ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области ветеринаринарной микробиологии, в частности к выделению возбудителя некробактериоза бактериологическим методом.

Некробактериоз дистальных частей конечностей - одна из инфекционных болезней крупного рогатого скота, встречающаяся довольно часто в специализированных хозяйствах, в результате нарушения ветеринарно-санитарных и технологических нормативов: отсутствие активного моциона, нарушения параметров микроклимата, неполноценность рационов, решетчатые полы. По этой причине к заболеваниям конечностей практические ветеринарные специалисты подходят с неинфекционной позиции, т.е. как раневая хромота механического происхождения.

В производственных условиях возникновению и распространению некробактериоза способствует ассоциация на раневой поверхности вирулентного возбудителя некробактериоза с другими условно-патогенными микроорганизмами. В результате несвоевременного установления диагноза обычные лечебные процедуры не дают желаемых результатов, и болезнь начинает приобретать злокачественный характер, поражая одновременно 2-3 конечности.

В ветеринарной практике для бактериологического исследования используют различные питательные среды.

Известно применение печеночного бульона, мозговой среды, свернутой сыворотки крови, мясопептонного агара с кровью, полужидкого агара с добавлением 2%-ного сахара (Балабанов В.А. Некробактериоз животных. - М., 1971; Лабораторные исследования в ветеринарии./Под ред. Б.И. Антонова. - М., 1986, с. 351).

Недостатком данных питательных сред является низкая чувствительность сред для выявления некробактериоза, приводящая к увеличению срока культивирования посевного материала до 3-8 суток.

Известна среда Китта-Тароцци, состоящая из мясопептонного бульона, 0,5%-ной глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды («Анаэробные организмы», материал из Википедии - свободной энциклопедии - ru.m.wikipedia.org).

Однако применение этой среды позволяет инкубировать посевы от трех до пяти суток, просматривая их ежедневно.

Задачей изобретения является создание такой питательной среды, которая обладала бы повышенной чувствительностью и эффективностью диагностики некробактериоза с сокращением срока культивирования посевного материала.

Поставленная задача решается тем, что питательная среда для выделения возбудителя некробактериоза содержит питательную среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ную глюкозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: питательная среда 199 - 85,0, сыворотка крови крупного рогатого скота - 10,0, 40%-ный раствор глюкозы - 5,0.

Входящая в состав питательной среды сыворотка крови крупного рогатого скота, 40%-ный раствор глюкозы являются источниками белка и углеводов, а также среда 199, имеющая широкий спектр питательных веществ с относительно невысокой их концентрацией (Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. - Л.: Наука, 1988, с. 56), что способствует быстрому размножению F. necrophorum и приводит к повышению чувствительности и эффективности диагностики некробактериоза, а также к сокращению сроков культивирования пасевного материала.

Питательную среду готовили следующим образом. К 85 мл основной среды 199 добавляют 10 мл сыворотки крупного рогатого скота и 5 мл 40%-ного раствора глюкозы, все тщательно перемешивают и по 10 мл разливают в стерильные пробирки.

Предлагаемая среда была испытана в лаборатории биотехнологии (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ г. Казани) с использованием для культивирования хранящихся в лаборатории культур F. necrophorum штаммов «8TS630501», «12TSK630501», а также на посевах из патологического материала, полученного от убоя больных коров с поражением дистальных частей конечностей (некробактериозом).

Пример 1. Бактериальные суспензии F.necrophorum из штаммов «8TS630501» и «12TSK630501» с содержанием 500000 микробных тел по стандарту мутности готовят на физиологическом растворе и высевают в три пробирки с содержанием предлагаемой питательной среды с наслоением вазелинового масла и в три пробирки без масла. Дале пробирки помещают в термостат при температуре 37°C с установлением визуального наблюдения через каждый час до 16 ч, а затем через 36 ч после высева культур. Результаты исследования представлены в табл. 1 и рис. 1-а, б, 2-а, б, 3-а, б и 4а, б.

Как видно из табл. 1 первичный рост музейных штаммов F. necrophorum начинает появляться в первые же часы после посева (рис. 1а, 3а) с последующем усилением роста в виде помутнения среды (рис. 1б, 3б).

В аэробных условиях рост возбудителя значительно выше (рис. 2а, б, 4а, б).

В отличие от музейных штаммов патологический материал обладает более высокой вирулентностью и медленным ростом на питательных средах, поэтому были проведены испытания с выделением возбудителя из патологического материала, полученного от больных коров с поражением дистальных частей конечностей из животноводческих хозяйств ООО АФ «Южная» Нурлатского, ООО АФ «Татарстан» Высокогорского районов Республики Татарстан.

Пример 2. Посевной материал после соответствующей обработки высевают в три пробирки с предлагаемой в качестве изобретения питательной средой с наслоением вазелинового масла и в три пробирки без масла. Помещают в термостат при температуре 37°С и устанавливают наблюдение в тех же параметрах, что описано в примере 1. Результаты исследования представлены в табл. 2 и рис. 5а, б; 6а, б.

На день проведения испытаний в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района РТ было всего 1452 голов крупного рогатого скота голштино-фризской породы, завезенных в 2012 г. из Республики Беларусь. Из всего поголовья - 600 голов коров, 85 - нетели, остальное поголовье молодняк разного возраста. При клиническом осмотре из всего поголовья 254 (42,3%) коровы и 15 (18,5%) нетелей имели поражения дистальных частей конечностей в виде хромоты различной степени. Больных коров в количестве пяти голов фиксировали в станке Исляева-Кутлукаева, отбирали материал (витальные соскобы) на границе здоровой и пораженной ткани. В лаборатории биотехнологии из соскобов делали мазки-отпечатки и окрашивали по Грамму. В мазках при микроскопии просматривались грамотрицательные нити разной длины и палочки. Затем материал помещали в ступку, тщательно растирали, добавляя небольшое количество среды 199. Высевы делали в шести пробирках с содержанием предлагаемой питательной среды. В три пробирки для создания анаэробных условий вносили вазелиновое масло, затем все пробирки помещали в термостат с температурой 37°С и устанавливали наблюдения через каждый час до 16 ч, а затем через 36 ч.

Результаты представлены в табл. 2 и рис. 5а, б и 6а, б.

Как видно из табл. 2 появление первичного роста возбудителя из патологического материала в анаэробных условиях происходит через 4 ч после посева (рис. 5а, б), а в аэробных условиях через 2 ч (рис. 6а, б).

Таким образом, предлагаемая питательная среда значительно повышает чувствительность бактериологического исследования (приблизительно в 15-20 раз), направленного на выявление возбудителя некробактериоза у больных животных, и может быть использована в ветеринарных лабораториях как экспресс-метод диагностика возбудителя некробактериоза.

Изобретение относится к ветеринаринарной микробиологии. Питательная среда для выявления возбудителя некробактериоза содержит среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ный раствор глюкозы в заданных соотношениях компонентов. Изобретение позволяет повысить чувствительность питательной среды к возбудителю некробактериоза и сократить сроки культивирования посевного материала. 6 ил, 2 табл., 2 пр.

Питательная среда для выделения возбудителя некробактериоза, содержащая питательную среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ный раствор глюкозы при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Питательная среда 199 85,0 Сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0 40%-ный раствор глюкозы 5,0