СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИНТОКСИКАЦИИ БЕРИЛЛИЕМ Российский патент 2018 года по МПК G09B23/28 

Предмет настоящего изобретения относится к области медицины, в частности к экспериментальной токсикологии. Способ моделирования интоксикации солями бериллия, превосходящий существующие модели, может быть использован при исследовании механизмов токсического действия ионов бериллия на функциональное состояние систем организма (выделительной, иммунной и др.) и органов (центральная нервная система, печень, легкие) при системном воздействии.

Бериллий, элемент второй группы, атомный №4, в чистом виде получен Лебо в 1898 году. Известно более 40 минералов бериллия, однако наиболее распространенным является берилл 3BeO*AL₂O₃*6SiO₂. Сплавы бериллия, обладающие прочностью и жаростойкостью, используются в активной зоне реакторов. Теплоемкость, жаропрочность и легкость способствуют внедрению бериллия и его соединений в космическую, ракетную и авиационную промышленность. Применение бериллия в различных видах топлива, в частности ракетных топливах, включающих до 40% соединений бериллия, постоянно расширяется [RU 2582712. Староверов Н.Е. Ракетное топливо /варианты]. Активное внедрение в практику соединений бериллия способствует увеличению экологической нагрузки и сопровождается возрастанием опасности для здоровья населения, контактирующего с комплексами добычи, производства и утилизации содержащих бериллий соединений.

Основными путями поступления бериллия и его соединений в организм являются: воздушно-аэрозольный, оральный и поверхностный. Вследствие высокой биологической активности ионы бериллия оказывают общетоксическое, аллергическое и канцерогенное действие. Исследование мутагенной активности показало его взаимодействие с ДНК и наличие генных мутаций и хромосомных аберраций на культуре клеток млекопитающих. [Филов В.А. Бериллий и его соединения: окружающая среда, токсикология, гигиена // Российский химический журнал. 2004. - Т. 48, №2. - С. 76-86].

Бериллий и его соединения могут стать причиной воспалительных процессов на коже и специфического заболевания, вызываемого вдыханием различных форм бериллия, называемого бериллиозом. При кратковременном вдыхании больших концентраций растворимых соединений бериллия возникает острый бериллиоз, представляющий собой раздражение дыхательных путей, иногда сопровождающееся отеком легких и удушьем. Смертельные исходы регистрировались при ингаляционных поступлениях растворимых соединений бериллия в концентрациях 50-75 мг/м³ и нерастворимых 85-850 мг/м³ [Лисиенко А.А., Мерзликин Л.А. Особенности бронхолегочной системы у работников, пренесших острое токсическое воздейтвие бериллиевой этиологии // Медицина труда и пром. экология. - 2004. - №3. - С. 45-48]. Существует также хроническая разновидность бериллиоза, которая характеризуется смазанной симптоматикой, но сопровождается более выражеными нарушениями функциий всего организма.

В настоящее время для изучения токсических свойств соединений бериллия наибольшее распространение получили способы внутривенного и внутрижелудочного введения, используют также внутрибрюшинный способ введения. Описанные способы формируют различные градиенты поступления вещества в организм, что маскирует некоторые аспекты действия собственно ионов бериллия на организм. В случае внутривенного введения, токсичность при котором по литературным данным в 2 раза выше, чем при внутрибрюшинном [Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, №3. - С. 32-34], солей бериллия формируется градиент, способствующий резкому изменению кислотно-щелочного равновесия и гибели животного в результате электролитного/окислительного стресса. Среднесмертельная доза для крыс при этом способе моделирования составляет для иона бериллия, при введении хлорида - 0,8 мг/кг, сульфата - 0,05 мг/кг [Филов В.А. Бериллий и его соединения: окружающая среда, токсикология, гигиена // Российский химический журнал. 2004. - Т. 48, №2. - С. 76-86]. Известное из литературных данных содержание ионов бериллия в органах и тканях после внутривенного введения раствора сульфата бериллия в дозе, соответствующей среднесмертельной, на порядок-два ниже полученного авторами при использовании заявленного способа. Данные приведены в таблице.

Способы моделирования, использующие пероральный путь введения, вследствие низкой абсорбции не позволяют достичь токсической нагрузки, необходимой для разворачивания механизмов токсического действия бериллия как в отдельных органах и тканях, так и на системном уровне, на фоне обеспечения продолжительной жизнедеятельности.

При внутрижелудочном введении среднесмертельная доза для крыс составляет до 200 мг/кг ионов бериллия [Reeves A.L. Beryllium. In: Handbook on toxicology of metals. Vol II. 2nd New York: Elsevier Science Publishing Co. P 95-116]. Биодоступность бериллия при этом способе введения находится на низком уровне, что связывают с низким уровнем абсорбции, при этом наблюдается поражение эндотелия кишечника, приводящее к образованию язв и обильных кровотечений, затрудняющих оценку воздействия бериллия на организм.

Внутрибрюшинное введение, с одной стороны, обеспечивает оптимальную скорость выхода ионов бериллия в кровяное русло по сравнению с низким уровнем абсорбции при внутрижелудочном и накожном путях и чрезмерно высоким при болюсном введении. С другой стороны, среднесмертельная доза при внутрибрюшинном способе введения хлорида и фторида бериллия составляет для мышей соответственно 23,0 мг/кг и 19,1 мг/кг массы тела в пересчете на ионы бериллия, а для крыс - 9,8 мг/кг массы тела ионов бериллия при введении хлорида, бериллия [Филов В.А. Бериллий и его соединения: окружающая среда, токсикология, гигиена // Российский химический журнал. 2004. - Т. 48, №2. - С. 76-86].

Задача настоящего изобретения состоит в подборе условий для внутрибрюшинного введения соединений бериллия, позволяющих создать предельно высокие концентрации ионов бериллия в организме, совместимые с продолжительной жизнедеятельностью, для воспроизведения как острого, так и хронического воздействия, минуя тканевые барьеры легких, желудочно-кишечного тракта и кожных покровов. Решение поставленной задачи позволяет расширить представления о патогенезе острого и хронического действия бериллия, его токсического действия на анатомо-морфологические и функциональные особенности почек, клеток иммунной системы, эндокринные и метаболические процессы при системном воздействии и позволит проводить поиск и разработку способов профилактики и терапии отравлений, а также разработку подходов использования специфического действия ионов бериллия на различные биохимические процессы с целью их направленной модуляции.

Реализация предлагаемой модели может быть осуществлена как однократным, так и многократным внутрибрюшинным введением солей бериллия в 0.2 М глициновом буфере с pH 9,2 дозами, достигающими 90 мг/кг массы тела животного по содержанию иона бериллия. Поступление соединения бериллия из внутрибрюшинного пространства в кровяное русло обеспечивает градуальное нарастание концентрации ионов в органах и тканях, а контроль экскреции интоксиканта с мочой и каловыми массами позволит уточнить значимость путей и скорость выделения его из организма.

Реализация модели осуществляется следующим образом.

В качестве токсикантов используют доступные водорастворимые неорганические соединения бериллия, производитель - Fluka (Brand, Германия), Sigma-Aldrich (США). Чистота и состав веществ описаны в паспортах качества (сертификат анализа) на данные реактивы. С использованием деионизированной воды готовят 0,2 М глициновый буфер с pH 9,2, в котором растворяют соли бериллия с содержанием 15 г/л по элементу (для приготовления раствора, вводимого крысам из расчета предельно допустимого объема, составляющего 5,0 мл [Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. Издание второе дополненное. М.: МДВ. - 2008. - 196 с.]). Концентрацию бериллия в растворах для введения и в биологических материалах животных определяют методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой [Ivanenko N.B., Ivanenko А.А., Solovyev N.D., Zeimal A.E., Navolotskii D.V., Drobyshev E.J. Biomonitoring of 20 trace elements in blood and urine of occupationally exposed workers by sector field inductively coupled plasma masss pectrometry // Talanta. - 2013. - №116. - P. 764-769].

Работу с лабораторными животными проводят в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» (РФ, утв. 06.04.1973); «Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных» (USA, National Academy Press, Washington, D.C., 1996); «Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных» (FELASA, 2010); «Лабораторные животные» (положение и руководство. Российская Академия Медицинских Наук, Москва, 2003).

Пример 1. Моделируют острое воздействие солями бериллия: сульфатом в диапазоне доз (по содержанию иона бериллия) 37,3-79,8 мг/кг массы тела крысы и хлоридом бериллия в дозе 89,8 мг/кг массы тела крысы (по содержанию иона бериллия).

Формируют экспериментальные группы по 5 особей в каждой.

1-я группа - интактные животные;

2-я группа - контроль, которому вводят 4,5 мл глицинового буфера, доведенного до физиологических значений pH 6,8-7,2;

3-я группа - опытная группа 37,3 мг/кг ионов бериллия из сульфата внутрибрюшинно;

4-я группа - опытная группа 49,6 мг/кг ионов бериллия из сульфата внутрибрюшинно;

5-я группа - опытная группа 62,1 мг/кг ионов бериллия из сульфата внутрибрюшинно;

6-я группа - опытная группа 79,8 мг/кг ионов бериллия из сульфата внутрибрюшинно;

7-я группа - опытная группа 89,8 мг/кг ионов бериллия из хлорида внутрибрюшинно.

В глициновом буфере, приготовленном на деионизированной воде, растворяют 15 г/л солей сульфата/хлорида бериллия по содержанию в них ионов бериллия для получения раствора, вводимого животным. Острое воздействие осуществляют внутрибрюшинным введением раствора объемом до 5 мл. Через сутки животных декапитируют и производят забор биологического материала для последующего анализа распределения ионов бериллия по тканям и органам. Результаты эксперимента по содержанию ионов бериллия в органах и тканях, соотнесенному с весом сырой ткани, представлены в таблице 2. Данные интактной и контрольной групп не приведены, так как уровень содержания ионов бериллия в них ниже чувствительности метода.

Из представленных данных видно, что в некоторых органах увеличение вводимой дозы сопровождается увеличением содержания бериллия. К таким органам, исследованным в экспериментах, можно отнести легкие, почки, яички, а также подобная дозозависимая тенденция наблюдается в плазме крови. Накопление бериллия в ткани печени достаточно постоянно, по содержанию в ней бериллия можно предположить, что печень является одной из основных мишеней этого токсиканта. Влияние выбранного аниона на распределение в организме ионов бериллия при заявленном способе незначительно. Следует обратить внимание на резкое изменение содержания бериллия в ткани мозга, учитывая данные о свойствах бериллия как ингибитора канальных рецепторов и конкурента Mg [Fatehi М., Raja М., Carter С., Soliman D., Holt A., E.P. Light The ATP-Sensitive K+ Channel ABCC8 S1369A Type 2 Diabetes Risk Variant Increases MgATPase Activity // Diabetes. - 2012. - Vol. 61. - P. 241-249].

Пример 2. Моделируют воздействие сульфатом бериллия при многократном внутрибрюшинном введении ежедневной дозы ионов бериллия 13,3 мг/кг массы тела крысы. Формируют экспериментальные группы по 5 особей в каждой.

1-я группа - интактные животные;

2-я группа - контроль, вводят 0,86 мл глицинового буфера, доведенного до физиологических значений pH 6,8-7,2, внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней;

3-я группа - опытная группа, вводят 13,3 мг/кг ионов бериллия из сульфата внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней.

Готовят раствор соли сульфата бериллия (BeSO₄×4H₂O) 295 г/л или 15 г/л по содержанию иона бериллия в 0,2 М глициновом буфере с pH 9,2. За три экспериментальных дня животные получили суммарно дозу 39,9 мг/кг массы тела.

После окончания срока 3-х дневного введения животных декапитируют и производят забор биологического материала для последующего анализа распределения ионов бериллия по тканям и органам. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Данные интактной и контрольной групп не приведены, так как уровень содержания ионов бериллия в них ниже чувствительности метода.

Данные, представленные в таблице, показывают возможность многократного внутрибрюшинного введения соединений бериллия и кумулятивные возможности некоторых органов.

Предлагаемый заявителем способ позволяет создать предельно высокие концентрации бериллия в организме, не достижимые при других способах моделирования; при этом отсутствует влияние изменения кислотно-щелочного равновесия, способного приводить к гибели животных от болевого шока, а также влияние резкого изменения электролитного баланса, являющегося причиной окислительного/электролитичекого стресса; благодаря избеганию тканевых барьеров и детоксицирующей функции печени обеспечивается оптимальный градиент выхода ионов в кровяное русло, что позволяет за ограниченное время создать в органах-мишенях наиболее высокие концентрации ионов бериллия; предложенный способ позволяет дифференцированно оценить начальные фазы экскреции ионов бериллия.

У заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: в органах-мишенях создается высокая концентрация ионов бериллия; в результате реализации данной модели у животных развиваются специфические признаки поражения, характеризующие специфическое действие ионов бериллия.

Предложенный авторами способ позволяет оценить процесс экскреции ионов бериллия и вклад органов, принимающих участие в этом процессе, а также механизмы кумуляции, возникающей вследствие токсического поражения органов экскреции.

Пример 3. Моделируют острое воздействие сульфатом бериллия в дозе 53 мг/кг массы тела крысы (по содержанию иона бериллия)

Формируют экспериментальную группу из 5 особей.

Готовят раствор соли сульфата бериллия (BeSO₄×4H₂O) 295 г/л или 15 г/л по содержанию иона бериллия в 0,2 М глициновом буфере с pH 9,2.

Опытной группе вводят приготовленный раствор однократно внутрибрюшинно из расчета 53 мг/кг ионов бериллия, животных сажают в обменные клетки со свободным доступом к воде и пище. Ежедневно в одно и то же время собирают суточную мочу и болюсы, фиксируют объем и вес. После определения содержания ионов бериллия указанным методом производят расчет выделенного бериллия.

Существенные изменения функционирования органов детоксикации на протяжении 3-х суток (почек и, в меньшей степени, печени) у крыс представлены в таблице 4.

На ранних этапах интоксикации, как показывают экспериментальные данные, выведение ионов бериллия осуществляется преимущественно почками, в дальнейшем их роль заметно снижается, а основными органами, принимающими участие в этом процессе, становятся печень и желудочно-кишечный тракт.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной токсикологии, и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия растворимых форм бериллия. Для этого моделирование интоксикации солями бериллия проводят путем однократного или продолжительного многократного внутрибрюшинного введения солей бериллия. Соли вводят в виде раствора в 0,2 М глициновом буфере с рН 9,2. Это позволяет вводить до 90 мг/кг массы тела животного в пересчете на ион бериллия. Способ воспроизводит отравление в отсутствии влияния скачкообразного изменения концентрации ионов бериллия и нарушения кислотно-щелочного равновесия, что обеспечивает создание предельно высокой токсической нагрузки на организм при сохранении жизни лабораторного животного. 3 пр., 4 табл.

Способ моделирования интоксикации солями бериллия, включающий внутрибрюшинное однократное или продолжительное многократное введение водных растворов солей бериллия, отличающийся тем, что соли бериллия вводят в виде раствора в 0,2 М глициновом буфере с рН 9,2, что позволяет вводить до 90 мг ионов бериллия на кг массы тела и создавать высокую токсическую нагрузку в органах и тканях.