РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ЭФФЕКТОРНЫХ БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ДЛЯ ИСПРАВЛЕНИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕФЕКТОВ В ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/68 

Область техники

Изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к способам, системам и анализам, включающим в себя низкомолекулярные соединения для косвенного исправления онкогенной дисфункции и мутаций в модифицирующих гистоны генах для лечения злокачественной опухоли или других нарушений благодаря эпигенетической дерегуляции.

Уровень техники

Разрушение эпигенетических механизмов и путей генной регуляции играет важную роль в спектре важных болезненных состояний, включая в себя злокачественную опухоль (Mai & Altucci, 2009, Int J. Biochem Cell Biol 41: 199-213).

Общегеномный скрининг соматических мутаций при неходжкинской лимфоме (NHL) показал высокую распространенность мутаций в генах/белках, участвующих в эпигенетической регуляции генной экспрессии. Оказалось, что рекуррентные соматические мутации в белке метилтрансферазе EZH2, скорее всего, способствуют развитию NHL через повышенную активность PRC2, составным белком которого он является. EZH2 представляет собой "писателя" гистоновых меток, который катализирует триметилирование лизина 27 в гистоне H3 (H3K27me3). Было показано, что опухоли NHL с мутациями EZH2 характеризуются повышенной активностью PRC2 в триметилировании гистона H3K27, что приводит к усиленной супрессии генной экспрессии и опухолеобразованию (Morin, et al., 2010, Nat. Genet., 42(2): 181-185).

Повышенная активность и/или сверхэкспрессия EZH2 была связана с рядом других видов злокачественной опухоли, включающих в себя злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль предстательной железы (в частности, злокачественную опухоль предстательной железы на поздней стадии), множественную миелому и злокачественную опухоль нервной системы. Во многих случаях, повышенная активность/сверхэкспрессия EZH2 была связана с агрессивными или устойчивыми к лекарствам формам этих видов злокачественных опухолей. Метки H3K27me3 читаются белком CBX2.

Метилтрансфераза MLL2 записывает активаторные гистоновые метки. Эта гистоновая модификация интерпретируется считывающим белком BPTF. Мутации в MLL2 также общие в неходжкинской лимфоме с мутациями, наблюдаемыми в 32% случаев DLBCL и 89% фолликулярных лимфом (Morin, et al., 2011, Nature 476: 298-303). Мутационный профиль MLL2 в этих опухолях был полностью согласован с потерей функции. MLL2 участвует в составлении активаторной метки, H3K4me3 (Yap, et al., 2011, Blood 117: 2451-2459; Sneeringer, et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: 20980-20985), и потеря этой способности поддерживает клетки в пролиферативном состоянии не с помощью репрессии программы транскрипции, а через неспособность клеток активировать программу транскрипции продифференциации. Мутации в генах MLL были также обнаружены при аденокарциномах желудка, лейкозах, злокачественных опухолях мочевого пузыря и толстой и прямой кишок (Gui, et al., 2011, Nat. Genet. 43: 875-878; Watanabe, et al., 2011, PLoS One 6:e23320; Ziemin-van der Poel, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10735-10739).

Способность BPTF считывать триметилированный H3K4 была модулирована с помощью конструирования замены одного тирозина на глутаминовую кислоту в домене пальца PHD белка, что приводит к изменению связывания преимущественно с триметил- на диметиллизин в контексте H3K4 (Li, et al., 2007, Molecular Cell, 28: 677-691).

Ингибирование или нарушение связывания считывателей меток гистонов сообщалось в качестве подхода для лечения заболевания, включающего в себя злокачественную опухоль. В частности, деметилазы гистонов были нацелены для ингибирования (смотрите Rotili & Mai, 2011, Genes & Cancer, 2: 663-679; International Patent Application Publication No. WO 2012/071469).

Публикация международной заявки на патент WO 2011/143669 описывает соединения и способы для нарушения взаимодействия бромодомена и экстратерминального белка семейства (BET) с ацетиллизиновой модификацией на N-терминальном хвосте гистона. В частности, соединения ингибируют связывание белка семейства BET с ацетиллизином. Также описано использование соединений для лечения злокачественной опухоли и воспалительных заболеваний.

Публикация международной заявки на патент WO 2012/123119 описывает способы in vitro, использующие биотин и стрептавидин, которые позволяют идентифицировать белки, взаимодействующие с хвостами гистонов и соединениями, которые взаимодействуют с такими белками.

Публикация международной заявки на патент №WO 2012/116170 описывает соединения, которые ингибируют связывающую активность ацетиллизина бромодомена CREB-связывающего белка (CBP).

Эта информация предшествующего уровня техники предусмотрена для целей получения известной информации, характеризующейся, по мнению заявителя, возможным отношением к данному изобретению. Никакое признание не претендует и не должно быть истолковано таким образом, что любая из предшествующей информации представляет собой известный уровень техники по отношению к настоящему изобретению.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится в целом к способам репрограммирования эффекторных белковых взаимодействий для исправления эпигенетических дефектов в злокачественной опухоли.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу идентификации соединений-кандидатов, которые модулируют связывание считывающего гистоновую метку белка с хвостом гистона, включающему: (а) расчетное получение структурной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с мишенью-меткой гистонового хвоста, структурная модель основана на расчетной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с его родственной меткой гистонового хвоста; (b) идентификацию одной или нескольких функциональных особенностей, необходимых для связывания с мишенью-меткой гистонового хвоста в активном сайте считывающего белка и (с) скрининг соединений-кандидатов для идентификации тех, которые вместе с остатками в активном сайте и мишенью-меткой гистонового хвоста существенно воспроизводят функциональные особенности, выявленные на стадии (b).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу идентификации соединений-кандидатов, которые модулируют связывание считывающего метку метилирования гистонов белка с метилированным хвостом гистона, способ включающий: (а) расчетное получение структурной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с мишенью-меткой метилированного гистонового хвоста, структурная модель основана на расчетной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с его родственной меткой метилированного гистонового хвоста; (b) идентификацию одной или нескольких функциональных особенностей, необходимых для связывания с мишенью-меткой метилированного гистонового хвоста в активном сайте считывающего белка и (с) скрининг соединений-кандидатов для идентификации тех, которые вместе с остатками в активном сайте и мишенью-меткой метилированного гистонового хвоста существенно воспроизводят функциональные особенности, выявленные на стадии (b).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения общей формулы I для усиления связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3:

где X представляет собой C=O или S(O)₂,

R₁ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или C₁-C₄-алкокси,

R₂ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкокси или галоген, и R₃ представляет собой Н, или R₂ и R₃, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования: или

R₄ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкокси или галоген,

R₅ представляет собой Н, CH₂NMe₂ или , и

R₆ представляет собой H, и R₇ представляет собой Н, или R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂,

причем, когда R₅ представляет собой H, и R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂, X представляет собой S(O)₂, и причем, когда R₄ представляет собой C₁-алкил, R₅ представляет собой CH₂NMe₂, и R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂, тогда по меньшей мере один из R₁, R₂ и R₃ отличен от Н;

или

(b) X представляет собой NH,

R₁ и R₂ представляют собой Н,

R₃ и R₄, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования:

или

R₅ представляет собой замещенный C₁-C₄-алкил или незамещенный C₂-C₄-алкил, причем каждый заместитель представляет собой галоген, и

R₆ и R₇ взятые вместе образуют =O.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения определенной выше общей формулы I в изготовлении лекарственного средства для увеличения связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к соединению определенной выше общей формулы I для применения для увеличения связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу увеличения связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3, включающему контактирование BPTF с соединением определенной выше общей формулы I.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения определенной выше общей формулы I для лечения злокачественной опухоли.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения определенной выше общей формулы I в изготовлении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к соединению определенной выше общей формулы I для применения в лечении злокачественной опухоли.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у субъекта, включающему введение субъекту соединения определенной выше общей формулы I.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из:

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению выбранного из определенной выше группы соединения в производстве лекарственного средства для увеличения связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к выбранному из определенной выше группы соединению для применения для увеличения связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу увеличения связывания BPTF с моно- или диметилированным лизином 4 гистона 3, включающему контактирование BPTF с выбранным из определенной выше группы соединением.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению выбранного из определенной выше группы соединения для лечения злокачественной опухоли.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению выбранного из определенной выше группы соединения в производстве лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к выбранному из определенной выше группы соединению для применения для лечения злокачественной опухоли.

Краткое описание чертежей

Эти и другие особенности настоящего изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, в котором делается ссылка на прилагаемые графические материалы.

На фиг. 1 представлена модель "тройного репрограммирующего комплекса" BPTF, соединения 2 и пептида H3K4me1.

На фиг. 2 представлены результаты экспериментов по исследованию (А) активности соединений 1-3 против MLL2 гомозиготных со вставками-делециями мутантных клеточных линий SU-DHL-9 и Пфайфер и (В) концентрации зависимости ингибиторной активности соединения 3 в клеточных линиях SU-DHL-9 и Пфайфер.

На фиг. 3 приведены результаты экспериментов, демонстрирующие специфичность цитотоксического эффекта нацеленных BPTF соединений 2 и 3, (А) цитотоксичность соединения 3 в различных клеточных линиях лимфомы, (В) дозозависимый эффект соединения 3 в двух MLL2 мутантных клеточных линиях и (С) дозозависимый эффект соединения 2 в MLL2 мутантной клеточной линии.

На фиг. 4 представлена общая схема анализа осаждения BPTF для оценки взаимодействия с метилированными хвостами H3K4, использованными в примере 5. Эта схема изображает соединение, которое будет стабилизировать связывание H3K4me1 и пространственное затруднение связывания H3K4me3.

На фиг. 5 представлены Вестерн-блоты, показывающие результаты анализа осаждения связывания H3K4 с BPTF в присутствии и в отсутствие (А) соединения 3 и (В) соединения 2.

На фиг. 6 представлены результаты тестирования in vivo соединений 2 и 3 в мышиной ксенотрансплантной модели, (А) соединение 3 и (В) соединение 2, показавшие снижение в увеличении опухоли свыше 9-дневного периода с использованием SU-DHL-9 (MLL2 мутировавшей) клеточной линии в мышиной ксенотрансплантной модели.

На фиг. 7 представлены результаты анализа in vitro для определения жизнеспособности клеток различных клеточных линий лимфомы в присутствии соединения 50 (NSC112372); DoHH-2: дикий тип для EZH2, MEF2B и MLL2; WSU-DLCL2: EZH2 мутация Y641F (дикий тип для MEF2B и MLL2); DB: EZH2 мутация Y641N, мутация MEF2B D83V и три мутации в MLL2.

На фиг. 8 представлены результаты экспериментов с ксенотрансплантатами с использованием WSU-DLCL2 клеточной линии диффузной крупноклеточной лимфомы человека, в которых мышей подвергали воздействию наполнителя, 1 мг/кг или 4 мг/кг соединения 50 (p=0,0047 между контролем и 4 мг/кг группами).

На фиг. 9 приведены результаты анализов in vitro для определения жизнеспособности клеток различных клеточных линий лимфомы в присутствии соединения 51 (NSC2450) (клеточные линии, как на фиг. 1; SU-DHL-9: Ezh2 дикий тип, MEF2B дикий тип, MLL2 indel).

На фиг. 10 представлены результаты экспериментов с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии диффузной крупноклеточной лимфомы человека WSU-DLCL2, в которых мышей подвергали воздействию носителя или соединения 51 в дозе 4 мг/кг в течение 5 дней с последующим 2 мг/кг в течение пяти дней (p=0,0125).

На фиг. 11 представлены результаты анализов in vitro для определения жизнеспособности клеток различных клеточных линий злокачественной опухоли молочной железы в присутствии соединения 50 или соединения 51.

На фиг. 12 представлена модель "тройного репрограммирующего комплекса" CBX2, репрограммирующего CBX2 соединения и пептида H3K4me1.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится в целом к способам "репрограммирования" эпигенетических считывателей или старателей меток для узнавания эпигенетических меток, отличных от их родственных (или природных) меток. Репрограммирование считывателей или старателей, таким образом, может компенсировать эффекты аномальной активности писателя (например, потерю функции или гиперактивность), что может вносить вклад в определенные болезненные состояния. Идентифицированные с помощью этих способов репрограммирующие соединения, таким образом, характеризуются потенциальными терапевтическими применениями при лечении таких болезненных состояний.

В широком аспекте поэтому настоящее изобретение относится к способу для идентификации низкомолекулярных соединений, которые модифицируют аффинность и/или селективность "считывателей" гистоновых меток к их соответствующим гистоновым меткам, которые определены соответствующими "писателями". С помощью изменения взаимодействия между считывающим белком и модифицированными остатками лизина на гистонах через, например, образование "тройного репрограммирующего комплекса" между лизиновым хвостом гистонов, низкомолекулярным соединением-посредником и связывающим лизиновый хвост карманом на считывающей метке, сигнал гистоновой метки, трансдуцированный с помощью считывателя метки ниже по ходу транскрипции (для того чтобы повлиять на экспрессию генов, например), может быть предпочтительно изменен/преобразован. Следовательно, идентифицированные таким образом низкомолекулярные соединения модулируют взаимодействие связывания между модифицированными остатками лизина на гистонах (метки), установленные писателями меток, и эффекторными белками сигнала меток (считывателями) путем введения новых связывающих взаимодействий между считывателем и модифицированными остатками лизина. Этот способ использования низкомолекулярных соединений для введения новых связывающих взаимодействий (репрограммирование) между эпигенетическими метками гистонов и соответствующими считывателями меток для того, чтобы модифицировать сигналы ниже по ходу транскрипции, трансдуцированные определенными гистоновыми метками, может быть применен к различным парам писатель/считыватель эпигенетических белков сигнализации. Путем изменения пути считыватели гистоновых меток трансдуцируют сигналы для различных модифицированных состояний своих субстратных остатков лизина на гистонах, вредные эффекты патогенных или аберрантных эпигенетических меток могут быть исправлены или обращены вспять для того, чтобы успешно лечить такое болезненное состояние, как злокачественная опухоль, причем было показано, что некоторые писатели мутируют (вызывая изменения в уровне или типе метки), и эти мутировавшие писатели представляют собой драйверы злокачественной опухоли (т.е. способствуют или вызывают злокачественную опухоль).

Низкомолекулярные соединения, "репрограммирующие" считывателей гистоновых меток, в соответствии с настоящим изобретением образуют тройной "репрограммирующий комплекс", включающий в себя гистоновый/лизиновый хвост, соединение-посредника и связывающий лизиновый хвост карман считывателя меток, и могут быть идентифицированы с помощью расчетного скрининга низкомолекулярных "виртуальных" библиотек соединений стыкующихся структур, содержащих ключевые связывающие остатки в модифицированном связывающем лизиновый хвост кармане считывателя и лизиновый хвост от гистоновой метки. Низкомолекулярные "репрограммирующие" соединения могут, например, вводить новые взаимодействия между считывающим белком и гистоновым/лизиновым хвостом, содержащим эпигенетическую "метку", и обеспечивать связывание считывающего белка с лизиновым хвостом, несмотря на состояние модификации лизинового хвоста (метки). Низкомолекулярные "репрограммирующие" соединения могут также увеличивать или уменьшать аффинность/связывание считывающего белка с конкретным лизиновым хвостом в зависимости от состояния модификации (например, метилирования) лизинового хвоста/метки. В силу новых взаимодействий, установленных таким образом, низкомолекулярные "репрограммирующие" соединения могут изменять субстратную специфичность считывателя метки к конкретной метке (например, метилированному остатку лизина гистона).

Согласно одному аспекту настоящего изобретения считыватель гистоновых меток представляет собой CBX2, который считывает метки, установленные писателем гистоновых меток метилтрансферазой EZH2 (компонентом белкового комплекса PRC2). EZH2 добавляет метильные группы к остатку лизина 27 гистона H3 (H3K27). Как правило, EZH2 записывает метки супрессии с конечным результатом в виде супрессии активности генов. Увеличения экспрессии (и, следовательно активности писателя меток) EZH2 дикого типа, а также определенных соматических миссенс-мутаций (включающих в себя без ограничения остаток тирозина 641) в EZH2, как известно, изменяют количество или валентность (т.е. моно, ди- или триметилирование) метильных меток в H3K27. Эти изменения в EZH2 приводят к увеличению генной супрессии по отношению к нормальному состоянию, и, как было показано, характеризуются патогенностью и связаны с заболеванием. В частности, они, скорее всего, представляют собой онкогенные или драйверные изменения/мутации для нескольких типов злокачественных опухолей. CBX2 (компонент белкового комплекса PRC1) действует в качестве эффектора для метильных меток EZH2 и важен для трансдукции репрессивного (или сайленсинга генов) сигнала для EZH2 при нормальной функции, а также при болезненных состояниях, где экспрессия или активность EZH2 изменяется. С использованием описанных в настоящем документе способов в настоящее время идентифицированы низкомолекулярные соединения (репрограммирующие соединения), которые будут связываться со связывающим метилированный лизин карманом CBX2 и изменять субстратную специфичность CBX2 к метилированному лизину 27 (H3K27) через образование тройного репрограммирующего комплекса с участием CBX2, низкомолекулярного соединения и метилированного лизинового хвоста. Было показано, что эти низкомолекулярные репрограммирующие CBX2 соединения характеризуются противораковой активностью против клеток лимфомы (с мутацией Тир-641) и опухолей in vitro и in vivo. Преимущество этих низкомолекулярных соединений, которые репрограммируют считыватель (CBX2) для EZH2 заключается в том, что в принципе, они должны быть эффективными лекарственными средствами, способными исправить вызывающие заболевания (онкогенные в случае злокачественной опухоли) изменения в метках EZH2, не зависимых от отклонений в писателе (EZH2). Эти соединения, следовательно, должны характеризоваться преимуществами перед другими соединениями, которые непосредственно воздействуют на белок EZH2 или генную экспрессию EZH2.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения считыватель гистоновых меток представляет собой BPTF, который считывает метки, установленные писателем гистоновых меток метилтрансферазой MLL2. MLL2 добавляет метильные группы к остатку лизина 4 гистона H3 (H3K4). Как правило, активность MLL2 и полученные метильные гистоновые метки активируются и приводят к увеличению генной активности. Снижение генной экспрессии MLL2 или некоторых мутаций MLL2, как известно, связано с болезненными состояниями. В частности, мутации потери функции (LoF) в MLL2 очень часто встречаются и, вероятно, будут онкогенными "драйверными" мутациями при неходжкинской лимфоме или других видах злокачественных опухолей. BPTF представляет собой важный эффекторный белок для трансдукции сигналов, относящихся к записывающему белку MLL2 в сигнальном пути ниже по ходу транскрипции, как при нормальных, так и болезненных состояниях, где активность MLL2 отклоняется. С использованием описанных в настоящем документе способов в настоящее время идентифицированы низкомолекулярные репрограммирующие соединения, которые способны изменять субстратную специфичность BPTF к метильным меткам H3K4, соответствующих писателю MLL2. Были идентифицированы соединения, которые образуют "тройной репрограммирующий комплекс" между соединением, метками H3K4 и метильным связывающим H3K4 карманом в BPTF, что приводит к изменению субстратной специфичности белка BPTF к метке H3K4. Идентифицированные с помощью этих способов репрограммирующие BPTF соединения способны преодолеть и исправить онкогенные эффекты отклонений в белке MLL2, включающие в себя уменьшение экспрессии или мутации с потерей функции в последнем. Эти соединения должны быть эффективными лекарственными средствами для лечения лимфом или других злокачественных опухолей, вызванных мутантным MLL2 или сниженной экспрессией MLL2. Особым преимуществом репрограммирующего BPTF подхода и открытых таким образом соединений заключается в том, что они представляют собой применимые лекарственные средства для исправления дефектной эпигенетической регуляции и для лечения таких заболеваний, как лимфома, включающих в себя мутации потери функции в MLL2, которые не способны к прямому воздействию низкомолекулярными соединениями.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения низкомолекулярное соединение, репрограммирующее описанные в настоящем документе эпигенетические считыватели меток, применимо для заболеваний или нарушений, включающих в себя отклонение или мутацию EZH2 и MLL2 в НМТ, включающих в себя без ограничения такие злокачественные опухоли, как лимфому, злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль молочной железы и неврологические злокачественной опухоли.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения низкомолекулярные соединения, применимые для лечения злокачественной опухоли или других заболеваний эпигенетической регуляции (в частности, модификации гистонов), могут быть идентифицированы через образование тройных репрограммирующих комплексов для изменения субстратной специфичности или аффинности связывания считывателей метилированных меток к метилированным аминокислотным остаткам в гистонах.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к применению способов согласно настоящему изобретению к другим типам/классам эпигенетических меток и их соответствующим писателям и считывателям, включающим в себя без ограничения ацетилирование.

Другой аспект настоящего изобретения относится к биохимическому анализу связывания для проверки и подтверждения свойств репрограммирующих соединений, идентифицированных раскрытыми в настоящем документе способами согласно настоящему изобретению, для модификации субстратной специфичности или аффинности связывания считывателей к различным гистоновым меткам. Этот анализ основан на тройном репрограммирующем комплексе, образованном между метилированным лизиновым остатком гистона (меткой), связывающим метилированный лизин карманом считывателя метки и низкомолекулярным репрограммирующим соединением-посредником. Связывающий анализ измеряет состояние метилирования конкретного лизинового остатка гистона, "осажденного" с соответствующим считывающим белком в присутствии или в отсутствие конкретного репрограммирующего соединения-кандидата.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к применению способов согласно настоящему изобретению к другим типам/классам эпигенетических меток и их соответствующим писателям и "стирателям" гистоновых меток (т.е. деметилазам или деацетилазам), чья биохимическая функция заключается в удалении гистоновых меток (метильных или ацетильных групп). Низкомолекулярные соединения, которые связываются и/или взаимодействуют со стирателями для ингибирования активности стирателя, представляют собой кандидатные лекарственные средства для лечения злокачественной опухоли, поскольку известно, что многие гистоновые стирающие белки характеризуются гиперэкспрессией при нескольких различных типах злокачественной опухоли. Примеры кандидатных стирающих гистоновые метки белков-мишеней включают в себя LSD1, чья биохимическая функция заключается в удалении метильных остатков из метильной метки H3K4 (me2/1), PLU1, чья биохимическая функция заключается в удалении метильных остатков из метильной метки H3K4 (me3/2), GASC1, чья биохимическая функция заключается в удалении метильных остатков из метильной метки H3K9 (me3/2) и другие стиратели меток H3K4, ингибирование которых может исправить или противодействовать онкогенному эффекту мутаций с потерей функций в MLL2.

Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации ингибиторов старателей H3K4 (включающих в себя без ограничения LSD1 и PLU1) с низкомолекулярными репрограммирующими BPTF соединениями (описанными в настоящем документе) для лечения злокачественных опухолей или других нарушений благодаря мутациям потери функций в метилтрансферазе MLL2 гистона.

Другой широкой аспект настоящего изобретения относится к искусственной имитации функций белка MLL2 в качестве подхода к разработке лекарственных средств для лечения неходжкинских лимфом (NHL) и других видов злокачественных опухолей.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к фактору транскрипции BPTF в качестве мишени для развития лекарственных средств для лечения неходжкинских лимфом (NHL), подтипа зародышевых центров В-клетки (GCB) диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), в котором белок метилтрансфераза MLL2 гистонов содержит мутации LoF, подтип похожих на активированные B-клетки (ABC) диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), в котором белок метилтрансфераза MLL2 гистонов содержит мутации LoF, и/или злокачественных опухолей с инактивированным белком MLL2, которые включают в себя без ограничения злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль молочной железы и злокачественной опухоли нервной системы.

Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к соединениям NSC382001 (соединение 1), NSC304107 (соединение 2), NSC127763 (соединение 3) и другим, включающим в себя без ограничения перечисленные в таблицах 2, 3 и 4 в настоящем документе, в качестве соединений, которые предположительно будут взаимодействовать или связываться с белком BPTF и тем самым изменять специфичность BPTF к метилированным формам лизина 4 белка H3 гистона.

Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к соединениям NSC382001 (соединение 1), NSC304107 (соединение 2), NSC127763 (соединение 3) и другим, включающим в себя без ограничения перечисленные в таблицах 2, 3 и 4 в настоящем документе, в качестве потенциальных средств для лечения NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL и/или злокачественных опухолей с низкой активностью экспрессии белка, включающих в себя без ограничения злокачественную опухоль легких, молочной железы и злокачественной опухоли нервной системы.

Другой аспект настоящего изобретения относятся к соединениям NSC382001 (соединение 1), NSC304107 (соединение 2), NSC127763 (соединение 3) и другим, включающим в себя без ограничения перечисленные в таблицах 2, 3 и 4 в настоящем документе, в качестве новых средств для лечения NHL, ABC-DLBCL или GCB-DLBCL, в которых а) метилтрансфераза MLL2 гистонов мутировавшая, b) белок метилтрансфераза MLL2 гистонов содержит мутации LoF, приводящие к снижению триметилирования остатков лизина 4 в гистоне H3 или с) белок MLL2 характеризуется более низкой активностью по отношению к нормальному состоянию или дикому типу.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к взаимодействующим/связывающим BPTF соединениям (включающим в себя без ограничения NSC382001 (соединение 1), NSC304107 (соединение 2), NSC127763 (соединение 3) и другие, включающие в себя без ограничения перечисленные в таблицах 2, 3 и 4 в настоящем документе) в комбинации с соединениями, которые взаимодействуют/связываются с белком CBX2 (например, тем, который показан в таблице 5 в настоящем описании) для лечения злокачественных опухолей, в которых как MLL2 содержит мутации LoF, так и активность EZH2 увеличена (либо в результате мутации, либо повышенной экспрессии белка EZH2). Примеры включают в себя без ограничения NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, фолликулярную лимфому, злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы и злокачественную опухоль нервной системы.

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединениям NSC382001 (соединение 1), NSC304107 (соединение 2), NSC127763 (соединение 3) и другим, включающим в себя без ограничения перечисленные в таблицах 2, 3 и 4 в настоящем документе, в комбинации со стандартными соединениями поддерживающей терапии (воздействующей направленно или не направленно) или развивающихся терапий для лечения злокачественных опухолей со сниженной активностью белка MLL2 (вызванной мутациями LoF, например), включающих в себя без ограничения NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, фолликулярную лимфому, злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы и злокачественную опухоль нервной системы. Согласно некоторым вариантам осуществления такие комбинации могут дополнительно включать в себя соединения, которые взаимодействуют/связываются с белком CBX2 (например, тем, который показан в таблице 5 в настоящем документе).

Определения

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины характеризуются тем же значением, которое обычно понимается специалистом с обычной квалификацией в настоящей области техники, к которой это изобретение относится.

Используемый в настоящем документе термин "примерно" относится к приблизительно +/- 10% изменению от заданного значения. Следует понимать, что такое изменение всегда включено в любую данную величину, предусмотренную в настоящем документе, упоминается ли она конкретно или нет.

Используемый в настоящем документе термин "множество" означает больше чем один, например два или более, три или более, четыре или более и так далее.

Использование неопределенного артикля единственного числа при использовании в настоящем документе в сочетании с термином "содержащий", может означать "один", но это также согласуется со значением "один или несколько", "по меньшей мере один" и "один или более чем один".

Используемые в настоящем документе термины "содержащий", "имеющий", "включающий" и "состоящий" и их грамматические вариации представляют собой охватывающие или не ограничивающие и не исключают дополнительные, не указанные элементы и/или стадии способа. Термин "состоящий по существу из" при использовании в настоящем документе в отношении композиции, использования или способа, обозначает, что дополнительные элементы и/или стадии способа могут присутствовать, но, что эти добавки не оказывают существенного влияния на перечисленные функции композиции, способа или использования. Используемый в настоящем документе термин "состоящий из" в отношении композиции, использования или способа исключает наличие дополнительных элементов и/или стадий способа. Описанные в настоящем документе композиция, использование или способ, содержащие определенные элементы и/или стадии, могут также согласно некоторым вариантам осуществления состоять в основном из этих элементов и/или стадий, а согласно другим вариантам осуществления состоять из этих элементов и/или стадий, специфически ли эти варианты осуществления относятся или нет.

Используемые в настоящем документе взаимозаменяемо термины "терапия" и "лечение" относятся к вмешательству, выполненному с намерением облегчения симптомов, связанных с, предотвращения развития или изменения патологии заболевания. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления термины терапия и лечение используются в самом широком смысле, и согласно различным вариантам осуществления могут включать в себя один или несколько из предупреждения (профилактики), замедления, уменьшения и/или излечивания заболевания на различных этапах. Те, кто нуждается в терапии/лечении, таким образом, могут включать в себя тех, которые уже характеризовались наличием заболевания, а также тех, кто склонен или характеризуется риском развития заболевания, нарушения или состояния, и тех, у которых заболевание должно быть предотвращено.

Используемые в настоящем документе термины "субъект" и "пациент" относятся к животному, нуждающемуся в лечении.

Используемый в настоящем документе термин "животное" относится как к человеку, так и отличным от человека животным.

Введение соединений согласно настоящему изобретению "в сочетании с" одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами подразумевает включение одновременного (параллельного) введения и последовательного введения. Последовательное введение подразумевает охват различных категорий введения терапевтического средства(в) и соединения(й) согласно настоящему изобретению субъекту с введением терапевтического средства(в) и соединения(й), которые разделены друг от друга определенным временным периодом, который может быть коротким (например, порядка минут) или расширенным (например, порядка дней или недель).

Термин "C₁-C₄-алкил" относится к прямой цепи или разветвленной алкильной группе от одного до четырех атомов углерода. Примеры включают в себя метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил (t-бутил).

Термины "галоген" и "гало" относятся к фтору, брому, хлору и иоду.

Термин "C₁-C₄-алкокси" относится к группе -OR, где R представляет собой C₁-C₄-алкил.

Белки-мишени

Подходящие белки-мишени для способов согласно настоящему изобретению включают в себя считывателей и стирателей гистоновых меток. Примеры включают в себя без ограничения считывающие белки CBX2, BPTF, HP1, 53BP1 и L3MBTL1 и стирающие белки гистоновые лизин деметилазы (KDM), принадлежащие к аминооксидазам или содержащим домен JmjC семейству белков, таким как LSD1, PLU1 и GASC1.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения белок-мишень представляет собой такой считыватель гистоновых меток, как CBX2, BPTF, HP1, 53BP1 или L3MBTL1. Согласно некоторым вариантам осуществления белок-мишень представляет собой считыватель гистоновых метилированных меток.

Согласно некоторым вариантам осуществления белок-мишень представляет собой считыватель гистоновых метилированных меток, который преимущественно распознает триметилированный остаток лизина в гистоновом хвосте. Примеры таких считывающих белков включают в себя без ограничения BPTF, CBX2 и HP1.

Согласно некоторым вариантам осуществления белок-мишень представляет собой CBX2. CBX2 также известен как гомолог 2 хромобокса, MGC10561, ассоциированный с циклом деления клеток 6, M33, гомолог 2 хромобокса (класс Pc дрозофил), CDCA6, гомолог 2 хромобокса (гомолог класса Pc, дрозофилы), гомолог 2 белка хромобокса, модификатор 3 и гомолог класса Pc. Идентификаторы баз данных для CBX2 включают в себя: UniProtKB/Swiss-Prot: CBX2_HUMAN, Q14781; HGNC: 15521 и Entrez Gene: 847332.

Согласно некоторым вариантам осуществления белок-мишень представляет собой BPTF. BPTF также известен как транскрипционный фактор бромодомена PHD-пальца, FAC1, фетальный антиген Альцгеймера, FALZ, NURF301, транскрипционный фактор, содержащий бромодомен и PHD-палец, фетальный белок клона 1 Alz-50 и OTTHUMP00000163084. Идентификаторы баз данных для BPTF включают в себя HGNC: 3581; Entrez Gene: 2186; Ensembl: ENSG00000171634; OMIM: 601819 и UniProtKB: Q12830.

Репрограммирующие способы

Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к расчетным способам для идентификации соединений-кандидатов, которые способны модифицировать селективность белка-мишени к его родственной гистоновой метке ("репрограммирующие соединения"). Соединения идентифицированы на основании того, что они в состоянии компенсировать определенные связывающие взаимодействия, которые присутствуют, когда белок-мишень связывается с модифицированным аминокислотным остатком, который составляет его родственную метку гистонового хвоста, но отсутствуют, когда состояние модификации остатка отличается. Как правило, способы включают в себя получение "тройного репрограммирующего комплекса" между модифицированным лизиновым хвостом гистона, соединением-кандидатом и ключевыми остатками в активном центре белка-мишени, который связывает лизиновый хвост.

В то время как репрограммирующие способы описаны в настоящем документе в качестве вариантов осуществления, относящихся к считывающим белкам, специалисту в настоящей области техники будет понятно, что репрограммирование может также быть применено к стирающим белкам, и определенные варианты осуществления настоящего изобретения, таким образом, относятся к способам репрограммирования стирающих белков.

Согласно некоторым вариантам осуществления способы включают в себя расчетное получение структурной модели активного центра считывающего белка в комплексе с не родственной меткой гистонового хвоста, считывателя, который репрограммируется для связывания ("метки-мишени гистонового хвоста"). Эта структурная модель, как правило, основывается на известной расчетной модели активного центра считывающего белка в комплексе с родственной меткой гистонового хвоста, в которой была идентифицирована одна или несколько функциональных особенностей, которые характеризуют связывание родственной метки гистонового хвоста в активном сайте. Под "функциональными особенностями" подразумеваются особенности, которые способствуют связыванию или стабилизации родственной гистоновой метки в активном центре. Такие особенности могут включать в себя, например, наличие или отсутствие определенных нековалентных взаимодействий, таких как водородные связи, ван-дер-ваальсовы взаимодействия, электростатические взаимодействия и/или гидрофобные взаимодействия; наличие или отсутствие определенных групп или остатков, таких как доноры водородных связей, акцепторы водородных связей, гидрофобные остатки или группы, ароматические остатки или группы; конформационных особенностей, таких как расстояние между функциональными группами в активном центре и/или родственной гистоновой метке, длина алифатических цепей и тому подобное. Расчетные модели различных активных центров считывающих белков могут быть получены из общедоступных баз данных, таких как Protein DataBank, поддерживаемый Rutgers, The State University of New Jersey and the University of California, San Diego.

Структурная модель активного центра считывающего белка в комплексе с меткой-мишенью гистонового хвоста может затем использоваться для того, чтобы идентифицировать один или несколько дополнительных функциональных особенностей, необходимых для связывания с меткой-мишенью гистонового хвоста в активном центре считывающего белка. Например, проверка вычислительного анализа модели может означать, что дополнительные функциональные особенности, такие как водородные связи или гидрофобные взаимодействия, должны быть добавлены или удалены для того, чтобы стабилизировать мишень-метку гистонов в активном центре считывающего белка. Обеспечение таких дополнительных функциональных особенностей кандидатным репрограммирующим соединением должно обеспечивать связывание мишени-метки гистонов в активном сайте считывателя.

Поскольку тримолекулярные комплексы представляют собой энтропийно неблагоприятные, по сравнению с бимолекулярными комплексами, конечный тройной репрограммирующий комплекс, содержащий модифицированный лизиновый хвост гистонов, соединение-кандидата и ключевые остатки в активном сайте, должен учитывать потерю энтропии, связанную с тримолекулярным комплексом и полученную свободную энергию. Это может быть достигнуто, например, посредством использования ряда шаблонных ("зондов") структур, которые выбирают таким образом, чтобы связываться неконкурентно с мишенью-меткой гистонов и которые могут быть многократно очищены при мониторинге поведения системы в целом для идентификации структуры зонда, что обеспечивает наиболее энергетически стабильный тройной репрограммирующий комплекс.

Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления для идентификации соответствующих соединений-кандидатов могут быть получены структуры зонда, который обеспечивает необходимые функциональные особенности для стабильного тройного репрограммирующего комплекса. Структуру зонда можно получить, например, путем итерационного очищения серии структур зонда с использованием, например, молекулярно-динамического моделирования и/или визуальной проверки для идентификации подходящей стабильной структуры. Структура конечного зонда в комплексе в активном центре может быть впоследствии использована в качестве основы для идентификации соединений-кандидатов.

Могут быть идентифицированы соединения-кандидаты, например, путем скрининга виртуальных библиотек соединений, таких как предусмотренные в Zinc Database, the National Cancer Institute's Diversity Set, the National Cancer Institute's Open Chemical Repository, the Chembridge Library DIVERSet, the Maybridge Library, the Platinum Collection from Asinex and Natural Product Libraries.

Специалисту в настоящей области техники доступны различные способы для скрининга химических соединений на их способность обеспечивать идентифицированные функциональные особенности. В целом, процесс может начаться, например, с визуального осмотра активного сайта и структуры зонда на экране компьютера. Выбранные химические соединения могут быть затем расположены в различных ориентациях или состыкованы в активном сайте для определения того, адекватно ли они воспроизводят функциональные особенности структуры зонда. Стыкование может быть выполнено с использованием различного коммерчески доступного программного обеспечения, такого как Quanta (Accelrys, Inc., Madison, WI), FlexX (TRIPOS, St. Louis, Minn.) и DOCK. За стыкованием может следовать минимизация энергии и молекулярные динамики со стандартными силовыми полями молекулярной механики, такими как CHARMM и AMBER (Accelrys, Inc., Madison, WI). Другие специализированные компьютерные программы, известные в настоящей области техники и/или коммерчески доступные, могут также участвовать в процессе выбора соединений-кандидатов.

Кроме того, соединения-кандидаты, которые включают соответствующие функциональные особенности, могут быть созданы de novo с использованием стандартных вычислительных способов. Различные способы разработки de novo известны в настоящей области техники.

После того как соединение было разработано или выбрано, эффективность, с которой это соединение может взаимодействовать с меткой-мишенью гистонов и активным сайтом считывателя, может быть исследована и оптимизирована с помощью вычислительной оценки, если это необходимо. Специфическое компьютерное программное обеспечение доступно в настоящей области техники для оценки энергии деформации соединения и электростатических взаимодействий. Примеры программ, разработанные для таких целей включают в себя: AMBER, QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., Madison, WI) и тому подобные.

Оценка in vitro

Соединения-кандидаты, идентифицированные с использованием описанных в настоящем документе репрограммирующих способов, могут быть затем оценены in vitro, например, на их способность модулировать связывание считывающего белка с мишенью-меткой гистона и/или на активность при болезненных состояниях (например, злокачественной опухоли), связанных с аномальной активностью их родственного записывающего белка.

Способность соединений-кандидатов модулировать связывание считывающего белка с мишенью-меткой гистона может быть оценена с помощью различных стандартных техник in vitro, таких как поверхностный плазмонный резонанс или поляризация флуоресценции.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению "осаждающего" анализа для характеристики связывания соединений-кандидатов с мишенью-меткой. Общая схема для такого анализа, относящегося к BPTF, показана на фиг. 4 и описана в примере 5. Вкратце, GST-меченый бромодомен PHD пальца в BPTF инкубировали с соединением-кандидатом и H3K4me0, me1, me2 или me3 пептидов, которые были соединены с мечеными стрептавидином парамагнитными микрочастицами dynabeads через молекулу биотина на пептиде. После отмывания в подходящем буфере связанный белок элюировали из гранул и оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и, необязательно, Вестерн-блоттинга. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что этот анализ может быть легко адаптирован к другим считывателям/стирателям и гистоновым меткам.

Кроме того, такие технологии, как Alpha Technology, разработанная PerkinElmer, могут быть использованы для оценки способности соединений-кандидатов модулировать связывание считывателя мишени-метки гистона. Такие технологии могут быть предусмотрены для таких оценок, которые будут проводиться на высокой пропускной основе. Анализ Alpha Technology, например, требует использования донорных гранул Alpha, конъюгированных со стрептавидином и акцепторными гранулами Alpha, конъюгированными с глутатионом. Взаимодействующий домен считывателя может быть клонирован в конструкт, который вводит тег глутатион-S-трансферазы, позволяющий образование пары с акцепторной гранулой Alpha через глутатион. Биотинилированные гистоновые пептиды, несущие специфические эпигенетические модификации, можно приобрести на коммерческой основе и в сочетании с донорными гранулами Alpha через стрептавидин. Если взаимодействующий домен связывается с гистоновым пептидом, донорные и акцепторные гранулы Alpha будут приведены в непосредственную близость друг к другу таким образом, что, когда донорная гранула возбуждается светом определенной длины волны, она будет излучать молекулы кислорода, которые затем вступают в реакцию с акцепторной гранулой, заставляя его производить хемилюминесценцию в качестве выходного сигнала для связывающего взаимодействия.

Различные анализы in vitro, относящиеся к состоянию заболевания (например, злокачественной опухоли), связанному с аномальной активностью записывающего белка, могут быть использованы для оценки активности соединений-кандидатов. Например, цитотоксичность соединений может быть проанализирована in vitro с использованием подходящей клеточной линии, как правило, клеточной линии злокачественной опухоли. В общем, клетки выбранной исследуемой клеточной линии выращивают до соответствующей плотности и добавляют кандидатное соединение. После соответствующего времени инкубации (например, приблизительно от 48 до 72 часов) оценивают выживаемость клеток. Способы определения выживаемости клеток хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя без ограничения редуктазную пробу с резазурином (смотрите Fields & Lancaster (1993) Am. Biotechnol. Lab. 11: 48-50; O'Brien et al., (2000) Eur. J. Biochem. 267: 5421-5426 и патент США №5501959), анализ с сульфородамином (Rubinstein et al., (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 113-118) или исследование с нейтральным красным красителем (Kitano et al., (1991) Euro. J. Clin. Investg. 21: 53-58; West et al., (1992) J. Investigative Derm. 99: 95-100). Цитотоксичность определяется путем сравнения выживаемости клеток в обрабатываемой культуре с выживаемостью клеток в одной или нескольких контрольных культурах, например культурах без воздействия и/или культурах, предварительно обработанных контрольным соединением (обычно известным лекарственным средством).

Способность соединений ингибировать пролиферацию клеток злокачественных опухолей in vitro может быть оценена, например, посредством культивирования клеток клеточной линии представляющей интерес злокачественной опухоли в подходящей среде. После соответствующего времени инкубации клетки могут быть обработаны соединением-кандидатом и инкубированы в течение дополнительного периода времени. Затем клетки подсчитывают и сравнивают с соответствующим контролем. Подходящие контроли включают в себя, например, клетки, обработанные с помощью стандартного химиотерапевтического средства и/или необработанные клетки.

Кроме того, соединения могут быть исследованы in vitro путем определения их способности ингибировать безъякорный рост опухолевых клеток. Безъякорный рост известен в настоящей области техники как хороший индикатор канцерогенности. В общем, безъякорный рост оценивали путем посева клеток из выбранной клеточной линии злокачественной опухоли на мягкий агар и определения количества колоний, образованных после соответствующего инкубационного периода. Рост клеток, обработанных соединением-кандидатом, может быть затем подвергнут сравнению с контрольными клетками (как описано выше).

Также могут быть использованы различные другие анализы, известные в настоящей области техники.

Различные клеточные линии злокачественных опухолей, подходящие для исследования соединений-кандидатов, известны в настоящей области техники и многие из них коммерчески доступны (например, из Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA).

При необходимости токсичность соединений также может быть первоначально оценена in vitro с использованием стандартных техник. Например, первичные фибробласты человека могут быть обработаны in vitro соединением-кандидатом, а затем исследованы в различных временных точках после обработки на их жизнеспособность с использованием стандартного анализа жизнеспособности, такого как описанные выше анализы, или анализа вытеснения трипанового синего. Клетки могут быть также проанализированы на их способность синтезировать ДНК, например, с использованием анализа включения тимидина, и на изменения в динамике клеточного цикла, например, с использованием стандартного анализа сортировки клеток в сочетании с клеточным сортером цитофлуориметра (FACS).

Фармацевтические композиции

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим репрограммирующее соединение, идентифицированное с помощью описанных в настоящем документе способов, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Фармацевтические композиции получают известными способами с использованием хорошо известных и легко доступных ингредиентов.

Репрограммирующее соединение или содержащие соединение фармацевтические композиции могут быть составлены для введения перорально (в том числе, например, за щеку или под язык), местно, парентерально, путем ингаляции или распылением, или ректально в виде лекарственных форм с однократной дозировкой, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители. Как правило, соединение включено в приемлемый наполнитель и составлено в такой пригодной для введения форме, как сиропы, эликсиры, таблетки, пастилки, леденцы, твердые или мягкие капсулы, пилюли, суппозитории, масляные или водные суспензии, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсии, инъекции или растворы. Используемый в настоящем документе термин парентеральный включает в себя подкожные инъекции, внутрикожные, внутрисуставные, внутривенные, внутримышечные, внутрисосудистые, внутримышечные, интратекальные техники инъекции или инфузии.

Предназначенные для перорального применения композиции могут быть получены либо в твердой, либо в жидкой лекарственной форме с однократной дозировкой. Жидкая лекарственная форма с однократной дозировкой может быть получена в соответствии с известными в настоящей области техники процедурами для производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих средств, ароматизирующих средств, красителей и консервантов, с тем, чтобы обеспечить фармацевтически элегантные и приятные на вкус препараты. Эликсир получают с использованием водно-спиртового (например, этанол) наполнителя с такими подходящими подсластителями, как сахар и сахарин вместе с ароматическим ароматизатором. Суспензии могут быть приготовлены с водным наполнителем с помощью такого суспендирующего средства, как аравийская камедь, трагакант, метилцеллюлоза и тому подобное.

Такие твердые составы, как таблетки, содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые пригодны для изготовления таблеток. Эти вспомогательные вещества могут представлять собой, например, такие инертные разбавители, как карбонат кальция, карбонат натрия, лактозу, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например, кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; связующие средства, например крахмал, желатин или аравийскую камедь, и смазывающие средства, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк, и другие обычные ингредиенты, такие как дикальцийфосфат, алюмосиликат магния, сульфат кальция, крахмал, лактозу, метилцеллюлозу, и функционально аналогичные материалы. Таблетки могут быть непокрытыми или они могут быть покрыты с помощью известных техник с целью замедлить дезинтеграцию и абсорбцию в желудочно-кишечном тракте и тем самым обеспечить пролонгированное действие в течение более длительного периода. Например, может быть использовано время замедления такого материала, как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина.

Составы для перорального применения могут быть также представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом. Мягкие желатиновые капсулы получают машинным инкапсулированием суспензии соединения с приемлемым растительным маслом, светлым жидким вазелином или другим инертным маслом.

Водные суспензии содержат активные материалы в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для изготовления водных суспензий. Такие вспомогательные вещества представляют собой суспендирующие средства, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидропропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие средства могут представлять собой природные фосфатиды, например лецитин или продукты конденсации алкилена оксида с жирными кислотами, например полиоксиэтилен стеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксиэтанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиэтиленсорбитмоноолеат. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов, например этил или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, одно или несколько ароматизирующих средств или один или несколько таких подсластителей, как сахароза или сахарин.

Масляные суспензии могут быть составлены суспендированием активных ингредиентов в растительном масле, например арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в таком минеральном масле, как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Такие как указанные выше подсластители и ароматизирующие средства могут быть добавлены, чтобы обеспечить приятные на вкус пероральные препараты. Эти композиции могут быть законсервированы путем добавления такого антиоксиданта, как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, обеспечивают активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим средством, суспендирующим средством и одним или несколькими консервантами. Подходящие диспергирующие или смачивающие средства и суспендирующие средства представлены теми, которые уже упоминались выше. Также могут присутствовать дополнительные вспомогательные вещества, например подсластители, вкусовые добавки и красители.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть также в форме эмульсий масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смеси. Подходящие эмульгаторы могут представлять собой природные камеди, например камедь акации или смолу трагаканта, природные фосфатиды, например соевых бобов, лецитин и сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и гексита, ангидриды, например сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии могут также содержать подсластители и ароматизаторы.

Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии. Эти суспензии могут быть составлены в соответствии с известными в настоящей области техники способами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств, которые были указаны выше. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых наполнителей и растворителей, которые могут быть использованы, находится вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. С этой целью может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, такие жирные кислоты, как олеиновая кислота, находят применение в приготовлении инъецируемых препаратов. Такие адъюванты, как местные анестетики, консерванты и буферные средства также могут быть включены в инъекцируемый раствор или суспензию.

Для ректального введения композиции могут быть получены смешиванием лекарственного средства с подходящим не вызывающим раздражения вспомогательным веществом, которое твердое при обычных температурах, но жидкое при ректальной температуре и, следовательно, будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают в себя масло какао и полиэтиленгликоли.

Другие фармацевтические композиции и способы получения фармацевтических композиций известны в настоящей области техники и описаны, например, в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy (ранее "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA (2000).

Область применения

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению репрограммирующих соединений, идентифицированных с помощью описанных в настоящем документе способов, для косвенного исправления дисфункции и модифицирующих белки мутаций в гистоне для лечения злокачественной опухоли или других нарушений, вызванных эпигенетическим дерегулированием. Согласно некоторым вариантам осуществления соединения модулируют активность связывания считывающего или стирающего белка гистоновой метки так, что белок способен связываться с меткой, отличной от его родственной метки. Таким образом, применение соединений может компенсировать или обратить вредные эффекты аномальной активности писателя, которая характеризует определенные болезненные состояния, такие как злокачественную опухоль.

Согласно некоторым вариантам осуществления репрограммирующее соединение модулирует активность связывания считывателя метилирования гистонов и может, следовательно, найти применение в лечении заболеваний, характеризующихся аномальной активностью метилтрансферазы гистонов (писателя), например, EZH2 или MLL2.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают использование репрограммирующих соединений, которые модулируют активность связывания BPTF, например, путем увеличения способности BPTF связываться с моно- или диметилированным H3K4, при лечении заболеваний, характеризующихся снижением активности метилирования MLL2. Например, репрограммирующие BPTF соединения могут быть использованы при лечении злокачественной опухоли и, в частности, при лечении злокачественных опухолей, характеризующихся сниженной активностью метилирования MLL2. Злокачественные опухоли, связанные с мутациями потери функций в MLL2, включают в себя без ограничения неходжкинские лимфомы (NHL), подтип зародышевых центров В-клетки (GCB) диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), подтип похожих на активированные B-клетки (ABC) диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL) и злокачественные опухоли с инактивированным белком MLL2, которые включают в себя без ограничения злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль молочной железы и злокачественной опухоли нервной системы.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения поэтому относятся к использованию репрограммирующих BPTF соединений, повышающих способность BPTF связываться с моно или диметилированным H3K4 у пациента, характеризующегося наличием NHL, GCB-DLBCL, ABC-DLBCL, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли молочной железы или злокачественной опухоли нервной системы.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают использование репрограммирующих соединений, которые модулируют активность связывания CBX2, например, путем увеличения способности CBX2 связываться с моно- или диметилированным H3K27, для лечения заболеваний, которые характеризуются повышенной активностью метилирования EZH2. Например, репрограммирующие CBX2 соединения могут быть использованы при лечении злокачественной опухоли и, в частности, при лечении злокачественных опухолей, характеризующихся повышенной активностью метилирования EZH2. Гиперэкспрессия EZH2 была связана с рядом злокачественных опухолей, включающих в себя злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль эндометрия, злокачественную опухоль легких, множественную миелому, злокачественные опухоли нервной системы и лимфомы. Некоторые варианты осуществления включают использование репрограммирующих CBX2 соединений в лечении агрессивных, устойчивых к лекарствам или трудно поддающихся лечению злокачественных опухолей, которые, как было показано, были связаны с гиперэкспрессией EZH2.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению репрограммирующих CBX2 соединений при лечении злокачественной опухоли, содержащей мутантную форму EZH2, например мутантную форму EZH2, в котором тирозин в положении 641 заменен на альтернативную аминокислоту (мутант Y641). Примеры таких видов злокачественных опухолей включают в себя без ограничения лимфомы (например, неходжкинскую лимфому (NHL), фолликулярную лимфому (FL) и подтип B зародышевых центров диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (GCB-DLBCL)), злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль легкого и злокачественную опухоль нервной системы.

Комбинированная терапия

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, относящегося к применению репрограммирующего соединения для лечения злокачественной опухоли, соединение может быть использовано в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами.

Различные химиотерапевтические средства известны в настоящей области техники и включают в себя те, которые специфичны для лечения конкретного типа злокачественной опухоли, а также те, которые применимы в диапазоне злокачественных опухолей, такие как доксорубицин, капецитабин, митоксантрон, иринотекан (СРТ-11), цисплатин и гемцитабин.

Химиотерапевтические средства, как правило, используемые в лечении солидных опухолей, включают в себя, например, гемцитабин (например, Гемзар®), циклофосфамид, капецитабин (например, Кселода®), ифосфамид, паклитаксел (например, Таксол®), цисплатин, доцетаксел (например, Таксотер®), карбоплатин, эпи-доксорубицин (эпирубицин), доксорубицин (например, Адриамицин®) и 5-фторурацил (5-ФУ).

Химиотерапевтические средства, как правило, используемые в лечении злокачественной опухоли молочной железы включают в себя, например, капецитабин (например, Кселода®), циклофосфамид, 5-фторурацил (5-ФУ), карбоплатин, паклитаксел (например, Таксол®), цисплатин, доцетаксел (например, Таксотер®), изофосфамид, эпи-доксорубицин (эпирубицин), доксорубицин (например Адриамицин®), трастузумаб (Герцептин®) и тамоксифен.

Химиотерапевтические средства, как правило, используемые в лечении неходжкинской лимфомы включают в себя, например, прокарбазин (например Матулане®), цитарабин, ритуксимаб (например Ритуксан®) и этопозид.

Химиотерапевтические средства, как правило, используемые в лечении злокачественной опухоли предстательной железы, включают, например, гозерелина ацетат (например, Золадекс®), митоксантрон (например, Новантрон®), преднизон (например, Дельтазон®), лиарозол, нилутамид (например, Ниландрон®), флутамид (например, Эулексин®), финастерид (например, Проскар®), теразозин (например Хайтрин®), доксазозин (например, Кардура®), циклофосфамид, доцетаксел (например Таксотер®), эстрамустин и агонист рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению репрограммирующего соединения, такого как репрограммирующее CBX2 или BPTF соединение, в сочетании с терапевтическим средством, которое нацелено воздействует на EZH2 для лечения злокачественной опухоли. Примеры таких соединений включают в себя, например, те, которые описаны в опубликованной заявке на патент США №2009/0137508, 2011/0251216, 2012/0071418 и 2011/0237606.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению репрограммирующего соединения, такого как репрограммирующее CBX2 или BPTF соединение, в сочетании с химиотерапевтическими средствами для лечения устойчивых к лекарствам опухолей, где лекарственная устойчивость представляет собой результат повышенной регуляции/гиперактивности EZH2.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению репрограммирующего BPTF соединения в комбинации с ингибитором стирателей H3K4, таких как LSD1 или PLU1, для лечения злокачественных опухолей или других нарушений, вызванных мутациями потери функций в MLL2.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению репрограммирующего BPTF соединения в сочетании с репрограммирующим CBX2 соединением при лечении злокачественных опухолей с пониженной активностью белка MLL2 (вызванной мутациями LoF, например) и/или повышенной активностью EZH2, включающим в себя без ограничения NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, фолликулярную лимфому, злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы и злокачественную опухоль нервной системы.

Наборы

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают наборы, содержащие один или несколько репрограммирующих соединений, например, терапевтические пакеты или наборы. Согласно тем вариантам осуществления, в которых репрограммирующие соединения предназначены для использования в качестве части комбинированной терапии, набор может необязательно содержать другое(ие) терапевтическое средство, которое составляет комбинацию.

Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько из компонентов набора могут быть лиофилизированы, и набор может дополнительно содержать подходящий растворитель для растворения лиофилизированных компонентов. Индивидуальные компоненты набора, как правило, упакованы в отдельные контейнеры и с такими контейнерами может быть связано уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, это уведомление отражает одобрение агентством производства для использования или продажи для введения человеку или животному.

Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрено репрограммирующее соединение(я) в наборе в виде фармацевтических композиций, пригодных для введения субъекту. В этом случае, если это необходимо, контейнер сам по себе может представлять собой ингалятор, шприц, пипетку, глазную капельницу или другой аппарат, из которого композицию можно вводить субъекту.

Репрограммирующие BPTF соединения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к репрограммирующим BPTF соединениям, идентифицированным с помощью описанных в настоящем документе способов, а также фармацевтическим композициям и наборам, содержащим эти соединения, и использованию этих соединений, как описано выше.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к соединениям для репрограммирования BPTF, характеризующимся общей формулой I:

где (a) X представляет собой C=O или S(O)₂,

R₁ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или C₁-C₄-алкокси,

R₂ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкокси или галоген, и R₃ представляет собой Н, или R₂ и R₃, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования: или

R₄ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкокси или галоген,

R₅ представляет собой Н, CH₂NMe₂ или , и

R₆ представляет собой H, и R₇ представляет собой Н, или R₆ и R₇ вместе образуют =CH₂,

причем, когда R₅ представляет собой H, и R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂, X представляет собой S(O)₂, и причем, когда R₄ представляет собой C₁-алкил, R₅ представляет собой CH₂NMe₂, и R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂, то по крайней мере один из R₁, R₂ и R₃ отличен от H;

или

(b) X представляет собой NH,

R₁ и R₂ представляют собой Н,

R₃ и R₄, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования:

или

R₅ представляет собой замещенный C₁-C₄-алкил или незамещенный C₂-C₄-алкил, причем каждый заместитель представляет собой галоген, и

R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =O.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, в которой:

X представляет собой С=O или S(O)₂,

R₁ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или C₁-C₄-алкокси,

R₂ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкокси или галоген, и R₃ представляет собой Н, или R₂ и R₃, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования: или

R₄ представляет собой H, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкокси или галоген,

R₅ представляет собой Н, CH₂NMe₂ или и

R₆ представляет собой H, и R₇ представляет собой Н, или R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, в которой:

X представляет собой С=O или S(O)₂,

R₁ представляет собой Н или C₁-C₄-алкил,

R₂ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или галоген, и R₃ представляет собой Н, или R₂ и R₃, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования: или

R₄ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или галоген,

R₅ представляет собой Н, CH₂NMe₂ или и

R₆ представляет собой Н, и R₇ представляет собой Н, или R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =CH₂,

причем, когда R₁, R₂, R₃ и R₄ каждый представляет собой Н, тогда R₅ представляет собой

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, которые характеризуются формулой II:

где R₁ представляет собой Н или C₁-C₄-алкил,

R₂ представляет собой Н или галоген, и R₃ представляет собой Н, или R₂ и R₃, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования:

R₄ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или галоген,

R₅ представляет собой CH₂NMe₂ или и

R₆ представляет собой Н, и R₇ представляет собой Н, или R₆ и R₇, взятые вместе образуют =CH₂.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I или II, в которой каждый из C₁-C₄-алкила представляет собой Me.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I или II, в которой:

R₁ и R₄ представляют собой Н или Me и

R₂ и R₃ представляют собой Н.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I или II, в которых:

R₁ и R₃ представляют собой Н,

R₂ и R₄ представляют собой Н или галоген.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, в которой:

X представляет собой S(O)₂,

R₁ представляет собой Н или C₁-C₄-алкил,

R₂ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или галоген, и R₃ представляет собой Н, или R₂ и R₃, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования: или

R₄ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или галоген,

R₅ представляет собой Н, CH₂NMe₂ или и

R₆ представляет собой Н, и R₇ представляет собой Н, или R₆ и R₇, взятые вместе образуют =CH₂.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, в которой:

X представляет собой NH,

R₁ и R₂ представляют собой Н,

R₃ и R₄, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования:

или

R₅ представляет собой замещенный C₁-С₄-алкил или незамещенный С₂-С₄-алкил, причем каждый заместитель представляет собой галоген, и

R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =O.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, в которой:

X представляет собой NH,

R₁ и R₂ представляют собой Н,

R₃ и R₄, взятые вместе с атомами углерода, они присоединены для образования:

R₅ представляет собой замещенный C₁-C₄-алкил или незамещенный C₂-C₄-алкил, причем каждый заместитель представляет собой галоген, и

R₆ и R₇, взятые вместе, образуют =O.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I или II, как описано в любом из предшествующих вариантов осуществления, в котором каждый галоген представляет собой Cl.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, которые выбраны из группы:

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям, выбранным из группы:

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, которые выбраны из группы:

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям общей формулы I, которые выбраны из группы:

и

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к репрограммирующим BPTF соединениям, характеризующихся структурой:

Репрограммирующие CBX2 соединения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к репрограммирующим CBX2 соединениям, идентифицированным с помощью описанных в настоящем документе способов, а также фармацевтическим композициям, и наборам, содержащим эти соединения, и использованию этих соединений, как описано выше.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к соединениям для репрограммирования CBX2, характеризующихся общей формулой III:

где R₁, R₂, R₄ и R₈ каждый независимо представляет собой Н или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген, C₁-C₄-алкил или фенил, и R₉ представляет собой Н или галоген; или R₃ и R₉, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют фенил;

R₅ представляет собой OR₇ или =O;

R₆ представляет собой X, СН₂Х, C₁-C₄-алкил, NH-NH₂, CH₂NR₁₀, или пиперидинил;

R₇ представляет собой Н или C₁-C₄-алкил;

R₁₀ представляет собой Н, C₁-C₄-алкил или CH₂-фенил и

X представляет собой галоген.

Согласно некоторым вариантам осуществления в общей формуле III:

R₁, R₂ и R₄ каждый независимо представляет собой Н или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген, C₁-C₄-алкил или фенил, и R₉ представляет собой Н или галоген; или R₃ и R₉, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют фенил;

R₅ представляет собой ОН или =O;

R₆ представляет собой X, СН₂Х, C₁-C₄-алкил, NH-NH₂, CH₂NR₁₀ или пиперидинил;

R₈ представляет собой Н;

R₁₀ представляет собой C₂-C₃-алкил или CH₂-фенил и

X представляет собой галоген.

Согласно некоторым вариантам осуществления в формуле III:

R₁, R₂ и R₄ каждый независимо представляет собой Н или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген, C₁-C₄-алкил или фенил, и R₉ представляет собой Н или галоген; или R₃ и R₉, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют фенил;

R₅ представляет собой OH или =O;

R₆ представляет собой СН₂Х или пиперидинил;

R₈ представляет собой Н;

R₁₀ представляет собой C₂-C₃-алкил или CH₂-фенил и

X представляет собой галоген.

Согласно некоторым вариантам осуществления соединения общей формулы III характеризуются формулой IV:

где R₁, R₂ и R₄ каждый независимо представляет собой H или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген или фенил;

R₅ представляет собой OH или =O;

R₆ представляет собой X, CH₂X или C₁-C₄-алкил и

X представляет собой галоген.

Согласно некоторым вариантам осуществления в формуле IV:

R₁, R₂ и R₄ каждый независимо представляет собой Н или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген или фенил;

R₅ представляет собой =O;

R₆ представляет собой СН₂Х и

X представляет собой галоген.

Согласно некоторым вариантам осуществления соединения общей формулы III характеризуются формулой V:

где R₁ и R₄ каждый независимо представляет собой Н или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген или C₁-C₄-алкил, и R₉ представляет собой Н или галоген; или R₃ и R₉, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют фенил;

R₅ представляет собой ОН или =O;

R₆ представляет собой NH-NH₂, CH₂NR₁₀ или пиперидинил;

R₁₀ представляет собой C₂-C₃-алкил или CH₂-фенил.

Согласно некоторым вариантам осуществления в формуле V:

R₁ и R₄ каждый независимо представляет собой Н или галоген;

R₃ представляет собой Н, галоген или C₁-C₄-алкил, и R₉ представляет собой Н или галоген; или R₃ и R₉, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют фенил;

R₅ представляет собой OH;

R₆ представляет собой пиперидинил;

R₁₀ представляет собой C₂-C₃-алкил или CH₂-фенил.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения в соединениях формулы III, IV или V каждый галоген представляет собой Cl или Br.

Согласно некоторым вариантам осуществления в соединениях формулы III или V X представляет собой Br.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения соединения общей формулы III характеризуются следующими структурами:

Описанные выше репрограммирующие BPTF и CBX2 соединения могут быть получены/происходить из различных хранилищ, например, из открытого химического хранилища NCI Developmental Therapeutics Program (DTP) в Национальном институте онкологии (NCI)/Национальном институте здоровья (NIH).

Согласно некоторым вариантам осуществления соединения формул I, II, III, IV и V могут обладать полностью кислотной группой, полностью основной группой или обеими функциональными группами и соответственно реагировать с некоторым числом органических и неорганических оснований, или органических и неорганических кислот с образованием фармацевтически приемлемых солей. Используемый в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли соединения, которое по существу нетоксично для живых организмов. Типичные фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли, полученные путем реакции соединения формул I, II, III, IV или V с фармацевтически приемлемой минеральной или органической кислотой или органическим или неорганическим основанием. Такие соли известны как кислотно-аддитивные и основно-аддитивные соли.

Кислоты, обычно используемые для образования кислотно-аддитивных солей, представляют собой такие неорганические кислоты, как соляная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и тому подобные, и такие органические кислоты, как п-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, п-бромофенилсульфоновая кислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и тому подобные. Примеры таких фармацевтически приемлемых солей представляют собой сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, бромид, иодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, гидрохлорид, дигидрохлорид, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гамма-оксибутират, гликолат, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, соль миндальной кислоты и тому подобные. Представляющие особый интерес фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли представляют собой соли, образованные с такими минеральными кислотами, как соляная кислота и бромистоводородная кислота, и соли, образованные с такими органическими кислотами, как малеиновая кислота и метансульфоновая кислота.

Соли аминогрупп также могут содержать четвертичные аммониевые соли, в которых аминный азот несет подходящую такую органическую группу, как алкил, низший алкенил, замещенный низший алкенил, низший алкинил, замещенный низший алкинил или аралкильный фрагмент.

Основно-аддитивные соли включают в себя соли, полученные из таких неорганических оснований, как аммоний или гидроксиды щелочных или щелочноземельных металлов, карбонаты, бикарбонаты и тому подобных. Основания, используемые при получении фармацевтически приемлемых солей, таким образом, включают в себя гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия, карбонат натрия, бикарбонат натрия, бикарбонат калия, гидроксид кальция, карбонат кальция и тому подобные.

Для специалиста в настоящей области техники будет понятно, что конкретный противоион, образующий часть фармацевтически приемлемой соли, как правило, не носит критический характер, при условии, что соль в целом фармакологически приемлема и пока противоион не придает нежелательные свойства соли в целом.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение дополнительно охватывает фармацевтически приемлемые сольваты соединения согласно формул I, II, III, IV или V. Многие из соединений формул I, II, III, IV и V можно комбинировать с такими растворителями, как вода, метанол, этанол и ацетонитрил с образованием фармацевтически приемлемых сольватов, таких как соответствующие гидраты, метанолаты, этанолаты и ацетонитрилаты.

Некоторые соединения формул I, II, III, IV или V могут содержать один или несколько асимметричных (хиральных) центров и/или одну или несколько ненасыщенных связей. Как следствие, эти соединения могут присутствовать в виде рацематов, отдельных энантиомеров, смесей энантиомеров, отдельных диастереомеров, смесей диастереомеров, отдельных изомеров и смесей изомеров. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формул I, II, III, IV или V в энантиомерной, диастереомерной или изомерной форме или в виде смесей энантиомеров, диастереомеров или изомеров.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение включает пролекарства соединений формул I, II, III, IV или V. Используемый в настоящем документе термин "пролекарство" относится к соединению, которое подверглось химическому изменению, например, замещению или добавлению дополнительной химической группы для изменения (для фармацевтического применения) одного или нескольких из своих физико-химических свойств, и что приводит к активному соединению per se путем одного или серии метаболических превращений после введения субъекту. Физико-химические свойства, которые могут быть изменены путем превращения соединения в форму пролекарства, включают в себя, например, растворимость, биодоступность, всасывание, распределение, сайт-специфичность, стабильность, характеристики высвобождения, токсичность и тому подобное. Примеры химических производных соединений формул I, II, III, IV и V, которые могут быть получены для того, чтобы превратить соединение в пролекарство, включают в себя без ограничения производные сложных эфиров, производные простых эфиров, производные карбамата, амидные производные, иминные производные и получение производных с соответствующим несущим фрагментом прямо или через линкерную группу. Примеры пролекарств и способов получения пролекарства настоящего действующего соединения хорошо известны специалистам в настоящей области техники и могут быть найдены, например, в Krogsgaard-Larsen et al. (Textbook of Drug Design and Discovery, Taylor & Francis, New York, NY (April 2002)).

Получение солей, сольватов и пролекарств может быть осуществлено способами, известными в настоящей области техники. Следует иметь в виду, что нефармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства, также входят в объем настоящего изобретения, так как они могут быть полезными в получении фармацевтически приемлемых солей, сольватов или пролекарств.

Для лучшего понимания описанного в настоящем документе настоящего изобретения представлены следующие примеры. Следует иметь в виду, что эти примеры предназначены для описания иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения и в любом случае не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: низкомолекулярное репрограммирующее BPTF соединение

Молекулярное моделирование. Молекулярно-динамические моделирования (MD), проведенные с пакетом GROMACS-4.0.5 вместе с программным обеспечением для поиска химических структур, осуществляемой на www.pubchem.org, были основным инструментом моделирования в настоящем исследовании. Способы молекулярного связывания, использующие пакет ICM (Molsoft LLC, San Diego, CA), показали низкую точность и вообще неудовлетворительные результаты.

Использовали 3D модель белка BPTF в комплексе с N-концевым хвостом пептида H3K4 от Li, Н., et al. (2006, Nature, 442: 91-95) (инвентарный номер банка данных белков 2FUU). До моделирования модель помещали в триклинную коробку простой точки заряда (SPC) воды (Berendsen, Н. et al. Intermolecular Forces 1981, 331-342), к которой добавляли 100 мМ эквивалент NaCl, в том числе нейтрализующие противоионы. Периодические границы применяли во всех направлениях. N- и C-концы всех белковых молекул ионизировали. Для всех других аминокислот назначали их каноническое состояние при физиологическом значении pH. Применяли энергетические условия от набора параметров GROMOS96 43a1 (Scott, W. et al. J Phys Chem A 1999, 103, 3596-3607) ко всем молекулярным частицам в системе. Чтобы обрабатывать два иона Zn²⁺, заданные параметры обновляли с восемью новыми координатными химическими связями (и соответствующими углами): для первого атома цинка к атому SG C11, атому SG С13, атому ND1 H34 и атому SG С37; для второго атома цинка к атому SG С26, атому SG С29, атому SG С53 и атому SG С56. Распределение заряда на соответствующих остатках обновляли либо: для первого координационного комплекса Zn²⁺ один электрон был сглажен по имидазольному кольцу H34 и второй была разделен поровну между атомом цинка и тремя атомами серы цис-остатков; для второго атома цинка заряд был установлен как -0.4e и остатки двух электронов были поделены поровну между четырьмя атомами серы цис-остатков.

Остаток K4me3 пептида гистона редактировали, чтобы заменить две из трех метильных групп на атомы водорода. В связи с отсутствием точных параметров для катион-π взаимодействий в силовом поле GROMOS96, все атомы ароматических колец, но не из остатка Y17, в ароматическом каркасе BPTF, а также атом NZ моно-метилированного Lys 4 замораживали в их координатах в структуре 2FUU с 1000 кДж моль^-1 нм^-2, как жесткое сдерживание гармонического расположения.

Конформацию Y17 боковой цепи редактировали вручную с поворотами вокруг двугранных углов таким образом, что гидроксифенильное кольцо больше не занимало полости, занимаемой в оригинальной модели, но было расположено на противоположной стороне сайта по отношению к атому CA Y17. Пустую полость затем использовали в качестве сайта стыкования для небольших органических соединений в исходной конфигурации моделей тройных комплексов. Все комплексы конструировали вручную путем поворота, перевода и чередований двугранного угла соединений, которые были оптимизированы в вакууме на сервере PRODRG (Schuttelkopf, A.W. et al, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2004, 60: 1355-1363). В связи с некоторым недостатком точности в наборах параметров, генерируемых PRODRG (Lemkul, J. A. et al. J. Chem. Inf. Model. 2010, 50: 2221-2235), несвязанные параметры соединений интенсивно редактировали вручную, в частности, распределение заряда переписывали для каждого соединения.

Все расчеты MD проводились с несколькими выпрямленными несвязанными взаимодействиями: близкодействующие взаимодействия как Леннард-Джонса, так и Кулона переводили на 1,3 нм и исчезали при 1,4 нм с поисками соседних радиусов, установленными на 1,5 нм и повторенные каждые 10 шагов интегратора MD. Дальние электростатические взаимодействия моделировали с алгоритмом Эвальда частица-сетка (РМЕ) (Essmann, U. et al. J. Chem. Phys. 1995, 103: 8577-8593). Для моделирования сольватированных комплексов структуры смягчали путем минимизации l-bfgs (Liu, D.С. and Nocedal, J. Math. Program. 1989, 45: 503-528) и 50ps молекулярно-динамического моделирования со сдержанными позициями тяжелых атомов как белка, так и соединения, моделированного при постоянном объеме (NVT) совокупности. Имитацию отжига (Kirkpatrick, S. et al. Science 1983, 220: 671-680, Cerny V.J. Optimiz. Theory Appl. 1985, 45: 41-51) использовали, чтобы разогреть систему от начальных скоростей, определенных в соответствии с распределением Больцмана при T=10 K до T=310 K. После нагревания NVT выполняли 100ps эквилибрацию постоянного давления (NPT). Комплекс и другие атомы соединяли с отдельными банями соединительных температур, и температуру поддерживали при Т=310 К. Для эквилибрации использовали слабые соединители (Berendsen, Н. J.С. et al. J. Chem. Phys. 1984, 81: 3684-3690) для поддержания давления изотропно на 1,0 бар, и способ слабого связывания Берендсена (Berendsen, 1984, там же) использовали для поддержания постоянной температуры. Все последующие продуктивные серии проводили с более точным термостатом Носа-Гувера (Nose, S. Mol. Phys. 2002, 100: 191-198, Hoover, W. Physical Review A 1985, 31: 1695-1697) с постоянным временем термостатирования 0,1 ps и баростатом Парринелло-Рамана (Parrinello, М. et al. J. Appl. Phys. 1981, 52: 7182-7190, Nose, S. and Klein, M.L. Mol. Phys. 1983, 50: 1055-1076) с постоянным временем баростатирования 1,0ps под совокупностью NPT. Это сочетание термостата и баростата гарантировало, что отбирали истинную совокупность NPT, и лишь небольшие артефакты, если таковые имелись, возникали в результате сдерживания крошечного (22 атома) и компактного ароматического каркаса. Для визуального контроля траекторий MD использовали прибор для наблюдения VMD (Humphrey, W.; et al. J. Mol. Graph. 1996, 14: 33-8, 27-8).

Результаты и обсуждение: мутации потери функции (LoF) в MLL2, по прогнозам, приведут к потере эпигенетических меток H3K4me2 и H3K4me3, потому что MLL представляет собой единственный эффекторный белок для этих меток. Поскольку метилирование H3K4 представляет собой общеизвестную метку активации, онкогенные функции инактивации MLL2 могут приводить к защите клетки злокачественной опухоли от экспрессии генов, в норме активированных метильной меткой H3K4.

Считыватель меток H3K4me2 и me3 представляет собой белок BPTF. BPTF связывается с метками me2 и me3, но не связывается с метками, H3K4me0,1 (Li Н., et al., 2007, Mol. Cell., 28: 677-691). Метки H3K4me0,1 связываются с белком L3MBTL (Li Н., et al., там же). В настоящем документе показано, что можно разработать химическое соединение, которое репрограммирует BPTF для связывания с метками H3K4me0,1 с более высокой аффинностью, чем обычно, и таким образом имитировать активность MLL2. Репрограммирование осуществляется путем образования тройного комплекса BPTF, хвоста H3K4me0 или me1 и низкомолекулярного соединения таким образом, что последний создает благоприятные условия для связывания BPTF с H4K4me0 и/или me1.

Использовали интенсивный вычислительный протокол для идентификации перспективных кандидатов, которые репрограммировали бы BPTF для того, чтобы продемонстрировать аффинность к H3K4me0,1. BPTF распознает триметилированный лизин через ароматический каркас, образованный 4 ароматическими остатками: W32, Y10, Y23 и Y17. Каркас образует коробку в 3D-пространстве, у которой 4 грани создаются этими ароматическими остатками, одна грань находится там, где найден скелет К4, и последняя грань открыта для воды. Без любых мотивов водородных связей, присутствующих в каркасе, каркас селективно связывается с триметилированными лизинами, которые не содержат атомы водорода в атоме NZ. Для репрограммирования специфичности BPTF необходимо закрепить соединение в пределах или вблизи активного центра, что обеспечивает мотив водородных связей, чтобы позволить образование тройного комплекса с H3K4me0,1.

Использованный подход применяли для деконструирования одной из граней ароматического каркаса для получения как сайта для крепления соединения, так и доступа к активному центру для поставки мотива акцептора водорода.

Модель комплекса пептидного хвоста BPTF-H3K4me1 брали из Li, Н. с соавт. (2006, Nature, 442: 91-95). Модель моделировали с молекулярными динамиками (MD) в течение 2 нс, используя ограничения положений, применяемые к ароматическому каркасу BPTF (боковым цепям остатков W32, Y10 и Y23) и атому NZ из К4 пептидного гистонового хвоста. Наименее сохраняемый остаток ароматического каркаса, Y17, выбирали для деконструирования.

Зонд виртуальных соединений (таблица 1) использовали, чтобы заменить Y17 в активном сайте BPTF. Две независимые серии с соединениями V1 и V2 использовали первоначально с тройным комплексом, моделируемым для 6 нс MD. Поскольку зонд диссоциациировал, не в состоянии конкурировать с Y17, область соединений, ответственных за провал, идентифицировали путем анализа траектории MD, и эта область мутировала. Таким образом происходила эволюция зонда соединений:

V1→V11→V12→V13→V14→V3←V23←V22←V21←V2

Окончательный виртуальный зонд V3 обеспечивал стабильный комплекс в течение 6 нс МД. V3 мог вытеснить Y17 для грани ароматического каркаса и образовать две хорошие водородные связи между кислородом кетона и двумя атомами водорода K4 (H2+, me1).

Среднюю структуру белка из окончательного комплекса с зондом V3 затем использовали для выбора реальных соединений в качестве потенциальных репрограммирующих BPTF соединений путем стыкования соединений из библиотеки Национального института злокачественной опухоли (NCI). После мануального обзора приблизительно 5000 комплексов соединений с самым высоким результатом из библиотеки NCI выбрали 22 кандидатные структуры, которые обеспечивали стабильные 6 нс MD тройного комплекса. При выборе учитывали тот факт, что силовое поле GROMOS96 не имеет специальных параметров катион-π, в результате чего, если зонд, содержащий алифатическое кольцо, как было установлено, стабилен при моделировании, структуры, в которых это якорное кольцо было ароматическим, выбирали как предпочтительные структуры.

Выбранное множество соединений тестировали in vitro на активность в клеточной линии SU-DHL-9 (гомозиготный LoF MLL2 мутант) с использованием протокола, описанного в примере 3 Дальнейшая оптимизация на основе сходства активных соединений привела к идентификации множества соединений (NSC382001 (соединение 1), NSC304107 (соединение 2) и NSC127763 (соединение 3)), активных в отношении мутантной LoF двойной MLL2 клеточной линии, но неактивных в отношении клеток дикого типа (смотрите таблицу 2). Модель, показывающая "тройной репрограммирующий комплекс" соединения 2, BPTF и пептида H3K4me1, показана на фиг. 1.

Другие соединения, которые были идентифицированы и продемонстрировали способность in vitro селективно убивать клеточные линии SU-DHL-9 и Пфайфер, которые обладают гомозиготными мутациями LoF MLL2, также показаны в таблице 2. Эти соединения показали активность в этих тестах в концентрации примерно 1 мкМ.

Пример 2: Идентификация, исследование и анализ дополнительных репрограммирующих BPTF соединений

Начальный отбор репрограммирующих BPTF соединений-кандидатов (смотрите пример 1) привел к идентификации двух перспективных остовов (A и B, ниже), которых дополнительно оптимизировали вручную с использованием подхода взаимосвязи структуры-активности (SAR) (фиг. 1), приводя к идентификации дополнительных репрограммирующих BPTF соединений-кандидатов, как показано в таблицах 3 и 4. Эти соединения исследовали на активность in vitro в клеточных линиях SU-DHL-9 и Пфайфер с использованием протокола, описанного в примере 3. Активность наиболее активных соединений составляла приблизительно 2 мкМ для клеточной линии SU-DHL-9 и примерно 6 мкМ для клеточной линии Пфайфер, в то же время никакой цитотоксичности не наблюдается в отношении отрицательных контролей при 10 мкМ.

Взаимосвязь структура-активность (SAR). Для обоих активных остовов, SAR анализ (селективной токсичности против SU-DHL-9, таблицы 2 и 3), как правило, соответствует молекулярной модели тройной комплекса. Согласно модели MD (фиг. 1) для остова A, R1, R2, R3 и R4 должны быть гидрофобными и, все, кроме R4, который стабилизирует Y17 в другом положении, должны быть достаточно небольшими с минимальным количеством вращающихся связей для того, чтобы соответствовать гидроксифенильному сайту связывания. Сравнение активных соединений 1 и 2 с неактивными или минимально активными соединениями 16, 17 и 19 подтверждает, что небольшие гидрофобные R1 и R3 оказывают отрицательный эффект на активность, которая может быть лишь немного компенсирована путем замены R2 - как можно видеть из активности соединений 15 и 20. Соединение 18 с небольшими, но вращающимися метокси-группами в положениях R1, R2 и R3 характеризуется только умеренной активностью, но если метокси вращения значительно сдерживаются в диоксольном кольце, активность восстанавливается, что можно увидеть из соединения 7. R4 оказывает более сложный эффект и может полностью компенсировать отсутствие R1, R2 и R3 (как в соединении 11) или не оказывать никакого эффекта, как в соединении 8. Возможным объяснением этой сложности может быть конкуренция боковой цепи Y17 с хвостом метилпиперидина, способным стабилизировать вне полости, в то время как трет-бутилметиламин не может.

Отсутствие любой замены в R1, R2, R3 и R4 оказывает, как и ожидалось, сильный отрицательный эффект на активность (смотрите соединение 13). Соединение 14 с симметричной заменой также не характеризуется активностью, вероятно, свидетельствуя в пользу желательного небольшого размера R2.

Решающее влияние репрограммирующего мотива A1 подтверждается соединением 21, в котором отсутствует карбонильная группа в этом положении. Намного меньшее значение мотива A0 показано соединением 6, хотя отсутствие R4 в этом соединении приводит только к умеренной активности. A2, кажется, не характеризуется решающим значением, как ожидалось (сравните пары соединения соединение 1/соединение 2 и соединение 17/соединение 19).

Подобные выводы SAR могут быть сделаны для остова B. Хотя библиотека NCI содержит относительно мало соединений, которые представляют собой структурные гомологи активного соединения 3 (NCI127763), важность длинного гидрофобного аналога R4 подтверждается сравнением соединения 3 и частично активного соединения 22 с неактивным соединением 23 (гидрофобность R4) и 24 (длина R4). Решающее значение межмолекулярной репрограммирующей водородной связи подтверждается парой соединение 3/соединение 9.

В соответствии с пространственной моделью результаты можно интерпретировать как ароматическую часть молекулы, занимающую связывающий Y17 карман, с репрограммирующим BPTF кислородом амида и алифатическим хвостом, стабилизирующим новое положение боковой цепи Y17.

Пример 3: активность in vitro соединений 1-3

Соединения 1-3 (смотрите табл. 2) исследовали in vitro на их способность ингибировать рост клеточных линий DoHH-2 (дикого типа для MLL2), SU-DHL-9 и Пфайфер (мутанты MLL2 с гомозиготными втавками/делециями). Результаты показаны на фиг. 2А. Также исследовали концентрационную зависимость активности соединения 3. Результаты показаны на фиг. 2B.

Способ: клеточные линии диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы поддерживали в среде RPMI 1640 (Life Technologies) с добавлением 10% (объем/объем) фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies) и 1% пенициллином/стрептомицином (Life Technologies) при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂, увлажненной атмосфере. Клеточную линию DOHH2 получали из DSMZ. Пфайфер получали из АТСС. SU-DHL-9 получали от Martin Dyer (University of Leicester, UK).

Соединения сначала растворяли в ДМСО в концентрации 10 мМ. Этот раствор соединения дополнительно разбавляли 1:100 в среде RPMI 1640 до конечной концентрации 100 мкМ. Девяносто микролитров клеток, поддерживаемых в концентрации 4×10⁵ клеток/мл, разливали в лунки 96-луночного аналитического планшета MICROTEST™, Optilux™ (BD). Десять микролитров 100 мкМ раствора соединения затем добавляли к клеткам, приводя к конечной концентрации соединения 10 мкМ. Каждое соединение исследовали трижды. Десять микролитров 1:100 ДМСО в растворе среды RPMI 1640 также добавляли к 90 мкл клеток в качестве контроля носителя. Кроме того, каждая пластина включала лунки, содержащие только среду RPMI 1640, чтобы служить в качестве контроля фонового шума, а также клетки, которые полностью не подвергались воздействию. Соединения инкубировали с клетками при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂, в увлажненной атмосфере в течение 48 часов перед тем, как подвергнуть анализу клеточной пролиферации alamarBlue® (Life Technologies). Сырые единицы флуоресценции корректировали для фонового шума и нормализовали к обработанному носителем контролю.

Пример 4: активность in vitro соединений 2 и 3

Активность соединения 3 in vitro дополнительно исследовали с использованием клеточных линий DoHH-2, OCI-LY3, WSU-DLCL2 (все дикого типа для MLL2) и SU-DHL9. Кроме того, дозозависимый эффект для соединения 2 исследовали в мутантных клеточных линиях для MLL2, или как MLL2, так и EZH2. Дозозависимый эффект для соединения 3 исследовали в мутантной по MLL2 клеточной линии. Применяли способы, описанные для примера 3. Клеточную линию WSU-DLCL2 получали из DSMZ и линии 3 OCI-LY получали от Louis Staudt (US National Institutes of Health).

Результаты представлены на фигуре 3A-C. Следует отметить, что соединение 3 не оказывало очевидного эффекта на клетки, где MLL2 был дикого типа, что указывает на то, что соединения не обладают общими токсичные свойствами.

Пример 5: взаимодействие соединений 2 и 3 с BPTF

Для того, чтобы продемонстрировать, что репрезентативные соединения 2 и 3 взаимодействуют с мишенью BPTF и влияют на ее способность связывать гистоновый хвост H3, проводили осаждающий BPTF анализа. Анализ схематически изображен на фигуре 4 и подробно описан ниже.

С использованием этого анализа установили, что соединение 3 способно стабилизировать связывание H3K4me1 с BPTF (фиг. 5А), в то время как благодаря счастливому стечению обстоятельств соединение 2 способно стабилизировать связывание H3K4me2 (фиг. 5B). На фиг. 5А окрашивание антител к GST показывает увеличенный белок BPTF в присутствии соединения 3 и H3K4me1 и сниженное связывание в присутствии соединения и H3K4me3. Значения денситометрии H3K4me1 + соединение 3 = 13335, H3K4me - соединение 3 = 9350, H3K4me3 + соединение 3 = 4227, H3K4me3 - соединение 3 = 2545. На фиг. 5B окрашивание антител к GST показывает увеличенный белок BPTF в присутствии соединения 2 и H3K4me2 и сниженное связывание в присутствии соединения и H3K4me3.

Способ: полноразмерный конструкт BPTF человека получали от С. David Allis из лаборатории биологии хроматина Rockefeller University (Li et al., 2006, там же). Двойной PHD палец-бромодомен (остатки 2583-2751) из BPTF человека (gi:31322942) клонировали в вектор pDEST15 с использованием технологии клонирования Gateway®, позволяющую тег для N-концевой GST (Life Technologies). Гиперэкспрессию GST-BPTF двойного PHD пальца-бромодомена индуцировали в химически компетентных клетках E.coli BL21-AI™ с использованием среды LB, дополненной 1 мМ IPTG и 0,2% L-арабинозой в течение 2 часов при 37°C в качающемся инкубаторе. GST-BPTF двойной PHD палец-бромодомен очищали с использованием среды глутатион сефарозы 4B (GE Healthcare Life Sciences) и подвергали диализу против PBS (Life Technologies) в течение ночи.

Эксперимент осаждения пептидов проводили, по существу, как описано ранее (Ruthenburg et al., 2011, Cell, 145(5): 692-706). Пятьдесят микролитров M-280 стрептавидин-связанных Dynabeads® (Life Technologies) вносили в 1,5 мл микропробирки и промывали 3×50 мкл в PBS. Гранулы затем инкубировали с биотинилированными на C-конце пептидами H3K4me0, mel, me2 или me3 длиной 21 аминокислота (AnaSpec) при вращении в течение 1 часа при 4°C в условиях насыщения. Гранулы промывали 3×100 мкл в HBS-TD (10 мМ Na-HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Твин-20, 2 мМ ДТТ) и инкубировали с 6,8 мкМ GST-BPTF вместе с или 68 мкМ лекарственного средства в 1:100 ДМСО в растворе PBS, или только наполнителем, при вращении в течение 3 часов при 4°C .Гранулы затем отмывали 10×200 мкл в HBS-TD. Белок элюировали с использованием 2х сэмпл буфера LDS (Life Technologies) и 1х восстанавливающего средства (Life Technologies) при 85°C в течение 10 минут. Образцы подвергали SDS-PAGE и полосы визуализировали с использованием либо красителя SimplyBlue (Life Technologies), либо антитела GST (Santa Cruz). Количественное определение полос осуществляли с использованием программного обеспечения ImageJ.

Пример 6: активность in vivo соединения 3

Соединения 2 и 3 исследовали на их способности уменьшать рост опухолей в мышиной ксенотрансплантной модели.

Ксенотрансплантная модель. NOD/SCID/γ^null (NSG) мышей разводили в местном виварии BCCRC. Для установления первичных опухолей мышей-самцов NSG инокулировали 1×10⁷ клеток клеточной линии диффузной гистиоцитарной лимфомы человека SU-DHL-9 в 50 мкл PBS в боковую область. После развития подкожной опухолей мышей умерщвляли, и небольшие фрагменты опухолей (~20 мг) трансплантировали подкожно в правый бок анестезированных шести-десяти недельных NSG мышей-самцов реципиентов, используя 13 G трокарные иглы. Лечение начинали после того, как опухоли становились пальпируемыми. Длину и ширину опухоли определяли с помощью калипера и объем опухоли рассчитывали с помощью модифицированной эллипсоидальной формулы как (длина×ширина)²/2.

Исследования эффективности. Соединения разбавляли в смеси 50% ДМСО и 50% полиэтиленгликоля 200. Восьми несущим опухоли мышам в группе вводили путем внутрибрюшинных инъекций каждый день в течение восьми дней любое соединение в дозах 1 мг/кг или 4 мг/кг (соединение 3; NSC 127763), 4 мг или 12 мг/кг (соединение 2; NSC 304107) или наполнитель для контроля. Вес тела записывали каждые два дня, размер опухоли каждые четыре дня, и мышей наблюдали на предмет любых других дополнительных побочных эффектов. Экспериментальных животных умерщвляли на девятый день, определяли объемы опухолей, и достоверность различий определяли по t-тесту Стьюдента после нормализации с исходным объемом опухоли.

Как показано на фиг. 6, оба соединения показали противоопухолевую активность в этой ксенотрансплантной мышиной модели. Для соединения 3 (фиг. 6А) в этой быстро растущей модели присутствие соединения в сравнительно низком содержании 4 мг/кг помогло уменьшить средний рост опухоли до 362%, по сравнению с контролем без воздействия, который характеризовался средним ростом опухоли равным 563%. Соединение 2 (фиг. 6B) в дозе 12 мг/кг смогло уменьшить средний рост опухоли до 1305%, по сравнению с контролем без воздействия, который характеризовался средним ростом опухоли равным 1755%. Эти результаты, особенно перспективные в качестве дозирования или состава этих соединений, были не оптимизированы.

Пример 7: низкомолекулярное соединение, репрограммирующее CBX2

Применяли расчетный подход к считывателю метилированных меток гистонов CBX2, основанный на структуре белка Policomb мухи (аналог CBX2), приводящий в результате к идентификации ряда кандидатных репрограммирующих CBX2 соединений (таблица 5).

Описание фармакофора: CBX2 связывается с положительно заряженными метилированными эпигенетическими метками с помощью ароматического каркаса, образованного тремя остатками: F11, W22 и W25. В отличие от BPTF, чей ароматический каркас образован 4 остатками, CBX2 характеризуется открытой структурой граней. Достаточно большая ароматическая группа соединения, таким образом, может быть использована для завершения образования более обычного, 4-гранного ароматического каркаса, типичного для метилированных Lys связующих. Как и в BPTF, стабилизация тройного репрограммирующего комплекса CBX2, пептида H3K27H[3,2,1]me[0,1,2] и репрограммирующего соединения может быть достигнута с помощью водородной связи между частично метилированным Lys27 и соединением. Отсутствие такой водородной связи в ароматическом каркасе, скорее всего, ответственно за селективную аффинность CBX2 к метке K27me3. Для репрограммирующих соединений, представленных в таблице 5, наличие акцептора водорода в непосредственной близости от большего ароматического фрагмента представляет собой критический компонент, что, по прогнозам, будет отвечать за отклонение природной аффинности CBX2 к триметилированному гистоновому хвосту. Дополнительный мотив акцептора водорода, предусмотренный соединением, объясняет превосходство тех соединений, которые включают в себя мотив кетона вблизи подобного нафталину фрагмента над гидроксильным мотивом. Аналогичный аргумент применяют к видимому превосходству соединений, содержащих фрагмент R₂NH над теми, которые включают в себя фрагмент R₄N. Гидрофобный фрагмент в качестве второго фланкирующего компонента мотива акцептора водорода может также иметь важное значение и может объясняться длинной углеводородной частью боковой цепи Lys27me2. В то время как ароматический каркас в активном сайте взаимодействует с метилированным азотом лизина, углеводороды Cβ, Cγ и Cδ открыты для полярных водных сред. Таким образом, прогнозируется, что достаточно большой фрагмент, такой как, CH₂Br или CH₂Ph (в случае NSC14755), охватывает эту зону пептида H3 и дополнительно способствует стабильности комплекса.

Пример 8: активность in vitro соединения 50

Лимфоидные злокачественные образования с различными мутациями в гене EZH2, как было показано, характеризуются повышенной активностью PRC2 в триметилированном гистоне H3 в остатке лизина 27 (H3K27). Соединение 50 исследовали на его влияние на жизнеспособность трех клеточных линий лимфомы in vitro с использованием стандартных способов. Исследованными клеточными линиями были: DoHH-2 (дикий тип для EZH2, MEF2B и MLL2); WSU-DLCL2 (мутация Y641F EZH2 (дикий тип для MEF2B и MLL2)) и DB (мутация Y641N EZH2, мутация D83V MEF2B и три мутации в MLL2 (две из которых приводят к процессированному белку после остатка Q2736 и третий аллель содержит делецию 1 пары оснований в остатке Р480)).

Результаты приведены на фиг. 7, и они показывают, что соединение 50 уменьшало жизнеспособность всех трех клеточных линий в зависимости от дозы, но показывало наивысшую активность против WSU-DLCL2 клеточных линий, который обладает мутацией Y641 EZH2.

Пример 9: влияние соединения 50 на рост опухоли в мышиной ксенотрансплантной модели

Фрагменты опухолей WSU-DLCL2 трансплантировали подкожно в бок мышей-самцов NSG. Мыши были 9,0-9,3 недели на трансплантации, лечение начинали, когда мыши были между 12,9 и 13,1 неделями. На группу использовали 8 мышей, и лечение проводили каждый день в течение десяти дней с оценкой на 12-й день. Размер опухоли определяли с помощью калипера каждые четыре дня, объем опухоли рассчитывали с помощью: длина×ширина²/2.

На группы мышей воздействовали носителем (контроль), соединением 50 в концентрации 1 мг/кг или соединением 50 в концентрации 4 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции. Носитель представлял собой 50% ДМСО/50% ПЭГ-400.

Результаты показаны на фиг. 8 и они демонстрируют, что соединение 50 в обоих дозировках могло сокращать объем опухоли.

Пример 10: влияние соединения 51 на пролиферацию клеточных линий лимфомы

Соединение 51 (NSC2540) исследовали на его влияние на жизнеспособность четырех клеточных линий лимфомы in vitro с использованием стандартных способов. Исследованные клеточные линии представляли собой DoHH-2, WSU-DLCL2, DB и SU-DHL-9 (EZH2 дикого типа, MEF2B дикого типа, MLL2 INDEL).

Результаты приведены на фиг. 9, и они показывают, что соединение 51 могло уменьшать жизнеспособность клеточных линий DoHH-2, WSU-DLCL2 и SU-DHL-9.

Пример 11: влияние соединения 51 рост опухоли в мышиной ксенотрансплантной модели

Фрагменты опухоли WSU-DLCL2 трансплантировали подкожно в бок мышей-самцов NSG. Мыши были 5,3-9,4 недели на трансплантации, лечение начинали, когда мыши были между 8,6 и 12,7 неделями. Использовали 8 мышей в контрольной группе и 6 мышей использовали в группе обработки соединением 51. Лечение проводили каждый день в течение десяти дней с оценкой на 12-й день. Размер опухоли определяли с помощью калипера каждые четыре дня, объем опухоли рассчитывали с помощью: длина×ширина²/2.

На группы мышей воздействовали носителем (контроль) или соединением 51 путем внутрибрюшинной инъекции в концентрации 4 мг/кг в первые 5 дней и 2 мг/кг в последующие 5 дней. Носитель представлял собой 50% ДМСО/50% ПЭГ-400.

Результаты показаны на фиг. 10, и они демонстрируют, что соединение 51 могло значительно сокращать объем опухоли.

Пример 12: влияние соединений 50 и 51 на пролиферацию клеточных линий злокачественной опухоли молочной железы

Соединения 50 и 51 исследовали на их влияние на жизнеспособность четырех клеточных линий злокачественной опухоли молочной железы in vitro с использованием стандартных способов. Исследованные клеточные линии представляли собой: MCF-7, MDA-MB-231, НСС202 (CRL-2316) и НСС1500 (CRL-2329).

Результаты приведены на фиг. 11, и они показывают, что соединение 51 могло уменьшать жизнеспособность клеточных линий MDA-MB-231, НСС202 (CRL-2316) и НСС1500 (CRL-2329).

Раскрытие всех патентов, патентных заявок, публикаций и элементов баз данных, упомянутых в настоящем описании, специально полностью включено в настоящий документ посредством ссылки в той же мере, как если бы такой каждый индивидуальный патент, патентная заявка, публикация и элемент базы данных был конкретно и индивидуально указан, как включенный посредством ссылки.

Несмотря на то что изобретение было описано со ссылкой на определенные конкретные варианты осуществления, различные их модификации будут очевидны специалистам в настоящей области техники без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Все такие модификации, которые были бы очевидны специалистам в настоящей области техники, предположительно включены в объем следующей формулы изобретения.

Изобретение касается способа для идентификации соединений-кандидатов, которые репрограммируют считывающий гистоновые метки белок от связывания его родственной метки гистонового хвоста на связывание неродственной метки гистонового хвоста, включающего: (a) расчетное получение структурной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с неродственной мишенью-меткой гистонового хвоста, где активный сайт моделируется с сайтом для связывания соединений-кандидатов; (b) получение структуры зонда, выбранной для неконкурентного связывания с мишенью-меткой гистонового хвоста в сайте для связывания соединений-кандидатов, так чтобы сформировать стабильный тройной репрограммирующий комплекс с мишенью-меткой гистонового хвоста и активным сайтом считывающего белка; и (c) скрининг соединений-кандидатов с целью идентификации тех, которые вместе с остатками в активном сайте и мишенью-меткой гистонового хвоста существенно воспроизводят одну или более функциональных особенностей, вовлеченных в формирование стабильного тройного репрограммирующего комплекса. 15 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 12 пр.

1. Способ для идентификации соединений-кандидатов, которые репрограммируют считывающий гистоновые метки белок от связывания его родственной метки гистонового хвоста на связывание неродственной метки гистонового хвоста, включающий:

(a) расчетное получение структурной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с неродственной мишенью-меткой гистонового хвоста, структурная модель основана на расчетной модели активного сайта считывающего белка в комплексе с его родственной меткой гистонового хвоста, где активный сайт моделируется с сайтом для связывания соединений-кандидатов;

(b) получение структуры зонда, выбранной для неконкурентного связывания с мишенью-меткой гистонового хвоста в сайте для связывания соединений-кандидатов, так чтобы сформировать стабильный тройной репрограммирующий комплекс с мишенью-меткой гистонового хвоста и активным сайтом считывающего белка, где структура зонда связывается в сайте для связывания соединений-кандидатов с помощью одной или более функциональных особенностей, включающих по меньшей мере одну водородную связь и/или гидрофобные взаимодействия; и

(c) скрининг соединений-кандидатов с целью идентификации тех, которые вместе с остатками в активном сайте и мишенью-меткой гистонового хвоста существенно воспроизводят одну или более функциональных особенностей, вовлеченных в формирование стабильного тройного репрограммирующего комплекса.

2. Способ по п. 1, при котором получение структуры зонда включает проведение итеративного моделирования молекулярной динамики серии структур зондов в активном сайте с мишенью-меткой гистонового хвоста для идентификации оптимальной структуры зонда, которая обеспечивает стабильный комплекс между структурой зонда, остатками в активном сайте и мишенью-меткой гистонового хвоста.

3. Способ по п. 2, при котором итеративное моделирование молекулярной динамики дополнительно включает итеративное выявление области структуры зонда, ответственной за диссоциацию зонда и мутацию выявленной области.

4. Способ по п. 2 или 3, при котором скрининг соединений-кандидатов включает стыкование соединений-кандидатов со средней структурой белка, основанной на стабильном тройном репрограмирующем комплексе.

5. Способ по любому из пп. 1-3, при котором скрининг соединений-кандидатов включает моделирование молекулярной динамики, способов стыкования in silico, поиск структурного подобия или их комбинации.

6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором родственная метка гистонового хвоста считывающего гистоновые метки белка представляет собой тримителированную родственную метку гистонового хвоста, а неродственная метка гистонового хвоста представляет собой частично метилированную мишень-метку гистонового хвоста.

7. Способ по п. 6, при котором

моделирование активного сайта на этапе (а) включает моделирование ароматического каркаса, имеющего 3 грани, образованные ароматическими остатками, одна из граней занята мишенью-меткой гистонового хвоста и сайтом для связывания соединений-кандидатов, и

структура зонда образует водородную связь с частично метилированной мишенью-меткой гистонового хвоста.

8. Способ по п. 7, при котором ароматический остаток на четвертой грани ароматического каркаса деконструирован.

9. Способ по любому из пп. 1-8, при котором мишень-метка гистонового хвоста и родственная метка гистонового хвоста представляют собой метки-метилированные лизины.

10. Способ по п. 9, при котором родственная метка гистонового хвоста представляет собой триметилированный лизин и мишень-метка гистонового хвоста представляет собой ди-, моно- или неметилированный лизин.

11. Способ по любому из пп. 1-9, при котором родственная метка гистонового хвоста представляет собой триметилированный лизин и мишень-метка гистонового хвоста представляет собой ди-, моно- или неметилированный лизин и при котором структура зонда включает акцептор водорода.

12. Способ по п. 11, при котором структура зонда дополнительно содержит 6-членную алифатическую или ароматическую кольцевую структуру.

13. Способ по любому из пп. 1-12, при котором соединения-кандидаты выбирают из виртуальной библиотеки низкомолекулярных соединений.

14. Способ по любому из пп. 1-13, при котором считывающий белок гистоновых меток представляет собой СВХ2 или BPTF.

15. Способ по п. 14, при котором идентифицированные на стадии (с) соединения-кандидаты представляют собой кандидаты для лечения злокачественной опухоли, характеризующейся повышенной активностью метилирования EZH2, или злокачественной опухоли, характеризующейся сниженной активностью метилирования MLL2.

16. Способ по любому из пп. 1-15, дополнительно включающий исследование идентифицированных на стадии (с) соединений-кандидатов в одном или нескольких анализах in vitro для оценки модуляции связывания считывающего белка к мишени-метке гистонового хвоста.