СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОМЫ С ДИСПЛАЗИЕЙ III СТЕПЕНИ И РАННЕЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ТОЛСТОЙ КИШКИ Российский патент 2017 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в патологической анатомии, медицинской диагностике и для медицинских исследований, в частности для дифференциальной диагностики аденомы толстой кишки с дисплазией III степени и ранней аденокарциномы.

Существует способ диагностики злокачественной опухоли, разработанный на примере ткани молочной железы (Патент США US 5042494 А, заявка № US 07/449,510 от 04.12.1989, опубл. 27.08.1991). Способ заключается в следующем. В качестве объекта исследования используют нативный биопсийный материал. Фрагменты исследуемой ткани подвергают флуориметрическому исследованию. Для чего проводят регистрацию спектров возбуждения флуоресценции на длине волн регистрации 520, 550 и 600 нм в диапазоне от 300 до 500 нм. После этого проводят сравнение интенсивности полос флуоресценции исследуемой ткани на длинах волн 352, 396, 457.9, 473, 488, 514.5 нм с таковыми для стандартных опухолевых и здоровых тканей.

Недостатки данного способа:

1) неспецифичность за счет большого количества полос флуоресценции в опухолевой и здоровой ткани молочной железы;

2) субъективность из-за большой области перекрывания полос флуоресценции на длинах волн регистрации 520, 550 и 600 нм и, как следствие, отсутствие возможности выделения свечения определенных эндогенных флуорофоров;

3) неприменимость для новообразований толстой кишки.

Также существуют способы дифференциальной диагностики между эпителиальной дисплазией III степени и началом малигнизации на гистологических срезах в сомнительных для патоморфолога случаях, основанные на определении одного из проявлений злокачественности - инвазивного роста. Способы, требующие проведения иммуногистохимического исследования с определением маркеров базальной мембраны, таких как коллаген IV типа, описаны для эндометрия и шейки матки (Furness P.N., Lam E.W.H. Patterns of basement membrane deposition in benign, premalignant, and malignant endometrium // Journal of Clinical Pathology. - 1987. - N40. - P. 1320-3; Stewart C.J., McNicol A.M. Distribution of type IV collagen immunoreactivity to assess questionable early stromal invasion// Journal of Clinical Pathology. - 1992. - N45, Vol. 1. - P. 9-15; Pinto G.A., Vassallo J., Andrade L.A., Magna L.A. Immunohistochemical study of basement membrane collagen IV in uterine cervix carcinoma.// Sao Paulo Med Journal. - 1998. - N 116, Vol. 6. - P 1846-1851). Для молочной железы аналогами являются маркеры миоэпителиальных клеток и коллагена XI типа, alpha 1 (Raymond W.A., Leong A. S.-Y. Assessment of invasion in breast lesions using antibodies to basement membrane components and myoepithelial cells // Pathology. - 1991. - Vol. 23, Issue 4. - P. 291-297; Freire J., Dominguez-Hormaetxe S., Pereda S., De Juane A. et al. Collagen, type XI, alpha 1: An accurate marker for differential diagnosis of breast carcinoma invasiveness in core needle biopsies // Pathology - Research and Practice. - 2014. - N210. - P. 879-884).

Недостатками данных способов являются:

1) неспецифичность за счет появления дефектов в базальных мембранах и при начальной инвазии, и при carcinoma in situ;

2) субьективность;

3) необходимость дорогостоящего оборудования, моноклональных антител, навыков приготовления микропрепаратов для иммуногистохимического исследования,

4) необходимость обязательной фиксации фрагментов ткани в забуференном формалине для проведения иммуногистохимического исследования;

5) исчезновение участка, подозрительного на инвазию, после приготовления параллельного среза для иммуногистохимического исследования после обзорной микроскопии с окраской гематоксилином и эозином;

6) невозможность оценки состояния базальной мембраны в случае поверхностной биопсии.

Недостатком методов является невозможность дифференциальной диагностики между аденомой с дисплазией III степени и ранней аденокарциномой толстой кишки на биопсийном материале, приготовленном в виде гистологических срезов. Поэтому сделать однозначное заключение о диагнозе, выбрать оптимальную тактику ведения пациентов с новообразованием весьма затруднительно, что существенно влияет на прогноз.

Техническим результатом предлагаемого способа является объективизация верификации диагноза у пациента в случае подозрения на начальную малигнизацию аденомы толстой кишки при гистологическом исследовании биопсийного материала новообразования.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что неокрашенные депарафинированные гистологические срезы новообразованя толстой кишки, приготовленные путем стандартной парафиновой проводки, подвергают флуориметрическому исследованию, поместив на кварцевое стекло, измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 220 до 390 нм при длине волны регистрации 410 нм с последующим сравнением спектров, испускаемых исследуемым фрагментом ткани, со спектрами доброкачественных и злокачественных новообразований толстой кишки.

Способ основан на выявлении биохимического атипизма, который является ранним проявлением злокачественной трансформации клеток на молекулярном уровне. Методом достижения технического результата является измерение спектров возбуждения флуоресценции от 220 до 390 нм при длине волны регистрации 410 нм. На фиг. 1 изображены типичные спектры возбуждения флуоресценции здоровой слизистой толстого кишечника, тубулярной аденомы, тубуло-ворсинчатой аденомы, высокодифференцированной аденокарциномы и умереннодифференцированной аденокарциномы. На фиг. 2 изображен пример разложения спектра возбуждения флуоресценции методом Гауссово-Лоренцевых кривых (Маряхина B.C. Оптические методы в химии, биологии и медицине. М: Флинта: Наука, 2015. - 144 с.).

Способ осуществляют следующим образом.

Фрагмент новообразования толстой кишки, полученный во время колоноскопии путем проведения биопсии, подвергают стандартной парафиновой проводке (Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. Спб.: Спецлит, 2010. - 96 с.). После окраски гематоксилином и эозином и обзорной микроскопии отбирают случай, подозрительный на начальную малигнизацию, для которого гистологическое исследование не может дать однозначного диагноза. С парафинового блока готовят параллельный срез толщиной 6-7 мкм без окрашивания гематоксилином и эозином, депарафинируют его в гексане в течение 3 мин, помещают на кварцевое стекло, не окрашивая, и измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 220 до 390 нм при длине волны регистрации 410 нм на спектрофлуориметре SOLAR СМ-2203. На графиках фиг. 1 изображены типичные спектры возбуждения флуоресценции здоровой слизистой толстого кишечника, тубулярной аденомы, тубуло-ворсинчатой аденомы, высокодифференцированной аденокарциномы и умереннодифференцированной аденокарциномы. Все спектры имеют сложную структуру, состоящую из двух четко выраженных максимумов: первый на 260-270 нм и второй 330-340 нм. По мере развития патологии соотношение между максимумами уменьшается.

Для анализа спектров необходимо разложить их на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых. На фиг. 2 приведен пример такого разложения типичного спектра. Кривая 1 представляет собой интенсивность света, после поглощения которого произойдет ионизация молекул флуорофоров исследуемой ткани. Кривые 2 и 3 характеризуют свечение эндогенных флуорофоров исследуемой ткани. Кривая 4 характеризует рассеянный свет. Кривая 5 характеризует измеренный спектр, который разложили на составляющие. После разложения спектра на составляющие необходимо вычислить отношение интенсивности максимумов кривых 2 и 3 I₂/I₃, полученное после разложения спектров возбуждения флуоресценции тканей различных новообразований толстой кишки, где где I₂ - это интенсивность флуоресценции кривой 2, I₃ - это интенсивность флуоресценции кривой 3, что характеризует стадию развития патологического процесса.

В таблице (Фиг. 3) приведены отношения между интенсивностями максимумов кривых 2 и 3. Наибольшее значение I₂/I₃ наблюдается для здоровой ткани. Величины для тубулярной и тубуло-ворсинчатой аденом близкие по значению, поскольку и с гистологической точки зрения они являются доброкачественными новообразованиями с несколько различной гистоархитектоникой. Наименьшее значение имеют величины для злокачественных опухолей - аденокарцином. Интенсивности их максимумов практически равны между собой. Если значение I₂/I₃ более 1,26, то делают заключение о аденоме с дисплазией III, если 1,25 и меньше - о ранней аденокарциноме.

Метод основан на выявлении биохимического атипизма, который является ранним проявлением злокачественной трансформации клеток на молекулярном уровне. Благодаря селективному свечению флуорофоров (никотинамиддинуклеотида и коллагена) на длине волны 410 нм удается выявить радикальные отличия в спектрах возбуждения флуоресценции разных видов тканей.

Пример 1. Пациентка К., 56 лет. В сигмовидной кишке во время колоноскопии обнаружено образование 0,7-0,8 см в диаметре на узком основании в виде псевдоножки, с гладкой гиперемированной поверхностью (рисунок ямок желез III тип по Kudo). Образование удалено, прислано на гистологическое исследование с клиническим диагнозом: «Аденома сигмовидной кишки». Гистологическая верификация диагноза была затруднительной, дифференциальная диагностика проводилась между тубуло-ворсинчатой аденомой с дисплазией 3 степени и начальными проявлениями малигнизации аденомы. После консультации гистологический диагноз: «Тубуло-ворсинчатая аденома, дисплазия III».

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂/I₃ составляет 1,15, что соответствует умереннодифференцированной аденокарциноме, то есть в данном случае имеет место гиподиагностика ранней аденокарциномы патологоанатомами.

Пример 2. Пациентка Ф., 64 года. Во время колоноскопии в прямой кишке обнаружено неподвижное крупнобугристое образование округлой формы диаметром 3,0 см, с незначительной контактной кровоточивостью. Из поверхностных отделов образования выполнена биопсия с диагнозом: «Полип прямой кишки, малигнизация?» материал направлен на гистологическое исследование. Дифференциальный диагноз проводился также между тубуло-ворсинчатой аденомой и начальными проявлениями малигнизации. Окончательный гистологический диагноз сформулирован как: «Тубуло-ворсинчатая аденома с очаговой интрамукозальной малигнизацией (в 1-м поле зрения)».

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂/I₃ составляет 1,27, что соответствует тубулярно-ворсинчатой аденоме, соответственно, гистологический диагноз отражает гипердиагностику аденокарциномы.

Пример 3. Пациентка С., 78 лет, в анамнезе резекция сигмовидной кишки по поводу умереннодифференцированной аденокарциномы сигмовидной кишки. На расстоянии 5-8 см от ануса передняя стенка кишки во время колоноскопии уплотненная, бугристая. Выполнена биопсия, материал направлен на патологоанатомическое исследование с диагнозом: «Неопластический процесс в прямой кишке?». Результаты гистологического исследования: тубулярно-ворсинчатая аденома, дисплазия III. Высокий риск малигнизации.

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂/I₃ составляет 1,3, что соответствует тубулярно-ворсинчатой аденоме.

Данным способом исследовано 80 колонобиоптатов, из них гистологическое исследование однозначно установило диагноз тубулярной аденомы в 20 случаях, тубуло-ворсинчатой аденомы в 22 случаях, в 8 случаях диагноз высокодифференцированной аденокарциномы и в 13 случаях диагноз умереннодифференцированной аденокарциномы, 11 случаях - диагноз слизистой толстой кишки без новообразований; способ был использован для дифференциальной диагностики аденомы с дисплазией III степени и ранней аденокарциномы в 16 случаях.

Данный способ является информативным, более чувствительным, по сравнению с гистологическим исследованием, поскольку рассматривает патологические процессы на молекулярном уровне; достоверным, нетрудоемким, экономичным вследствие предварительного отбора лишь сложных случаев, не приводит к затягиванию инвазивной манипуляции - колоноскопии, сопровождающейся неприятными ощущениями для пациента, и не требует присутствия специалиста-спектроскописта во время проведения манипуляции.

Изобретение относится к медицине и касается способа дифференциальной диагностики аденомы с дисплазией III степени и ранней аденокарциномы толстой кишки, включающего исследование биоптатов новообразования толстой кишки, где гистологический срез биоптата новообразования толстой кишки подвергают флуориметрическому исследованию, измеряя спектры возбуждения флуоресценции с последующим сравнением спектров, испускаемых исследуемым фрагментом ткани, со спектрами доброкачественных и злокачественных новообразований толстой кишки. Изобретение обеспечивает информативность, большую чувствительность по сравнению с гистологическим исследованием, достоверность, нетрудоемкость, экономичность. 3 ил., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики аденомы с дисплазией III степени и ранней аденокарциномы толстой кишки, включающий исследование биоптатов новообразования толстой кишки, отличающийся тем, что гистологический срез биоптата новообразования толстой кишки подвергают флуориметрическому исследованию, измеряя спектры возбуждения флуоресценции с 220 до 390 нм при длине волны регистрации 410 нм с последующим сравнением спектров, испускаемых исследуемым фрагментом ткани, со спектрами доброкачественных и злокачественных новообразований толстой кишки, если значение отношения интенсивности максимумов кривых 2 и 3, полученных методом Гауссово-Лоренцевых кривых и характеризующих свечение эндогенных флуорофоров исследуемой ткани, I₂/I₃ более 1,26, то делают заключение о аденоме с дисплазией III степени, если 1,25 и меньше - о ранней аденокарциноме.