Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C12Q1/14 C12R1/01 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения питательных сред для транспортировки и ускоренного выделения возбудителя некробактериоза животных.

Сохранение жизнеспособности микроорганизмов, вызвавших то или иное инфекционное заболевание, в период от момента взятия биоматериала до посева является важной, а зачастую, сложной задачей для практической ветеринарной микробиологии, так как в большинстве случаев время от момента взятия биоматериала до начала исследования лимитировано. Одним из элементов, содействующих сохранению специфического возбудителя при доставке в ветеринарную лабораторию, является применение специальных транспортных сред, которая, с одной стороны, должна обеспечить сохранение жизнеспособности микроорганизма, причем не менее чем на 8-12 ч при комнатной температуре, и в то же время предупредить или в значительной степени лимитировать размножение микроорганизмов, в том числе и при транспортировки F. necrophorum.

F. necrophorum - микроорганизм, который вызывает тяжелое инфекционное заболевание у животных с поражением преимущественно дистальных частей конечностей.

Необходимо сохранить жизнеспособность возбудителя некробактериоза F. necrophorum, который вне хозяина быстро погибает, особенно при условии конкурентного роста менее требовательных микроорганизмов, а также при создании неблагоприятных условий.

В ветеринарной практике для транспортировки патологического материала в лабораторию используют 30%-ный раствор глицерина (Справочник Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Под редакцией Б.И. Антонова. М.: Агропромиздат, 1986, с. 56-57).

Однако этот раствор не отвечает тем требованиям, когда исследуется раневое отделяемое, так как в таких случаях исследуемый биоматериал параллельно обсеменяется облигатными анаэробами или другими, более жизнеспособными болезнетворными микроорганизмами.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в увеличении срока сохранения жизнеспособности специфического возбудителя F. necrophorum в период его транспортировки.

Для достижения названного технического результата, что в предлагаемом способе получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза, транспортировку осуществляют в фильтрате золотистого стафилококка, полученном путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия, культивирование в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней, инактивирование в водяной бане течение 30 мин при температуре 90-95°С, центрифугирование при 1000 об/мин в течение 20 мин с отделением прозрачной надосадочной жидкости и фильтрование ее через фильтр Зейтца.

Предлагаемый способ позволяет увеличить срок сохранения жизнеспособности специфического возбудителя F. necrophorum в период его транспортировки.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Пример 1. Питательную среду готовили следующим образом. В колбу с содержанием 500 мл мясопептонного бульона и 10% хлорида натрия вносили 5,0 мл суточную культуру золотистого стафилококка. Колбу ставили в термостат при температуре 37°С и культивировали в течение 8-10 суток.

Полученная бульонная культура стафилококка инактивируется в водяной бане при температуре 90-95°С в течение 30 мин и для освобождения от микробных тел подвергается центрифугированию при 1000 об/мин на электрической центрифуге в продолжении 20 мин. Верхний прозрачный слой сливается в стерильную колбу, дополнительно фильтруется через фильтр Зейтца и используется как транспортная среда для доставки патологического материала в ветеринарную лабораторию.

Предлагаемая среда для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза, должна не только защищать F. necrophorum от гибели, но и содержать факторы роста, поэтому она была испытана в Республиканской лаборатории г. Казани для культивирования с использованием производственных штаммов F. Necrophorum, выделенных нами от больных коров с поражением дистальных частей конечностей в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района и в ООО АФ «Южный» Нурлатского района Республики Татарстан (патент №2569456, МПК C12N 1/20, C12R 1/01, опуб. 27.11.2015 г., БН №33).

Пример 2. Бактериальные суспензии F. necrophorum из производственных штаммов, выделенных в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района и ООО АФ «Южный» Нурлатского района, с содержанием 500000 микробных тел по стандарту мутности готовили на физиологическом растворе и высевали в 10 пробирок с содержанием предлагаемой питательной среды с наслоением вазелинового масла и в 10 пробирок без масла. Перед применением пробирки со средами регенерировали в водяной бане 30 мин при температуре 55°С. Дале пробирки помещали в термостат при температуре 37°С с установлением визуального наблюдения через каждый час до 14 ч, а затем через 36, 56 ч после высева культур. Результаты исследования представлены в таблице 1 и на рисунках 1-а, б, в, г; 2-а, б, в, г; 3-а, б, в, г и 4-а, б, в, г.

Условные обозначения:

(-) - рост отсутствует;

(+) - наличие роста;

(++) - обильный рост;

(+*) - сделан мазок.

Как видно из таблицы 1, первичный рост музейных штаммов F. necrophorum начинает проявляться в первые же часы культивирования (рис. 1а, 3а) с последующим усилением роста с образованием пузырьков газа и помутнением среды (рис. 1-б, в, г; 3-б, в, г).

В аэробных условиях рост возбудителя несколько усиливается, что подтверждается представленными рисунками 2-а, б, в, г и 4-а, б, в, г.

Рост вышеуказанных штаммов определяли по результатам оптической плотности с помощью прибора фотоэлектроколориметра (ФЭК-56 М).

Пример 3. В четыре стерильные пробирки вносили по 10 мл испытуемой среды, с целью создания анаэробных условий в две из них по 1,0 мл наслаивали вазелиновое масло. Затем среду в пробирках с целью уничтожения сопутствующей микрофлоры инактивировали в водяной бане при t=55°С 30 мин и засевали возбудителем некробактериоза производственными штаммами выделенными в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района и ООО АФ «Южный» Нурлатского района РТ, и помещали в термостат при температуре 37°С. Измерения проводили перед посевом, затем через каждый час, сутки, двое суток. Параллельно с измерением делали мазки, окрашивали по Грамму, высушивали на воздухе с последующей микроскопией.

Результаты измерений по оптической плотности представлены в таблице 2 и на рисунках 5 (а, б, в); 6 (а, б, в); 7 (а, б, в); 8 (а, б, в).

Из данных таблицы 2 видно, что пик роста у культур независимо от аэробных или анаэробных условий происходит в первые три часа, затем происходит постепенный спад, который продолжается до 56⁰⁰ ч (рис. 5а, б, в; 6а, б, в; 7а, б, в; 8а, б, в).

Опыт по изысканию оптимальных транспортных сред проводили в хозяйстве ООО «Сот Иле» филиал «Новая Шешма» Ново-Шешминского района Республики Татарстан.

ООО «Сот Иле» филиал «Новая Шешма» Н. Шешминского района РТ имеет 3599 головы крупного рогатого скота черно-пестрой породы. Из всего наличного поголовья 1587 - коровы, 157 - нетели, 16 - быки-производители, остальное поголовье - молодняк разного возраста. При клиническом осмотре всего поголовья среди дойного стада было выявлено 329 (21%) коровы и 26 (17%) нетелей с поражениями дистальных частей конечностей с проявлением различной степени хромоты. Из общего количества больных были изолированы 22 гол: 12 - коров; 10 - нетелей для взятия патологического материала. Животных фиксировали в стационарном станке и из мест поражения взяли соскобы на границе здоровой и некротизированной тканей. Одну часть взятого материала для доставки в лабораторию поместили в 30%-ный раствор глицерина, вторую - в среду Китта-Тароцци с наслоением вазелинового масла, третью - в фильтрат стафилококка, а четвертую - в предлагаемую в качестве изобретения транспортную среду.

Пример 4. В лаборатории из некротизированных тканей были сделаны мазки-отпечатки, а также сделаны мазки из сред, где находился биоматериал.

Результаты исследований представлены в таблицах 4, 5 и на рисунках 11, 12.

Примечание: Гр- - грамотрицательные; Гр+ - грамположительные.

Примечание: Гр- - грамотрицательные; Гр+ - грамположительные.

Из данных таблицы 4, 5 видно, что микроб также находится в среде, в которой был доставлен в лабораторию, так же видно, что предлагаемая среда в качестве изобретения наиболее приемлема для транспортировки, чем 30%-ный раствор глицерина, среда Китта-Тароцци, фильтрат стафилококка.

Выделение чистой культуры из патологического материала представляет лабораторным работникам определенные трудности, основной из них является доставка биоматериала, который при доставке обсеменяется сопутствующей микрофлорой, а возбудитель некробактериоза при этом погибает, и выделение его из такого материала становится просто невозможным. Поэтому нужно разработать такую транспортную среду, в которой возбудитель некробактериоза сохранялся бы длительное время, и при теплой погоде не прорастал.

Пример 5. С целью выяснения пророста сред они были помещены в термостат при температуре 37°С. После четырехчасового культивирования из испытуемых сред, где находился биоматериал, сделали мазки, окрашивали по Грамму.

Результаты исследований представлены в таблице 6, рисунок 13.

Примечание: Гр- - грамотрицательные; Гр+ - грамотрицательные.

Из таблицы 6 видно, что в течение четырехчасового культивирования идет прорастание питательных сред, но в среде, представленной как изобретение, возбудитель некробактериоза сохраняется, это еще раз подтверждает, что указанная среда является оптимальной для транспортировки биоматериала в лабораторию.

Высевы из патологического материала делали в среду из фильтрата золотистого стафилококка, изготовленную по нашей методике.

По мере культивирования посевного материала делали контрольные мазки-отпечатки для микрокопирования. Результаты представлены в рисунках 9, 10.

Как видно из рисунков 9-10, уже через 2 ч с начала культивирования происходит рост чистой культуры возбудителя некробактериоза F. necrophorum.

Таким образом, использование предложенного способа получения транспортной питательной среды в ветеринарной практике позволит увеличить срок сохранения жизнеспособности специфического возбудителя F. necrophorum в период его транспортировки, повысить не только эффективность первичной диагностики некробактериоза, но и проводимых лечебно-профилактических мероприятий в результате своевременно поставленного диагноза.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных, предусматривает получение фильтрата золотистого стафилококка путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия и культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней с последующим инактивированием в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С. Отделяют надосадочную жидкость центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин и фильтруют через фильтр Зейтца. Изобретение позволяет увеличить срок сохранения жизнеспособности возбудителя неробактериоза и повысить эффективность первичной диагностики и лечебно- профилактических мероприятий. 13 ил., 6 табл., 5 пр.

.

Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза, заключающийся в том, что транспортировку осуществляют в фильтрате золотистого стафилококка, полученного путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10%-ного хлорида натрия, культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней, инактивирования в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С, центрифугирования при 1000 об/мин в течение 20 мин с отделением прозрачной надосадочной жидкости и фильтрованием ее через фильтр Зейтца.