СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НИЗКОИНВАЗИВНЫХ ТРЕМАДОЗОВ ГЕПАТО-БИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано при лабораторной диагностике гельминтозов желудочно-кишечного тракта, в частности печеночных трематодозов.

Трематодозы гепато-билиарной системы человека - группа природно-очаговых биогельминтозов, антропозоонозов, вызываемых трематодами, зонами облигатного паразитирования которых у человека являются внутрипеченочные желчные протоки, внепеченочные желчевыводящие пути и протоки поджелудочной железы.

Из практики медицины известен метод уксусно-эфирной седиментации (УЭС), который используется в качестве специального метода для диагностики трематодозов (включая описторхоз), в том числе при инвазиях низкой степени (Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов. Методические указания. МУК 4.2.735-99. Минздрав России. М., 2003. Стр. 13-15).

Суть метода УЭС заключается в том, что смесь эмульгированной при помощи раствора уксусной кислоты взвеси фекалий и диэтилового эфира в соотношении 3:2 подвергается центрифугированию с целью послойного осаждения (седиментации). Осадок после удаления надосадочной жидкости и "каловой пробки" содержит яйца и личинки гельминтов, цисты и ооцисты простейших, а также незначительное количество частиц фекалий с удельным весом более 1, т.е. тяжелее воды. При использовании метода УЭС возможно выявление яиц гельминтов при их низкой концентрации в биоматериале (1 и более яиц в 1 г фекалий). Однако широко распространены гельминтозы, при которых концентрация яиц в фекалиях ниже пороговой для этого метода (низкоинвазивные терматодозы гепато-билиарной системы). Кроме того, наличие артефактов затрудняет поиск и визуализацию мелких яиц трематод. Попытки увеличить объем исследуемых фекалий более стандартного в УЭС (более 1 г) приводят к увеличению объема получаемого осадка, увеличению в осадке содержания артефактов, невозможности получить тонкий и прозрачный мазок.

В качестве прототипа принят известный химико-седиментационный метод (ХСМ) исследования фекалий, который является наиболее близким к предлагаемому (Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов. Методические указания. МУК 4.2.735-99. Минздрав России. М., 2003. Стр. 15-16). Химико-седиментационный метод имеет преимущество перед аналоговым (УЭС) в том, что позволяет уменьшить количество артефактов в полученных мазках с помощью дополнительной обработки осадка химическими реактивами. Суть ХСМ заключается в том, что этапу, принципиально аналогичному УЭС, предшествует дополнительный этап флотационного осаждения, заключающийся в том, что эмульгированная при помощи уксусной кислоты взвесь фекалий подвергается центрифугированию в смеси с насыщенным раствором азотно-кислого натрия с удельным весом 1,15. После центрифугирования удаляется надосадочная жидкость, полученный осадок повторно центрифугируется в смеси с раствором уксусной кислоты и диэтилового эфира (аналогично УЭС). По чувствительности он не превосходит УЭС, т.к. количество исследуемых фекалий составляет 0,5-1 г, но

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности диагностики низкоинвазивных трематодозов гепато-билиарной системы.

Поставленная в изобретении цель достигается тем, что к 2 г. фекалий добавляют 10 мл 5%-ной уксусной кислоты, взвесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1,5 мин, сливают надосадочную жидкость вместе с верхней половиной осадка, к оставшейся половине осадка добавляют 5 мл 1%-ной уксусной кислоты и 4 мл диэтилового эфира, повторно центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2 мин, полученный в результате осадок исследуют.

Предлагаемым способом достигается следующий положительный эффект:

1. Чувствительность метода повышается, т.к. количество исследуемых фекалий в 2-4 раза больше, чем в прототипе.

2. Дополнительный этап первичной седиментации позволяет механически (путем сливания) уменьшить объем осадка наполовину и более, дополнительно эмульгировать взвесь фекалий и обесцветить ее. Полученные мазки более тонкие, обесцвеченные, прозрачные, облегчается визуализация мелких (менее 20 мкм), с тонкой оболочкой, слабо окрашенных яиц.

3. По сравнению с прототипом используются более дешевые реактивы (уксусная кислота вместо азотно-кислого натрия).

4. Уменьшается трудоемкость (отсутствует этап приготовления рабочего раствора азотно-кислого натрия с заданным удельным весом, т.е. порционное растворение реактива в горячей воде с постоянным нагреванием на плите и постоянным помешиванием до полного растворения, а также необходимость регулярно контролировать ареометром постепенно снижающийся удельный вес приготовленного рабочего раствора).

5. Сокращается время проведения диагностики (1 центрифугирование в течение 1,5 мин вместо 5 мин).

Таким образом, предлагаемый метод является более эффективным по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

1 этап: В одноразовый градуированный до 12 мл пластиковый флакон наливают 10 мл 5%-ной уксусной кислоты, помещают 2 г фекалий, доводя уровень до метки 12 мл, размешивают стеклянной палочкой. Интенсивно встряхивают до образования однородной взвеси. Дают постоять 2 мин. Профильтровывают взвесь через двойной слой марли в градуированную центрифужную пробирку.

2 этап: Центрифугируют 1,5 мин при 1500 об/мин. Сливают надосадочную жидкость.

Затем удаляют верхнюю рыхлую сливаемую часть осадка переворачиванием пробирки так, чтобы осадок уменьшился наполовину. В случае образования осадка однородной плотности верхнюю половину осадка удаляют с помощью стеклянной палочки. Яйца гельминтов, цисты и ооцисты простейших, будучи тяжелее воды, при центифугировании остаются в нижней части осадка.

3 этап: К оставшейся части осадка (около 1 мл) добавляют 5 мл 1%-ной уксусной кислоты, размешивают, добавляют 4 мл диэтилового эфира. Закрывают пробкой. Интенсивно встряхивают пробирку, держа ее в горизонтальном положении, в течение 30 сек. Повторно центрифугируют 2 мин при 1500 об/мин. При этом образуются 3 слоя: верхний - "каловая пробка", средний - надосадочная жидкость с эфиром, нижний - осадок. Далее осторожно отделяют "каловую пробку" от стенок пробирки стеклянной палочкой, затем сливают надосадочную жидкость вместе с эфиром и "каловой пробкой". К оставшемуся осадку добавляют каплю 50%-ного глицерина, размешивают, равномерно распределяют на предметном стекле. Готовый мазок микроскопируют.

Предлагаемый метод используется для первичной диагностики гельминтозов и протозоозов желудочно-кишечного тракта в клинической лаборатории "Лабмед" с 2008 года по настоящее время и зарекомендовал себя как надежный и в то же время достаточно дешевый и нетрудоемкий способ, особенно в диагностически сложных случаях: при подозрении на низкоинвазивные состояния, микст-инвазии, неполную паразитологическую излеченность.

Заявленные преимущества предлагаемого метода при массовом и продолжительном практическом использовании позволили придти к следующим результатам:

1. Чувствительность предлагаемого метода выше, поэтому выявляемость низкоинвазивных трематодозов становится лучше. Повышение выявляемости трематодозов гепато-билиарной системы у обследованного контингента приводит к выводу о распространенности инвазий низкой и крайне низкой степени, так как на одного инвазированного со средней и высокой степенью инвазии приходится не менее 20-30 инвазированных низкой степени.

Сравнительная чувствительность предлагаемого и аналогового (УЭС) методов в отношении трематодозов гепато-билиарной системы:

количество обследованных одновременно обоими методами 94 количество выявленных инвазий при использовании УЭС 38 количество выявленных инвазий при использовании предлагаемого метода 49

2. Техническая возможность лабораторной диагностики инвазий низкой и крайне низкой степени меняет представление о структуре паразитарной заболеваемости. Обнаружено, что инвазированность описторхидозами на территории РТ выше инвазированности всеми остальными гельминтозами, включая ларвальные (исключая энтеробиоз), вместе взятыми.

3. При использовании аналога и прототипа попытка увеличить объем исследуемых фекалий приводит к недостаточной тонкости и прозрачности мазков, соответственно, визуализация и идентификация мелких яиц описторхид технически затруднительна. Это исключено при использовании предлагаемого метода. Обнаруживаемые стойкие морфологические отличия яиц позволяют предположить распространенность не менее 6-7 видов и подвидов трематод.

4. Предлагаемый метод позволяет существенно увеличить частоту встречаемости мелких (менее 20 мкм), слабо окрашенных яиц с тонкой оболочкой, невизуализируемой структурой мирацидия, плохо различимой крышечкой, что затруднительно при использовании аналога и прототипа.

5. Предлагаемый метод позволяет обнаружить зависимость между морфологией яиц и чувствительностью к стандартным методам дегельминтизации.

6. Предлагаемый метод приобретает ценность для контроля паразитологической излеченности. Так, из 20 пролеченных, у которых предлагаемый метод контроля дал положительный результат (обнаружение яиц), аналоговые методы (УЭС) дали положительный результат у 14 пролеченных, у 6 - отрицательный результат.

Следующие клинические наблюдения иллюстрируют ценность выявления инвазий низкой и крайне низкой степени:

Пример 1. Больной Ш., 10 лет. Направлен аллергологом с диагнозом: рецидивирующий отек Квинке. Рецидивирующая крапивница. Паразитологический диагноз: низкоинвазивный трематодоз гепато-билиарной системы (меторхоз).

Пример 2. Больной К., 46 лет. Направлен гастроэнтерологом с диагнозом: хр. гепатит неуточненной этиологии с синдромом холестаза, цитолитическим синдромом, умеренной гепато-спленомегалией. Паразитологический диагноз: микст-инвазия низкой степени (описторхоз + меторхоз). Хр. вторичная инфекция вирусом Эпштейна-Барр.

Пример 3. Больной С, 36 лет. Направлен дерматологом с диагнозом: папилломатоз гладкой кожи. Паразитологический диагноз: хр. низкоинвазивный описторхоз. Приобретенная дисфункция иммунной системы. Хр. папилломавирусная инфекция.

Пример 4. Больной К., 5 лет. Направлен офтальмологом с диагнозом: рецидивирующий фибринозно-пластический увеит. Паразитологический диагноз: хр. низкоинвазивный описторхоз. Хр. лямблиоз. Вторичное иммунодефицитное состояние. Хр. герпесвирусная + цитомегаловирусная инфекция. Хр. хламидийная инфекция.

Пример 5. Больная П, 52 года. Направлена гастроэнтерологом с диагнозом: хр. холецистит, панкреатит. Хр. энтероколит неуточненной этиологии. Паразитологический диагноз: хр. низкоинвазивный описторхоз. Хр. лямблиоз. Хр. изоспороз.

Пример 6. Больной В., 12 лет. Направлен аллергологом с диагнозом: бронхиальная астма, атопическая, средней степени тяжести. Аллергический риносинусит круглогодичный. Атопический дерматит ограниченный. Паразитологический диагноз: хр. низкоинвазивный описторхоз. Хр. лямблиоз. Токсокароз, висцеральная форма.

Применение предлагаемого метода.

Метод двойной седиментации предназначен для первичной диагностики низкоинвазивных печеночных трематодозов, а также для мониторинга паразитологической излеченности.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики трематодозов. При лабораторном исследовании к 2 г фекалий добавляют 10 мл 5%-ной уксусной кислоты. Взвесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1,5 мин. Полученный осадок уменьшают наполовину механически путем сливания верхней рыхлой половины. К оставшемуся осадку добавляют 5 мл 1%-ной уксусной кислоты и 4 мл диэтилового эфира, который повторно центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2 мин. Полученный в результате осадок исследуют. Заявленный способ высокоэффективен для первичной диагностики низкоинвазивных печеночных трематодозов, а также для мониторинга паразитологической излеченности. 6 пр.

Способ диагностики низкоинвазивных тремадозов гепато-билиарной системы, включающий двойное центрифугирование взвеси фекалий с последующим сливом надосадочной жидкости, отличающийся тем, что к 2 г фекалий добавляют 10 мл 5%-ной уксусной кислоты, взвесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1,5 мин, сливают надосадочную жидкость вместе с верхней половиной осадка, к оставшейся половине осадка добавляют 5 мл 1%-ной уксусной кислоты и 4 мл диэтилового эфира, повторно центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2 мин, полученный в результате осадок исследуют.