СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИСТОЧНИКА АНЕУПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ПО КРОВИ БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/49 C12Q1/68 G06F19/20 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и медицинской генетике.

Предшествующий уровень техники

Известно, что анеуплоидии - генетические патологии, при которых число хромосом в клетках некратно основному набору. Они, в частности, приводят к проявлению у новорожденных синдрома Дауна (трисомия по 21 хромосоме), синдрома Эдвардса (трисомия по 18 хромосоме), синдрома Патау (трисомия по 13 хромосоме), синдрома Тернера (моносомия X) и других патологий.

Наиболее безопасным методом скрининга анеуплоидий плода в настоящее время является неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери (НИПС) (см. Spencer, K. Screening for Down syndrome. Scand. J. Clin. Lab. Investig., 74, suppl 2, 41-7 (2014)). Для неинвазивного пренатального ДНК-скрининга применяют методы, основанные на высокопроизводительном секвенировании свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК в плазме крови беременной женщины.

Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови матери основан на анализе свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК в плазме крови беременной женщины начиная с 8-ой недели беременности. Помимо материнской внеклеточной ДНК в плазме крови женщины присутствует внеклеточная ДНК плода (прошедшая плацентарный барьер). ДНК-скрининг проводится с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования (next generation sequencing, massively parallel sequencing). На первом этапе проводится забор периферической крови из вены, после чего с помощью последовательного центрифугирования или любым другим адаптированным для данного исследования способом отделяют плазму. На втором этапе из плазмы выделяют внеклеточную ДНК, содержащую материнскую и плодовую фракции. Далее определяют последовательность нуклеотидов полученных фрагментов ДНК (проводят секвенирование) с помощью методов высокопроизводительного секвенирования (NGS). Для секвенирования может быть использована любая технология, позволяющая определить длину фрагментов внеклеточной ДНК, например, Ion Torrent (Life technologies Thermo Fisher, США), позволяющая получать прочтения длиной порядка 300 пар нуклеотидов (п.н.); использование парно-концевых библиотек (pair-end) и другие методы (NGS: высокопроизводительное секвенирование / Ребриков Д.В., Коростин Д.О., Шубина Е.С., Ильинский В.В.; под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова; предисл. акад. Е.Д. Свердлова и М.С. Гельфанда. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. - 232 с.: ил. ISBN 978-5-9963-1784-4.). Как правило секвенируется вся свободно циркулирующая (внеклеточная) ДНК. Результаты оцениваются путем подсчета фрагментов, приходящихся на уникальные участки каждой из хромосом с использованием биоинформатических алгоритмов обработки данных. Для определения риска наличия анеуплоидий у плода может использоваться любой способ проверки статистической значимости увеличения количества фрагментов, приходящихся на выбранную хромосому. Длина фрагментов плодовой ДНК в среднем меньше, чем материнской. Максимум распределения длин материнской ДНК находится примерно в диапазоне 160-180 п.н., в то время как плодовой - 140-160 п.н. Отбор для анализа фрагментов меньшей длины (короче 150-200 п.н.) позволяет исключить из анализа часть материнской ДНК, при этом растет доля фрагментов плодового происхождения, в анализируемой выборке фрагментов.

Однако использование описанного выше метода предполагает нормальный кариотип матери (отсутствие у беременной женщины ее собственных анеуплоидных клеток). Наличие анеуплоидий, включая частичные и мозаичные варианты, в соматических клетках матери является ограничением для проведения исследования и может приводить к ложноположительным результатам, поскольку стандартные алгоритмы анализа не позволяют различать материнское и плодовое происхождение фрагментов внеклеточной ДНК.

Для анеуплоидий описаны различные варианты мозаицизма (наличия в одном организме клеток с разным генотипом), причем при низкой степени мозаицизма могут отсутствовать характерные (или даже какие-либо) фенотипические признаки анеуплоидий.

Наиболее часто встречается мозаичный вариант синдрома Тернера (Levitsky, L.L., O'Donnell Luria, А.Н., Hayes, F.J. & Lin, A.E. Turner syndrome. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 22, 65-72 (2015). По данным цитогенетических исследований положительное предсказательное значение (PPV) высокого риска моносомии по X хромосоме по результатам неинвазивного пренатального ДНК-скрининга составляет меньше 50% (Wang, J.-C. et al. Discordant noninvasive prenatal testing and cytogenetic results: a study of 109 consecutive cases. Genet. Med. 17, 2-4 (2014). Это снижает доверие пациентов к результатам скрининга и часть беременных отказывается от подтверждающей диагностики, что, в свою очередь, может приводить к рождению детей с патологией.

В изобретении «DIAGNOSING FETAL CHROMOSOMAL ANEUPLOIDY USING MASSIVELY PARALLEL GENOMIC SEQUENCING)) (US2009029377(A1), UNIV HONG KONG CHINESE, 29.01.2009) описан способ определения анеуплоидий плода по биологическому образцу беременной женщины, содержащему смесь свободноциркулирующей ДНК матери и плода, заключающийся в том, что содержащуюся в образце внеклеточную. ДНК секвенируют, затем определяют количество фрагментов, принадлежащих каждой из исследуемых хромосом. После чего с помощью статистического анализа определяют вероятность наличия анеуплоидий у плода. Изобретение обеспечивает эффективную пренатальную неинвазивную диагностику анеуплоидий плода, однако не позволяет отличить анеуплоидий в клетках плода и клетках матери.

Описан способ неинвазивной диагностики анеуплоидий плода методом секвенирования на основе использования геномных библиотек (RU 2543155 С1, "Геноаналитика", 27.02.2015). Способ позволяет повысить чувствительность и селективность определения анеуплоидий плода. Описаны процедуры анализа, позволяющие скорректировать зашумленность первичных данных, возникающую в следствие особенностей приготовления геномных библиотек и секвенирования. Изобретение позволяет повысить чувствительность и селективность определения анеуплоидий плода, однако не позволяет установить источник анеуплоидных клеток: клетки ли это плода или клетки матери.

Описана «ТЕХНОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНЕУПЛОИДИЙ МЕТОДОМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ» (RU 2529784 С2, ЗАО Теноаналитика", 27.09.2014). Из образца крови беременной женщины получают внеклеточную ДНК, создают геномные библиотеки, которые секвенируют с целью получения множества прочтений ДНК и определяют представленность каждой хромосомы в геноме. Вывод о наличии анеуплоидий по какой-либо хромосоме делают при обнаружении отличий в представленности отдельных хромосом от среднего значения по геному, при этом отличие в представленности отдельных хромосом от среднего значения по геному идентифицируют при р-value <0.0001 в результате применения одностороннего двухвыборочного t-критерия Стьюдента для независимых выборок к покрытиям окон. Изобретение обеспечивает эффективную пренатальную неинвазивную диагностику анеуплоидий плода начиная с периода первого триместра беременности, однако также не позволяет установить источник анеуплоидных клеток: клетки ли это плода или клетки матери.

Известен способ неинвазивного обнаружения генетической аномалии плода (RU 2589681 С2, БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд. (CN), 10.07.2016), в котором представлен алгоритм анализа результатов секвенирования смеси ДНК матери и плода. Способ включает операции: получение данных о последовательностях нуклеотидных фрагментов для нормальных образцов, анализ отношения между глубиной покрытия и GC составом хромосомы. Затем проводят подсчет количества фрагментов, принадлежащих каждой из хромосом для анализируемого образца, проводят нормализацию покрытия в зависимости от покрытия других хромосом и сравнение нормализованной глубины покрытия исследуемого образца с глубиной покрытия хромосом для нормальных образцов. Степень различия между значениями для исследуемого образца и нормального контроля указывает на наличие или отсутствие анеуплоидий у плода. Однако изобретение также не позволяет установить источник анеуплоидных клеток: клетки ли это плода или клетки матери.

В заявке US 2013275103 (A1), ARIOSA DIAGNOSTICS INC, 17.10.2013, описан способ определения копийности половых хромосом по биологическому образцу беременной женщины, содержащему смесь ДНК матери и плода. Для образца, содержащего смесь ДНК матери и плода, с помощью специфичных праймеров, проводится обогащение фрагментами ДНК, относящимися к выбранным регионам на X и Y хромосоме и, по меньшей мере, одной аутосоме. Регионы отобраны таким образом, чтобы они содержали в себе высоко полиморфные локусы. На основании соотношения аллелей в этих локусах определяется доля плодовой ДНК в образце. Определяется соотношение представленности фрагментов X и Y хромосом и аутосом, и рассчитывается наиболее вероятный генотип плода с учетом определенной ранее доли плодовой ДНК. Авторы утверждают, что на основании данных о доле плодовой ДНК и соотношения представленности фрагментов хромосом в некоторых случаях можно сделать предположение о наличии анеуплоидий по X хромосоме у матери. Примеров применения для определения анеуплоидий у матери и описания алгоритма определения не приводится.

Наиболее близким аналогом патентуемого изобретения является способ, предложенный Ло и соавт. (US 2016217251 (A1), THE CHINESE UNIV OF HONG KONG, 28.07.2016). Способ позволяет детектировать наличие субхромосомных аберраций (изменения числа копий, делеции или дупликации отдельных участков хромосом) в образцах, содержащих смесь свободно циркулирующей ДНК матери и плода, и определять источник аберраций: клетки ли это плода или клетки матери. Для каждой секвенированной последовательности определяется ее размер и положение в геноме. Затем подсчитывается число молекул, приходящихся на различные участки фиксированной длины и рассчитывается параметр, позволяющий классифицировать каждый из участков как имеющий/не имеющий аберрацию. После этого: 1) подсчитывается распределение длин последовательностей, приходящихся на каждый из участков; 2) подсчитывается распределение длин последовательностей, приходящихся на референсные участки и 3) определяется значение отсечек для установления статистической значимости.

В зависимости от того, каким методом была обнаружена делеция (или дупликация) определяется источник аберраций.

Способ предлагает определять наличие у матери субхромосомных аберраций, но не анеуплоидий целых хромосом.

Известно, что распределение длин фрагментов свободно циркулирующей ДНК матери и плода имеет характерный вид и отличается для матери и плода (Lo, Y.М.D. et al. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. Sci. Transl. Med. 2, 61ra91 (2010). Длина фрагментов плодовой ДНК несколько меньше материнской. Полагают, что это связано с деградацией ДНК в процессе апоптоза клеток фетального происхождения. Оценка распределения длин секвенированных фрагментов может быть использована для определения доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода (Yu, S.С.Y. et al. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 8583-8 (2014)). Кроме того, отбор для анализа более коротких фрагментов помогает увеличить долю фрагментов ДНК плодового происхождения и повысить чувствительность метода (Minarik, G. et al. Utilization of Benchtop Next Generation Sequencing Platforms Ion Torrent PGM and MiSeq in Noninvasive Prenatal Testing for Chromosome 21 Trisomy and Testing of Impact of In Silico and Physical Size Selection on Its Analytical Performance. PLoS One 10, e0144811 (2015).

Таким образом, из достигнутого уровня техники неизвестна возможность определения источника анеуплоидных клеток: клетки ли это плода или клетки матери, посредством неинвазивного пренатального ДНК-скрининга. Эта информация является важной для исключения анеуплоидий матери, в том числе в частичной и мозаичной форме, как причины ложноположительных результатов скрининга и формирования группы женщин с высоким риском различных форм анеуплоидий в кариотипе, для которых неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови матери в отношении установленных анеуплоидий является неинформативным.

Раскрытие изобретения

Проблемой, на решение которой направлено изобретение, является определение источника анеуплоидных клеток: клетки ли это плода или клетки матери, при неинвазивном пренатальном ДНК-скрининге анеуплоидий плода по крови беременной.

Технический результат - повышение достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови беременной) за счет выявления случаев анеуплоидий самой матери, в том числе мозаичных форм, являющихся причиной ложноположительных результатов ДНК-скрининга. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу женщин с высоким риском анеуплоидий их собственных клеток (но не клеток плода).

Лучший вариант осуществления изобретения

Способ, позволяющий установить источник анеуплоидных клеток: клетки ли это плода или клетки матери, осуществляют следующим образом:

1. Проводят неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови беременной женщины путем анализа свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК одним из стандартных методов высокопроизводительного секвенирования, для чего:

выделяют из плазмы крови беременной женщины свободно циркулирующую (внеклеточную) ДНК;

проводят высокопроизводительное секвенирование полученной внеклеточной ДНК с оценкой размера (длины) исходных фрагментов ДНК;

проводят компьютерное определение местоположения секвенированных фрагментов ДНК на референсной последовательности геномной ДНК человека;

проводят подсчет количества фрагментов, приходящихся на каждую хромосому (или любой выбранный участок любой хромосомы);

проводят проверку статистической значимости увеличения количества фрагментов, приходящихся на каждую отдельную хромосому, для установления риска анеуплоидий плода.

2. В случае обнаружения высокого риска анеуплоидий, определяют долю плодовой ДНК по хромосоме, для которой определен высокий риск анеуплоидий, с использованием всех секвенированных фрагментов вне зависимости от их длины;

3. Путем анализа данных секвенирования проводят отбор фракции фрагментов свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК меньшей длины.

4. Для полученной фракции определяют долю плодовой ДНК.

5. Для хромосомы, для которой определен высокий риск анеуплоидий, определяют изменение доли плодовой ДНК, в зависимости от длины фрагментов внеклеточной ДНК, отобранных для анализа.

6. В случае возрастания доли плодовой ДНК при уменьшении длины отобранных для анализа фрагментов внеклеточной ДНК следует предполагать плодовое происхождение анеуплоидий, в случае отсутствия возрастания доли плодовой ДНК -следует предполагать наличие анеуплоидий в клетках матери.

Для анеуплоидной хромосомы доля плодовой ДНК может быть вычислена по формуле , где N_ma - среднее покрытие аутосом, N_x - покрытие хромосомы, для которой определен высокий риск анеуплоидий.

Для определения изменения доли плодовой ДНК проводят отбор фракции более коротких фрагментов (на практике значение отсечки подбирают эмпирически, например, берут фрагменты короче 160 п.н., или 165 п.н., или 168 п.н., или 170 п.н. и т.п.).

В случае плодового происхождения анеуплоидий доля плодовой ДНК будет возрастать при отборе для анализа более коротких фрагментов, а в случае анеуплоидий в клетках матери возрастания не будет. На рисунке показаны экспериментальные результаты - примеры зависимости доли плодовой ДНК, определенной по анеуплоидной хромосоме, от длины анализируемых фрагментов при анеуплоидий в клетках матери и анеуплоидий плодового происхождения.

Наличие или отсутствие роста определяют по значению соотношения

(((ff₂-ff₁)/ff₁)-1.29)/r

где ff₁ - доля плодовой ДНК для анеуплоидной хромосомы при использовании для анализа всех фрагментов;

ff₂ - доля плодовой ДНК после отбора для анализа более коротких фрагментов внеклеточной ДНК;

r - доля фрагментов, оставшихся после отбора для анализа более коротких фрагментов внеклеточной ДНК;

r=М2/М1, где M1 - количество фрагментов ДНК при использовании для анализа всех фрагментов, М2 - количество фрагментов ДНК после отбора для анализа более коротких фрагментов.

При значении r>0,7 проводят дополнительный отбор для анализа еще более коротких фрагментов внеклеточной ДНК, и повторяют шаг до тех пор, пока г не достигнет значения ≤0,7, или максимальная длина анализируемых фрагментов станет менее 150 п.н. В последнем случае дальнейший анализ невозможен, так как данная ситуация свидетельствует о проблемах в лабораторной части анализа, либо связана с низким качеством исходного биоматериала. При значении отношения (((ff₂-ff₁)/ff₁)-1.29)/r больше или равном минус 2 делается заключение о плодовом происхождении выявленной анеуплоидий, а при значении меньше минус 2 - о материнском.

Наличие или отсутствие роста доли ff_X плодовой ДНК может также определяться по абсолютным показателям значений доли плодовой ДНК или другим способом.

Нижеследующие примеры обосновывают достижение технического результата.

Клинический пример №1.

Пациентка Т. 31 год, срок беременности 13-14 недель, обратилась для проведения неинвазивного пренатального ДНК-скрининга из-за ультразвуковых (УЗ) маркеров анеуплоидий: толщина воротникового пространства (ТВП) 8-9 мм (в 3 раза выше нормы), изменение размеров носовой кости, отек подкожной клетчатки туловища, гидроторакс правосторонний.

По результатам ДНК-скрининга обнаружен высокий риск моносомии по X хромосоме. Доля плодовой ДНК по X хромосоме 9% (ff₁=0,09), количество прочитанных фрагментов ДНК - 13 210 443 (M1).

После использования предложенного метода отбора для анализа фрагментов короче 168 п.н. доля плодовой ДНК составила 11% (ff₂=0,11), количество фрагментов 8 062 540 (М2) (r=М2/М1=0.61). Наблюдалось увеличение доли плодовой ДНК. Значение отношения (((ff₂-ff₁)/ff₁)-1.29)/r составило -1.73 > -2.

Следовательно, источником анеуплоидных клеток являются клетки плода.

Риск моносомии по X хромосоме составил 75%. Инвазивное исследование амниотической жидкости с помощью кариотипирования подтвердило наличие у плода моносомии по X хромосоме.

Клинический пример №2.

Пациентка Р. 33 года, срок беременности 15 недель, обратилась для проведения неинвазивного пренатального ДНК-скрининга, риск наличия анеуплоидий по данным скрининга 1-го триместра низкий.

По результатам ДНК-скрининга обнаружен высокий риск моносомии по X хромосоме. Доля плодовой ДНК по X хромосоме 17,5% (ff₁=0,175), количество прочитанных фрагментов ДНК Ml=7 845 909.

После использования предложенного метода отбора для анализа фрагментов короче 168 п.н. доля плодовой ДНК составила 17,3% (ff₂=0,173), количество фрагментов М2=4 523 317 (r=М2/М1=0,576). Наблюдалось уменьшение доли плодовой ДНК. Значение отношения (((ff₂-ff₁)/ff₁)-1.29)/r составило -2.25 < -2.

Следовательно, источником анеуплоидных клеток являются клетки матери.

Инвазивное исследование амниотической жидкости с помощью кариотипирования показало, что у плода нормальный кариотип. При этом цитогенетическое исследование методом FISH (Fluorescence in situ hybridization) показало наличие у матери мозаицизма ХХ/Х0 на уровне 10% анеуплоидных клеток.

Таким образом, представленные материалы подтверждают достижение технического результата - повышение достоверности скрининга за счет отнесения полученного по данным неинвазивного скрининга риска анеуплоидий к плодовому или материнскому происхождению для исключения анеуплоидий самой матери, в том числе частичных и мозаичных форм, являющихся причиной ложноположительных результатов ДНК-скрининга. Описанный способ позволяет сформировать группу женщин с высоким риском анеуплоидий в кариотипе.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности акушерству и медицинской генетике. Предложены способы определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины. Путем анализа данных секвенирования проводят отбор фракции фрагментов свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК короче 150-200 п. н. Для полученной фракции определяют долю плодовой ДНК (ff_X). В случае возрастания доли плодовой ДНК при уменьшении длины отобранных для анализа фрагментов внеклеточной ДНК предполагают плодовое происхождение анеуплоидий. В случае отсутствия возрастания доли плодовой ДНК - наличие анеуплоидий в клетках матери. Предложенная группа изобретений обеспечивает повышение достоверности лабораторного исследования за счет выявления случаев анеуплоидий самой матери, в том числе мозаичных форм, являющихся причиной ложноположительных результатов ДНК-скрининга. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины, включающий операции:

неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови беременной женщины путем анализа свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК одним из стандартных методов высокопроизводительного секвенирования;

в случае обнаружения высокого риска анеуплоидий определяют долю плодовой ДНК по хромосоме, для которой определен высокий риск анеуплоидий, с использованием всех секвенированных фрагментов вне зависимости от их длины;

путем анализа данных секвенирования проводят отбор фракции фрагментов свободно циркулирующей (внеклеточной) ДНК короче 150-200 п. н.;

для полученной фракции определяют долю плодовой ДНК (ff_X);

долю ff_X плодовой ДНК определяют по формуле

где N_ma - среднее покрытие аутосом, N_x - покрытие хромосомы, для которой определен риск анеуплоидий;

для хромосомы, для которой определен высокий риск анеуплоидий, определяют изменение доли плодовой ДНК, в зависимости от длины фрагментов внеклеточной ДНК, отобранных для анализа;

в случае возрастания доли плодовой ДНК при уменьшении длины отобранных для анализа фрагментов внеклеточной ДНК следует предполагать плодовое происхождение анеуплоидий, в случае отсутствия возрастания доли плодовой ДНК - следует предполагать наличие анеуплоидий в клетках матери.

2. Способ определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины, включающий операции:

выделение из плазмы крови беременной женщины внеклеточной ДНК, содержащей материнскую и плодовую фракции;

секвенирование полученной внеклеточной ДНК с оценкой размера исходных фрагментов ДНК;

определение местоположения на геноме человека секвенированных фрагментов ДНК;

подсчет количества фрагментов, приходящихся на выбранную хромосому или участок хромосомы;

проверка статистической значимости увеличения количества фрагментов, приходящихся на выбранную хромосому для установления риска анеуплоидий плода, и при установлении такого риска - определение доли ff₁ плодовой ДНК для всех секвенированных фрагментов ДНК по хромосоме, для которой выявлен высокий риск анеуплоидий по формуле

где N_ma - среднее покрытие аутосом, N_x - покрытие хромосомы, для которой определен риск анеуплоидий;

подсчет количества M1 всех секвенированных фрагментов;

отбор для анализа фрагментов короче 168 п. н.;

определение доли ff2 плодовой ДНК для фрагментов ДНК короче 168 п. н.;

подсчет количества М2 фрагментов ДНК короче 168 п. н.;

наличие или отсутствие роста доли ff_X плодовой ДНК от длины фрагментов ДНК определяют по показателю:

K=[((ff₂-ff₁)/ff₁)-1.29]:r,

где ff1 - доля плодовой ДНК по хромосоме, для которой выявлен высокий риск анеуплоидий при использовании для анализа всех секвенированных фрагментов ДНК; ff2 - доля плодовой ДНК для длины фрагментов ДНК короче 168 пар нуклеотидов; r=М2/М1 доля фрагментов оставшихся после отбора для анализа более коротких фрагментов внеклеточной ДНК для r≤0,7,

и при K, равном или большем минус 2, относят анеуплоидии к плодовому происхождению, а при K, меньшем минус 2, - к материнскому происхождению.