Метод седиментации для диагностики криптоспоридиоза Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, к работе по выявлению ооцист криптоспоридий в фекалиях. Сущность изобретения заключается в разработке усовершенствованного седиментационного метода для увеличения достоверности прижизненной диагностики криптоспоридиоза.

Криптоспоридиоз относится к остро протекающим зоонозным заболевания молодняка. Болеют домашние и дикие животные, в том числе человек. Возбудителем являются простейшие из рода Cryptosporidium. У млекопитающих заболевание вызывают различные виды: Cryptosporidium parvum, C. bovis, C. ryanae, C. andersoni, C. muris, C. ubiquitum, C. meleagridis, C. xiaoi, C. suis-like и т.д. Первые пять видов относятся к наиболее распространенным среди крупного рогатого скота, тогда как другие встречались изредка [11, 12, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 28, 29].

Криптоспоридиоз имеет широкий диапазон распространения как в развивающихся, так и в развитых странах. Например, в Бразилии ЭИ составляет в среднем 25,7 %, в Малайзии - 12,5 %, в Иране - 22,3 %, в Китае от 11,9 % до 17 %, в Эфиопии от 11 % до 21 %, в Онтарио достигает до 78 %. В России ЭИ по данным многих авторов варьирует от 11,5 до 92 % [3, 4, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28].

Данное заболевание представляет собой серьезную проблему для животноводства, вызывает поражение желудочно-кишечного тракта у молодняка с первых дней жизни и до 6 месяцев (иногда до года). При этом повреждается эпителий кишечника, что приводит к снижению всасывания питательных веществ, обезвоживанию, осложнению течения основных вирусных или бактериальных инфекций, снижению прироста живой массы до 55 % (относительно здоровых животных), а так же может вызывать гибель животных. Таким образом, хозяйства несут значительный экономический ущерб [2, 3, 5, 11, 11, 15, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28].

Криптоспоридиоз клинически схож с другими заболеваниям, которые характеризуются поражением пищеварительного тракта, поэтому необходимо особое внимание уделять его диагностике [2, 23].

Диагноз на криптоспоридиоз обычно ставится микроскопическими (копроскопическими) методами обнаружения ооцист паразита, которые широко используются за счет простоты и доступности. Так же данными методами можно проводить предварительное исследование фекалий для дальнейшего молекулярного анализа [2, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28].

Самым простым и доступным методом диагностики является приготовление мазков из свежих фекалий. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят каплю фекалий, разбавляют каплей физиологического раствора и распределяют тонким слоем. Полученный мазок можно сразу микроскопировать, либо его высушивают при комнатной температуре и окрашивают. Данный метод позволяет быстро без лишних затрат провести исследование, но обладает низкой достоверностью. Ооцисты криптоспоридий бесцветные, шаровидные или яйцевидные, в поле зрения их заметить сложно за счет их крайне малого размера. Эффективность метода нативного мазка низкая, всего 46 %, ооцисты встречаются не во всех полях зрения. При добавлении раствора сахарозы или при окрашивании мазков, криптоспоридии становятся визуально заметнее, но просмотр проб затрудняет большое количество детритного материала [2, 4, 5, 6, 10, 13, 16, 21, 28].

Для увеличения эффективности выявления ооцист криптоспоридий используют различные методы обогащения: флотации и седиментации.

При флотационных методах пробу фекалий заливают небольшим количеством флотационного раствора (насыщенный раствор хлорида натрия, сульфата цинка, аммиачной селитры, сахара, смесь Павласека, раствор Бреза). Тщательно размешивают палочкой, добавляют раствор до краев стакана, фильтруют через сито и отстаивают в течение 15-20 мин. Затем металлической петлей снимают 15-20 капель с поверхностной пленки, переносят на предметное стекло и микроскопируют, либо делают тонкий мазок, который высушивают на воздухе и окрашивают. Для повышения эффективности данной методики применяют центрифугирование в сочетании с флотацией [2, 5, 6, 10, 12, 13, 18, 19].

Недостатком данной методики является то, что флотационные растворы могут приводить к морфологическим и структурным изменениям ооцист (приобретают форму полушара или полукруга, а иногда и разрушатся), исключение составляет только раствор сахарозы, который позволяет сохранять оболочку ооцист криптоспоридий [6, 10, 14, 16].

Для обогащения проб при диагностике на криптоспоридиоз используют метод седиментации с центрифугированием. Фекалии процеживают через 2-слойную марлю в центрифужные пробирки в количестве 1 мл, добавляют до уровня 10 мл воды и центрифугируют в течение 4 минут при 1500 об./мин. В последующем надосадочную жидкость сливают, из полученного осадка делают мазки и исследуют под микроскопом. Метод седиментации центрифугированием повышал выявление ооцист криптоспоридий до 64 %, но осадок на дне пробирки был значительным, что затрудняет выявление ооцист. Для повышения эффективности в данной методике предлагают использовать в качестве детергента поверхностно-активные вещества (перколл, 0,3 % раствор стирального порошка «Самара» или «Миф»), это позволяет увеличить чувствительность данного метода [1, 2, 4, 6, 11].

Широко используют в практике для диагностики криптоспоридиоза методы эфирной седиментации в различном сочетании (водно-эфирная, уксусно-эфирная, формалин-эфирная). Данные методы обладают хорошей эффективностью (от 76 до 86 %) и позволяют увеличить концентрацию ооцист в пробе, благодаря воздействию эфира или его смеси с уксусом (формалином) частицы непереваренного корма эмульгируют, а жироподобные вещества растворяются и ооцисты осаждаются на дно. Однако вместе с ооцистами осадок содержит большое количество микроорганизмов, спор, простейших, что затрудняет диагностику, при этом ооцисты морфологически были слабодифференцированы. Для устранения данного недостатка Мехова О. С. с соавторами предложила к седиментированному осадку добавлять раствор сахарозы, далее центрифугировать в течение 5 минут при 1,5 тыс. об./мин. Поверхностную пленку переносят на предметное стекло и микроскопируют. Сочетание седиментации и флотации позволяет очистить поле зрения от примеси непереваренных частиц корма, микроорганизмов и простейших, при этом ооцисты морфологически легко диагностируются [2, 4, 6, 13, 21].

Кириллов Е. Г. с соавторами в модифицированном методе исследования предлагают фекалии телят фильтровать через марлю в центрифужную пробирку, после добавляют воду до уровня 10 мл, центрифугируют в течение 3-х минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают и к осадку добавляют 7 мл 4 % раствора молочной кислоты, перемешивают, затем вливают 2 мл этилового эфира, встряхивают в течение 5-10 сек и центрифугируют в течение 2-х минут при 1500 об/мин, после коагулянт и надосадочную жидкость сливают, а осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Использование молочной кислоты для суспензирования фекалий позволяет увеличить эффективность исследования до 96 %, так же молочная кислота усиливает проникающее свойство красителя в тело паразита [4, 6, 21, 23].

Несмотря на высокую эффективность методов эфирной седиментации при их применении используются химические соединения 2 класса опасности (эфир, формалин, ледяная уксусная кислота), так же эфир является прекурсором, что значительно усложняет процесс использования, за счет ограничения доступа к данным средствам.

Исходя из вышеизложенного поиск эффективных и доступных методов исследования на выявление ооцист криптоспоридий остается актуальным на данный момент.

Усовершенствование способов диагностики протозоозов позволит своевременно выявлять их в хозяйствах, что является залогом успешной борьбы с ними и позволит снизить экономические потери.

Нами был усовершенствован метод седиментации, с целью улучшении выявления ооцист криптоспоридий в пробах фекалий и повышения достоверности прижизненной диагностики.

Техника проведения усовершенствованного метода седиментации для диагностики криптоспоридиоза у животных заключается в следующем. Берут фекалии исследуемых животных весом 1 гр, можно использовать как свежие пробы фекалий, так и консервированные 2,5 % раствором бихромата калия, помещают в ступку, добавляют 5 мл воды дистиллированной и 1 мл моющего средства «Италмас». Пробу тщательно растирают в ступке и процеживают через двойной слой марли в центрифужные пробирки и доводят дистиллированной водой до объема 10 мл. Центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты, далее надосадочную жидкость сливают, в последующем к осадку добавляют 10 мл 5 % муравьиной кислоты, осадок ресуспендируют стеклянной палочкой и центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты. Надосадочную жидкость сливают, из полученного осадка делают мазки, если осадок получался в большом количестве, то его делят на 2 и более частей.

Настоящее изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

При разработке усовершенствованного метода диагностики криптоспоридиоза особое внимание уделяли материалам для проведения исследования, обращали внимание на их безопасность и доступность.

В качестве детергента было выбрано моющее средство «Италмас», в состав которого входят анионные и амфотерные поверхностно-активные вещества. При выборе вещества используемого для суспезирование фекалий, провели сравнительное исследование муравьиного спирта и 5% муравьиной кислоты.

В ходе проведения исследования пробу фекалии разделяли на 2 части и помещали по 1 гр в ступки, добавляли 5 мл воды дистиллированной и 1 мл моющего средства «Италмас», далее пробу тщательно растирали в ступке и процеживали через двойной слой марли в центрифужные пробирки и дистиллированной водой доводя объем до 10 мл. Центрифугировали при 1500 об/мин 4 минуты, затем надосадочную жидкость сливали, в последующем к осадку в первой пробирке добавляли 10 мл муравьиного спирта, а во вторую - 10 мл 5 % муравьиной кислоты. Осадок ресуспендировали стеклянной палочкой и центрифугировали при 1500 об/мин 4 минуты. Надосадочную жидкость сливали, из полученного осадка делали мазки и окрашивали по Цилю-Нильсену. Сравнительные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты копроовоскопического исследования при использовании муравьиного спирта и 5 % муравьиной кислоты

Наименование исследования ЭИ, % ИИ, экз усовершенствованный метод с муравьиным спиртом 85 % 1 усовершенствованный метод с 5 % муравьиной кислотой 97 % 12

В усовершенствованном методе с муравьиным спиртом ЭИ составила 85 %, при этом ИИ была 1 экз. в поле зрения. При использовании в качестве суспезирующего вещества 5 % раствор муравьиной кислоты ЭИ увеличилась до 97 %, а ИИ составила 12 экз. в поле зрения.

Пример 2

Сравнительное изучение диагностической эффективности при криптоспоридиозе телят проводилось между нашим усовершенствованным методом седиментации с «Италмасом» и 5 % муравьиной кислотой, модифицированным методом исследования Кирилова Е. Г. с соавторами и методом седиментации по Красильникову в модификации Красновой О.П. (таблица 2).

Таблица 2. Сравнительная оценка постановки методов определения ооцист криптоспоридий в биологическом материале (фекалии)

Усовершенствованный метод седиментации с муравьиной кислотой Модифицированный метод седиментации по Кириллову Е. Г. с соавторами [6] Метод седиментации по Красильникову в модификации Красновой О. П. [9] 1. Пробу фекалий помещают в ступку в количестве 1 гр 2. добавляют дистиллированную воду 5 мл, моющее средство «Италмас» 1 мл и тщательно растерают 2. добавляют воду и тщательно растерают 3. процеживают через двойной слой марли в центрифужные пробирки и доводят дистиллированной водой до объема 10 мл 4. центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты 4. центрифугируют в течение 3-х минут при 1500 об/мин 4. центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты 5. надосадочную жидкость сливают 6. к осадку добавляют 10 мл 5% муравьиной кислоты, осадок ресуспендируют стеклянной палочкой 6. к осадку добавляют 7 мл 4 % раствора молочной кислоты, перемешивают, затем вливают 2 мл этилового эфира, закрывают пробкой, встряхивают в течение 5-10 сек 6. к осадку добавляют до уровня 10 мл 0,3 % стирального порошка «Самара», осадок ресуспендируют стеклянной палочкой 7. центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты 7. центрифугируют в течение 2-х минут при 1500 об/мин. 7. центрифугируют в течение 3-х минут при 1500 об/мин 8. Надосадочную жидкость сливают, из полученного осадка делают мазки

Предлагаемый нами усовершенствованный метод выявления ооцист криптоспоридий совмещает в себе использование детергента, в виде ПАВ моющего средства «Италмас» и седеминтирующего вещества - муравьиной кислоты, что позволяет наиболее эффективно очистить исследуемый материал от частичек детрита и освободить ооцисты.

В таблице 3 приведены результаты сравнительного исследования эффективности проводимых диагностических методов.

Материалом для исследования служили 15 проб фекалий от больных криптоспоридиозом телят. Все пробы исследовали тремя методами.

Таблица 3. Сравнительная оценка эффективности методов диагностики криптоспоридиоза

Наименование исследования ЭИ, % ИИ, экз Усовершенствованный метод седиментации с муравьиной кислотой 97 18 Модифицированный метод седиментации по Кириллову Е.Г. с соавторами 95 15 Метод седиментации по Красильникову в модификации Красновой О.П. 91 13

Было установлено, что степень инвазированности криптоспоридиозом составила в предлагаемом нами методе с использованием 5 % муравьиной кислоты 97 %, в поле зрения ооцисты легко диагностировались.

В модифицированном методе Красновой О.П. ооцисты были слабо дифференцированны.

Разработанный нами усовершенствованный метод седиментации показал свою высокую эффективность, относительно аналогичных методов исследования, так же при постановке данного метода не используются вещества, относящиеся ко 2 классу опасности.

Список литературы:

1. Данко М.М. Сравнительная оценка копроскопических методов диагностики криптоспоридиоза крупного рогатого скота / М.М. Данко, А.Л. Тишин, Р.В. Хомяк // Науковий вісник Львівського національного університету ветеринарної медицинита біотехнологій імені С.З. Ґжицького. - 2016. - Т. 18, №3-1(70). - С. 71-73.

2. Диагностика криптоспоридиоза телят [Текст]: методические рекомендации / М.Ш. Акбаев, Н.В. Есаулова, О.Е. Давыдова, С.А. Шемякова, Д.Н. Шемяков. - М.: ФГОУВПО «МГАВМиБ им. К.И. Скрябина», 2004. - 14 с.

3. Дмитриева Е.Л. Распространение возбудителя криптоспоридиоза в природных и синантропных биоценозах Центрально-Черноземной зоны (на примере Курской области): специальность 03.00.19: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Дмитриева Екатерина Леонидовна. - Курск, 2008. - 128 с.

4. Кириллов Е.Г. Криптоспоридиоз телят в Республике Татарстан: эпизоотология, диагностика, патоморфология и терапия: специальность 03.02.11: диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Кириллов Евгений Геннадьевич. - Казань, 2017. - 146 с.

5. Кириллов Е.Г. Криптоспоридиоз: общая характеристика и особенности его распространения / Е.Г. Кириллов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2014. - Т. 218. - №2. - С. 128-131.

6. Кириллов Е.Г. Усовершенствование копроскопического метода диагностики криптоспоридиоза телят / Е.Г. Кириллов, Д.Г. Латыпов // Ветеринарный врач. - 2016. - №1. - С. 39-43.

7. Кириллов Е.Г. Эпизоотология криптоспоридиоза в Республике Татарстан / Е.Г. Кириллов, Д.Г. Латыпов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2015. - Т. 223. - №3. - С. 93-96.

8. Климова Е.С. Инвазированность крупного рогатого скота эндопаразитозами в зависимости от категории хозяйств / Е.С. Климова // Ветеринарная патология. - 2022. - №2(80). - С. 14-18.

9. Климова Е.С. Распространенность возбудителя Cryptosporidium parvum в синантропных биоценозах / Е.С. Климова // Международный вестник ветеринарии. - 2022. - №4. - С. 70-76.

10. Климова Е.С. Сравнительный анализ методов диагностики криптоспоридиоза крупного рогатого скота / Е.С. Климова, Т.В. Бабинцева // Вклад молодых ученых в реализацию приоритетных направлений развития аграрной науки: материалы Национальной науч.-прак. конф. молодых ученых (Ижевск, 17-19 ноября 2021 г.). - Ижевск, 2021. - С. 135-139.

11. Краснова О.П. Криптоспоридиоз телят и меры борьбы с ним: специальность 03.00.19: диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Краснова Оксана Петровна. - Саратов, 2000. - 125 с.

12. Кряжев А.Л. Криптоспоридиоз телят в хозяйствах молочной специализации Северо-Запада России (Эпизоотология, клиническая картина, терапия и профилактика): специальность 06.02.02: диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Кряжев Андрей Леонидович. - Москва, 2005. - 152 с.

13. Мехова О.С. Криптоспоридиоз лабораторных мышей (методы диагностики) / О.С. Мехова // Животноводство и ветеринарная медицина. - 2016. - №1. - С. 38-41.

14. Никитин Н.Ф. Копроскопическая диагностика криптоспоридиоза и эймериоза телят / Н.Ф. Никитин // Ветеринария. - 2002. - №9. - C. 27-31.

15. Решетникова А.Д. Влияние кишечных кокцидиозов на прирост массы тела молодняка крупного рогатого скота / А.Д. Решетникова, Е.С. Климова // Российский паразитологический журнал. - 2023. - Т. 17. - №1. - С. 99-104.

16. Calf-level risk factors for neonatal diarrhea and shedding of Cryptosporidium parvum in Ontario dairy calves / Lise A. Trotz-Williams, S. Wayne Martin, Kenneth E. Leslie, Todd Duffield, Daryl V. Nydam, Andrew S. Peregrine // Preventive Veterinary Medicine. - 15 November 2007. - Vol. 82. - Issues 1-2. - P. 12-28.

17. Cryptosporidium Infection and Associated Risk Factors among Cattle in the Central Region of Ghana / K. Dankwa, P. K. Feglo, S. V. Nuvor, M. Aggrey-Korsah, M. Mutocheluh // Journal of Parasitology Research. - 2021. - Vol. 2021. - P. 1-8.

18. Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in feces and water and the associated exposure factors on dairy farms / R.D. Toledo, F.D. Martins, F.P. Ferreira, J.C. de Almeida, L. Ogawa, H.L. Dos Santos, M.M. Dos Santos, F.A. Pinheiro, I.T. Navarro, J.L. Garcia, R.L. Freire // PLoS One. - 2017. - Vol. 12(4). - e0175311.

19. Ebiyo A. Prevalence and Factors Associated with Cryptosporidium Infection in Calves in and around Nekemte Town, East Wollega Zone of Ethiopia / A. Ebiyo, G. Haile // Veterinary Medicine International. - 17 Feb. 2022. - Vol. 2022. - 1468242.

20. Epidemiology of Cryptosporidium infection in cattle in China: a review / C. Gong, X.F. Cao, L. Deng, W. Li, X. M. Huang, J.C. Lan, Q.C. Xiao, Z.J. Zhong, F. Feng, Y. Zhang, W.B. Wang, P. Guo, K.J. Wu, G.N. Peng // Parasite. - 2017. - Vol. 24:1.

21. Gerace E. Cryptosporidium Infection: Epidemiology, Pathogenesis, and Differential Diagnosis / E. Gerace, V.D.M. Lo Presti, C.Biondo // European Journal of Microbiology and Immunology. - 2019. - Vol. 9(4). - P. 119-123.

22. Helmy Y. A. Cryptosporidiosis: From Prevention to Treatment, a Narrative Review / Y.A. Helmy, H.M. Hafez // Microorganisms. - 2022. - Vol. 10. - Issue 12. - 2456.

23. Long-term production effects of clinical cryptosporidiosis in neonatal calves / Hannah J. Shaw, Elisabeth A. Innes , Liam J. Morrison, Frank Katzer, Beth Wells // International Journal for Parasitology. - May 2020. - Vol. 50. - Issue 5. - P. 371-376.

24. Mirzai Y. Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium andersoni infection in naturally infected cattle of northwest Iran / Y. Mirzai, M. Yakhchali, K. Mardani // Vet Res Forum. - 2014. - Vol. 5(1). - P. 55-60.

25. Molecular detection and epidemiological risk factors associated with Cryptosporidium infection among cattle in Peninsular Malaysia / D.A. Abdullah, S.D. Ola-Fadunsin, K. Ruviniyia, F.I. Gimba, P. Chandrawathani, Y.A.L. Lim, F.F.A. Jesse, R.S.K. Sharma // Food and Waterborne Parasitology. - March 2019. - Vol. 14. - e00035.

26. Prevalence of Cryptosporidium in dairy cattle in China during 2008-2018: A systematic review and meta-analysis / Y. Cai, N.Z. Zhang, Q.L. Gong, Q. Zhao, X.X. Zhang // Microbial Pathogenesis. - 2019. - Vol. 132. - P. 193-200.

27. Prevalence of infection by Cryptosporidium spp. in calves and associated risk factors in Northeastern Brazil / A.I. Conceição1, L.P.S. Almeida, L.O. Macedo, C.L. Mendonça, L.C. Alves, R.A.N. Ramos, G.A. Carvalho // Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. - 2021. - Vol. 73. - № 1. - P. 34-40.

28. Prevalence, risk factors and molecular characterization of Cryptosporidium infection in cattle in Addis Ababa and its environs, Ethiopia / A. Manyazewal, S. Francesca, M. Pal, M. Gezahegn, M. Tesfaye, M. Lucy, W. Teklu, T. Getachew // Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports. - August 2018. - Vol. 13. - P. 79-84.

29. Tarekegn Z.S. Cryptosporidium infection in cattle and humans in Ethiopia: A systematic review and meta-analysis / Z.S. Tarekegn, Y. Tigabu, H. Dejene // Parasite Epidemiology and Control. - August 2021. - Vol. 14. - e00219.

Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии и может быть использовано для выявления ооцист криптоспоридий в пробах фекалий. Проводят метод седиментации, при этом 1 г пробы фекалий помещают в ступку и приливают 5 мл дистиллированной воды, после добавляют 1 мл моющего средства «Италмас». Пробу тщательно растирают в ступке и процеживают через двойной слой марли в центрифужные пробирки, после чего дистиллированной водой доводят объем до 10 мл и центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты. Далее надосадочную жидкость сливают и приливают 10 мл 5% муравьиной кислоты, осадок ресуспендируют и вновь центрифугируют 7 при 1500 об/мин 4 минуты. Надосадочную жидкость сливают и получившийся осадок наносят на предметное стекло и выявляют ооцисты криптоспоридий. Изобретение обеспечивает высокую эффективность, относительно аналогичных методов исследования, также при постановке данного метода не используются вещества, относящиеся ко 2 классу опасности. 3 табл., 2 пр.

Способ выявления ооцист криптоспоридий в пробах фекалий, включающий проведение метода седиментации, отличающийся тем, что 1 г пробы фекалий помещают в ступку и приливают 5 мл дистиллированной воды, после добавляют 1 мл моющего средства «Италмас», пробу тщательно растирают в ступке и процеживают через двойной слой марли в центрифужные пробирки, после чего дистиллированной водой доводят объем до 10 мл и центрифугируют при 1500 об/мин 4 минуты, далее надосадочную жидкость сливают и приливают 10 мл 5% муравьиной кислоты, осадок ресуспендируют и вновь центрифугируют 7 при 1500 об/мин 4 минуты, надосадочную жидкость сливают и получившийся осадок наносят на предметное стекло и выявляют ооцисты криптоспоридий.