Способ пробоподготовки биологического материала кала для определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий Российский патент 2017 года по МПК G01N1/28 

Предлагаемое изобретение относится к области клинической медицины, более конкретно к работам по определению паразитологических агентов в клиническом материале кале адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением с разработанной пробоподготовкой биологического материала к проведению исследований.

До настоящего времени в паразитологических лабораториях при определении цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале кал применяют метод эфир-формалиновой или уксусной седиментации, обладающий очень низкой чувствительностью - 100% выявляемостью яиц и личинок гельминтов, 30-40% цист лямблий, ооцисты криптоспоридий не выявляются.

Известен способ определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале кале, включающий отбор проб биологического материала кала, пробоподготовку биологического материала к исследованию и исследование (Метод эфир-формалиновый или уксусной сегментации и в консервант Турдыева см. Методические указания МУК 4.2.3145-13).

Известный способ трудоемок и низкоэффективен для определения цист лямблий и не позволяет определить наличие ооцист криптоспоридий.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является повышение эффективности определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий паразитологическими лабораториями в биологическом материале кале.

Технический результат достигается тем, что в способе определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале кале адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, включающий отбор проб биологического материала кала, пробоподготовку биологического материала к исследованию и исследование, осуществляют объединенный отбор проб трехкратным сбором пробы кала нативного или кала, отобранного в консерванте, а пробоподготовку осуществляют водным суспензированным раствором с дистиллированной водой, при этом отобранная проба перемешивается встряхиванием или стеклянной палочкой, суспензируется в центрифужную стандартную пробирку объемом 10.0 мл, с дальнейшей фильтрацией, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 оборотов в мин, затем надосадочную жидкость удаляют и исследуют осадок, не более 1 мл, при большем объеме осадка его ресуспензируют дистиллированной водой и далее обрабатывают как 2 и более порции, для подсчета интенсивности заражения исследуется весь объем полученного осадка, в зависимости от объема диагностического осадка применяют от 1 до 3 магнитных пробирок, затем проводят определение цист лямблий и ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных от 8 до 14 мкм в длину от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Таким образом, благодаря разработанной методике пробоподготовки биологического материала кала для определения в цист лямблий и ооцист криптоспоридий, отличающейся методикой сбора объединенной пробы кала, состоящей из трехкратной пробы кала нативного или кала, отобранного в консерванте Турдыева и других консервантах, а также тем, что в предлагаемой системе пробоподготовки биологического материала к исследованию заменяют эфир-формалиновой или уксусной седиментацией, при применении которой используются химические соединения 2 класса опасности (эфир и формалин или ледяная уксусная кислота) на водный суспензированный раствор с дистиллированной водой с проведением дальнейших процедур связывания и промывки, диссоциации и идентификации цист лямблий и ооцист криптоспоридий методом иммунофлуоресцентного мечения, позволяющие долгосрочное хранение готовых препаратов и сокращение времени исследования до 15 минут.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

В пробу биологического материала кала, состоящую из пробы свежего нативного кала или трехкратной пробы кала, отобранную в консервант Турдыева и др. консерванты, добавляют дистиллированной воды до достижения общего установленного нормативными документами объема пробы 8 мл, тщательно перемешивают встряхиванием или стеклянной палочкой; проба суспензируется в центрифужную пробирку объемом 10.0 мл путем фильтрования через воронку с двумя слоями марли или металлическими или пластмассовыми ситечками. Пробирки центрифугируют экспериментально подобранным временем 2 мин при стандартном количестве оборотов центрифуги 1500 оборотов в минуту. Из полученной взвеси пипеткой удаляют надосадочную жидкость. В случае получения большого объем осадка его ресуспензируют дистиллированной водой и далее обрабатывают как 2 и более порции. Для подсчета интенсивности заражения исследуется весь объем полученного осадка. В зависимости от объема диагностического осадка применяют 1-3 магнитных пробирок. Образовавшийся диагностический осадок исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением. Результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных от 8 до 14 мкм в длину от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Предполагаемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Подготовка к исследованию пробы кала, собранного в консервант

Для определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий методом эфир-формалиновым (или уксусной) седиментацией применяют реактивы, относящиеся к группе высокотоксичных химических соединений; метод трудоемкий, время, затраченное на выполнение метода, составляет 15 мин на пробоподготовку и 5 мин на учет результатов, препараты не хранятся.

В способе пробоподготовки для проведения дальнейшего исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением не применяют реактивы, относящиеся к группе высокотоксичных химических соединений, трудоемкость метода составляет 15 мин на пробоподготовку и 2-3 мин на учет результатов, препараты хранятся несколько месяцев (Таблица 1).

На Фиг. 1. Схематично представлено изображение пробоподготовки клинического материала кала к адоптированному методу адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением.

Пример 2. Выявляемость цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале кале в экспериментальной серии заражения

Для определение специфичности способа пробоподготовки для проведения дальнейшего исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением использовали экспериментальные модели с искусственным заражением натурного материала.

Метод эфир-формалиновой (или уксусной) седиментации: эффективность метода в экспериментальной серии исследований составила 36% - выявляемости цист лямблий и ооцист криптоспоридий не обнаружены.

Эффективность способ пробоподготовки для проведения дальнейшего исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением в экспериментальной серии исследований составила 100% цист лямблий, 100% - ооцист криптоспоридий (Таблица 2).

Пример 3. Выявляемость цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале кале из нативного материала

Метод эфир-формалиновой (или уксусной) седиментации: эффективность метода в собственных исследованиях составила 35±2,8 цисты лямблий.

Эффективность способа пробоподготовки для проведения дальнейшего исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением метода в собственных исследованиях составила 35±2,8 цисты лямблий, 4.0±2,2 ооцисты криптоспоридий.

При исследовании 650 проб натурного материала 2 способами установлена 100% эффективность метода способа пробоподготовки для проведения дальнейшего исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением при определении цист лямблий и ооцист криптоспоридий (табл. 3).

Новым этапом усовершенствования общепринятого метода лабораторных исследований биологического материала (кал) явились разработка и применение сорбентов с магнитными свойствами при выделении и идентификации различных микроорганизмов и их антигенов. Магнитоиммуносорбенты используют в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов. Широкий диапазон исследуемых проб (от нескольких миллилитров до многих кубических метров жидкостей), возможность исследования сильно загрязненных объектов позволит проводить более качественную диагностику паразитарных заболеваний и значительно расширит возможности эпидемиологического мониторинга оценки риска здоровья населения паразитарными заболеваниями. Для проведения исследования пробы кала методом иммунофлуоресцентным мечением разработана методика пробоподготовки, которая исключает применение реактивов, относящихся к группе высокотоксичных химических соединений, менее трудоемка в исполнении и обеспечивает 100% эффективность определения в пробах яиц и личинок гельминтов, цист лямблий и ооцист криптоспоридий в каждой пробе.

Изобретение относится к области клинической медицины, более конкретно к работам по определению паразитологических агентов в клиническом материале – кале адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением. Способ пробоподготовки биологического материала кала для проведения определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением включает отбор свежего нативного кала или трехкратной пробы кала, отобранного в консервант, добавление дистиллированной воды, тщательное перемешивание встряхиванием или стеклянной палочкой, фильтрование в центрифужную пробирку объемом 10 мл, центрифугирование в течение 10 мин при 1500 об/мин, затем надосадочную жидкость удаляют и исследуют осадок не более 1 мл, при большем объеме осадка, его ресуспензируют дистиллированной водой и далее обрабатывают как 2 и более порции, для подсчета интенсивности заражения исследуется весь объем полученного осадка. 3 табл., 1 ил., 3 пр.

Способ пробоподготовки биологического материала кала для проведения определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением, включающий отбор проб биологического материала кала, пробоподготовку биологического материала, отличающийся тем, что осуществляют отбор свежего нативного кала или трехкратной пробы кала, отобранного в консервант, добавляют дистиллированную воду, тщательно перемешивают встряхиванием или стеклянной палочкой, фильтруют в центрифужную пробирку объемом 10 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, затем надосадочную жидкость удаляют и исследуют осадок не более 1 мл, при большем объеме осадка его ресуспензируют дистиллированной водой и далее обрабатывают как 2 и более порции, для подсчета интенсивности заражения исследуется весь объем полученного осадка.