Способ и тест-система для определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Настоящий способ относится к области молекулярной генетики, акушерства. Предложенный способ позволяет определить долю плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины вне зависимости от пола плода.

Уровень техники.

В плазме крови беременной женщины помимо свободноциркулирующей ДНК (сцДНК) самой женщины есть еще и ДНК, принадлежащая плоду. Это используется для скрининга наличия ряда генетических нарушений, таких как изменения числа хромосом (анеуплоидии). При проведении таких исследований важным параметром, влияющим на чувствительность метода, является доля плодовой ДНК среди всей сцДНК. В случае беременности с плодом мужского пола для определения доли плодовой ДНК может быть использована представленность фрагментов Y хромосомы, что не представляет технической сложности. В случае беременности плодом женского пола определение доли плодовой ДНК требует проведения дополнительных исследований.

На данный момент в мире применяется несколько способов определения доли фетальной ДНК в общем пуле сцДНК. Все они основаны на пределении подсчете фрагментов, для которых можно определить их происхождение. Например, использование фрагментов специфичных для Y хромосомы, что возможно только для плода мужского пола или вне зависимости от пола: по-разному метилированных фрагментов сцДНК, однонуклеотидные полиморфизмы, различия плодовой и материнской ДНК по длине.

Существует патент (Methods for non-invasive prenatal ploidy calling US 2011/0288780 A1), описывающий процедуру определения наличия анеуплоидий плода с использованием около 20000 полиморфных локусов, включающий в том числе этап определения доли плодовой ДНК. Однако точность оценки доли плодовой ДНК достигается использованием значительного количества исследуемых локусов.

Существует патент (Resolving genome fractions using polymorphism counts US 21012/0264121 A1), описывающий процедуру определения доли ДНК примеси, в том числе доли плодовой ДНК, на основании подсчета частоты встречаемости полиморфных аллелей, в том числе ОНП. Метод также предполагает использования большого числа локусов.

При использовании однонуклеотидных полиморфизмов для определения доли плодовой ДНК, информативными (пригодными для определения доли плодовой ДНК) будут точки, в которых мать имеет гомозиготный генотип АА, а плод гетерозиготный АВ. В этом случая доля плодовой ДНК может быть определена, как удвоенное отношение количества прочтений аллеля B ко всем прочтениям: Доля плодовой ДНК=2*В/(А+В).

Наибольшая вероятность получить информативный вариант ОНП при одинаковом соотношении частот встречаемости обоих аллелей. Для выбора ОНП с подходящей частотой встречаемости можно использовать данные широкомасштабных популяционных исследований Hapmap (International, Т. & Consortium, Н. The International НарМар Project Nature 426, 789-796 (2003)).

Задача изобретения - определение доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины вне зависимости от пола плода.

Данное изобретение отличается от перечисленных выше использованием небольшого числа ОНП с высокой частотой встречаемости гетерозиготы для определения доли плодовой ДНК и набором праймеров.

Описание изобретения

Для определения доли плодовой ДНК используется 53 однонуклеотидных полиморфизма (ОНП) расположенных на 1-12 хромосомах с частотой встречаемости гетерозиготы 40-50%. Список ОНП их позиций в геноме и частоты встречаемости в российской популяции приведен в таблице 1. Список праймеров приведен в таблице 2.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Проводят забор периферической крови из вены у беременной женщины

2. С помощью последовательного центрифугирования или любым другим адаптированным для данного исследования способом отделяют плазму.

3. Из плазмы выделяется внеклеточная ДНК, содержащая материнскую и плодовую фракции.

4. Проводят амплификацию фрагментов ДНК, включающих ОНП.

5. Определяют последовательности (проводят секвенированирование) полученных фрагментов ДНК с помощью методов высокопроизводительного секвенирования.

6. Для каждого из ОНП подсчитывают представленность обоих аллелей. ОНП с долей менее представленного аллеля от 0.0075 до 0.20 и суммарным покрытием не менее 1000 фрагментов считают информативными. И для каждого ОНП рассчитывают долю плодовой ДНК по формуле: 2*B/(A+B), где A доля более представленного аллеля, а B - доля менее представленного аллеля.

7. Доля плодовой ДНК определяется как медиана значений доли плодовой ДНК для всех информативных аллелей.

Реализация изобретения (пример)

Результаты определения доли плодовой ДНК с помощью ОНП сравнивали с результатами определения доли плодовой ДНК по Y хромосоме.

Образец 1: доля плодовой ДНК по Y хромосоме - 14%.

В таблице 3 приведены результаты подсчета частоты встречаемости аллелей для каждого ОНП. Всего 13 информативных ОНП. Доля плодовой ДНК, определенная на основании секвенирования последовательностей ОНП, 13%.

Образец 2: доля плодовой ДНК по Y хромосоме - 11%.

В таблице 4 приведены результаты подсчета частоты встречаемости аллелей для каждого ОНП. Всего 17 информативных ОНП. rs7696439 исключен из рассмотрения из-за низкого покрытия - 204 фрагмента. Доля плодовой ДНК, определенная на основании секвенирования последовательностей ОНП, 11,4%.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, и предназначено для определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования. Используют 53 однонуклеотидных полиморфизма (ОНП), расположенных на 1-12 хромосомах с частотой встречаемости гетерозиготы 40-50%, и специфические праймеры к ним. Долю плодовой ДНК определяют как медиану значений доли плодовой ДНК для всех информативных ОНП. Изобретение обеспечивает эффективное определение доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины вне зависимости от пола плода. 4 табл., 2 пр.

Способ определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования отличается тем, что используют 53 однонуклеотидных полиморфизма (ОНП), расположенных на 1-12 хромосомах с частотой встречаемости гетерозиготы 40-50%, и специфические праймеры к ним:

,

при этом для каждого из ОНП подсчитывают представленность обоих аллелей, ОНП с долей менее представленного аллеля от 0.0075 до 0.20 и суммарным покрытием не менее 1000 фрагментов считают информативными; для каждого информативного ОНП рассчитывают долю плодовой ДНК по формуле: 2*В/(А+В), где А доля более представленного аллеля, а В - доля менее представленного аллеля; долю плодовой ДНК определяют как медиану значений доли плодовой ДНК для всех информативных ОНП.