КОМБИНАЦИИ СПЕЦИФИЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ ГИСТОНОВЫХ ДЕАЦЕТИЛАЗ КЛАССА I С ИНГИБИТОРАМИ ПРОТЕАСОМ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/506 A61K31/69 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к ингибиторам гистоновых деацетилаз (HDAC) в сочетании с ингибиторами протеасом. Изобретение относится к способам их получения, к содержащим их композициям, а также к их применению в качестве лекарственного средства, например в качестве лекарственного средства, ингибирующего гематопоэтические опухоли, такие как лимфомы и лейкозы.

Семейство ферментов HDAC было названо по их первому идентифицированному субстрату, а именно ядерным белкам гистонам. Гистоны (H2A, H2B, H3 и H4) образуют октамерный комплекс, вокруг которого оборачивается спираль ДНК, и, таким образом, формируется структура конденсированного хроматина. Статус ацетилирования гистонов находится в динамическом равновесии, регулируемом гистон-ацетилтрансферазами (HAT), которые ацетилируют гистоны, и HDAC, которые отвечают за деацетилирование гистоновых хвостов. Ингибирование фермента HDAC усиливает ацетилирование гистоновых хвостов в нуклеосоме, способствуя образованию более транскрипционно-активной структуры хроматина, что, в свою очередь, приводит к изменению экспрессии генов, вовлеченных в клеточные процессы, такие как пролиферация клеток, апоптоз и дифференциация. В последнее время идентифицированы негистонные субстраты HDAC, и их число растет.

При некоторых специфических формах лейкоза и лимфомы, таких как острый промиелоцитарный лейкоз (APL), неходжкинская лимфома и острый миелоидный лейкоз (AML), наблюдается нарушенное и постоянное рекрутирование в хроматин HDAC вместе с онкогенными транскрипционными факторами. В клетках рака простаты наблюдается повышение количества белка HDAC1 по мере развития заболевания от злокачественных очагов и хорошо дифференцированной, отвечающей на андрогены аденокарциномы простаты в направлении к фенотипически дедифференцированному, нечувствительному к андрогенам, раку простаты. Кроме того, повышение экспрессии HDAC2 было обнаружено в большинстве эксплантатов рака толстой кишки в результате потери гена опухолевого супрессора аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС).

Было показано, что ингибиторы HDAC вызывают остановку клеточного цикла, терминальную дифференцировку и/или апоптоз во многих клеточных линиях опухолей человека in vitro, ингибируют ангиогенез и проявляют противоопухолевую активность in vivo на моделях ксенотрансплантатов опухолей человека бестимусным мышам, что согласуется с равновесием активности HDAC/HAT при раке.

Семейство ферментов HDAC обычно подразделяют на 3 класса, а именно классы I, II и III. На основании клинических исследований на сегодняшний момент полагают, что эффект ингибиторов HDAC в основном опосредован ферментами I и II классов.

Было показано, что группа HDAC класса I, которая состоит из членов семейства HDAC 1-3 и 8, является основной в пролиферации опухолевых клеток.

Среди множества транскрипционных факторов, которые используют, HDAC класса I для «молчания» определенных промоторов, наиболее известным примером является класс ядерных гормонорецепторов, которые связывают HDAC3 только в отсутствие лигандов, и, таким образом, поддерживают транскрипционное молчание. Диссоциация комплекса происходит лиганд-зависимым образом, например в результате действия ретиноидов, эстрогенов, андрогенов и тому подобное, что в результате приводит к экспрессии генов и дифференциации. Другим основным примером является HDAC1-зависимое подавление экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ, p21^waf1,cip1. Главная роль индукции p21^waf1,cip1 в антипролиферативных эффектах ингибиторов HDAC была продемонстрирована в исследованиях, в которых было показано, что в клетках, в которых отсутствует экспрессия p21^waf1,cip1, резистентность к ингибитору HDAC трихостатину А (TSA) увеличена в 6 раз по сравнению с клетками родительской линии HCT-116. Кроме того, p21^waf1cip1 повсеместно присутствует в опухолевых клетках и индуцируется ингибиторами HDAC в отличие от настоящих генов опухолевых супрессоров.

Гистоны не являются единственными субстратами для HDAC класса I. Например, HDAC 1-3 деацетилируют опухолевый супрессор p53, в результате чего происходит убиквитилирование этого белка и его деградация. Поскольку р53 является сильным опухолевым супрессором, включая остановку клеточного цикла и апоптоз, то поддержание этого белка на низком уровне является решающим фактором для выживания и неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток.

HDAC класса II можно разделить на 2 подкласса: класс-IIa, включающий в себя HDAC 4, 5, 7, 9 и сплайсинговый вариант HDAC9 - MITR. Класс-IIb включает в себя HDAC6 и HDAC10, причем оба белка имеют по два HDAC-домена. HDAC класса IIa не обладают характерной гистон-деацетилазной активностью, но регулируют экспрессию генов, действуя в качестве мостиков, поскольку они связываются как с комплексами HDAC класса I, так и с комплексами транскрипционных факторов и ДНК.

HDAC6, относящийся к классу-IIb, интересен как фермент, деацетилирующий Hsp90. Было показано, что HDAC-ингибиторы LAQ824 и LBH589 вызывают деацетилирование Hsp90, в то время как трапоксин и бутират натрия нет. Деацетилирование Hsp90 приводит к деградации связанных с Hsp90 взаимодействующих с ним белков, которые отвечают за выживание и пролиферацию клетки. Основные примеры включают Her-2, Bcr-Abl, глюкокортикоидный рецептор, мутантный FLT-3, c-Raf и Akt. Кроме того, Hsp90, HDAC6 также деацетилирует тубулин при дестабилизации микротрубочек во время стресса.

Кроме того, биологическую роль HDAC6 подтверждают данные о том, что специфический низкомолекулярный ингибитор HDAC6, тубацин, вызывает гиперацетилирование α-тубулина и снижает подвижность клеток, не влияя на развитие клеточного цикла. Тубацин, который ингибирует только α-тубулин-деацетилазный домен HDAC6, вызывает только минимальное увеличение ацетилирования HSP90.

Было обнаружено, что HDAC6 является основным фактором в эстрадиол-стимулируемой миграции клеток линии MCF-7 карциномы молочной железы, что согласуется с предыдущими данными.

Наконец, HDAC6 играет решающую роль в клеточных механизмах контроля за неправильно свернутыми белками и в процессе удаления их из цитоплазмы.

Вследствие большого числа белков клеточного цикла, которые регулируются белками HDAC - или на уровне их экспрессии, или на уровне их активности, невозможно связать антипролиферативный эффект ингибиторов HDAC с одним механизмом действия. Ингибиторы HDAC имеют большие перспективы в области противораковой терапии, в которой согласованные эффекты на множество биохимических путей, вовлеченных в ингибирование роста, дифференцировку и апоптоз, могут обеспечить преимущество при лечении гетерогенного патологического состояния, такого как образование и рост опухоли.

Со временем стало очевидно, что белки HDAC играют основную роль не только в канцерогенезе, но также в ряде процессов дифференцировки, которые не относятся к злокачественным. Наиболее очевидно это для HDAC класса IIa - 4, 5, 7 и 9. Например, было высказано предположение, что HDAC7 играет решающую роль в созревании Т-клеток в тимусе, в то время как HDAC4 вовлечена в регуляцию гипертрофии хондроцитов и образование хрящевых костей. Однако большинство вопросов сосредоточены на роли белков HDAC класса IIa в мышечной дифференцировке. HDAC 4, 5, 7 и 9, все подавляют дифференцировку миоцитов (мышечных клеток) вследствие того, что они являются транскрипционными ко-репрессорами миоцитарного энхансерного фактора 2 (MEF2).

Наиболее частым наблюдаемым токсическим действием ингибиторов HDAC является миелосупрессия в степени от слабой и до средней. Кроме того, при многих клинических испытаниях в качестве нежелательной реакции отмечаются тошнота/рвота, утомление и диарея.

В EP 1485365, опубликованном 18 сентября 2003 года, описано получение, композиция и фармацевтические свойства соединения со следующей формулой Маркуша:

его N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые соли присоединения и стереохимические изомеры,

где n, m, t, R¹, R², R³, R⁴, L, Q, X, Y, Z и имеют значения, определенные в указанном описании.

В WO 2006/010750, опубликованном 2 февраля 2006 года, среди других раскрыт ингибитор HDAC - JNJ26481585

Однако возможности терапии ингибиторами HDAC выходят за рамки применения единственного средства. Биохимические пути, на которые воздействуют ингибиторы HDAC, делают их перспективными кандидатами для комбинаторных исследований.

Существует необходимость в специфичных ингибиторах HDAC класса I, которые имели бы клинические преимущества в эффективности и/или токсичности, или при их индивидуальном использовании, или в сочетании с другими терапевтическими агентами.

Также ингибирование протеасом представляет собой важную недавно разработанную стратегию в области терапии рака. Протеасома является мультиферментным комплексом, присутствующим во всех клетках, который играет роль в деградации белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Ряд основных регуляторных белков, включая р53, циклины и ингибитор циклин-зависимых киназ p21^waf1,cip1 временно разрушаются в течение клеточного цикла по убиквитин-протеасомному пути. Упорядоченная деградация этих белков требуется для того, чтобы клетка прошла через клеточный цикл и митоз. Кроме того, убиквитин-протеасомный путь необходим для регуляции транскрипции.

В EP 788360, EP 1312609, EP 1627880, US 6066730 и US 6083903 описаны соединения пептидного борного сложного эфира и кислоты, которые можно использовать в качестве протеасомных ингибиторов. Одно из этих соединений - N-пиразинкарбонил-L-фенилаланин-L-лейцинборная кислота (PS-341, в настоящее время известное как бортезомиб или Велкад (Millenium)), обладает противоопухолевой активностью в моделях опухолевых ксенографтов, и этот препарат разрешен к применению у пациентов с рецидивирующей рефрактерной множественной миеломой, а также в настоящее время этот препарат находится на стадии клинических испытаний при других показаниях, включая другие гематологические раковые заболевания, а также солидные опухоли. Бортезомиб вызывает смерть клеток в результате образования неправильно свернутых или как-либо еще поврежденных белков, тем самым активируя митохондриальный путь апоптоза, например, через Bax-зависимый или опосредуемый активными формами кислорода механизмы.

Бортезомиб вызывает отток конъюгированных с убиквитином белков в структуры, называемые агресомами. По-видимому, агресомы участвуют в цитозащитном ответе, который активируется в ответ на ингибирование протеасом, возможно путем переноса убиквитилированных белков в лизосомы для деградации.

Образование агресом, вызванное действием бортезомиба, можно остановить, используя ингибитор HDAC, SAHA (субероиланилид-гидроксамовую кислоту). Для SAHA также был продемонстрирован синергический эффект на апоптоз in vitro и в модели ортотопических ксенографтов рака поджелудочной железы in vivo (Cancer Research 2006; 66: (7) 3773-3781).

Для другого ингибитора HDAC, LAQ824, также было продемонстрировано, что уровни клеточной смерти указывали на синергизм действия с бортезомибом (Journal of Biological Chemistry 2005; 280: (29) 26729-26734).

Синергический эффект SAHA и LAQ824 с бортезомибом связывают с их ингибиторной активностью в отношении HDAC6.

Необходимо еще увеличить эффективность ингибирования протеасомными ингибиторами роста опухолей, а также снизить дозы таких средств для того, чтобы снизить возможность проявления отрицательных токсических побочных эффектов у пациента.

В настоящий момент нет точных данных по корреляции степени ацетилирования с опухолевым ответом. Вкратце, простые и легко воспроизводимые способы количественного определения степени ацетилирования гистоновых и негистоновых субстратов, вызванного описанными ниже специфичными ингибиторами HDAC класса I, или комбинациями, включающими в себя указанные HDAC-ингибиторы, будут решающими для их будущего.

Задача изобретения относится к специфичным ингибиторам HDAC класса I и терапевтическим комбинациям протеасомного ингибитора и HDAC-ингибиторов описанного ниже типа, которые могут обладать точным и характерным эффектом на ацетилирование, специфичным ингибиторным действием в отношении HDAC класса I, благоприятным эффектом ингибирования роста опухолевых клеток и меньшим количеством нежелательных побочных эффектов.

Поэтому авторы изобретения предлагают комбинацию протеасомного ингибитора и HDAC-ингибитора формулы (I)

его фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот и оснований и стереохимических изомеров, где

является радикалом, выбранным из

где R⁵ выбран из водорода; тиенила; тиенила, замещенного ди(С_1-6алкил)аминоС_1-6алкилом или С_1-6алкилпиперазинилС_1-6алкилом; фуранила; фенила; или фенила, замещенного одним заместителем, независимо выбранным из ди(С_1-4алкил)аминоС_1-4алкокси-группы, ди(С_1-4алкил)амино-группы, ди(С_1-4алкил)аминоС_1-4алкила, ди(С_1-4алкил)аминоС_1-4алкил(С_1-4алкил)аминоС_1-4алкила, пирролидинилС_1-4алкила, пирролидинилС_1-4алкокси-группы или С_1-4алкилпиперазинилС_1-4алкила.

Линии, проведенные от заместителей в бициклические кольцевые системы, указывают на то, что связи могут быть образованы с любым из подходящих кольцевых атомов бициклической кольцевой системы.

Используемый в предшествующих определениях и ниже, С_1-4алкил определяет линейные и разветвленные насыщенные углеводородные радикалы, имеющие от 1 до 4 атомов углерода, такие как метил, этил, пропил, бутил, 1-метилэтил, 2-метилпропил и т.п.; С_1-6алкил включает С_1-4алкил и его высшие гомологи, имеющие от 5 до 6 атомов углерода, такие как, например, пентил, 2-метилбутил, гексил, 2-метилпентил и т.п.

Представляющими интерес соединениями формулы (I) являются те соединения формулы (I), в которых является (а-2).

Также представляющими интерес соединениями формулы (I) являются те соединения формулы (I), в которых R⁵ является водородом.

Другими представляющими интерес соединениями формулы (I) являются те соединения формулы (I), в которых R⁵ находится в пара-положении.

Предпочтительными соединениями формулы (I) являются соединения №6, №100, №104, №128, №144, №124, №154, №125, №157, №156, №159, №163, №164, №168, №169, №127, №171, №170, №172 и №173, соответствующих нумерации, указанной в таблице на стр.21-23 в EP 1485365.

Наиболее предпочтительным соединением формулы (I) является соединение, в котором является (а-2), а R⁵ является водородом (соединение №6 (R306465) в EP 1485365)

или его фармацевтически приемлемая соль присоединения.

Предполагается, что используемые в настоящем описании термины «гистоновая деацетилаза» и «HDAC» относятся к любому белку из семейства ферментов, которые удаляют ацетильные группы с ε-аминогрупп остатков лизина на N-конце гистона. Если в контексте не указано иное, подразумевается, что термин «гистон» относится к любому гистоновому белку, включая H1, H2A, H2B, H3, H4 и H5, из любого биологического вида. Белки HDAC человека или продукты генов включают в себя, но не ограничены этим: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 и HDAC-11. Также источником гистоновой деацетилазы могут служить простейшие или грибы.

Термин «ингибитор гистоновой деацетилазы» используют для определения соединения, которое способно взаимодействовать с гистоновой деацетилазой и ингибировать ее активность, более конкретно - ферментативную активность. Ингибирование ферментативной активности гистоновой деацетилазы означает снижение способности гистоновой деацетилазы к удалению ацетильной группы с гистона или другого белового субстрата. Предпочтительно, чтобы такой ингибитор был специфичным, т.е. ингибитор гистоновой деацетилазы снижал способность гистоновой деацетилазы удалять ацетильную группу с гистона или другого белкового субстрата при концентрации ниже, чем концентрация ингибитора, которая требуется для получения какого-либо другого, несвязанного биологического эффекта.

Термины «специфичное ингибирование HDAC класса I» или «специфичный ингибитор HDAC класса I» используются для определения соединений, которые понижают ферментативную активность члена семейства HDAC класса I (HDAC 1-3 или 8) при концентрации ниже, чем концентрация ингибитора, которая требуется для ингибирования ферментов HDAC других классов, таких как класс-IIa или класс-IIb HDAC.

Предполагается, что используемые в настоящем описании термины «протеасома» и «убиквитин-протеасомная система (UPS)» относятся к любой из структур и функций всех компонентов в UPS, которые включают в себя, но не ограничены этим:

а) убиквитин (Ub) и убиквитин-подобные белки (Ulp); например SUMO, NEDD8, ISG15 и т.п.,

b) убиквитиновые мономеры, соединенные через К48 полиубиквитиновые цепи, соединенные через К63 полиубиквитиновые цепи и т.п.,

c) убиквитин-активирующие ферменты Е1; например El^Ub, E1^SUMO, E1^NEDD8, E1^ISG15 и т.п.,

d) субъединицы убиквитин-активирующих ферментов Е1; например APPBP1, UBA3, SAE1, SAE2 и т.п.,

e) убиквитин-конъюгирующие ферменты Е2; например UBC9, UBC12, UBC8 и т.п.,

f) убиквитин-лигазы Е3; например, содержащие домен RING палец Е3-лигазы, простые содержащие домен RING-палец Е3-лигазы, куллин-подобные содержащие домен RING-палец Е3-лигазы, RBX1-/RBX2-зависимые Е3-лигазы, содержащие НЕСТ-домен Е3-лигазы, содержащие домен U-box Е3-лигазы и т.п.,

g) комплекс SCF (SKP1-Cullin1-F-box) Е3-лигазы, например SCF^SKP2, SCF^B-TRCP, SCF^FBW7 и т.п.,

h) куллины, например CUL1, CUL2, CUL3, CUL4, CUL5 и т.п.,

i) содержащие домен F-box белки, например белки SKP2, B-TRCP, белки FBW и т.п.,

j) другие субстрат-специфичные адаптеры, например белки BTB, содержащие домен SOCS-box белки, DDB1/2, VHL и т.п.,

k) протеасому, ее компоненты и т.п.,

l) металлоизопептидазу RPN11, субъединицу крышки протеасомы, которая удаляет убиквитины с мишеней UPS перед их деградацией, и т.п.,

m) металлоизопептидазу CSN5, субъединицу COP9-сигналосомного комплекса, который отвечает за удаление NEDD8 от куллинов и т.п.,

n) стадию активации убиквитин-активирующим ферментом Е1, в которой сначала происходит аденилирование Ub/Ulp по их С-концевому остатку глицина и затем происходит их активация в виде тиольного эфира снова на их С-конце,

o) перенос Ub/Ulp от убиквитин-активирующих ферментов Е1 к убиквитин-конъюгирующему ферменту Е2,

р) распознавание конъюгата с убиквитином,

q) перенос и связывание убиквитин-субстратного комплекса с протеасомой,

r) удаление убиквитина или

s) деградацию субстрата.

Термины «протеасомный ингибитор» или «ингибитор убиквитин-протеасомной системы» используют для определения соединения, которое способно взаимодействовать с одним из обычных, измененных, гиперактивных или сверхэкспрессированных компонентов в UPS и ингибировать ее активность, а именно ферментативную активность. Ингибирование ферментативной активности UPS означает снижение способности компонента UPS выполнять свои функции. Предпочтительно, чтобы такое ингибирование было специфичным, т.е. протеасомный ингибитор снижал активность компонента UPS при концентрации ниже концентрации ингибитора, которая требуется для какого-либо другого, несвязанного биологического эффекта. Ингибиторы активности компонента UPS включают в себя, но не ограничены этим:

а) ингибиторы аденилирования Ub или Ulp в результате блокирования доступа к Ub/Ulp к сайту аденилирования или блокирования доступа к АТФ; например, иматиниб (Гливек; Novartis) и т.п.,

b) соединения, разрушающие взаимодействие Е3 или Е3-комплекса с Е2,

c) соединения, мешающие взаимодействию между субстратом и субстрат-взаимодействующим доменом в Е3 и Е3-комплексе, такие как блокирующие взаимодействие между р53 (субстратом) и MDM2 (содержащей RING-палец Е3-лигазой), например, нутлины (которые связывают MDM2), RITA (которое связывает N-конец р53) и т.п.,

d) соединения, разрушающие комплекс Е3-лигазы,

e) искусственные рекрутеры субстратов к убиквитин-лигазам, например протакс и т.п.,

f) ингибиторы протеасомы и ее компонентов, например бортезомиб, карфилзомиб, NPI-0052, Bsc2118 и т.п.,

g) ингибиторы удаления убиквитина/Ulp, такие как ингибиторы металлоизопептидаз RPN11 и CSN5 или

h) модификаторы полиубиквитиновой цепи, например, убистатины и т.п.

Подразумевается, что упоминаемые выше фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот включают в себя терапевтически активные нетоксичные формы солей присоединения кислот, которые способны образовывать соединения формулы (I). Соединения формулы (I), имеющие основные свойства, можно превратить в их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот обработкой указанного основания подходящей кислотой. Подходящие кислоты включают, например, неорганические кислоты, такие как галогеноводородные кислоты, например хлористоводородная или бромистоводородная кислота; серная; азотная; фосфорная и т.п. кислоты; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, трифторуксусная, пропановая, гидроксиуксусная, молочная, пировиноградная, щавелевая, малоновая, янтарная (т.е. бутандионовая кислота), малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая, памовая и т.п. кислоты.

Соединения формулы (I), имеющие кислые свойства, можно преобразовать в их фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований обработкой указанной кислой формы подходящим органическим или неорганическим основанием. Подходящие формы солей оснований включают в себя, например соли аммония, соли щелочных и щелочноземельных металлов, например, соли лития, натрия, калия, магния, кальция и т.п., соли с органическими основаниями, например бензатином, N-метил-D-глюкамином, гидрабаминовые соли и соли с аминокислотами, такими как, например, аргинин, лизин и т.п.

Термины соль присоединения кислоты или основания также включают в себя гидраты и формы с присоединенным растворителем, которые способны образовывать соединения формулы (I). Примерами таких форм являются, например, гидраты, алкоголяты и т.п.

Используемый выше термин стереохимические изомеры соединений формулы (I) определяет все возможные формы соединений из одних и тех же атомов, соединенных одинаковой последовательностью связей, но имеющих различные не взаимозаменяемые трехмерные структуры, которые соединения формулы (I) могут иметь. Если не упомянуто или указано иное, то химическое обозначение соединения охватывает смесь всех возможных стереохимических изомеров, которые указанное соединение может иметь. Указанная смесь может содержать все диастереомеры и/или энантиомеры основной молекулярной структуры указанного соединения. Предполагается, что все стереохимические изомеры соединения формулы (I) как в чистом виде, так и в виде смеси друг с другом находятся в рамках настоящего изобретения.

Некоторые из соединений формулы (I) могут также существовать в своих таутомерных формах. Следует учесть, что хотя такие формы прямо не указаны в приведенной выше формуле, они включены в объем настоящего изобретения.

Подразумевается, что используемый ниже термин «соединения формулы (I)» всегда включает в себя также фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот или оснований и все стереоизомеры.

Особенно предпочтительным протеасомным ингибитором для использования по изобретению является бортезомиб. Бортезомиб доступен в продаже от Millennium под торговым наименованием Velcade, и может быть получен способом, например, описанным в EP 788360, EP 1312609, EP 1627880, US 6066730 и US 6083903 или аналогичным способом.

Настоящее изобретение также относится к комбинациям по изобретению для применения в медицине, например, для ингибирования роста опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также относится к применению комбинаций по изобретению для получения фармацевтической композиции для ингибирования роста опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у человека, который включает в себя введение субъекту эффективного количества комбинации по изобретению.

Это изобретение, кроме того, связано со способом ингибирования аномального роста клеток, включая трансформированные клетки, путем введения эффективного количества комбинации по изобретению. Аномальный рост клеток относится к росту клеток, независимому от обычных механизмов регуляции (например, потере контактного ингибирования). Ингибирование включает ингибирование роста опухолей как непосредственным образом - вызывая остановку роста, терминальную дифференцировку и/или апоптоз у раковых клеток, и непрямым образом - ингибируя миграцию, инвазию и выживание опухолевых клеток или неоваскуляризацию опухолей.

Настоящее изобретение также связано со способом ингибирования роста опухоли путем введения эффективного количества комбинации по настоящему изобретению субъекту, например млекопитающему (и более конкретно, человеку), которому необходимо такое лечение. В частности, это изобретение связано со способом ингибирования роста опухолей путем введения эффективного количества комбинации по настоящему изобретению. Настоящее изобретение в особенности применимо для лечения рака поджелудочной железы, гематопоэтических опухолей лимфоидного ряда, например острого лимфобластоидного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы, хронического В-клеточного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза в бластном кризисе, лимфомы Беркита и множественной миеломы, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы, меланомы, рака предстательной железы, рака молочной железы и рака толстой кишки. Примеры других опухолей, которые можно ингибировать, включают, но не ограничены этим: фолликулярный рак щитовидной железы, миелодиспластический синдром (MDS), опухоли мезенхимального происхождения (например, фибросаркомы и рабдомиосаркомы), тератокарциномы, нейробластомы, глиомы, доброкачественные опухоли кожи (например, кератоакантомы), карциному почек, карциному яичников, карциному мочевого пузыря и эпидермальную карциному.

Изобретение также связано со способом лечения острого лимфобластоидного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы, хронического В-клеточного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза в бластном кризисе, лимфомы Беркита и множественной миеломы путем введения эффективного количества ингибитора гистоновой деацетилазы формулы (I), субъекту, например млекопитающему (и более конкретно, человеку), которому необходимо такое лечение.

Изобретение также связано со способом лечения лекарственно-устойчивых опухолей, таких как, но не ограниченных этим: гематопоэтические опухоли лимфоидного ряда, например лекарственно-устойчивый острый лимфобластоидный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый миелогенный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый промиелоцитарный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый миелоидный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый моноцитарный лейкоз, лекарственно-устойчивая лимфома, лекарственно-устойчивый хронический В-клеточный лейкоз, лекарственно-устойчивый хронический миелоидный лейкоз, лекарственно-устойчивый хронический миелоидный лейкоз в бластном кризисе, лекарственно-устойчивая лимфома Беркита и лекарственно-устойчивая множественная миелома, путем введения эффективного количества ингибитора гистоновой деацетилазы формулы (I), или индивидуально или в комбинации с протеасомным ингибитором, субъекту, например млекопитающему (и более конкретно, человеку), которому необходимо такое лечение. Настоящее изобретение особенно эффективно для лечения лекарственно-устойчивой множественной миеломы, более конкретно, множественной миеломы, устойчивой к протеасомным ингибиторам, еще конкретнее, для лечения устойчивой к бортезомибу множественной миеломы.

Термин «лекарственно-устойчивая множественная миелома» включает в себя, но не ограничен этим: множественную миелому, устойчивую к одному или нескольким лекарственным препаратам, выбранным из группы талидомида, дексаметазона, ревлимида, доксорубицина, винкристина, циклофосфамида, памидроната, мелфалана, дефибротида, преднизона, даринапарзина, белиностата, вориностата, PD 0332991, LBH589, LAQ824, MGCDO103, HuLuc63, AZD 6244, пазопаниба, P276-00, плитидепсина, бендамустина, танеспимицина, энзастаурина, перифозина, ABT-737 или RAD001. Термин «лекарственно-устойчивая множественная миелома» также включает в себя рецидивирующую или рефрактерную множественную миелому.

Под термином «лекарственно-устойчивый» подразумевается состояние, при котором наблюдается первичная устойчивость или приобретенная устойчивость. Под «первичной устойчивостью» подразумевается характерный профиль экспрессии в раковых клетках основных генов важных биохимических путей, включающих, но не ограниченных этим: апоптоз, развитие клетки и восстановление ДНК, которые вносят вклад в более быструю способность к росту раковых клеток по сравнению с такими же нормальными клетками. Под «приобретенной устойчивостью» подразумевается многофакторное явление, возникающее при образовании и развитии опухоли, которое может оказывать влияние на чувствительность раковых клеток к лекарственному препарату. Приобретенная устойчивость может возникнуть в результате нескольких механизмов, таких как, но не ограниченных этим: изменения в мишенях лекарственных препаратов, пониженное накопление лекарственного препарата, изменение во внутриклеточном распределении лекарственного препарата, уменьшение взаимодействия между лекарственным препаратом и его мишенью, увеличенный детоксикационный ответ, нарушение регуляции клеточного цикла, ускорение восстановления поврежденной ДНК и снижение апоптотического ответа. Некоторые из указанных механизмов могут возникнуть одновременно и/или могут взаимодействовать друг с другом. Их активация и/или инактивация могут произойти вследствие генетических или эпигенетических событий или благодаря присутствию онковирусных белков. Приобретенная устойчивость может возникнуть в отношении отдельных лекарственных препаратов, но также может возникнуть устойчивость более широкого спектра в отношении многих разных лекарственных препаратов с различной химической структурой и различными механизмами действия. Эти формы устойчивости называют мультилекарственной устойчивостью.

Комбинацию по изобретению можно использовать для других терапевтических целей,

например:

а) сенсибилизации опухолей к радиационной терапии путем введения соединения по изобретению перед, в течение или после радиоактивного облучения опухоли для лечения рака;

b) лечения артропатий и остеопатологических состояний, таких как ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный артрит, подагра, полиартрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит и системный волчаночный эритематоз;

c) ингибирования пролиферации клеток гладкой мускулатуры, включая сосудистые пролиферативные нарушения, атеросклероз и рестеноз;

d) лечения воспалительных состояний и кожных заболеваний, таких как язвенный колит, болезнь Крона, аллергический ринит, болезнь трансплантат против хозяина, конъюнктивит, астма, ARDS (синдром острой дыхательной недостаточности), болезнь Бехчета, отторжение трансплантата, крапивница, аллергический дерматит, очаговая алопеция, склеродерма, экзантема, экзема, дерматомиозит, угри, диабет, системный волчаночный эритематоз, болезнь Кавасаки, множественный склероз, эмфизема, муковисцидоз и хронический бронхит;

e) лечения эндометриоза, миомы матки, дисфункционального маточного кровотечения и гиперплазии эндометрия;

f) лечения окулярной васкуляризации, включая васкулопатию, затрагивающую сосуды сетчатки и хориоидальные сосуды;

g) лечения сердечных нарушений;

h) ингибирования иммуносупрессорных состояний, таких как лечение инфекций HIV;

i) лечения нарушения работы почек;

j) подавления эндокринных расстройств;

k) ингибирования нарушений глюконеогенеза;

l) лечения нейропатологии, например болезни Паркинсона, или нейропатологии, которая приводит к когнитивному расстройству, например болезни Альцгеймера или полиглутамин-связанных нейрональных заболеваний;

m) лечения психических расстройств, например шизофрении, биполярного расстройства, депрессии, тревожности и психоза;

n) ингибирования нейромускуляторной патологии, например амилотропного латерального склероза;

o) лечения спинальной мышечной атрофии;

p) лечения других патологических состояний, поддающихся лечению путем усиления экспрессии гена;

q) усиления генной терапии;

r) ингибирования адипогенеза;

s) лечения паразитоза, такого как малярия.

Из этого следует, что в настоящем изобретении описаны вышеописанные комбинации для применения в качестве лекарственного средства, а также для применения специфичных к HDAC класса I ингибиторов формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, для изготовления лекарственного средства для лечения одного или нескольких вышеупомянутых состояний.

Поэтому в настоящем изобретении описано применение специфичных к HDAC класса I ингибиторов формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, для изготовления лекарственного средства для лечения острого лимфобластоидного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы, хронического В-клеточного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза в бластном кризисе, лимфомы Беркита и множественной миеломы.

В настоящем изобретении также описано применение специфичных к HDAC класса I ингибиторов формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, для изготовления лекарственного средства для лечения лекарственно-устойчивых опухолей, таких как, но не ограниченных этим: гематопоэтические опухоли лимфоидного ряда, например лекарственно-устойчивый острый лимфобластоидный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый миелогенный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый промиелоцитарный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый миелоидный лейкоз, лекарственно-устойчивый острый моноцитарный лейкоз, лекарственно-устойчивая лимфома, лекарственно-устойчивый хронический В-клеточный лейкоз, лекарственно-устойчивый хронический миелоидный лейкоз, лекарственно-устойчивый хронический миелоидный лейкоз в бластном кризисе, лекарственно-устойчивая лимфома Беркита и лекарственно-устойчивая множественная миелома.

Кроме того, в настоящем изобретении описано применение специфичных к HDAC класса I ингибиторов формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, для изготовления лекарственного препарата для лечения лекарственно-устойчивой множественной миеломы, более конкретно, множественной миеломы, устойчивой к протеасомным ингибиторам, еще конкретнее, для лечения устойчивой к бортезомибу множественной миеломы.

Протеасомный ингибитор и HDAC-ингибитор формулы (I) можно вводить одновременно (например, в отдельных или единых композициях) или последовательно в любом порядке. В последнем случае, период времени введения, количество и способ введения двух соединений должны быть достаточными для достижения благоприятного или синергического эффекта. Очевидно, что предпочтительный способ и порядок введения, соответствующие количества и схемы дозирования для каждого компонента комбинации будут зависеть от конкретных протеасомного ингибитора и HDAC-ингибитора, которые будут вводить, пути введения комбинации, конкретной опухоли, которую будут лечить, и конкретного субъекта, которого будут лечить. Оптимальный способ и порядок введения, а также количество и схему введения могут легко определить опытные специалисты в данной области с использованием стандартных способов и с учетом информации, приведенной в этом описании.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к продукту, содержащему в качестве первого действующего ингредиента - HDAC-ингибитор формулы (I), а в качестве второго действующего ингредиента - протеасомный ингибитор, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении пациентов, страдающих от рака.

Опытные специалисты в данной области могут легко определить эффективное количество по результатам тестирования, представленным ниже. Как правило, предполагается, что терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) и протеасомного ингибитора будет составлять от 0,005 мг/кг до 100 мг/кг веса тела, и, в частности, от 0,005 мг/кг до 10 мг/кг веса тела. Может быть уместно вводить требуемую дозу в виде двух, трех, четырех или больше дробных доз через соответствующие интервалы времени в течение дня. Указанные дробные дозы могут быть разработаны в виде стандартных лекарственных форм, например, содержащих от 0,5 до 500 мг, и, в частности, от 10 мг до 500 мг действующего ингредиента на стандартную лекарственную форму.

Принимая во внимание их эффективные фармакологические свойства, компоненты комбинаций по изобретению, т.е. протеасомный ингибитор и HDAC-ингибитор, можно разработать в виде различных фармацевтических форм для целей введения. Компоненты можно разработать по отдельности в виде индивидуальных фармацевтических композиций или в виде единой фармацевтической композиции, содержащей оба компонента. Ингибиторы HDAC можно получить и разработать в виде фармацевтических композиций способами, известными в данной области, и, в частности, способами, описанными в опубликованном патентном описании, упомянутом в данной описании и включенном посредством ссылки.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей протеасомный ингибитор и HDAC-ингибитор формулы (I) вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями. Для получения фармацевтических композиций для применения по изобретению в качестве действующего ингредиента соединяют эффективное количество конкретного соединения в форме присоединенной соли основания или кислоты в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, причем носитель может иметь любую форму в зависимости от формы препарата, который желательно ввести. Желательно, чтобы фармацевтические композиции представляли собой стандартную лекарственную форму, подходящую, предпочтительно, для перорального, ректального, подкожного введения или парентеральных инъекций. Например, при получении пероральной лекарственной формы можно использовать любую из обычных фармацевтических сред, таких как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п., в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазки, связующие вещества, разрыхлители и т.п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Благодаря тому, что таблетки и капсулы легко вводить, они представляют наиболее эффективные стандартные лекарственные формы для перорального введения, в которых, безусловно, используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель будет обычно содержать стерильную воду, по меньшей мере, значительную часть, хотя в них могут быть включены другие ингредиенты, например, для улучшения растворимости. Можно получить, например, растворы для инъекций, в которых носитель содержит солевой раствор, раствор глюкозы или смесь солевого раствора и раствора глюкозы. Также можно получить суспензии для инъекций, в которых можно использовать подходящие жидкие носители, ресуспендирующие агенты и т.п. В композициях, которые подходят для подкожного введения, носитель, необязательно, содержит усиливающий проникновение в кожу агент и/или подходящий увлажняющий агент, необязательно, объединенные с соответствующими добавками любой природы в незначительном количестве, причем эти добавки не оказывают существенного отрицательного воздействия на кожу. Указанные добавки могут облегчить введение в кожу и/или могут быть полезными при получении желаемых композиций. Введение этих композиций можно осуществить различными путями, например при помощи трансдермального пластыря, точечного нанесения, мази.

Особенно удобно разработать вышеупомянутые фармацевтические композиции в стандартной лекарственной форме для легкости введения и единства дозирования. Стандартная лекарственная форма, используемая в данном описании и формуле изобретения, относится к физически дискретным единицам, которые подходят в качестве разовых доз, причем каждая единица содержит определенное количество действующего ингредиента, рассчитанного для желаемого терапевтического эффекта, совместно с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких стандартных лекарственных форм являются таблетки (включая таблетки с насечкой или покрытые оболочкой таблетки), капсулы, пилюли, порошки в пакетиках, облатки, растворы или суспензии для инъекций, жидкая лекарственная форма в объеме чайной ложки, столовой ложки и т.д., и эти формы в изолированных многодозовых упаковках.

Может быть удобно вводить требуемую дозу каждого компонента комбинации в виде двух, трех, четырех или больше кратных доз через соответствующие промежутки времени в течение курса лечения. Кратные дозы можно разработать в виде стандартных лекарственных форм, например, в каждом случае они могут содержать, независимо, от 0,01 до 500 мг, например, от 0,1 до 200 мг, и, в частности, от 1 до 100 мг каждого действующего ингредиента.

Термин «индукция ацетилирования гистонов или других белков» означает индукцию статуса ацетилирования субстратов HDAC, таких как, но не ограниченных этим, гистоны, например гистон 3, гистон 4 и т.п.; тубулин, например альфа-тубулин и т.п.; белки теплового шока, например Hsp 90 и т.п.

Термин «индукция белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием» означает вторичные эффекты, такие как, но не ограниченные этим, индукцию Hsp70, индукцию р21 и т.п.

Изобретение также относится к способу определения характеристик HDAC-ингибитора формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, который включает в себя определение в образце степени индукции ацетилирования гистонов или других белков, индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием. Конкретнее, изобретение относится к способу определения характеристик HDAC-ингибитора формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, который включает в себя определение в образце степени:

а) индукции ацетилирования гистона 3, индукции ацетилирования гистона 4 или индукции р21, и

b) индукции ацетилирования альфа-тубулина, индукции ацетилирования Hsp 90 или индукции Hsp 70.

Наиболее точно, изобретение относится к вышеописанному способу, в котором концентрация, необходимая для индукции по п. а), ниже концентрации, необходимой для индукции по п. b).

Определение в образце степени индукции ацетилирования гистонов или других белков или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, может охватывать идентификацию пациентов, которые отвечают на лечение, и, поэтому, может обладать благоприятным воздействием при лечении рака человека.

Определение в образце степени индукции ацетилирования гистонов или других белков или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, может охватывать контроль эффективности лечения пациентов и, поэтому, может обладать благоприятным воздействием при лечении рака человека.

Определение в образце степени индукции ацетилирования гистонов или других белков или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, может охватывать прогноз терапевтических ответов на лечение и, поэтому, может обладать благоприятным воздействием при лечении рака человека.

Определение в образце степени индукции ацетилирования гистонов или других белков или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, может охватывать идентификацию пациентов, которые отвечают на лечение, контроль эффективности лечения пациентов и прогноз терапевтических ответов на лечение и, поэтому, может обладать благоприятным воздействием при лечении рака человека.

Поэтому изобретение также относится к применению HDAC-ингибитора формулы (I) или индивидуально, или в комбинации с протеасомным ингибитором, в котором индукция гиперацетилирования гистонов или других белков, или индукция белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, обладает благоприятным воздействием при лечении рака человека.

Образец можно получить из клеток, которые были обработаны указанным HDAC-ингибитором или указанной композицией. Образец также можно получить из пораженной ткани и/или от индивидуума, который принимал HDAC-ингибитор формулы (I) или комбинацию протеасомного ингибитора и HDAC-ингибитора формулы (I).

Клетки могут представлять собой культивированные клетки, которые контактировали с указанным HDAC-ингибитором или указанной комбинацией. Указанный ингибитор или указанную комбинацию можно добавить в ростовую среду для клеток.

Клетки также можно получить из ткани и/или от индивидуума, который получал лечение указанным ингибитором или указанной комбинацией.

Предпочтительно, чтобы способ определения характеристик включал в себя только стадии, которые проводятся in vitro. Поэтому по этому варианту осуществления изобретения стадия получения тканевого материала от человека или животного не охвачена настоящим изобретением.

Обычно клетки обрабатывают до такого состояния, которое подходит для используемого способа определения индукции ацетилирования гистонов или других белков, или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием. Обработка может включать гомогенизирование, экстракцию, фиксацию, промывки и/или стадию образования пор в клеточной мембране («пермеабилизацию»). Метод обработки в основном зависит от способа, используемого для определения индукции ацетилирования гистонов или других белков, или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием. Образец можно получить из биопсии пациента. Биопсию можно дополнительно обработать, чтобы получить образец, подходящий для способа, используемого для определения индукции ацетилирования гистонов или других белков, или индукции белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием.

Степень ацетилирования белков или степень индукции белка можно определить с использованием антител.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» означает иммуноглобулин или его производное, имеющее такую же специфичность связывания. Антитело, используемое по изобретению, может представлять собой моноклональное антитело или антитело, которое получено из поликлональной сыворотки, или которое содержится в ней. Термин «антитело», кроме того, означает производные, такие как Fab-, F(ab')2-, Fv- или scFv-фрагменты. Антитело или его производные могут иметь природное происхождение или могут быть (полу)синтетическими.

Можно использовать Вестерн-блоттинг, широко известный в данной области. Для получения образцов клеточный материал или ткань можно гомогенизировать и обработать денатурирующим и/или восстанавливающим агентами. Далее для разделения белков можно нанести образец на полиакриламидный гель и затем провести перенос на мембрану, или образцы можно точечно нанести на твердый носитель. Затем образец приводят в контакт с антителом. После одной или нескольких промывочных стадий проводят детекцию связанного антитела с использованием методик, известных в данной области.

После фиксации и пермеабилизации тканевого материала (например, срезов солидной опухоли) можно использовать иммуногистохимические методы, а именно инкубируют антитело с образцом, и после одной или нескольких промывочных стадий проводят детекцию связанного антитела.

Степень индукции ацетилирования гистонов или других белков или индукцию белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, можно определить с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Могут быть предусмотрены различные форматы ELISA. В одном формате антитело иммобилизуют на твердую фазу, такую как микротитровочный планшет, с последующей забивкой неспецифических сайтов связывания и инкубацией с образцом. В другом формате сначала образец контактирует с твердой фазой для иммобилизации ацетилированных и/или индуцированных белков, которые содержатся в образце. После забивки и, необязательно, промывки антитело контактирует с иммобилизованным образом.

Степень индукции ацетилирования гистонов или других белков или индукцию белков, функционально регулируемых указанным ацетилированием, можно определить с помощью проточной цитофлуориметрии. Клетки, например клеточную культуру или клетки крови, или клетки костного мозга, фиксируют и пермеабилизуют для того, чтобы позволить антителам достигнуть ацетилированных и/или индуцированных белков. После, необязательно, стадий промывки и забивки, добавляют антитело к клеткам. Затем проводят проточную цитофлуориметрию по протоколам, известным в данной области, для того, чтобы определить клетки, несущие антитело, связанное с ацетилированными и/или индуцированными белками.

Для того чтобы определить активны ли HDAC-ингибитор или комбинация протеасомного ингибитора и HDAC-ингибитора формулы (I), можно определить степень ацетилирования белка или индукции белка в референсном образце, где референсный образец получен из клеток, которых не обрабатывали HDAC-ингибитором или указанной комбинацией. Определение степени ацетилирования белков и/или степени индукции белка в образце и референсном образце можно провести параллельно. В случае клеток из клеточной культуры получают две клеточных композиции, одна из которых обработана указанным HDAC-ингибитором или указанной комбинацией, в то время как другую оставляют без обработки. После обе композиции обрабатывают дальше и определяют соответствующие степень ацетилирования белков и/или количество индукцированных белков. В качестве альтернативы, для того, чтобы определить имеют ли активность HDAC-ингибитор или комбинация протеасомного ингибитора и HDAC-ингибитора формулы (I), можно определить ингибирование пролиферации клеток.

В случае пациентов образец получают от пациента, который получал лечение HDAC-ингибитором формулы (I) или комбинацией протеасомного ингибитора и HDAC-ингибитора формулы (I). Референсный образец получают от другого пациента, страдающего таким же заболеванием, который не получал лечения указанным HDAC-ингибитором или указанной комбинацией, или от здорового индивидуума. Ткань, из которой получают референсный образец, соответствует ткани, из которой получают образец. Например, если образец получают из ткани опухоли пациента с раком молочной железы, то референсный образец также получают из ткани опухоли пациента с раком молочной железы, или из ткани молочной железы здорового индивидуума. Также может быть предусмотрено, что образец и референсный образец получают от одного индивидуума. В этом случае ткань, из которой получают референсный образец получают от индивидуума перед или после лечения индивидуума указанным HDAC-ингибитором или указанной комбинацией. Предпочтительно получать ткань перед лечением, чтобы исключить возможность последствий лечения ингибитором после прекращения лечения.

Экспериментальная часть

А. Фармакологический пример

Для активности в клетках соединений формулы (I), которую определяли на опухолевых клетках A2780 с использованием колориметрического метода анализа на клеточную токсичность или выживание (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983), ссылка дана на экспериментальную часть EP 1485365.

Антипролиферативные эффекты HDAC-ингибиторов связывали с ингибированием ферментов HDAC I класса, который состоит из членов 1-3 и 8 семейства HDAC. Активность R306465 на HDAC1, иммунопреципитированную из клеток A2780, и силу его действия по сравнению с JNJ 26481585, SAHA, LBH-589 и LAQ-824 можно найти в примере А.1. Активность R306465 на рекомбинантную HDAC 8 человека и силу его действия по сравнению с JNJ 26481585, SAHA, LBH-589 и LAQ-824 можно найти в примере А.2.

Далее проводили исследования: способно ли R306465 модулировать статус ацетилирования субстратов HDAC1 - гистона 3 (Н3) и гистона 4 (Н4). Также исследовали индукцию ингибитора циклин-зависимых киназ, p21^waf1,cip1, в клетках A2780 карциномы яичников. Экспрессия p21^waf1,cip1 подавляется в результате ацетилирования гистонов, и играет основную роль в индукции остановки клеточного цикла в ответе на ингибиторы HDAC (см. пример А.3).

Для оценки ингибирования HDAC6 и относительной силы действия соединений на HDAC1 по сравнению с HDAC6 контролировали ацетилирование ее субстрата - тубулина, и индукцию Hsp 70, возникающую вследствие ацетилирования Hsp 90 (см. пример А.3).

Пример А: специфичность действия в отношении HDAC класса I и эффекты на ацетилирование соединений формулы (I)

Пример А.1: ингибирование фермента HDAC1, иммунопреципитированного из клеток A2780

В методах анализа активности HDAC1 проводили иммунопреципитацию HDAC1 из лизатов клеток A2780 и инкубировали с рядом концентраций (для построения концентрационной кривой) указанного ингибитора HDAC и с [³H]ацетил-меченным фрагментом пептида Н4 (50000 расп./мин) [биотин-(6-аминогексановая кислота)Gly-Ala-(ацетил[³H]Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH₂] (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Активность HDAC оценивали, измеряя высвобождение свободных ацетильных групп. Результаты представлены как средние величины IC₅₀±SD для трех независимых экспериментов.

  IC ₅₀ (ингибирование HDAC1), нМ R306465 3,31±0,78 JNJ 26481585 0,16±0,02 SAHA 73±26 LAQ-824 0,29±0,05 LBH-589 0,23±0,06

Пример А.2: ингибирование рекомбинантного фермента HDAC8 человека

Для ингибирования рекомбинантной HDAC8 человека использовали HDAC 8 Colorimetric/Flourimetric Activity Assay/Drug Discovery Kit (Biomol; номер в каталоге AK-508). Результаты представлены как средние величины IC₅₀±SD для трех независимых экспериментов. Анализы проводили в дупликатах и стандартную ошибку для IC₅₀ вычисляли при помощи Graphpad Prism (Graphpad Software).

  IC ₅₀ (ингибирование HDAC1), нМ R306465 23±17 JNJ 26481585 34±41 SAHA 370±314 LAQ-824 37±23 LBH-589 283±29

Пример А.3: ацетилирование клеточных субстратов HDAC1 и индукция p21^waf1,cip1

Клетки A2780 карциномы яичников человека инкубировали с 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нМ соединений в течение 24 часов.

Получали тотальные клеточные лизаты и анализировали их на ДСН-ПААГ. Уровни ацетилированных гистонов Н3 и Н4, общее количество белка Н3 и уровень белка p21^waf1,cip1 определяли, используя соответствующие разведения кроличьих поликлональных и мышиных моноклональных антител с последующей детекцией методом усиленной хемилюминесценции (ECL). Детекцию количества ацетилированных Н3 и Н4 проводили антителами от Upstate Biotechnology (номера в каталоге 06-299 и 06-866), общее количество белка H3 определяли с помощью антител от Abcam (номер в каталоге abl791), а уровень белка p21^waf1,cip1 определяли с помощью антител от Transduction Laboratories (номер в каталоге C24420). Антитела инкубировали или 1-2 часа при комнатной температуре, или в течение ночи при 4°С. Для контроля одинакового наноса на гель связанные антитела удаляли с мембраны, и затем мембраны повторно инкубировали с мышиными моноклональными IgM против актина (Ab-1, Oncogene Research Products); для контроля эффективности выделения ядерных белков удаляли связанные антитела с блотов и повторно инкубировали их с антителами против ламина В1 (Zymed; номер в каталоге 33.2000). Проводили визуализацию комплексов белок-антитело посредством хемилюминесценции (Pierce Chemical Co) или флуоресценции (Odyssey) согласно инструкциям изготовителей. Эксперименты проводили три раза.

  Концентрация (нМ), при которой наблюдается индукция ацетилирования гистона Н3 и Н4 и индукция p21 ^waf1,cip1 R306465 100 JNJ 26481585 10 SAHA 3000 LAQ-824 10 LBH-589 10

Пример А.4: ацетилирование тубулина и индукция Hsp 70

Клетки A2780 карциномы яичников человека инкубировали с 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нМ соединений в течение 24 часов.

Получали тотальные клеточные лизаты и анализировали их на ДСН-ПААГ. Уровень общего и ацетилированного тубулина определяли с помощью антител от Sigma: клона DM1A (номер в каталоге T9026) и клона 6-111B (номер в каталоге T6793). Детекцию белка Hsp70 проводили антителами от Stressgen (номер в каталоге SPA-810), с последующей детекцией с помощью ECL. Антитела в соответствующем разведении инкубировали или 1-2 часа при комнатной температуре, или в течение ночи при 4°С.

Для контроля одинакового наноса на гель связанные антитела удаляли с мембраны, и затем мембраны повторно инкубировали с мышиными моноклональными IgM против актина (Ab-1, Oncogene Research Products). Для контроля эффективности выделения ядерных белков удаляли связанные антитела с блотов и повторно инкубировали их с антителами против ламина В1 (Zymed; номер в каталоге 33.2000). Проводили визуализацию комплексов белок-антитело посредством хемилюминесценции (Pierce Chemical Co) или флуоресценции (Odyssey) согласно инструкциям изготовителей. Эксперименты проводили три раза.

  Концентрация (нМ), при которой наблюдается начало индукции ацетилирования тубулина и индукция Hsp70 R306465 1000 JNJ 26481585 30 SAHA 100 LAQ-824 30 LBH-589 30

Пример B: ингибирование пролиферации клеток гематологической опухоли человека

Оценку анти-пролиферативной активности R306465 на ряде клеточных линий гематологических опухолей человека проводили в компании Oncodesign (Dijon, France). Опухолевые клетки растили в клеточной суспензии в соответствующей подходящей культуральной среде при 37°С в инкубаторе с 5% содержанием СО₂ и поддерживаемой влажностью. Свободные от микоплазмы клетки опухоли высевали в 96-луночный микротитровочные планшеты с плоским дном лунок и инкубировали при 37°С в течение 24 часов в культуральной среде, содержащий 10% FCS (фетальной бычьей сыворотки). Затем опухолевые клетки обрабатывали носителем (контроль) или увеличивающимися концентрациями R306465 (5 различных концентраций*), Бортезомибом (5 различных концентраций*) или комбинацией этих двух соединений в различных соотношениях. Затем клетки инкубировали дополнительные 72 часа. Цитотоксическую активность соединения (соединений) выявляли стандартным MTS-анализом, измеряя поглощение при 490 нм. Взаимодействие соединений (синергизм, аддитивность или антагонизм) вычисляли методом анализа эффекта множества лекарственных соединений и проводили с помощью принципа равенства медиан по методике, описанной Chou & Talalay [CHOU et al. (1984) Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55; CHOU et al. (1991) in Encyclopaedia of human Biology. Academic Press. 2: 371-379; CHOU et al. (1991) in Synergism and antagonism in chemotherapy. Academic Press: 61-102; CHOU et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86: 1517-1524].

*: на основе предварительного определения анти-пролиферативной активности каждого лекарственного соединения, используемого как одиночный агент, выбирали концентрации, которые не превышали степень ингибирования 50% в каждой из выбранных клеточных линий.

Пример B.1: ингибирование пролиферации клеток гематологических опухолей человека с помощью R306465.

Таблица F.1 Результаты представлены в виде средней величины IC₄₀ (т.е. концентрации, выраженной в нМ, которая требуется для того, чтобы достичь 40% ингибирования пролиферации клеток)±SD, определенной из трех независимых достоверных экспериментов Клеточная линия Тип Среднее SD CCRF-CEM Острый лимфобластоидный лейкоз 78,79 42,19 Клон Е6-1 линии Jurkat Острый лимфобластоидный лейкоз 56,19 26,36 KG-1 Острый лимфобластоидный лейкоз 170,59 61,64 MOLT-4 Острый миелогенный лейкоз 155,83 140,81 SUP-B15 Острый лимфобластоидный лейкоз 15,67   HL-60 Острый промиелоцитарный лейкоз 86,76 25,11 OCI-AML2 Острый миелоидный лейкоз 267,92 321,41 THP-1 Острый моноцитарный лейкоз 446,29 226,25 EHEB Хронический В-клеточный лейкоз 486,62 318,18 BV-173 Хронический В-клеточный лейкоз 26,33 13,03 K-562 Хронический миелоидный лейкоз 80,76 50,47 KCL-22 Хронический миелоидный лейкоз 89,88 56,58 LAMA-84 Хронический миелоидный лейкоз в бластном кризисе 165,89 75,19 U-937 Лимфома 154,68 30,07 Daudi Лимфома Беркита 454,11 368,54 Namalwa Лимфома Беркита 49,25 23,17 Raji Лимфома Беркита 221,09 88,12 Ramos Лимфома Беркита 66,08 34,68 ARH-77 Миелома 207,27 117,10 RPMI 8226 Миелома 37,59 22,94

Пример B.2: ингибирование пролиферации клеток гематологических опухолей человека Бортезомибом.

Таблица F.2 Результаты представлены в виде средней величины IC₄₀ (т.е. концентрации, выраженной в нМ, которая требуется для того, чтобы достичь 40% ингибирования пролиферации клеток)±SD, определенной из трех независимых достоверных экспериментов Клеточная линия Тип Среднее SD CCRF-CEM Острый лимфобластоидный лейкоз 4,40 0,84 Клон Е6-1 линии Jurkat Острый лимфобластоидный лейкоз 5,63 2,68 KG-1 Острый миелогенный лейкоз 3,36 0,83 MOLT-4 Острый лимфобластоидный лейкоз 12,14 12,91 SUP-B15 Острый лимфобластоидный лейкоз 2,40   HL-60 Острый промиелоцитарный лейкоз 13,38 1,99 OCI-AML2 Острый миелоидный лейкоз 11,64 11,61 ТНР-1 Острый моноцитарный лейкоз 5,83 0,94 ЕНЕВ Хронический В-клеточный лейкоз 6,02 0,34 BV-173 Хронический В-клеточный лейкоз 2,77 0,20 К-562 Хронический миелоидный лейкоз 12,83 4,11 KCL-22 Хронический миелоидный лейкоз 1,74 1,56 LAMA-84 Хронический миелоидный лейкоз в бластном кризисе 2,61 0,46 U-937 Лимфома 5,68 1,07 Daudi Лимфома Беркита 2,68 0,54 Namalwa Лимфома Беркита 4,48 1,00 Raji Лимфома Беркита 5,20 0,69 Ramos Лимфома Беркита 1,83 0,10 ARH-77 Миелома 7,21 2,22 RPMI 8226 Миелома 4,23 0,99

Пример В.3: ингибирование пролиферации клеток гематологических опухолей человека с помощью R306465 совместно с Бортезомибом.

Таблица 3 Результаты выражены в виде среднего Объединенного Индекса (CI±SD) медианных значений CI в каждом отдельном исследовании (3 независимых достоверных эксперимента) и вычислены из каждого индивидуального соотношения в комбинации. Величина CI ниже 0,9 указывает на «синергизм» (светло-серый цвет), CI от 0,91 до 1,09 указывает на «аддитивность» (белый цвет); а CI выше 1,1 указывает на «антагонизм» (темно-серый)   Среднее SD CCRF-CEM 0,93 0,11 Клон Е6-1 линии Jurkat 1,32 0,27 KG-1 0,90 0,20 MOLT-4 0,81 0,06 SUP-B15 0,75 0,03 HL-60 1,01 0,11 OCI-AML2 0,70 0,17 THP-1 0,87 0,06 EHEB 1,07 0,06 BV-173 0,83 0,06 K-562 0,88 0,25 KCL-22 0,90 0,20 LAMA-84 1,08 0,09 U-937 0,65 0,22 Daudi 0,95 0,15 Namalwa 0,76 0,05 Raji 0,55 0,02 Ramos 1,31 0,14 ARH-77 0,91 0,09 RPMI 8226 0,84 0,19

Группа изобретений относится к медицине и касается комбинации протеасомного ингибитора и ингибитора гистоновой деацетилазы для ингибирования роста/пролиферации опухолевых клеток. Предложена новая комбинация, в которой протеасомным ингибитором является бортезомиб, а ингибитором гистоновой деацетилазы является R306465

Также предложено применение этой комбинации для изготовления лекарственного средства для ингибирования роста/пролиферации опухолевых клеток, в том числе клеток гематологических опухолей. Группа изобретений обеспечивает новую комбинацию с терапевтическим потенциалом, обладающую синергетическим эффектом ингибирования пролиферации клеток гематологических опухолей человека. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 пр.

1. Комбинация протеасомного ингибитора и ингибитора гистоновой деацетилазы для ингибирования роста/пролиферации опухолевых клеток, в которой протеасомным ингибитором является бортезомиб, а ингибитором гистоновой деацетилазы является R306465 (соединение №6)

2. Комбинация по п.1 в форме фармацевтической композиции, содержащий протеасомный ингибитор бортезомиб и ингибитор гистоновой деацетилазы R306465 совместно с одним или несколькими фармацевтическими носителями.

3. Комбинация по п.1 для одновременного, раздельного или последовательного применения.

4. Комбинация по любому из пп.1-3 для применения в качестве лекарственного средства, ингибирующего рост гематологической опухоли.

5. Применение комбинации по любому из пп.1-4 для изготовления лекарственного средства для ингибирования роста/пролиферации опухолевых клеток.