
[0129] В других примерах матричный полинуклеотид может иметь (или может быть присоединен к ней) полинуклеотидную последовательность на 3-штрих конце матричного полинуклеотида, которая является комплементарной праймеру, который является частью одного матричного сайта каркаса или присоединен к нему, называемому праймером матричного сайта. После гибридизации такой последовательности или присоединения к 3-штрих концу матричного полинуклеотида праймера матричного сайта можно выполнить процесс полимеризации, в котором ДНК-полимераза полимеризует образование растущего полинуклеотида, комплементарного матричному полинуклеотиду, инициированному из праймера матричного сайта. Затем выполняют дегибридизацию матричного полинуклеотида из присоединенного к каркасу комплемента к матричному полинуклеотиду. 3-штрих конец присоединенного к каркасу комплемента матричного полинуклеотида, ориентированного от сайта прикрепления к каркасу, может включать нуклеотидную последовательность, которая комплементарна вышеописанной последовательности второго праймера (второй праймер представляет собой присоединенный к каркасу праймер, с которым может гибридизоваться 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида путем комплементарного спаривания оснований по Уотсону-Крику). Копии вторых праймеров, комплементарных 3-штрих концу комплемента к матричному полинуклеотиду, можно дополнительно присоединить к вспомогательным сайтам каркаса. Затем можно провести вторую реакцию полимеризации, в которой 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида гибридизуется посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с комплементарным ему вторым праймером, связанным с каркасом. Полимераза во второй реакции полимеризации может создавать копию растущей цепи матричного полинуклеотида (т. е. комплемент связанного с каркасом комплемента матричного полинуклеотида), инициированную из присоединенного к каркасу второго праймера, с которым гибридизуют 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида, полимеризованного в предыдущей реакции полимеризации. Затем можно провести стадию дегибридизации для дегибридизации связанного с каркасом комплемента с матричным полинуклеотидом и копирования матричного полинуклеотида друг из друга.
[0130] Копия матричного полинуклеотида на 3-штрих конце копии может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную вышеописанной первой праймерной последовательности. Копии первых праймеров, комплементарных 3-штрих концу копии матричного полинуклеотида, как описано выше, можно дополнительно присоединить к вспомогательным сайтам каркаса. Затем можно провести третью реакцию полимеризации, в которой 3-штрих конец копии матричного полинуклеотида гибридизуется посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с комплементарным ему первым праймером, связанным с каркасом, а 3-штрих конец комплемента с матричным полинуклеотидом гибридизуется посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с комплементарным ему вторым праймером, связанным с каркасом. Полимераза в третьей реакции полимеризации может создавать другую растущую цепь, комплементарную матричному полинуклеотиду, присоединенному к каркасу, инициированную из присоединенного к каркасу первого праймера, с которым гибридизуют 3-штрих конец копии матричного полинуклеотида. А полимераза в третьей реакции полимеризации может дополнительно создавать копию растущей цепи матричного полинуклеотида, инициированную из присоединенного к каркасу второго праймера, с которым гибридизуют 3-штрих конец комплемента матричного полинуклеотида, полимеризованного в предыдущей реакции полимеризации. Затем можно выполнить стадию дегибридизации копий и комплементов матричного полинуклеотида друг от друга.
[0131] Последующие реакции полимеризации можно затем проводить в итерационном процессе. 3-штрих концы связанных с каркасом копий матричного полинуклеотида гибридизуют с комплементарными ему связанными с каркасом первыми праймерами, а 3-штрих концы связанных с каркасом комплементов матричного полинуклеотида гибридизуют с комплементарными ему связанными с каркасом вторыми праймерами. Растущие цепи полимеризуются с помощью полимеразы, инициируются в связанных с каркасом первом и втором праймерах, с которыми гибридизуются связанный с каркасом матричный полинуклеотид, и комплементы, и его копии. Дегибридизацию цепей выполняют после полимеризации, затем проводят последовательные реакции полимеризации с последующей дополнительной дегибридизацией. Таким образом, копии и комплементы к матричному полинуклеотиду амплифицируются, причем амплифицированные копии и комплементы связаны с каркасом, образуя кластер. Как описано в настоящем документе, этот процесс кластеризации можно выполнять на каркасе, например, в растворе, в отличие от традиционной кластеризации, выполняемой на поверхности субстрата в ходе традиционного процесса SBS. Поскольку присутствуют копии и комплементы только к одному матричному полинуклеотиду, кластеризованному на каркасе, на каркасе присутствует моноклональный кластер.
[0132] В одном примере конец матричного полинуклеотида, который включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, включенной в один матричный сайт каркаса, или присоединен к ней, называется третьим праймером сайта матрицы. В одном примере комплемент к матричному полинуклеотиду можно синтезировать на каркасе, инициированном в третьем праймере матричного сайта.
[0133] В примерах кластеризации на каркасе, описанных в настоящем документе, матричный полинуклеотид может быть связан с одним матричным сайтом каркаса в соответствии с любой из различных ковалентных или нековалентных связей, описанных в настоящем документе. Например, любой конец матричного полинуклеотида может содержать функциональную группу или структуру из пары сайтов связывания, таких как указано в таблице 1, причем комплементарная функциональная группа или структура той же пары могут присутствовать на одном матричном сайте каркаса. Затем могут следовать последовательные циклы полимеризации, как описано выше. Например, 3-штрих конец матричного полинуклеотида, связанный с одним матричным сайтом каркаса на 5-штрих конце матричного полинуклеотида или по направлению к нему, может гибридизоваться с олигонуклеотидным праймером, связанным со вспомогательным сайтом каркаса, и комплементом, синтезированным ДНК-полимеразой. Затем можно выполнять последовательные циклы полимеризации, как описано выше, что приводит к полимеризации множества копий матричного полинуклеотида и его комплементов, исходящих от вспомогательных сайтов каркаса. Поскольку с каркасом был связан только один матричный полинуклеотид, причем каркас имеет только один сайт матричного полинуклеотида, то такие копии будут представлять собой моноклональный кластер на каркасе.
[0134] В другом примере каркас может присоединяться к поверхности субстрата, такой как поверхность субстрата, для использования в процедуре SBS. Например, вспомогательные сайты каркаса могут включать в себя или представлять собой, или становиться присоединенными к сайтам, присоединенным к поверхности субстрата, или композициям, которые связываются с поверхностью субстрата. В одном примере поверхность субстрата может быть связана с праймерами, такими как, например, копии праймеров, комплементарных первым праймерам, или вторым праймерам, как описано выше, или с обоими праймерами, в качестве не имеющих ограничительного характера примеров. Такие комплементарные праймеры можно присоединять либо непосредственно к поверхности субстрата, либо можно прикреплять к модифицированной поверхности, такой как поверхность, к которой прикреплены полимерные молекулы (например, PAZAM или родственные полимеры) с праймерами, прикрепленными к таким полимерам. Вышеупомянутые первые праймеры и вторые праймеры можно присоединять к вспомогательным сайтам каркаса (непосредственно или посредством полимера, такого как PAZAM или других PAZAM-подобных полимеров, как описано выше в качестве не имеющих ограничительного характера примеров, или спейсера или другой композиции). Такие первый и второй праймеры каркаса, или присоединенные к каркасу, могут гибридизоваться с комплементарными им праймерами, присоединенными к поверхности субстрата, таким образом связывая каркас с поверхностью субстрата.
[0135] Примеры первого и второго праймеров, как описано выше, могут включать праймеры, используемые в существующих процессах SBS. Конкретные примеры подходящих праймеров включают праймеры P5 и/или P7, которые используются на поверхности доступных в продаже проточных кювет, продаваемых компанией Illumina Inc., для секвенирования на приборах HiSeq™, HiSeqX™, MiSeq™, MiSeqDX™, MiNISeq™, NextSeq™, NextSeqDX™, NovaSeq™, Genome Analyzer™, ISEQ™ и других инструментальных платформах. А часть матричного полинуклеотида, которая содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую или комплементарную первому или второму праймеру, как описано выше, может иметь, например, последовательность, соответствующую или комплементарную праймеру P5 (включая нуклеотидную последовательность AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC (SEQ ID NO:7)), праймеру P7 (включая нуклеотидную последовательность CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (SEQ ID NO:8)), или оба варианта, в соответствии с такими праймерными последовательностями, которые используются в вышеупомянутых платформах SBS или других.
[0136] Субстрат для процесса SBS может включать в себя, в качестве не имеющих ограничительного характера примеров, субстраты, используемые в любой из вышеупомянутых платформ SBS или других. В качестве не имеющего ограничительного характера примера такой субстрат может представлять собой проточную кювету. Используемый в настоящем документе термин «проточная кювета» означает сосуд, имеющий камеру (например, проточный канал), в которой может протекать реакция, впускное отверстие для доставки реагента (-ов) в камеру и выпускное отверстие для удаления реагента (-ов) из камеры. В некоторых примерах камера позволяет обнаруживать протекание реакции или сигнала в камере. Например, камера может включать в себя одну или более прозрачных поверхностей, обеспечивающих оптическое обнаружение в камере матриц, оптически маркированных молекул и т. п. Используемый в данном документе термин «проточный канал» или «область проточного канала» может представлять собой область, образованную между двумя соединенными компонентами, которые могут избирательно принимать жидкую пробу. В некоторых примерах проточный канал может быть образован между профилированной подложкой и крышкой и, таким образом, может сообщаться по текучей среде с одним или более углублениями, образованными в профилированной подложке. В других примерах проточный канал может быть образован между непрофилированной подложкой и крышкой.
[0137] В настоящем документе термин «углубление» относится к дискретному вогнутому элементу в профилированной подложке, имеющему отверстие на поверхности, которое полностью окружено промежуточной (-ыми) областью (-ями) поверхности профилированной подложки. Углубления могут иметь любую из множества форм у их отверстий на поверхности, включая, например, круглую, эллиптическую, квадратную, многоугольную, звездообразную (с любым количеством вершин) и т. д. Поперечное сечение углубления, взятое перпендикулярно поверхности, может быть изогнутым, квадратным, многоугольным, гиперболическим, коническим, угловым и т. д. В качестве примера углубление может представлять собой лунку. Кроме того, используемый в настоящем документе термин «функционализированное углубление» относится к отдельному вогнутому элементу, в котором в некоторых примерах прикреплены праймеры к поверхности углубления посредством полимера (такого как PAZAM или аналогичного полимера).
[0138] Термин «подложка» или «субстрат» проточной кюветы относится к подложке или субстрату, на который можно нанести коллоидную систему. Термин «профилированный субстрат» относится к подложке, в которой или на которой образованы углубления. Термин «непрофилированный субстрат» относится к по существу плоской подложке. В настоящем документе субстрат также может называться «подложкой», «профилированной подложкой» или «непрофилированной подложкой». Подложка может представлять собой пластину, панель, прямоугольный лист, кристалл или иметь любую другую подходящую конфигурацию. Подложка является по существу жесткой и нерастворимой в водной жидкости. Подложка может быть инертной по отношению к химическому составу, используемому для модификации углублений. Например, подложка может быть инертной к химическому составу, используемому для получения полимерного покрытия, которое было осаждено и т. д. Примеры подходящих подложек включают эпоксидный силоксан, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, многогранный олигомерный силсесквиоксан (POSS) и их производные, пластмассы (включая акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (например, TEFLON® от Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (COP) (такие как ZEONOR® от Zeon), полиимиды и т. д.), нейлон, керамику/керамические оксиды, диоксид кремния, плавленый диоксид кремния или материалы на основе диоксида кремния, силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний (например, кремний p +, легированный бором), нитрид кремния (Si3N4), оксид кремния (SiO2), пятиокись тантала (TaO5) или другой (-ие) оксид(-ы) тантала (TaOx), оксид гафния (HaO2), углерод, металлы, неорганические стекла или т. п. Подложка также может представлять собой стекло, или кремний, или кремнийорганический полимер, такой как материал POSS, необязательно с покрытием из оксида тантала или другой оксидной керамики на поверхности. Материал POSS может представлять собой описанный в публикации Kejagoas et al., Microelectronics Engineering 86 (2009) 776-668, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
[0139] В одном примере углубления могут представлять собой лунки, так что субстрат с рисунком включает в себя массив лунок на своей поверхности. Лунки могут представлять собой микролунки или нанолунки. Размер каждой лунки может характеризоваться ее объемом, площадью отверстия лунки, глубиной и/или диаметром.
[0140] Каждая лунка может иметь любой объем, способный удерживать жидкость. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, таким образом, чтобы соответствовать пропускной способности (например, мультиплексность), разрешению, составу аналита или реакционной способности аналита, ожидаемой при последующих применениях проточной кюветы. Например, объем может составлять по меньшей мере около 1×10-3 мкм3, около 1×10-2 мкм3, около 0,1 мкм3, около 1 мкм3, около 10 мкм3, около 100 мкм3 или более. В альтернативном варианте или дополнительно объем может составлять не более около 1×104 мкм3, около 1×103 мкм3, около 100 мкм3, около 10 мкм3, около 1 мкм3, около 0,1 мкм3 или менее.
[0141] Площадь, занимаемая на поверхности каждым отверстием лунки, может быть выбрана на основе критериев, аналогичных критериям, изложенным выше для объема лунки. Например, площадь каждого отверстия лунки на поверхности может составлять по меньшей мере около 1×10-3 мкм2, около 1×10-2 мкм2, около 0,1 мкм2, около 1 мкм2, около 10 мкм2, около 100 мкм2 или более. В альтернативном варианте или дополнительно площадь может составлять не более около 1×103 мкм2, около 100 мкм2, около 10 мкм2, около 1 мкм2, около 0,1 мкм2, около 1×10−2 мкм2 или менее. Площадь, занимаемая каждым отверстием лунки, может быть больше указанных значений, меньше указанных значений или находиться в промежутке между указанными выше значениями.
[0142] Глубина каждой лунки может составлять по меньшей мере около 0,1 мкм, около 1 мкм, около 10 мкм, около 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно глубина может составлять не более около 1×103 мкм, около 100 мкм, около 10 мкм, около 1 мкм, около 0,1 мкм или менее. Глубина каждой лунки 14’ может быть больше, меньше или находится в промежутке между указанными выше значениями.
[0143] В некоторых случаях диаметр каждой лунки может составлять по меньшей мере около 50 нм, около 0,1 мкм, около 0,5 мкм, около 1 мкм, около 10 мкм, около 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно диаметр может составлять не более чем около 1×103 мкм, около 100 мкм, около 10 мкм, около 1 мкм, около 0,5 мкм, около 0,1 мкм или менее (например, около 50 нм). Диаметр может составлять около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм, около 500 нм, около 550 нм, около 600 нм, около 650 нм, около 700 нм, около 750 нм, около 800 нм, около 900 нм, около 950 нм, около 1 мкм, около 1,25 мкм, около 1,5 мкм, около 1,74 мкм, около 2 мкм, около 2,25 мкм, около 2,5 мкм, около 2,75 мкм, около 3 мкм, около 3,25 мкм, приблизительно 3,5 мкм, около 3,75 мкм, около 4 мкм, около 4,25 мкм, около 4,5 мкм, около 4,75 мкм, около 5 мкм, около 5,25 мкм, около 5,5 мкм, около 5,75 мкм, около 6 мкм, около 6,25 мкм, около 6,5 мкм, около 6,75 мкм, около 7 мкм, около 7,25 мкм, около 7,5 мкм, около 7,75 мкм, около 8 мкм, около 8,25 мкм, около 8,5 мкм, около 8,75 мкм, около 9 мкм, около 9,25 мкм, около 9,5 мкм или около 9,75 мкм. Диаметр каждой лунки может быть больше, меньше или находится в промежутке между указанными выше значениями. Термин «нанолунка» в настоящем документе означает лунку с круглым отверстием, наибольший диаметр которого составляет около 1 мкм или менее.
[0144] Следует понимать, что представленные в данном документе диапазоны включают в себя указанный диапазон и любое значение или поддиапазон в пределах указанного диапазона. Например, диапазон от около 100 нм до около 1 мкм (1000 нм) следует интерпретировать как включающий не только явно указанные пределы от около 100 нм до около 1 мкм, но также включающий отдельные значения, например около 708 нм, около 945,5 нм и т. д., и поддиапазоны, например от около 425 нм до около 825 нм, от около 550 нм до около 940 нм и т. д. Более того, если термины «около» и/или «по существу» используются для описания величины, они охватывают незначительные отклонения (до +/-10%) от указанного значения.
[0145] В одном примере размер наночастицы может быть таким, что присутствие наночастицы в лунке, такой как нанолунка, занимает настолько большую часть объема лунки, что другая наночастица не может занимать лунку одновременно. Размер наночастицы может быть разработан или определен по отношению к известному размеру лунок на поверхности субстрата таким образом, что она может входить в лунку, в которой другая наночастица отсутствует, но проникновение которой в лунку будет предотвращено за счет присутствия другой наночастицы, ранее введенной и по-прежнему присутствующей в лунке. Наночастицы такого размера, который не позволяет помещать более двух наночастиц в лунку, могут способствовать моноклональности кластера в лунке. Например, в традиционном процессе SBS матричные полинуклеотиды можно вводить в проточную кювету, структурированную по лункам в растворе, в концентрации, откалиброванной для максимального увеличения числа лунок, в которых будут затравливать матричный полинуклеотид (т. е. связываться, например, с праймером, присоединенным к лунке, непосредственно или посредством присоединенного к поверхности полимера, который является комплементарным нуклеотидной последовательности части матричного нуклеотида), но достаточно низкой, чтобы, насколько это возможно, свести к минимуму образование поликлональных кластеров.
[0146] В одном примере проточная кювета может содержать наноразмерные области, которые не являются углублениями или нанолунками, но иным образом пространственно изолированные области, в пределах которых матричный полинуклеотид или каркас могут связываться или затравливаться, называемые в настоящем документе наносферами. В некоторых примерах поверхность проточной кюветы содержит наносферы, отделенные друг от друга областями поверхности, в которых не может связываться матричный полинуклеотид или каркас. Наносферы могут быть расположены на расстоянии друг от друга таким образом, чтобы способствовать образованию моноклональных кластеров. Например, наносферы могут быть отделены друг от друга таким образом, что кластер, образованный в одной наносфере, затравленной одним матричным полинуклеотидом, будет в достаточной степени отделен от другой такой наносферы, которая была затравлена только одним матричным полинуклеотидом. Однако, это может в значительной степени затруднять препятствование затравливанию наносферы более чем одним матричным полинуклеотидом, что приводит к образованию одного или более поликлональных кластеров. В одном примере, описанном в настоящем документе, наночастица может способствовать образованию моноклональных кластеров в пользу поликлональных кластеров, предотвращая затравку или присоединение более одного матричного полинуклеотида в пределах данной наносферы. Например, размер наночастицы может быть таким, чтобы на наночастице было недостаточно места для связывания более одной наночастицы, где матричные полинуклеотиды связываются с одним сайтом матричного полинуклеотида каркасов.
[0147] В некоторых случаях поликлональный кластер может возникать, если два или более матричных полинуклеотида с нуклеотидными последовательностями, которые отличаются друг от друга, связываются, или затравливаются, внутри одной и той же лунки. Молекулы могут распределяться по лункам на основании их концентрации в применяемом растворе на основе распределения Пуассона, в соответствии с которым существует баланс между сведением к минимуму количества незанятых лунок (для повышения эффективности прогона SBS) и сведением к минимуму количества лунок, занятых множеством несопоставимых матричных полинуклеотидов. Различие между минимальным размером лунки и размером матричного полинуклеотида (например, диаметр молекулы B-ДНК может составлять порядка 2 нм) может привести к выбору между концентрацией, которая не использует столько поверхности субстрата, такой как поверхность внутри лунок, сколько доступно или предпочтительно с одной стороны, что приводит к образованию нежелательного или нежелательно большого количества поликлональных кластеров.
[0148] Как описано в настоящем документе, матричные полинуклеотиды могут связываться с наночастицей с только одним связыванием матричного полинуклеотида на наночастицу. Наночастица может иметь размер, позволяющий вводить наночастицу в лунку проточной кюветы, в которой уже отсутствует другая наночастица, но не вводить в лунку проточной кюветы, в которой уже присутствует другая наночастица. Кластеризация, такая как моноклональная кластеризация, может происходить на наночастице до того, как наночастица войдет в лунку, что приводит к присутствию моноклональных кластеров в лунках. Или матричный полинуклеотид может связываться с матричным сайтом наночастицы, и наночастица может вводиться и связываться внутри лунки (например, путем связывания вспомогательных сайтов с поверхностью или модификации с поверхностью лунки), таким образом затравливая лунку только одной наночастицей, и затем кластеризация может продолжаться внутри лунки, что приводит к присутствию моноклональных кластеров в лунках. В некоторых примерах некоторая степень кластеризации наночастиц может происходить до их ввода в лунку, а дополнительная кластеризация может происходить после того, как наночастица будет введена в лунку. Все такие примеры включают примеры, в которых внутри лунок образуются моноклональные кластеры. Более того, регулировка размера наночастиц таким образом, чтобы уменьшить, свести к минимуму или в одном примере устранить одновременное присутствие более одной наночастицы в лунке за один раз может уменьшить, свести к минимуму или в одном примере устранить образование поликлональных кластеров.
[0149] Размер наночастиц можно регулировать путем модификации размера каркаса, модификации размера вспомогательных веществ, связанных с вспомогательными сайтами, таких как полимеры, присоединенные к нему, или и тем, и другим. Размер наночастицы также можно модифицировать путем изменения степени кластеризации, которая произошла или не произошла на наночастице, например, путем модификации количества сайтов на наночастице, на которой в ходе циклов полимеризации в процессе кластеризации могут связываться копии комплементов и комплементы матричного полинуклеотида, причем меньшее количество таких сайтов потенциально приводит к меньшему верхнему пределу размеру наночастицы, а большее количество таких сайтов потенциально приводит к большему верхнему пределу размера наночастицы. Количество циклов полимеризации в процессе кластеризации также может модифицировать размер наночастиц, причем большее количество циклов приводит к большему количеству копий и комплементов матричного полинуклеотида, связанного с наночастицей, и, следовательно, потенциальному увеличению его верхнего предела размера, а меньшее количество циклов приводит к меньшему количеству копий и комплементов матричного полинуклеотида, связанного с наночастицей, и, таким образом, потенциальному уменьшению его верхнего предела размера. Размер наночастицы можно определить в соответствии с ее размером до кластеризации на каркасе или после кластеризации на каркасе.
[0150] Используемый в настоящем документе термин «наночастица» означает частицу с наибольшим размером до около 1000 нм. В зависимости от геометрии размер может относиться к длине, ширине, высоте, диаметру и т. д. Хотя термин «диаметр» по существу используется для описания размера в качестве одного примера в настоящем документе, наночастица, описанная в настоящем документе, необязательно должна быть сферической или круглой. Наночастица, описанная в настоящем документе, может иметь диаметр около 2 нм, около 5 нм, около 7 нм, около 10 нм, около 12 нм, около 15 нм, около 17 нм, около 20 нм, около 22 нм, около 25 нм, около 27 нм, около 30 нм, около 32 нм, около 35 нм, около 40 нм, около 42 нм, около 45 нм, около 47 нм, около 50 нм, около 52 нм, около 55 нм, около 57 нм, около 60 нм, около 62 нм, около 65 нм, около 67 нм, около 70 нм, около 72 нм, около 75 нм, около 77 нм, около 80 нм, около 82 нм, около 85 нм, около 87 нм, около 90 нм, около 92 нм, около 95 нм, около 97 нм, около 100 нм, около 125 нм, около 150 нм, около 175 нм, около 200 нм, около 225 нм, около 250 нм, около 275 нм, около 300 нм, около 325 нм, около 350 нм, около 375 нм, около 400 нм, около 425 нм, около 450 нм, около 475 нм, около 500 нм, около 525 нм, около 550 нм, около 575 нм, около 600 нм, около 625 нм, около 650 нм, около 675 нм, около 700 нм, около 725 нм, около 750 нм, около 775 нм, около 800 нм, около 825 нм, около 850 нм, около 875 нм, около 900 нм, около 925 нм, около 950 нм, около 975 нм или около 1000 нм. Диаметр наночастицы измеряют с помощью динамического рассеивания света (DLS; dynamic light scattering), также известного как квазиупругое светорассеяние, выраженное как удвоенный гидродинамический радиус (Rh), который можно определить на системе DLS или другой системе, включающей DLS и другие функциональные возможности (например, ZETASIZER®, Malvern Instruments Limited).
[0151] Наночастица, описанная в настоящем документе, может иметь диаметр в диапазоне от около 2 нм до около 10 нм, от около 5 нм до около 15 нм, от около 7 нм до около 20 нм, от около 10 нм до около 25 нм, от около 15 нм до около 30 нм, от около 20 нм до около 50 нм, от около 40 нм до около 60 нм, от около 50 нм до около 75 нм, от около 60 нм до около 100 нм, от около 70 нм до около 100 нм, от около 75 нм до около 100 нм, от около 80 нм до около 110 нм, от около 90 нм до около 130 нм, от около 100 нм до около 150 нм, от около 100 нм до около 200 нм, от около 150 нм до около 225 нм, от около 200 нм до около 250 нм, от около 200 нм до около 300 нм, от около 225 нм до около 275 нм, от около 250 нм до около 300 нм, от около 275 нм до около 325 нм, от около 300 нм до около 400 нм, от около 300 нм до около 350 нм, от около 325 нм до около 375 нм, от около 350 нм до около 400 нм, от около 375 нм до около 425 нм, от около 400 нм до около 500 нм, от около 400 нм до около 450 нм, от около 425 нм до около 475 нм, от около 450 нм до около 500 нм, от около 475 нм до около 525 нм, от около 500 нм до около 600 нм, от около 500 нм до около 550 нм, от около 525 нм до около 575 нм, от около 550 нм до около 600 нм, от около 575 нм до около 625 нм, от около 600 нм до около 700 нм, от около 600 нм до около 625 нм, от около 625 нм до около 675 нм, от около 650 нм до около 700 нм, от около 675 нм до около 725 нм, от около 700 нм до около 800 нм, от около 700 нм до около 725 нм, от около 725 нм до около 775 нм, от около 750 нм до около 800 нм, от около 775 нм до около 825 нм, от около 800 нм до около 900 нм, от около 800 нм до около 850 нм, от около 825 нм до около 875 нм, от около 850 нм до около 900 нм, от около 875 нм до около 925 нм, от около 900 нм до около 1000 нм, от около 900 нм до около 950 нм, от около 925 нм до около 975 нм, от около 950 нм до около 1000 нм, от около 300 нм до около 450 нм, от около 350 нм до около 500 нм, от около 400 нм до около 550 нм, от около 450 нм до около 600 нм, от около 500 нм до около 650 нм, от около 550 нм до около 700 нм, от около 600 нм до около 750 нм, от около 650 нм до около 800 нм, от около 700 нм до около 850 нм, от около 750 нм до около 900 нм, от около 800 нм до около 950 или от около 850 нм до около 1000 нм.
[0152] Для удобства и ясности в настоящем документе объяснены определенные термины, используемые в описании, примерах и формуле изобретения.
[0153] «Акрилатная группа» включает в себя соли, сложные эфиры и сопряженные основания акриловой кислоты и ее производных (например, метакриловой кислоты). Акрилатный ион имеет молекулярную формулу CH2=CHCOO−.
[0154] «Акриламидный мономер» представляет собой мономер со структурой 
или его замещенный аналог (например, метакриламид или N-изопропилакриламид). Примером мономера, включающего акриламидную группу и азидогруппу, является азидоацетамидопентилакриламид:
.
[0155] В контексте данного документа термин «алкил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, которая является полностью насыщенной (т. е. не содержит двойных или тройных связей). Алкильная группа может иметь от 1 до 20 атомов углерода. Типичные алкильные группы включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и т. п. Только в качестве примера: «C1-4 алкил» указывает, что в алкильной цепи присутствует от одного до четырех атомов углерода, т. е. алкильную цепь выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила.
[0156] В контексте данного документа термин «алкенил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или более двойных связей. Алкенильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода. Примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и т. п.
[0157] Используемый в данном документе термин «алкинил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или более тройных связей. Алкинильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода.
[0158] Термин «алкокси» или «алкоксил» относится к группам, содержащим от 1 до 20 атомов углерода (например, от 1 до 10 атомов углерода, в частности от 1 до 6 атомов углерода) в линейной или разветвленной структуре, которая присоединяется к исходной структуре посредством кислорода. Примеры включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси и т. п.
[0159] Оксаалкил относится к алкильным остаткам, в которых один или более атомов углерода (и связанные с ними атомы водорода) заменены на кислород. Примеры включают метоксипропокси, 3,6,9-триоксадецил и т. п. Термин «оксаалкил» относится к соединениям, в которых кислород связан со смежными с ним атомами посредством одинарной связи (образуя эфирные связи); он не относится к дважды связанному кислороду, в отличие таких молекул в карбонильных группах. Аналогичным образом тиаалкил и азаалкил относятся к алкильным остаткам, в которых один или более атомов углерода заменены серой или азотом, соответственно. Примеры азаалкила включают этиламиноэтил и аминогексил.
[0160] В контексте данного документа термин «арил» относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т. е. к двум или более конденсированным кольцам, имеющим два общих соседних атома углерода), содержащей в основной цепи кольца только углерод. Если арил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в системе является ароматическим. Арильная группа может иметь от 6 до 18 атомов углерода. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, азуленил и антраценил.
[0161] Используемый в настоящем документе термин «присоединенный» относится к состоянию двух компонентов, объединенных, закрепленных, склеенных, соединенных или связанных друг с другом ковалентно или нековалентно (например, водородными связями, ионными связями, ван-дер-ваальсовыми силами, гидрофильными взаимодействиями и гидрофобными взаимодействиями). Например, нуклеиновая кислота может быть присоединена к функционализированному полимеру посредством ковалентной или нековалентной связи.
[0162] « Азидная » функциональная группа или « азидо » относится к -N3.
[0163] В настоящем документе термин «область связывания» относится к области на субстрате, которая должна быть соединена с другим материалом, который может представлять собой, например, разделительный слой, крышку, другой субстрат и т. д. или их комбинации (например, разделительный слой и крышку). Связь, образованная в области связывания, может представлять собой химическую связь (как описано выше) или механическую связь (например, с использованием крепежного элемента и т. д.).
[0164] Термин «трет-бутилоксикарбонильная группа» (Boc) относится к группе 
. Термин «бутилоксикарбонилокси группа» относится к группе -OCO2tBu.
[0165] В настоящем документе термин «карбоциклил» означает неароматическое циклическое кольцо или кольцевую систему, содержащую только атомы углерода в основной цепи кольцевой системы. Когда карбоциклил представляет собой кольцевую систему, два или более кольца могут быть соединены друг с другом по типу конденсирования, образования мостика или спиросоединения. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. Таким образом, к карбоциклилам относятся циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбоциклильная группа может содержать от 3 до 20 атомов углерода. Примеры карбоциклильных колец включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикло[2.2.2]октанил, адамантил и спиро[4.4]нонанил.
[0166] В контексте данного документа термин «карбоновая кислота» или «карбоксил» относится к -COOH.
[0167] Используемый в настоящем документе термин «циклоалкилен» означает полностью насыщенное карбоциклильное кольцо или кольцевую систему, которая присоединена к остальной части молекулы посредством двух точек присоединения.
[0168] В контексте данного документа термин «циклоалкенил» или «циклоалкен» означает карбоциклильное кольцо или кольцевую систему, имеющую по меньшей мере одну двойную связь, причем ни одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. Примеры включают циклогексенил или циклогексен и норборненил или норборнен. Также в контексте данного документа термин «гетероциклоалкенил» или «гетероциклоалкен» означает карбоциклильное кольцо или кольцевую систему с по меньшей мере одним гетероатомом в основной цепи кольца, с по меньшей мере одной двойной связью, причем ни одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим.
[0169] В данном документе термины « гидрокси » или « гидроксил » относятся к группе - OH.
[0170] В контексте данного документа «праймер» определяется как одноцепочечная нуклеотидная последовательность (например, одноцепочечная ДНК или одноцепочечная РНК), которая служит начальной точкой для синтеза ДНК или РНК. 5’-конец праймера можно модифицировать для обеспечения реакции связывания с функционализированным полимерным слоем. Длина праймера может иметь любое число оснований и может включать множество нуклеотидов искусственного происхождения. В одном примере праймер представляет собой короткую цепь, имеющую длину в диапазоне от 20 до 40 оснований.
[0171] При использовании в настоящем документе термин «необязательно замещенный» можно использовать взаимозаменяемо с термином «незамещенный или замещенный». Термин «замещенный» относится к замещению одного или более атомов водорода в указанной группе указанным радикалом. Например, «замещенный алкил, арил, циклоалкил, гетероциклил» и т. п. относится к алкилу, арилу, циклоалкилу или гетероциклилу, в которых один атом или несколько атомов водорода в каждом остатке замещены галогеном, галогеналкилом, алкилом, ацилом, алкоксиалкилом, гидроксинизшим алкилом, карбонилом, фенилом, гетероарил, бензолсульфонил, гидрокси, низший алкоксил, галогеналкокси, оксаалкил, карбокси, алкоксикарбонилом [-C(=O)O-алкил], алкоксикарбониламино [HNC(=O)O-алкил], карбоксамидо [-C(=O)NH2], алкиламинокарбонилом [-C(=O)NH-алкил], циано, ацетокси, нитро, амино, алкиламино, диалкиламино, (алкил)(арил)аминоалкилом, алкиламиноалкилом (включая циклоалкиламиноалкил), диалкиламиноалкилом, диалкиламиноалкокси, гетероциклилалкокси, меркапто, алкилтио, сульфоксидом, сульфоном, сульфониламино, алкилсульфинилом, алкилсульфонилом, алкилсульфониламино, арилсульфонилом, арилсульфониламино, арилсульфониламино, ациламиноалкилом, ациламиноалкокси, ациламино, амидино, арил, бензилом, гетероциклилом, гетероциклилалкилом, фенокси, бензилокси, гетероарилокси, гидроксиимино, алкоксиимино, оксаалкилом, аминосульфонилом, тритилом, амидино, гуанидином, уреидо, бензилоксифенилом и бензилокси. «Оксо» также включен в перечень заместителей, упомянутых в документе как «необязательно замещенные»; специалистам в данной области будет понятно, что, поскольку оксо представляет собой двухвалентный радикал, существуют обстоятельства, в которых оксо нельзя использовать в качестве заместителя (например, фенила). В одном примере 1, 2 или 3 атомов водорода можно заместить заданным радикалом. В случае алкила и циклоалкила более трех атомов водорода можно заместить фтором; по факту, все доступные атомы водорода можно заменить фтором. Такие соединения (например, перфторалкил) относятся к классу «фторуглеводороды». Поясним, что общий термин может охватывать более одного заместителя, то есть, например, «галогеналкил» или «галогенфенил», относится к алкилу или фенилу, в которых по меньшей мере один атом, но, возможно, более одного атома водорода замещены галогеном. В некоторых примерах заместители представляют собой галоген, галогеналкил, алкил, ацил, гидроксиалкил, гидрокси, алкокси, галогеналкокси, оксаалкил, карбокси, циано, ацетокси, нитро, амино, алкиламино, диалкиламино, алкилтио, алкилсульфинил, алкилсульфонил, алкилсульфониламино арилсульфонил, арилсульфониламино и бензилокси.
[0172] При описании соединений в настоящем документе используется термин «замещенный по меньшей мере одним кислородсодержащим заместителем». Кислородсодержащий заместитель представляет собой заместитель, который помимо углерода и водорода содержит кислород; кислородсодержащий заместитель может также включать дополнительные гетероатомы, такие как азот (например, карбоксамид или метансульфонил). Типичные примеры оксизамещенных заместителей включают алкокси, гидрокси, фторалкокси, формил, ацетил и другие C1-C6 ацильные цепи.
НЕ ИМЕЮЩИЕ ОГРАНИЧИТЕЛЬНОГО ХАРАКТЕРА ПРИМЕРЫ
[0173] Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, но никоим образом не предназначены для ограничения их объема.
[0174] На ФИГ. 1 представлен не имеющий ограничительного характера пример наночастицы, описанной в настоящем документе. В данном не имеющем ограничительного характера примере один сайт матричного полинуклеотида показан в виде клиновидной части каркасной части наночастицы, как описано в настоящем документе. Показан один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом. Также в этом не имеющем ограничительного характера примере показано множество вспомогательных веществ, отходящих от вспомогательных сайтов каркаса. На иллюстрации в центральной части вспомогательные вещества показаны в виде полимеров. На левой панели показан ряд копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий матричного полинуклеотида, причем такие копии присоединены к каркасу и отходят от него. В этом примере они отходят от полимеров, которые, в свою очередь, отходят от каркаса.
[0175] На правой панели в лунке субстрата показана наночастица со связанным с ней матричным полинуклеотидом в одном матричном сайте. Показано множество вспомогательных олигонуклеотидов, отходящих от каркаса. Хотя это не показано на правой панели, в данном примере вспомогательные олигонуклеотиды отходят от полимеров, которые присоединены к каркасу. Нуклеотидные последовательности вспомогательных олигонуклеотидов являются комплементарными праймерам, присоединенным к поверхности лунки. Таким образом, вспомогательные олигонуклеотиды гибридизуются с хорошо присоединенными праймерами и присоединяются к поверхности лунки. В данном случае в лунке в конкретный момент времени может присутствовать только одна наночастица вследствие размера наночастицы по отношению к размеру лунки. Таким образом, кластеризация инициирована из одной матрицы
[0176] На ФИГ. 2 представлен не имеющий ограничительного характера пример каркаса наночастицы в соответствии с настоящим изобретением. Слева каркас обозначен как асимметричный каркас, содержащий три полимерных хвоста и один матричный полинуклеотид, прикрепленный к каркасу. Справа показан пример молекулярной структуры наночастицы (включая 3-плечевое ядро RAFT-агента) с одной точкой присоединения матрицы и полимерами, отходящими от ядра каркаса. Также показан не имеющий ограничительного характера пример акриламидных мономеров, которые могут образовывать часть каркаса, включая вспомогательные сайты, показанные в данном примере в виде азидной группы (например, матричного мономера и точки присоединения праймера).
[0177] На ФИГ. 3 представлен другой не имеющий ограничительного характера пример каркасного полимера, описанного в настоящем документе. Справа показано ядро каркаса с тремя отходящими от него полимерными плечами и один сайт связывания матричного полинуклеотида. Слева показана химическая структура ядра и одного из полимерных плеч (другие полимерные плечи опущены с целью исключения двусмысленного толкования иллюстрации, но могут быть включены в каркас). Дибензоциклооктеновая группа показана в виде одного матричного сайта присоединения полинуклеотида. Вспомогательные сайты связывания показаны на проиллюстрированном полимерном плече.
[0178] На ФИГ. 4 показан другой не имеющий ограничительного характера пример схемы синтеза для примера каркаса в соответствии с аспектами настоящего изобретения. В этом примере аминная концевая группа молекулы трис блокируется (трет-бутилдикарбонат, или Boc2O, DIPEA или N, N-диизопропилэтиламин и THF, или тетрагидрофуран), и к гидроксильным концам трис-ядра добавляется группа 2-(додецилтиокарбонотиоилтио)-2-метилпропионовой кислоты (DDMAT). После этого показаны два варианта полимеризации. В пути 1 проводят стандартную водную RAFT полимеризацию для добавления мономеров к цепи с последующим снятием защиты с аминогруппы и присоединением к ней дибензоциклооктеновой группы (DBCO). В альтернативном пути 2 сначала удаляют блок аминогруппы трифторуксусной кислотой (TFA) и сначала прикрепляют дибензициклооктеновую группу (сложный эфир DBCO-PEG1-NHS), после чего выполняют RAFT полимеризацию для добавления мономерных групп.
[0179] Ниже представлена альтернативная схема синтеза каркаса в соответствии с настоящим изобретением.
(в данном примере для упрощения иллюстрации после добавления DDMAT указано только одно из полимерных плеч, хотя все три плеча будут иметь одинаковую структуру). В данном не имеющем ограничительного характера рабочем примере между сайтом матричного полинуклеотида (R) и полимерными плечами был добавлен PEG-линкер, который содержит вспомогательные сайты, азидные группы в данном примере.
[0180] Другая схема синтеза каркаса, выполненного в соответствии с аспектами настоящего изобретения, представлена в соответствии со следующим неограничивающим рабочим примером:
.
Отсюда можно выполнить следующий не имеющий ограничительного характера пример схемы синтеза (для наглядности на которой снова показано только одно из трех полимерных плеч, хотя все полимерные плечи будут синтезированы в соответствии с одной и той же схемой):
[0181] В данном не имеющем ограничительного характера примере один сайт матричного полинуклеотида представляет собой тетразин. Следующие R1-содержащие мономеры можно добавлять во время полимеризации для синтеза различных видов каркаса, как описано в настоящем документе (для добавления азидной группы для вспомогательных сайтов связывания в качестве не имеющего ограничительного характера примера):
[0182] Во время полимеризации можно необязательно добавлять следующие R2-содержащие мономеры для синтеза различных видов каркаса, как описано в настоящем документе:
[0183] Акриламидные мономеры могут быть необязательно пегилированы в соответствии со следующей схемой:
[0184] Альтернативная схема синтеза каркаса из триазинового ядра в соответствии с настоящим изобретением представлена в соответствии со следующим не имеющим ограничительного характера примером:
[0185] В данном не имеющем ограничительного характера примере один сайт матричного полинуклеотида представляет собой амин, отходящий от верхней части тетразинового ядра, как показано выше. Следующие R1-содержащие мономеры можно добавлять во время полимеризации для синтеза различных видов каркаса, как описано в настоящем документе (для добавления азидной группы для вспомогательных сайтов связывания в качестве не имеющего ограничительного характера примера):
[0186] Во время полимеризации можно необязательно добавлять следующие R2-содержащие мономеры для синтеза различных видов каркаса, как описано в настоящем документе:
[0187] Акриламидные мономеры могут быть необязательно пегилированы в соответствии со следующей схемой:
[0188] Бифункциональные пегилированные вторичные амины для добавления к ядру триазинового каркаса можно синтезировать в соответствии со следующей схемой:
[0189] Стехиометрический контроль компонентов, добавляемых во время первоначального добавления бифункциональных пегилированных вторичных аминов к ядру триазинового каркаса и способы очистки (основанные, например, на различиях в полярности) можно применять для благоприятного получения и выделения бизамещенных триазинов (с добавлением двух бифункциональных вторичных аминов) в отличие от одно- и трехзамещенных продуктов.
[0190] На ФИГ. 5 показан пример каркаса дендримера в соответствии с аспектами настоящего изобретения. В данном примере показан полипептид, содержащий четыре лизина и заканчивающийся C-концевым цистеином. Второй, третий и четвертый лизины содержат вилки, содержащие изопептидную связь посредством их эпсилон-аминогрупп с другой лизиновой группой. Второй лизин имеет один лизин, присоединенный изопептидной связью. Третий лизин присоединен к дилизину, который имеет другой лизин, связанный с ним изопептидной связью с эпсилон-аминогруппой его С-концевого лизина. Четвертый лизин присоединен к остатку трилизина, к которому другой лизин присоединяется к его второму лизину посредством изопептидной связи, а остаток дилизина с другим лизином, присоединенным к нему посредством изопептидной связи, присоединяется к его C-концевому лизину.
[0191] Таким образом, в данном примере каркаса дендрона разное число поколений происходит из ветвей, отходящих от цистеинового ядра. В другом примере может быть включено большее или меньшее число поколений, и различные ветви могут иметь такое же число поколений, что и другое число поколений друг от друга. В других примерах могут быть включены дополнительные виды аминокислот, например, посредством пептидных связей с остатками лизина, между лизиновыми вилками или на конце, содержащем один сайт матричного полинуклеотида.
[0192] На ФИГ. 6 представлены схемы синтеза наночастиц с разветвленными заместителями лизина с альфа-аминопептидными и эпсилон-аминоизопептидными связями, например, в каркасе лизил-дендримерной структуры или каркасе лизинсодержащих полипептидов, связанных друг с другом изопептидными связями на эпсилон-аминогруппах заместителей лизина с образованием разветвленного полипептидного каркаса. Твердофазный пептидный синтез можно использовать для синтеза последовательности аминокислот вместе с, например, линейной полипептидной цепью, в соответствии с верхней панелью, показанной на ФИГ. 6 (стратегия последовательного синтеза с помощью твердофазного синтеза пептидов (SPPS)). Аминогруппу блокируют фторенилметилоксикарбонилом (Fmoc) или трет-бутилоксикарбонилом (Boc). Защитную группу избирательно удаляют в присутствии добавленной композиции/связующего реагента. Путем итерационной защиты свободной аминогруппы (добавление n мономеров, где n=количество циклов) с последующим удалением и добавлением активированной аминокислоты можно синтезировать полипептид линейной цепи (добавление n мономеров, где n=количество циклов). Таким образом, в качестве компонентов каркаса можно создавать линейные цепи заряженных аминокислот, включая один или более остатков лизина. Затем композиция может быть отщеплена от смолы субстрата и дополнительно модифицирована при необходимости.
[0193] Как дополнительно показано на нижней панели на ФИГ. 6, можно использовать метод твердофазного синтеза белков, в котором индивидуально образованные полипептидные цепи, содержащие один или более остатков лизина, могут быть добавлены в виде наборов полимеров на стадии синтеза (нижняя панель, стратегия конвергентного синтеза с помощью твердофазного синтеза пептидов (SPPS)). В некоторых примерах, не показанных на ФИГ. 6, аминокислоты или полипептиды могут независимо добавляться в виде ветвей к вилке, где вилка представляет собой структуру, содержащую две аминогруппы (т. е. N-концевую, такую как альфа-аминогруппа лизина или другая аминокислота), а не структуру с последовательным линейным ответвлением от одной аминогруппы, как показано на ФИГ. 22. Например, аминокислота лизина, имеющая две аминогруппы может служить в качестве точек присоединения вилки, к которым могут быть присоединены две ветки линейного полипептида или два отдельных остатка лизина, по одному к каждой аминогруппе в соответствии со схемой твердофазного синтеза белка, показанной на ФИГ. 6.
[0194] На ФИГ. 7 представлены различные способы связывания матричного полинуклеотида с каркасом. Сверху показан каркас с одним сайтом матричного полинуклеотида. Слева в один сайт матричного полинуклеотида включен праймер матричного сайта, причем конец которого является комплементарным концу матричного полинуклеотида, чтобы обеспечить нековалентное связывание матричного полинуклеотида с каркасом посредством гибридизации посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику. В середине матричный полинуклеотид и один сайт матричного полинуклеотида имеют, соответственно, комплементарные функциональные группы или структуры, что приводит к образованию ковалентной связи, формирующейся между матричным полинуклеотидом и каркасом. Справа полипептид включен в один матричный сайт, а комплементарный ему полипептид присоединен к концу матричного полинуклеотида. Нековалентное связывание между полипептидом одного матричного сайта и матричным полинуклеотидом связывает матричный полинуклеотид с каркасом.
[0195] На ФИГ. 8 представлены примеры матричного полинуклеотида, связанного с одним матричным сайтом белкового каркаса путем гибридизации с праймером матричного сайта, представленным PX (GFP-олиго конъюгат). Показаны два примера матричных полинуклеотидов библиотеки: одна стандартная молекула библиотеки с последовательностями P5 и P7 с областью, комплементарной праймеру матричного сайта PX (обозначенного PX') на 3-штрих конце, или модифицированная версия, где последовательность PX' отделена от последовательности P5 PEG-линкером. Цепь простого эфира связывается с одним матричным сайтом каркаса. Стандартную библиотеку можно использовать в первой реакции полимеризации с удлинением цепи, причем праймер PX служит в качестве инициаторного праймера для полимеризации зарождающейся цепи, комплементарной матричному полинуклеотиду.
[0196] На ФИГ. 9 показан пример нековалентной связи, в частности нековалентной связи суперспирального пептида (в одном примере с KD в пикомолярном диапазоне < 1×10-10 M). Показаны две аминокислотные последовательности для альфа-спиральных полипептидных структур, которые образуют два комплементарных партнера по связыванию суперспирального присоединения. Путем присоединения одной такой последовательности к каркасу или матричному полинуклеотиду библиотеки матричный полинуклеотид может быть связан с каркасом посредством нековалентной связи между альфа-спиралями. В другом примере одна из альфа-спиральных последовательностей, комплементарных присоединенным к каркасу, может быть присоединена к вспомогательному веществу, такому как вспомогательный олигонуклеотид, для присоединения вспомогательного олигонуклеотида к вспомогательному сайту.
[0197] На ФИГ. 10 показан график (зависимость событий затравки от площади поверхности нанолунки) примера испытаний количества каркасов заданного размера, которые могут присутствовать в нанолунке (Дендримеры/Нанолунка) заданной площади поверхности нанолунки (SA) или диаметра (D). Наночастицы (имеющие структуру, отличную от структур наночастиц описанных в настоящем документе) диаметром около 100 нм, затравливали в нанолунки диаметром 185, 285 или 375 нм и измеряли количество дендримеров на нанолунку. Экстраполяция результатов по кривой наилучшего приближения (y=3E-0,5x - 3,4874, R2=0,9991) указывает на то, что затравка нанолунки одной наночастицей приведет, в данном примере, к использованию наночастиц диаметром около 100 нм и нанолунки диаметром около 100 нм.
[0198] На ФИГ. 11A-11C показан пример затравки субстрата матричными полинуклеотидами с использованием каркаса в соответствии с аспектами настоящего описания. Каркасы, структурированные как ДНК-дендримерные каркасы в соответствии с предварительной заявкой на патент США № 62/952,799, имели диаметр от 50 нм до 150 нм. Каркас содержит один матричный сайт (Pa) для связывания матричного полинуклеотида и множество вспомогательных сайтов (cPX). На ФИГ. 11A показан матричный полинуклеотид и его комплемент с добавленной к каждому концу праймерной последовательностью (P5/cP5 и P7/cP7). Конец P5-праймера матричного полинуклеотида соединяется с праймером (cPa) посредством PEG-линкера. Праймер cPa является комплементарным одному матричному сайту (Pa) каркаса. На ФИГ. 11B представлено изображение каркасной молекулы, гибридизованной посредством ее одного матричного сайта (Pa) с матричным полинуклеотидом и ее комплементом, показанными на Фиг. 11A, посредством праймера cPa. Каркас присоединяется к субстрату. Субстрат соединяется с праймерами (PX), которые являются комплементарными вспомогательным сайтам (cPX) каркаса. Субстрат также присоединяется к праймерам, чтобы обеспечить гибридизацию с ними концов матрицы для обеспечения кластеризации на субстрате.
[0199] На ФИГ. 11C показан пример в соответствии с вышеизложенным, демонстрирующий затравку субстрата матричным полинуклеотидом с использованием каркаса с одним матричным сайтом с последующей кластеризацией. Каркасы присоединяли к матричным полинуклеотидам в соответствии с аспектами настоящего изобретения и ФИГ. 11A и 11B. Каркасы объединяли с матричными полинуклеотидами (библиотекой) в показанных молярных соотношениях, субстрат (проточная кювета с нанолунками для затравки), затравливали ними, затем проводили кластеризацию в соответствии с процессом кластерной амплификации, инициируемым рекомбиназой (кластерная амплификация ExAmp). Отрицательные контрольные пробы содержат каркас без матрицы и матрицу без каркаса. В качестве положительной контрольной пробы (+ контрольная проба) выполняли кластеризацию на субстрате без каркаса, используя кластеризацию на субстрате после гибридизации матричных молекул с праймерами, присоединенными к субстрату не посредством каркаса.
[0200] На левой панели показано изображение проточной кюветы после процесса кластеризации в соответствии с приведенными выше условиями (2 отрицательных контрольных пробы, 5 условий с различными молярными соотношениями каркас : матрица и 1 положительная контрольная проба). Флуоресценция во всех условиях, за исключением отрицательных контрольных проб, указывает на то, что каркас с одним матричным сайтом связывания может затравливать субстрат матричным полинуклеотидом и поддерживать процесс кластеризации. Столбиковые диаграммы представляют собой количественные измерения результатов кластеризации для 8 условий. Верхний график, интенсивность C1 представляет собой интенсивность цикла 1 в качестве косвенного показателя размера или выхода кластера (интенсивность которого прямо пропорциональна размеру или выходу кластера). Нижний график, %PF представляет собой % пропускающего фильтра, который представляет собой процент нанолунок, проходящих через пороговый фильтр, указывающий на чистоту образованного в нем кластера, т. е. непосредственно пропорциональный количеству нанолунок с моноклональными кластерами.
[0201] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных в настоящем документе (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть объекта изобретения, описанного в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью объекта изобретения, описанного в настоящем документе, и могут использоваться для достижения выгод и преимуществ, описанных в настоящем документе.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ILLUMINA, INC.
ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED
ILLUMINA SINGAPORE PTE. LTD.
<120> НАНОЧАСТИЦА С ОДНИМ САЙТОМ ДЛЯ ПРИСОЕДИНЕНИЯ МАТРИЧНОГО
ПОЛИНУКЛЕОТИДА
<130> IP-1936
<160> 8
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 1
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 134
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 2
Met Lys Gly Ser Ser His His His His His His Val Asp Ile Pro Thr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly
20 25 30
Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp
35 40 45
Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu
50 55 60
Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile
65 70 75 80
Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro
85 90 95
Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val
100 105 110
Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val
115 120 125
Asn Gly Lys Ala Thr Lys
130
<210> 3
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 3
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 4
Asp Ser Leu Glu Phe Ile Ala Ser Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 5
Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Ala Val Leu Glu Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Glu Glu Glu
20
<210> 6
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 6
Gly Phe Glu Ile Asp Lys Val Trp Tyr Asp Leu Asp Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac
29
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная в лаборатории последовательность
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agat
24
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРИСОЕДИНЕНИЕ ПОЛИМЕРАЗЫ К ПРОВОДЯЩЕМУ КАНАЛУ | 2020 |
|
RU2781299C2 |
| СЛОЖНЫЕ КОМПЛЕКСЫ СВЯЗАННОЙ НА ПОВЕРХНОСТИ ТРАНСПОСОМЫ | 2020 |
|
RU2790295C2 |
| ПОЛНОГЕНОМНЫЕ БИБЛИОТЕКИ ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ БИСУЛЬФИТНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ | 2018 |
|
RU2770879C2 |
| ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ И НАБОРЫ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ | 2019 |
|
RU2823075C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ХИМИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ И СНЯТИЯ ЗАЩИТЫ ДЛЯ СВЯЗАННЫХ С ПОВЕРХНОСТЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ | 2019 |
|
RU2766688C2 |
| ПРОТОЧНЫЕ КЮВЕТЫ | 2020 |
|
RU2823720C2 |
| НУКЛЕОТИДЫ, МЕЧЕННЫЕ ЗАРЯДОМ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2751359C2 |
| ПОЛИМЕТИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК | 2016 |
|
RU2696562C1 |
| КУМАРИНЫ, ЗАМЕЩЕННЫЕ ВТОРИЧНЫМИ АМИНАМИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК | 2018 |
|
RU2756272C2 |
| КОМПОЗИЦИИ, СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ СОЕДИНИТЕЛЬНЫХ СТРУКТУР, ПРИКРЕПЛЕННЫХ К ПОЛИМЕРАЗАМ, РАСПОЛОЖЕННЫМ ВБЛИЗИ НАНОПОР | 2016 |
|
RU2713396C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа, включающая наночастицу для повышения доступной площади поверхности субстрата для затравки и кластеризации при секвенированиии путем синтеза (SBS) (варианты) и способ повышения плотности затравки и моноклональной кластеризации при SBS (варианты). В одном варианте реализации наночастица содержит каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом. Изобретение расширяет арсенал средств для повышения доступной площади поверхности субстрата для затравки и кластеризации при секвенированиии путем синтеза (SBS). 6 н. и 40 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 1 пр.
1. Наночастица для повышения доступной площади поверхности субстрата для затравки и кластеризации при секвенированиии путем синтеза (SBS), содержащая:
каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, выбранный из матричного сайта для ковалентного связывания и матричного сайта для нековалентного связывания, и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом, выбранных из вспомогательных сайтов для ковалентного связывания олигонуклеотидов и вспомогательных сайтов для нековалентного связывания олигонуклеотидов, причем
каркас представляет собой соединение формулы I
,
каждый X представляет собой соединение формулы II
,
где R2 выбирают из формулы IIIa
,
где R5 выбирают из 
, 
, 
, 
, 
и 
,
x представляет собой целое число в диапазоне 1-20000, и y представляет собой целое число в диапазоне 1-100000, и соотношение x : y может составлять от около 10 : 90 до около 1 : 99, и где каждый Rz независимо представляет собой H или C1-4 алкил,
и формулы IIIb
,
где R5 выбирают из , , , , и ,
y представляет собой целое число в диапазоне 1-2000, а x и z представляют собой целые числа, сумма которых находится в диапазоне 1-10000, и соотношение (x : y) : z может составлять от около (85) : 15 до около (95) : 5, и где каждый Rz независимо представляет собой H или C1-4 алкил,
R1 включает один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из C1-C20 алкила, C1-C20 алкенила, C1-C20 алкинила, C1-C20 оксаалкила, C1-C20 тиаалкила или C1-C20 азаалкила, а R3 включает вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов.
2. Наночастица по п. 1, где C1-C20 алкил, C1-C20 алкенил, C1-C20 алкинил, C1-C20 оксаалкил, C1-C20 тиаалкил и C1-C20 азаалкил одного или более R4 замещен одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы.
3. Наночастица по п. 1 или 2, в которой один матричный сайт содержит матричный сайт для ковалентного связывания.
4. Наночастица по п. 3, в которой матричный сайт для ковалентного связывания выбирают из сайта связывания амин-NHS сложного эфира, сайта связывания амин-сложного имидоэфира, сайта связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайта связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайта связывания карбоксил-карбодиимида, сайта связывания тиол-малеимида, сайта связывания тиол-галогенацетила, сайта связывания тиол-пиридил дисульфида, сайта связывания тиол-тиосульфоната, сайта связывания тиол-винилсульфона, сайта связывания альдегид-гидразида, сайта связывания альдегид-алкоксиамина, сайта связывания альдегид-NHS сложного эфира, сайта связывания гидрокси-изоцианата, сайта связывания азид-алкина, сайта связывания азид-фосфина, сайта связывания трансциклооктен-тетразина, сайта связывания норборнен-тетразина, сайта связывания азид-циклооктина, сайта связывания азид-норборнена, сайта связывания оксима, сайта связывания SpyTag-SpyCatcher, сайта связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайта связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайта связывания присоединения сортазы.
5. Наночастица по п. 1 или 2, в которой один матричный сайт содержит матричный сайт для нековалентного связывания.
6. Наночастица по п. 5, в которой матричный сайт для нековалентного связывания содержит сайт гибридизации полинуклеотидов.
7. Наночастица по п. 5, в которой матричный сайт для нековалентного связывания содержит сайт для нековалентного связывания пептидов, а сайт для нековалентного связывания пептидов выбирают из сайта связывания с суперспиралью и сайта связывания авидина с биотином.
8. Наночастица по любому из пп. 1-7, в которой множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом содержит вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов.
9. Наночастица по п. 8, в которой вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов выбирают из сайтов связывания амин-NHS сложного эфира, сайтов связывания амин-сложного имидоэфира, сайтов связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайтов связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайтов связывания карбоксил-карбодиимида, сайтов связывания тиол-малеимида, сайтов связывания тиол-галогенацетила, сайтов связывания тиол-пиридил дисульфида, сайтов связывания тиол-тиосульфоната, сайтов связывания тиол-винилсульфона, сайтов связывания альдегид-гидразида, сайтов связывания альдегид-алкоксиамина, сайтов связывания гидрокси-изоцианата, сайтов связывания азид-алкина, сайтов связывания азид-фосфина, сайтов связывания трансциклооктен-тетразина, сайтов связывания норборнен-тетразина, сайтов связывания азид-циклооктина, сайтов связывания азид-норборнена, сайтов связывания оксима, сайтов связывания SpyTag-SpyCatcher, сайтов связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайтов связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина, сайтов связывания присоединения сортазы, а также любой комбинации двух или более из приведенных выше.
10. Наночастица по любому из пп. 1-7, в которой вспомогательные сайты для связывания олигонуклеотидов содержат вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов.
11. Наночастица по п. 10, в которой вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов содержат сайты гибридизации полинуклеотидов.
12. Наночастица по п. 10, в которой вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов содержат сайты для нековалентного связывания пептидов, а сайты для нековалентного связывания пептидов выбирают из одного или обоих сайтов связывания с суперспиралью и сайтов связывания авидина с биотином.
13. Наночастица по любому из пп. 1-12, дополнительно содержащая один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом.
14. Наночастица по любому из пп. 1-13, дополнительно содержащая множество вспомогательных олигонуклеотидов, связанных со множеством вспомогательных сайтов.
15. Наночастица по любому из пп. 1-14, причем наночастица имеет диаметр по меньшей мере около 10 нм.
16. Способ повышения плотности затравки и моноклональной кластеризации при SBS, включающий связывание одного матричного полинуклеотида с одним матричным сайтом наночастицы по любому из пп. 1-15.
17. Способ повышения плотности затравки и моноклональной кластеризации при SBS, включающий связывание множества вспомогательных олигонуклеотидов со множеством вспомогательных сайтов наночастицы по любому из пп. 1-15.
18. Способ по п. 16 или 17, дополнительно включающий синтез одной или более присоединенных к каркасу копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к каркасу копии отходят от вспомогательных олигонуклеотидов.
19. Способ по любому из пп. 16-18, дополнительно включающий присоединение каркаса к субстрату, причем присоединение включает гибридизацию вспомогательных олигонуклеотидов с олигонуклеотидами, присоединенными к субстрату.
20. Способ по п. 19, в котором субстрат содержит множество нанолунок, а олигонуклеотиды, присоединенные к субстрату, присоединены во множестве нанолунок.
21. Способ по п. 20, в котором в любой из нанолунок связывается не более одного каркаса.
22. Способ по любому из пп. 19-21, дополнительно включающий синтез одной или более присоединенных к субстрату копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к субстрату копии отходят от олигонуклеотидов, присоединенных к субстрату.
23. Способ по п. 18 или 22, дополнительно включающий секвенирование по меньшей мере одной из присоединенных к каркасу копий и присоединенных к субстрату копий, причем секвенирование включает секвенирование путем синтеза.
24. Наночастица для повышения доступной площади поверхности субстрата для затравки и кластеризации при SBS, содержащая:
каркас, один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, выбранный из матричного сайта для ковалентного связывания и матричного сайта для нековалентного связывания, и множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом, выбранных из вспомогательных сайтов для ковалентного связывания олигонуклеотидов и вспомогательных сайтов для нековалентного связывания олигонуклеотидов, причем
каркас представляет собой соединение формулы IV
,
каждый X представляет собой соединение формулы V
,
где R2 выбирают из формулы VIa
и формулы VIb 
,
где p представляет собой целое число, выбранное из диапазона от 1 до 20, а R5 содержит вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов, R3 выбирают из прямой связи, 
, 
, 
, 
, 
и 
, m представляет собой целое число от 1 до 20000, а n представляет собой целое число от 1 до 100000,
R1 содержит один матричный сайт для связывания матричного полинуклеотида с каркасом, R4 выбирают из C1-C20 алкила, C1-C20 алкенила, C1-C20 алкинила, C1-C20 оксаалкила, C1-C20 тиаалкила и C1-C20 азаалкила, а R3 содержит вспомогательный сайт для связывания вспомогательных олигонуклеотидов.
25. Наночастица по п. 24, где C1-C20 алкил, C1-C20 алкенил, C1-C20 алкинил, C1-C20 оксаалкил, C1-C20 тиаалкил или C1-C20 азаалкил одного или более R4 замещен одним или более из C1-C20 алкила, кислорода с двойной связью и гидроксильной группы.
26. Наночастица по п. 24 или 25, в которой один матричный сайт содержит матричный сайт для ковалентного связывания.
27. Наночастица по п. 26, в которой матричный сайт для ковалентного связывания выбирают из сайта связывания амин-NHS сложного эфира, сайта связывания амин-сложного имидоэфира, сайта связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайта связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайта связывания карбоксил-карбодиимида, сайта связывания тиол-малеимида, сайта связывания тиол-галогенацетила, сайта связывания тиол-пиридил дисульфида, сайта связывания тиол-тиосульфоната, сайта связывания тиол-винилсульфона, сайта связывания альдегид-гидразида, сайта связывания альдегид-алкоксиамина, сайта связывания гидрокси-изоцианата, сайта связывания азид-алкина, сайта связывания азид-фосфина, сайта связывания трансциклооктен-тетразина, сайта связывания норборнен-тетразина, сайта связывания азид-циклооктина, сайта связывания азид-норборнена, сайта связывания оксима, сайта связывания SpyTag-SpyCatcher, сайта связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайта связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина и сайта связывания присоединения сортазы.
28. Наночастица по любому из пп. 24 или 25, в которой один матричный сайт содержит матричный сайт для нековалентного связывания.
29. Наночастица по п. 28, в которой матричный сайт для нековалентного связывания содержит сайт гибридизации полинуклеотидов.
30. Наночастица по п. 28, в которой матричный сайт для нековалентного связывания содержит сайт для нековалентного связывания пептидов, а сайт для нековалентного связывания пептидов выбирают из одного или обоих из сайта связывания с суперспиралью и сайта связывания авидина с биотином.
31. Наночастица по любому из пп. 24-30, в которой множество вспомогательных сайтов для связывания вспомогательных олигонуклеотидов с каркасом содержит вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов.
32. Наночастица по п. 31, в которой вспомогательные сайты для ковалентного связывания олигонуклеотидов выбирают из сайтов связывания амин-NHS сложного эфира, сайтов связывания амин-сложного имидоэфира, сайтов связывания амин-пентафторфенилового сложного эфира, сайтов связывания амин-гидроксиметилфосфина, сайтов связывания карбоксил-карбодиимида, сайтов связывания тиол-малеимида, сайтов связывания тиол-галогенацетила, сайтов связывания тиол-пиридил дисульфида, сайтов связывания тиол-тиосульфоната, сайтов связывания тиол-винилсульфона, сайтов связывания альдегид-гидразида, сайтов связывания альдегид-алкоксиамина, сайтов связывания гидрокси-изоцианата, сайтов связывания азид-алкина, сайтов связывания азид-фосфина, сайтов связывания трансциклооктен-тетразина, сайтов связывания норборнен-тетразина, сайтов связывания азид-циклооктина, сайтов связывания азид-норборнена, сайтов связывания оксима, сайтов связывания SpyTag-SpyCatcher, сайтов связывания Snap-тег-O6-бензилгуанина, сайтов связывания CLIP-тег-O2-бензилцитозина, сайтов связывания присоединения сортазы, а также любой комбинации двух или более из приведенных выше.
33. Наночастица по любому из пп. 24-30, в которой вспомогательные сайты для связывания олигонуклеотидов содержат вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов.
34. Наночастица по п. 33, в которой вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов содержат сайты гибридизации полинуклеотидов.
35. Наночастица по п. 33, в которой вспомогательные сайты для нековалентного связывания олигонуклеотидов содержат сайты для нековалентного связывания пептидов, а сайты для нековалентного связывания пептидов выбирают из одного или обоих сайтов связывания с суперспиралью и сайтов связывания авидина с биотином.
36. Наночастица по любому из пп. 24-35, дополнительно содержащая один матричный полинуклеотид, связанный с одним матричным сайтом.
37. Наночастица по любому из пп. 24-36, дополнительно содержащая множество вспомогательных олигонуклеотидов, связанных со множеством вспомогательных сайтов.
38. Наночастица по любому из пп. 24-37, причем наночастица имеет диаметр по меньшей мере около 10 нм.
39. Способ повышения плотности затравки и моноклональной кластеризации при SBS, включающий связывание одного матричного полинуклеотида с одним матричным сайтом наночастицы по любому из пп. 24-38.
40. Способ повышения плотности затравки и моноклональной кластеризации при SBS, включающий связывание множества вспомогательных олигонуклеотидов со множеством вспомогательных сайтов наночастицы по любому из пп. 24-38.
41. Способ по п. 39 или 40, дополнительно включающий синтез одной или более присоединенных к каркасу копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к каркасу копии отходят от вспомогательных олигонуклеотидов.
42. Способ по любому из пп. 39-41, дополнительно включающий присоединение каркаса к субстрату, причем присоединение включает гибридизацию вспомогательных олигонуклеотидов с олигонуклеотидами, присоединенными к субстрату.
43. Способ по п. 42, в котором субстрат содержит множество нанолунок, а олигонуклеотиды, присоединенные к субстрату, присоединены во множестве нанолунок.
44. Способ по п. 43, в котором в любой из нанолунок связывается не более одного каркаса.
45. Способ по любому из пп. 42-44, дополнительно включающий синтез одной или более присоединенных к субстрату копий, выбранных из копий матричного полинуклеотида, копий полинуклеотидов, комплементарных матричному полинуклеотиду, и копий обоих, причем присоединенные к субстрату копии отходят от олигонуклеотидов, присоединенных к субстрату.
46. Способ по п. 41 или 45, дополнительно включающий секвенирование по меньшей мере одной из присоединенных к каркасу копий и присоединенных к субстрату копий, причем секвенирование включает секвенирование путем синтеза.
| WO 2019195633 A1, 10.10.2019 | |||
| US 6645721 B2, 11.11.2003 | |||
| US 8063131 B2, 22.11.2011 | |||
| Предохранительное приспособление при круглых пилах | 1930 |
|
SU21422A1 |
| RU 2018105118 A, 23.09.2019 | |||
| СЛИТЫЙ БЕЛОК, НАНОЧАСТИЦА, СОСТОЯЩАЯ ИЗ МНОЖЕСТВА МОНОМЕРОВ УКАЗАННОГО СЛИТОГО БЕЛКА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2714155C2 |
