P53 ПЕПТИДОМИМЕТИЧЕСКИЕ МАКРОЦИКЛЫ Российский патент 2018 года по МПК C07K14/47 C07K7/08 C07K7/64 C07K7/54 C07K1/113 A61K38/12 A61K38/10 A61K38/03 A61K38/17 A61P35/00 

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был представлен в формате ASCII через EFS-Web. Указанная ASCII копия, созданная 20 марта 2013, названа 35224-766.601_SL.txt размером 1201625 байт.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фактор транскрипции белок p53 человека индуцирует задержку клеточного цикла и апоптоз в ответ на повреждение ДНК и клеточный стресс, и тем самым играет важную роль в защите клеток от злокачественной трансформации. E3 убихитинлигаза MDM2 (также известная как HDM2) отрицательно регулирует функцию p53 посредством прямого связывающего взаимодействия, которое нейтрализует трансактивационную активность p53, приводит к экскреции из ядра белка p53, нацеливает p53 на разрушение через убихитинилирование-протеасомальный путь. Утрата активности p53 либо посредством делеции, мутации, либо гиперэкспрессии MDM2, является наиболее распространенным нарушением при злокачественных заболеваниях у людей. Опухоли, которые экспрессируют p53 дикого типа, являются чувствительными к фармакологическим средствам, которые стабилизируют или увеличивают концентрацию активного p53. В этом контексте ингибирование активностей MDM2 оказалось обоснованным подходом для восстановления активности p53 и восстановления чувствительности злокачественных клеток к апоптозу in vitro и in vivo. MDMX (MDM4) позже был идентифицирован как аналогичный отрицательный регулятор p53, и исследования показали значительную структурную гомологию между связывающими поверхностями p53 у MDM2 и MDMX. Взаимодействия белок-белок p53-MDM2 и p53-MDMX опосредуются одним и тем же альфа-спиральным трансактивационным доменом p53 из 15 остатков, который встраивается в гидрофобные щели поверхности MDM2 и MDMX. Три остатка в этом домене p53 (F19, W23 и L26) являются необходимыми для связывания MDM2 и MDMX.

Существует большая потребность в соединениях, способных связываться и модулировать активность p53, MDM2 и/или MDMX. В настоящем изобретении представлены пептидомиметические макроциклы на основе p53, которые модулируют активность p53. В настоящем изобретении также представлены пептидомиметические макроциклы на основе p53, которые ингибируют взаимодействия между белками p53, MDM2 и/или MDMX. Далее, в настоящем изобретении представлены пептидомиметические макроциклы на основе p53, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, включающих, но не ограничивающихся, злокачественные заболевания и другие гиперпролиферативные заболевания.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении описаны стабильные поперечно-сшитые пептиды, относящиеся к части p53 человека («p53 пептидомиметические макроциклы»). Эти поперечно-сшитые пептиды содержат по меньшей мере две модифицированные аминокислоты, которые вместе образуют внутримолекулярную поперечную связь, которая помогает стабилизировать альфа-спиральную вторичную структуру части p53, которая считается важной для связывания p53 с MDM2 и для связывания p53 с MDMX. Соответственно, поперечно-сшитый полипептид, описанный в настоящем изобретении, может обладать улучшенной биологической активностью по сравнению с соответствующим полипептидом, который не является поперечно-сшитым. Считается, что пептидомиметические макроциклы p53 препятствуют связыванию p53 с MDM2 и/или p53 с MDMX, тем самым, высвобождая функционально активный p53 и ингибируя его деструкцию. Пептидомиметические макроциклы p53, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы терапевтически, например, для лечения злокачественных заболеваний и других нарушений, характеризующихся нежелательно низким уровнем или низкой активностью p53, и/или для лечения злокачественных заболеваний и других нарушений, характеризующихся нежелательно высоким уровнем активности MDM2 или MDMX. Пептидомиметические макроциклы p53 также могут применяться для лечения любого нарушения, связанного с нарушенной регуляцией транскрипционного пути p53, приводящей к состояниям избыточного клеточного выживания и пролиферации, таким как злокачественные заболевания и аутоиммунитет, помимо состояний неадекватной задержки клеточного цикла и апоптоза, таких как нейродегенерация и иммунодефициты. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы p53 связываются с MDM2 (например, GenBank® регистрационный номер: 228952; GI:228952) и/или MDMX (также называемые MDM4; GenBank® регистрационный номер: 88702791; GI:88702791).

В одном аспекте в настоящем изобретении представлен пептидомиметический макроцикл, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 60%, 80%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей в Таблице 1, Таблице 1a, Таблице 1b или Таблице 1c. Альтернативно, аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла выбрана из группы аминокислотных последовательностей в Таблице 4. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл не является пептидом, показанным в Таблице 2a или 2b. В других случаях пептидомиметический макроцикл не содержит структуру, показанную в Таблице 2a или 2b. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет аминокислотную последовательность, выбранную из Таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет аминокислотную последовательность, выбранную из Таблицы 1a. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет аминокислотную последовательность, выбранную из Таблицы 1b. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет аминокислотную последовательность, выбранную из Таблицы 1c.

Альтернативно, аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла выбрана как указано выше, и дополнительно, где макроцикл не включает тиоэфир или триазол. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл содержит спираль, например, α-спираль. В других вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл содержит α,α-двузамещенную аминокислоту. Пептидомиметический макроцикл может содержать сшивающее вещество, связывающее α-положения по меньшей мере двух аминокислот. По меньшей мере одна из указанных двух аминокислот может представлять собой α,α-двузамещенную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления представлен пептидомиметический макроцикл формулы:

Формула I,

где:

каждый A, C, D и E независимо представляет собой аминокислоту;

B представляет собой аминокислоту, , [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-] или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый L или L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ и L₃ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂ или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20 или 1-10;

u представляет собой целое число от 1 до 10, например, 1-5, 1-3 или 1-2;

x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10, например, сумма x+y+z равна 2, 3, или 6; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах осуществления w>2 и каждая из первых двух аминокислот, представленных Е, содержит незаряженную боковую цепь или отрицательно заряженную боковую цепь.

В некоторых вариантах осуществления первая С-концевая аминокислота и/или вторая С-концевая аминокислота, представленная Е, содержит гидрофобную боковую цепь. Например, первая С-концевая аминокислота и/или вторая C-концевая аминокислота, представленная Е, содержит гидрофобную боковую цепь, например, большую гидрофобную боковую цепь.

В некоторых вариантах осуществления w составляет от 3 до 1000. Например, третья аминокислота, представленная Е, содержит большую гидрофобную боковую цепь.

В других вариантах осуществления заявленный пептидомиметический макроцикл исключает последовательность:

Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH₂ (SEQ ID NO: 1)_, Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH₂ (SEQ ID NO: 2),

Ac-$r8SQQTFS$LWRLLAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 3), Ac-QSQ$r8TFSNLW$LLAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 4),

Ac-QS$r5QTFStNLW$LLAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 5), или Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 6).

В других вариантах осуществления заявленный пептидомиметический макроцикл исключает последовательность:

Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 7).

Пептидомиметические макроциклы также представлены формулой:

,

где:

каждый из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉ и Xaa₁₀ представляет собой индивидуально аминокислоту, где по меньшей мере три из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉ и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8), где каждый X представляет собой аминокислоту;

каждый D и E независимо представляет собой аминокислоту;

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа положением одной из указанных D или Е аминокислот;

каждый L или L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v представляет собой целое число от 1 до 1000, например, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, или 1-10;

w представляет собой целое число от 3 до 1000, например, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, или 3-10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет Формулу:

,

где:

каждый из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉ и Xaa₁₀ представляет собой индивидуально аминокислоту, где по меньшей мере три из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉ и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9), где каждый X представляет собой аминокислоту;

каждый D независимо представляет собой аминокислоту;

каждый E независимо представляет собой аминокислоту, например, аминокислоту, выбранную из Ala (аланин), D-Ala (D-аланин), Aib (α-аминоизомасляная кислота), Sar (N-метилглицин), и Ser (серин);

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

каждый L или L' независимо представляет собой формирующий макроцикл линкер формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v представляет собой целое число от 1 до 1000, например, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, или 1-10;

w представляет собой целое число от 3 до 1000, например, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, или 3-10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет Формулу:

,

где:

каждый из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляет собой индивидуально аминокислоту, где по меньшей мере два из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9), где каждый X представляет собой аминокислоту;

каждый D и E независимо представляет собой аминокислоту;

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

каждый L или L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-, где L содержит по меньшей мере одну двойную связь в Е конфигурации;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v представляет собой целое число от 1 до 1000;

w представляет собой целое число от 3 до 1000;

n представляет собой целое число от 1 до 5; и

Xaa₇ представляет собой Boc-защищенный триптофан.

В некоторых вариантах осуществления любой из формул, описанных в настоящей заявке, [D]_v представляет собой -Leu₁-Thr₂. В других вариантах осуществления формул, описанных в настоящей заявке, каждый E, за исключением третьей аминокислоты, представленной E, представляет собой аминокислоту, выбранную из Ala (аланин), D-Ala (D-аланин), Aib (α-аминоизомасляная кислота), Sar (N-метилглицин) и Ser (серин).

В некоторых вариантах осуществления w представляет собой целое число от 3 до 10, например, 3-6, 3-8, 6-8 или 6-10. В некоторых вариантах осуществления w равно 3. В других вариантах осуществления w равно 6. В некоторых вариантах осуществления v представляет собой целое число от 1 до 10, например, 2-5. В некоторых вариантах осуществления v равно 2.

В некоторых вариантах осуществления пептиды, описанные в настоящем изобретении, связываются с сайтом связывания, определенным по меньшей мере частично, аминокислотными боковыми цепями MDMX L17, V46, M50, Y96 (образующими край кармана) и L99. Не связываясь теорией, связывание с таким сайтом связывания улучшает одно или несколько свойств, таких как аффинность связывания, индукция апоптоза, in vitro или in vivo противоопухолевая эффективность или уменьшенное соотношение аффинностей связывания с MDMX по сравнению с MDM2.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет улучшенную аффинность связывания с MDM2 или MDMX по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В других случаях пептидомиметический макроцикл имеет сниженное соотношение аффинностей связывания с MDMX по сравнению с MDM2 по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В других случаях пептидомиметический макроцикл имеет улучшенную противоопухолевую эффективность in vitro в отношении p53-позитивных линий опухолевых клеток по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл демонстрирует улучшенную in vitro индукцию апоптоза в p53-позитивных линиях опухолевых клеток по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В других случаях пептидомиметический макроцикл по пункту 1, где пептидомиметический макроцикл имеет улучшенное соотношение противоопухолевой эффективности in vitro в отношении p53-позитивных по сравнению с p53-негативными линиями или линиями мутантных опухолевых клеток по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В некоторых случаях улучшенное соотношение эффективности in vitro, составляет 1-29, ≥30-49 или ≥50. В других случаях пептидомиметический макроцикл имеет улучшенную противоопухолевую эффективность in vivo в отношении p53-позитивных опухолей по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В некоторых случаях улучшенное соотношение эффективности in vivo составляет -29, ≥30-49, или ≥50. В других случаях пептидомиметический макроцикл имеет улучшенную индукцию апоптоза in vivo в p53-позитивных опухолях по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет улучшенную клеточную проницаемость по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2. В других случаях пептидомиметический макроцикл имеет улучшенную растворимость по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором w равно 0, 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления Xaa₅ представляет собой Glu или его аминокислотный аналог. В некоторых вариантах осуществления Xaa₅ представляет собой Glu или его аминокислотный аналог и где пептидомиметический макроцикл обладает улучшенными свойствами, такими как улучшенная аффинность связывания, улучшенная растворимость, улучшенная клеточная эффективность, улучшенная клеточная проницаемость, улучшенная противоопухолевая эффективность in vivo или in vitro или улучшенная индукция апоптоза по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором Xaa₅ представляет собой Ala.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл обладает улучшенной аффинностью связывания с MDM2 или MDMX по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором Xaa₅ представляет собой Ala. В других вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет уменьшенное соотношение аффинностей связывания с MDMX по сравнению с MDM2 по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором Xaa₅ представляет собой Ala. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл обладает улучшенной растворимостью по сравнению с пептидомиметическим макроциклом, в котором Xaa₅ представляет собой Ala, или пептидомиметический макроцикл обладает улучшенной клеточной эффективностью по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором Xaa₅ представляет собой Ala.

В некоторых вариантах осуществления Xaa₅ представляет собой Glu или его аминокислотный аналог и где пептидомиметический макроцикл обладает улучшенной биологической активностью, например, улучшенной аффинностью связывания, улучшенной растворимостью, улучшенной клеточной эффективностью, улучшенной спиральностью, улучшенной клеточной проницаемостью, улучшенной противоопухолевой эффективностью in vivo или in vitro или улучшенной индукцией апоптоза по сравнению с соответствующим пептидомиметическим макроциклом, в котором Xaa₅ представляет собой Ala.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл обладает активностью в отношении p53+/+ клеточных линий, которая по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 50 раз, 70 раз или в 100 раз больше, чем его связывающая аффинность в отношении p53-/- клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл обладает активностью в отношении p53+/+ клеточной лини, которая в 1-29 раз, 30-49 раз или ≥50 раз больше, чем его связывающая аффинность в отношении p53-/- клеточной линии. Активность можно измерить, например, как значение IC50. Например, p53+/+ клеточная линия представляет собой SJSA-1, RKO, HCT-116, или MCF-7, а p53-/- клеточная линия представляет собой RKO-E6 или SW-480. В некоторых вариантах осуществления этот пептид имеет IC50 в отношении p53+/+ клеточной линии менее 1 мкM.

В некоторых вариантах осуществления Xaa₅ представляет собой Glu или его аминокислотный аналог, и пептидомиметический макроцикл обладает активностью в отношении p53+/+ клеточной линии, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем его связывающая аффинность в отношении p53-/- клеточной линии.

Дополнительно представлен способ лечения злокачественных заболеваний у пациента, включающий введение этому пациенту пептидомиметического макроцикла. В некоторых вариантах осуществления злокачественным заболеванием является рак тканей головы и шеи, рак легких, рак груди или глиома.

Также представлен способ модуляции активности p53 или MDM2 или MDMX у пациента, включающий введение указанному пациенту пептидомиметического макроцикла, или способ противодействия взаимодействию между белками p53 и MDM2 и/или MDMX у пациента, включающий введение указанному пациенту такого пептидомиметического макроцикла.

В настоящем изобретении представлен способ получения композиции, содержащей пептидомиметический макроцикл формулы (I):

Формула (I),

содержащий аминокислотную последовательность, которая примерно на 60-100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей в Таблице 1, Таблице 1a, Таблице 1b или Таблице 1c, указанный способ включает обработку соединения Формулы (II)

Формула (II),

катализатором с получением соединения Формулы I,

где в соединении (соединениях) Формул (I) и (II)

каждый A, C, D и E независимо представляет собой аминокислоту;

каждый B независимо представляет собой аминокислоту, , [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

каждый R₁ и R₂ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа-положением одной из D или E аминокислот;

каждый R₃ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

каждый L₁, L₂ и L₃ независимо представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄'-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

каждый R₄ и R₄' независимо представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K независимо представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₇ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

каждый R₈ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

каждый v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000;

u представляет собой целое число от 1 до 10;

каждый x, y и z независимо представляет собой целые числа от 0 до 10;

каждый n независимо представляет собой целое число от 1 до 5;

каждый o независимо представляет собой целое число от 1 до 15;

каждый p независимо представляет собой целое число от 1 до 15;

«(E)» указывает транс-двойную связь; и

одна или более из аминокислот A, C и/или B, в тех случаях, когда B представляет собой аминокислоту, находится в соединениях Формул (I) и (II), имеет боковую цепь, несущую защитную группу.

В некоторых вариантах осуществления защитная группа представляет собой защитную группу атома азота.

В некоторых вариантах осуществления защитная группа представляет собой Boc-группу.

В некоторых вариантах осуществления боковая цепь аминокислоты, несущей защитную группу, содержит защищенный индол.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота, несущая защитную группу на своей боковой цепи, представляет собой триптофан (W), который защищен защитной группой на азоте индола. Например, защитная группа представляет собой Boc-группу.

В некоторых вариантах осуществления после стадии контактирования соединения Формулы II с катализатором соединение Формулы (I) получают в равных или более высоких количествах, чем соответствующее соединение, которое представляет собой Z изомер. Например, после стадии контактирования соединения Формулы II с катализатором соединение Формулы (I) получают в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 раз большем количестве, чем соответствующее соединение, которое представляет собой Z изомер.

В некоторых вариантах осуществления катализатор представляет собой рутениевый катализатор.

В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает стадию обработки соединений Формулы (I) восстанавливающим агентом или окисляющим агентом.

В некоторых вариантах осуществления соединение Формулы (II) присоединено к твердой подложке. В других вариантах осуществления соединение Формулы (II) не присоединено к твердой подложке.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление защитной группы (групп) с соединений Формулы (I).

В некоторых вариантах осуществления метатезис с закрытием цикла проводят при температуре в интервале примерно от 20ºC примерно до 80ºC.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл Формулы (I) имеет Формулу:

,

где:

каждый из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉ и Xaa₁₀ индивидуально представляет собой аминокислоту, где по меньшей мере два из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₈, Xaa₉ и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8), где каждый X представляет собой аминокислоту;

каждый D и E независимо представляет собой аминокислоту;

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L' соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

каждый L или L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-, где L содержит по меньшей мере одну двойную связь в Е конфигурации;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v представляет собой целое число от 1 до 1000;

w представляет собой целое число от 3 до 1000;

n представляет собой целое число от 1 до 5; и

Xaa₇ представляет собой Boc-защищенный триптофан.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл Формулы (I) содержит α-спираль.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Новые признаки настоящего изобретения изложены с подробностями в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание этих признаков и преимуществ настоящего изобретения будет получено посредством ссылки на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстрирующие варианты осуществления, в которых использованы принципы настоящего изобретения, и сопровождающие фигуры, на которых:

На Фигуре 1 показана структура пептидомиметического макроцикла 46 (Таблица 2b), p53 пептидомиметического макроцикла, в комплексе с MDMX (Primary SwissProt регистрационный номер Q7ZUW7; Entry MDM4_DANRE).

На Фигуре 2 показаны перекрывающиеся структуры p53 пептидомиметических макроциклов 142 (Таблица 2b) и SP43 связанных с MDMX (Primary SwissProt регистрационный номер Q7ZUW7; Entry MDM4_DANRE).

На Фигуре 3 показано действие SP154, пептидомиметического макроцикла, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата у мышей MCF-7.

На Фигуре 4 показано действие SP249, пептидомиметического макроцикла, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата у мышей MCF-7.

На Фигуре 5 показано действие SP315, пептидомиметического макроцикла, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата у мышей MCF-7.

На Фигуре 6 показано действие SP252, точковой мутации SP154, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата у мышей MCF-7.

На Фигуре 7 показан график растворимости для пептидомиметических макроциклов с различными С-концевыми удлинениями.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В контексте настоящего изобретения термин «макроцикл» относится к молекуле, имеющей химическую структуру, включающую кольцо или цикл, образованный по меньшей мере 9 ковалентно связанными атомами.

В контексте настоящего изобретения термин «пепидомиметический макроцикл» или «поперечно сшитый полипептид» относится к соединению, содержащему множество аминокислотных остатков, соединенных множеством пептидных связей, и по меньшей мере один формирующий макроцикл линкер, который образует макроцикл между первым природным или неприродным аминокислотным остатком (или аналогом) и вторым природным или неприродным аминокислотным остатком (или аналогом) в пределах одной и той же молекулы. Пептидомиметический макроцикл включает варианты осуществления, в которых линкер, образующий макроцикл, соединяет α-углерод первого аминокислотного остатка (или аналога) с α-углеродом второго аминокислотного остатка (или аналога). Пептидомиметические макроциклы необязательно включают одну или более непептидных связей между одним или более аминокислотными остатками и/или остатками аналогов аминокислот, и необязательно включают один или более неприродных аминокислотных остатков или остатков аналогов аминокислот дополнительно к любому, который образует макроцикл. Подразумевается, что «соответствующий непоперечносшитый полипептид», в тех случаях, когда на него имеется ссылка в контексте пептидомиметического макроцикла, относится к полипептиду такой же длины, что и макроцикл, и содержащему эквивалентные природные аминокислоты последовательности дикого типа, соответствующей макроциклу.

В контексте настоящего изобретения термин «стабильность» относится к поддержанию определенной вторичной структуры в растворе пептидомиметическим макроциклом, как определено посредством кругового дихроизма, ЯМР или другого биофизического измерения, или к резистентности в отношении протеолитического расщепления in vitro или in vivo. Неограничивающими примерами вторичных структур, рассматриваемых в настоящем описании, являются α-спирали, 3₁₀-спирали, β-изгибы и β-складчатые конформации.

В контексте настоящего изобретения термин «спиральная стабильность» относится к поддержанию α-спиральной структуры пептидомиметическим макроциклом, как определено посредством кругового дихроизма или ЯМР. Например, в некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл демонстрирует по меньшей мере 1,25, 1,5, 1,75 или 2-кратное увеличение α-спиральности, как определено посредством кругового дихроизма, по сравнению с соответствующим макроциклом без поперечных связей.

Термин «аминокислота» относится к молекуле, содержащей как аминогруппу, так и карбоксильную группу. Подходящие аминокислоты включают, без ограничения, как D- и L-изомеры природных аминокислот, так и неприродные аминокислоты, полученные посредством органического синтеза или другими метаболическими путями. Термин аминокислота, в контексте настоящего изобретения, включает без ограничения, α-аминокислоты, природные аминокислоты, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот.

Термин «α-аминокислота» относится к молекуле, содержащей как аминогруппу, так и карбоксильную группу, связанную с атомом углерода, который обозначается α-углеродом.

Термин «β-аминокислота» относится к молекуле, содержащей как аминогруппу, так и карбоксильную группу, в β-конфигурации.

Термин «природная аминокислота» относится к любой из двадцати аминокислот, обычно находящихся в пептидах, синтезируемых в природе, и известных под однобуквенными аббревиатурами A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y и V.

В следующей таблице представлено краткое изложение свойств природных аминокислот:

Аминокислота 3-буквенный код 1-буквенный код Полярность боковых цепей Заряд боковой цепи (pH 7,4) Гидропатический индекс Аланин Ala A неполярная нейтральный 1,8 Аргинин Arg R полярная положительный −4,5 Аспарагин Asn N полярная нейтральный −3,5 Аспарагиновая кислота Asp D полярная отрицательный −3,5 Цистеин Cys C полярная нейтральный 2,5 Глутаминовая кислота Glu E полярная отрицательный −3,5 Глутамин Gln Q полярная нейтральный −3,5 Глицин Gly G неполярная нейтральный −0,4 Гистидин His H полярная положительный
(10%)
нейтральный (90%) −3,2 Изолейцин Ile I неполярная нейтральный 4,5 Лейцин Leu L неполярная нейтральный 3,8 Лизин Lys K полярная положительный −3,9 Метионин Met M неполярная нейтральный 1,9 Фенилаланин Phe F неполярная нейтральный 2,8 Пролин Pro P неполярная нейтральный −1,6 Серин Ser S полярная нейтральный −0,8 Треонин Thr T полярная нейтральный −0,7 Триптофан Trp W неполярная нейтральный −0,9 Тирозин Tyr Y полярная нейтральный −1,3 Валин Val V неполярная нейтральный 4,2

«Гидрофобные аминокислоты» включают небольшие гидрофобные аминокислоты и крупные гидрофобные аминокислоты. «Небольшими гидрофобными аминокислотами» являются глицин, аланин, пролин, и их аналоги. «Крупными гидрофобными аминокислотами» являются валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин, триптофан, и их аналоги. «Полярными аминокислотами» являются серин, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, тирозин и их аналоги. «Заряженными аминокислотами» являются лизин, аргинин, гистидин, аспартат, глутамат и их аналоги.

Термин «аналог аминокислоты» относится к молекуле, которая по существу аналогична аминокислоте и которая может быть заменена аминокислотой в образовании пептидомиметического макроцикла. Аналоги аминокислот включают, без ограничения, β-аминокислоты и аминокислоты, в которых амино или карбокси группа заменена аналогичной реакционноспособной группой (например, замена первичного амина вторичным или третичным амином, или замена карбоксигруппы сложным эфиром).

Термин «неприродная аминокислота» относится к аминокислоте, которая не является одной из двадцати аминокислот, обычно находящихся в пептидах, синтезированных в природе, и известных под однобуквенными аббревиатурами A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y и V. Неприродные аминокислоты или аналоги аминокислот включают, без ограничения, структуры, соответствующие следующим:

Аналоги аминокислот включают аналоги β-аминокислот. Примеры аналогов β-аминокислот включают, но не ограничиваются, следующие: аналоги циклических β-аминокислот; β-аланин; (R)-β-фенилаланин; (R)-1,2,3,4-тетрагидро-изохинолин-3-уксусную кислоту; (R)-3-амино-4-(1-нафтил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2,4-дихлорфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-хлорфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-цианофенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-фторфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-фурил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-метилфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-нафтил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-тиенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(2-трифторметилфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3,4-дихлорфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3,4-дифторфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-бензотиенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-хлорфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-цианофенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-фторфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-метилфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-пиридил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-тиенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(3-трифторметилфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-бромфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-хлорфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-цианофенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-фторфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-йодфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-метилфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-нитрофенил-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-пиридил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-(4-трифторметилфенил)-масляную кислоту; (R)-3-амино-4-пентафтор-фенил-масляную кислоту; (R)-3-амино-5-гексеновую кислоту; (R)-3-амино-5-гексиновую кислоту; (R)-3-амино-5-фенилпентановую кислоту; (R)-3-амино-6-фенил-5-гексеновую кислоту; (S)-1,2,3,4-тетрагидро-изохинолин-3-уксусную кислоту; (S)-3-амино-4-(1-нафтил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2,4-дихлорфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-хлорфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-цианофенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-фторфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-фурил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-метилфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-нафтил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-тиенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(2-трифторметилфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3,4-дихлорфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3,4-дифторфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-бензотиенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-хлорфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-цианофенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-фторфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-метилфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-пиридил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-тиенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(3-трифторметилфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-бромфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-хлорфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-цианофенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-фторфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-йодфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-метилфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-нитрофенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-пиридил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-(4-трифторметилфенил)-масляную кислоту; (S)-3-амино-4-пентафтор-фенилмасляную кислоту; (S)-3-амино-5-гексеновую кислоту; (S)-3-амино-5-гексиновую кислоту; (S)-3-амино-5-фенилпентановую кислоту; (S)-3-амино-6-фенил-5-гексеновую кислоту; 1,2,5,6-тетрагидропиридин-3-карбоновую кислоту; 1,2,5,6-тетрагидропиридин-4-карбоновую кислоту; 3-амино-3-(2-хлорфенил)-пропионовую кислоту; 3-амино-3-(2-тиенил)-пропионовую кислоту; 3-амино-3-(3-бромфенил)-пропионовую кислоту; 3-амино-3-(4-хлорфенил)-пропионовую кислоту; 3-амино-3-(4-метоксифенил)-пропионовую кислоту; 3-амино-4,4,4-трифтор-масляную кислоту; 3-аминоадипиновую кислоту; D-β-фенилаланин; β-лейцин; L-β-гомоаланин; L-β-гомоаспарагиновой кислоты γ-бензиловый эфир; L-β-гомоглутаминовой кислоты δ-бензиловый эфир; L-β-гомоизолейцин; L-β-гомолейцин; L-β-гомометионин; L-β-гомофенилаланин; L-β-гомопролин; L-β-гомотриптофан; L-β-гомовалин; L-Nω-бензилоксикарбонил-β-гомолизин; Nω-L-β-гомоаргинин; O-бензил-L-β-гомогидроксипролин; O-бензил-L-β-гомосерин; O-бензил-L-β-гомотреонин; O-бензил-L-β-гомотирозин; γ-тритил-L-β-гомоаспарагин; (R)-β-фенилаланин; L-β-гомоаспарагиновой кислоты γ-t-бутиловый эфир; L-β-гомоглутаминовой кислоты δ-t-бутиловый эфир; L-Nω-β-гомолизин; Nδ-тритил-L-β-гомоглутамин; Nω-2,2,4,6,7-пентаметил-дигидробензофуран-5-сульфонил-L-β-гомоаргинин; O-t-бутил-L-β-гомогидрокси-пролин; O-t-бутил-L-β-гомосерин; O-t-бутил-L-β-гомотреонин; O-t-бутил-L-β-гомотирозин; 2-аминоциклопентан карбоновую кислоту; и 2-аминоциклогексан карбоновую кислоту.

Аналоги аминокислот включают аналоги аланина, валина, глицина или лейцина. Примеры аминокислотных аналогов аланина, валина, глицина и лейцина включают, но не ограничиваются, следующие: α-метоксиглицин; α-аллил-L-аланин; α-аминоизомасляную кислоту; α-метил-лейцин; β-(1-нафтил)-D-аланин; β-(1-нафтил)-L-аланин; β-(2-нафтил)-D-аланин; β-(2-нафтил)-L-аланин; β-(2-пиридил)-D-аланин; β-(2-пиридил)-L-аланин; β-(2-тиенил)-D-аланин; β-(2-тиенил)-L-аланин; β-(3-бензотиенил)-D-аланин; β-(3-бензотиенил)-L-аланин; β-(3-пиридил)-D-аланин; β-(3-пиридил)-L-аланин; β-(4-пиридил)-D-аланин; β-(4-пиридил)-L-аланин; β-хлор-L-аланин; β-циано-L-аланин; β-циклогексил-D-аланин; β-циклогексил-L-аланин; β-циклопентен-1-ил-аланин; β-циклопентил-аланин; β-циклопропил-L-Ala-OH ⋅ дициклогексиламмониевую соль; β-t-бутил-D-аланин; β-t-бутил-L-аланин; γ-аминомасляную кислоту; L-α,β-диаминопропионовую кислоту; 2,4-динитрофенилглицин; 2,5-дигидро-D-фенилглицин; 2-амино-4,4,4-трифтормасляную кислоту; 2-фторфенилглицин; 3-амино-4,4,4-трифтормасляную кислоту; 3-фторвалин; 4,4,4-трифторвалин; 4,5-дегидро-L-leu-OH ⋅ дициклогексиламмониевую соль; 4-фтор-D-фенилглицин; 4-фтор-L-фенилглицин; 4-гидрокси-D-фенилглицин; 5,5,5-трифторлейцин; 6-аминогексановую кислоту; циклопентил-D-Gly-OH ⋅ дициклогексиламмониевую соль; циклопентил-Gly-OH ⋅ дициклогексиламмониевую соль; D-α,β-диаминопропионовую кислоту; D-α-аминомасляную кислоту; D-α-t-бутилглицин; D-(2-тиенил)глицин; D-(3-тиенил)глицин; D-2-аминокапроновую кислоту; D-2-инданилглицин; D-аллилглицин•дициклогексиламмониевую соль; D-циклогексилглицин; D-норвалин; D-фенилглицин; β-аминомасляную кислоту; β-аминоизомасляную кислоту; (2-бромфенил)глицин; (2-метоксифенил)глицин; (2-метилфенил)глицин; (2-тиазолил)глицин; (2-тиенил)глицин; 2-амино-3-(диметиламино)-пропионовую кислоту; L-α,β-диаминопропионовую кислоту; L-α-аминомасляную кислоту; L-α-t-бутилглицин; L-(3-тиенил)глицин; L-2-амино-3-(диметиламино)-пропионовую кислоту; L-2-аминокапроновой кислоты дициклогексил-аммониевую соль; L-2-инданилглицин; L-аллилглицин•дициклогексил аммониевую соль; L-циклогексилглицин; L-фенилглицин; L-пропаргилглицин; L-норвалин; N-α-аминометил-L-аланин; D-α,γ-диаминомасляную кислоту; L-α,γ-диаминомасляную кислоту; β-циклопропил-L-аланин; (N-β-(2,4-динитрофенил))-L-α,β-диаминопропионовую кислоту; (N-β-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-D-α,β-диаминопропионовую кислоту; (N-β-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-L-α,β-диаминопропионовую кислоту; (N-β-4-метилтритил)-L-α,β-диаминопропионовую кислоту; (N-β-аллилоксикарбонил)-L-α,β-диаминопропионовую кислоту; (N-γ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-D-α,γ-диаминомасляную кислоту; (N-γ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-L-α,γ-диаминомасляную кислоту; (N-γ-4-метилтритил)-D-α,γ-диаминомасляную кислоту; (N-γ-4-метилтритил)-L-α,γ-диаминомасляную кислоту; (N-γ-аллилоксикарбонил)-L-α,γ-диаминомасляную кислоту; D-α,γ-диаминомасляную кислоту; 4,5-дегидро-L-лейцин; циклопентил-D-Gly-OH; циклопентил-Gly-OH; D-аллилглицин; D-гомоциклогексилаланин; L-1-пиренилаланин; L-2-аминокапроновую кислоту; L-аллилглицин; L-гомоциклогексилаланин; и N-(2-гидрокси-4-метокси-Bzl)-Gly-OH.

Аналоги аминокислот включают аналоги аргинина или лизина. Примеры аминокислотных аналогов аргинина и лизина включают следующие, но не ограничиваются ими: цитруллин; L-2-амино-3-гуанидинопропионовую кислоту; L-2-амино-3-уреидопропионовую кислоту; L-цитруллин; Lys(Me)₂-OH; Lys(N₃)-OH; Nδ-бензилоксикарбонил-L-орнитин; Nω-нитро-D-аргинин; Nω-нитро-L-аргинин; α-метилорнитин; 2,6-диаминопимелиновую кислоту; L-орнитин; (Nδ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогекс-1-илиден)этил)-D-орнитин; (Nδ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогекс-1-илиден)этил)-L-орнитин; (Nδ-4-метилтритил)-D-орнитин; (Nδ-4-метилтритил)-L-орнитин; D-орнитин; L-орнитин; Arg(Me)(Pbf)-OH; Arg(Me)₂-OH (асимметричный); Arg(Me)2-OH (симметричный); Lys(ivDde)-OH; Lys(Me)2-OH ⋅ HCl; Lys(Me3)-OH хлорид; Nω-нитро-D-аргинин; и Nω-нитро-L-аргинин.

Аналоги аминокислот включают аналоги аспарагиновой или глутаминовой кислот. Примеры аминокислотных аналогов аспарагиновой и глутаминовой кислот включают следующие, но не ограничиваются ими: α-метил-D-аспарагиновую кислоту; α-метил-глутаминовую кислоту; α-метил-L-аспарагиновую кислоту; γ-метилен-глутаминовую кислоту; (N-γ-этил)-L-глутамин; [N-α-(4-аминобензоил)]-L-глутаминовую кислоту; 2,6-диаминопимелиновую кислоту; L-α-аминосубериновую кислоту; D-2-аминоадипиновую кислоту; D-α-аминосубериновую кислоту; α-аминопимелиновую кислоту; иминодиуксусную кислоту; L-2-аминоадипиновую кислоту; трео-β-метил-аспарагиновую кислоту; γ-карбокси-D-глутаминовую кислоту γ,γ-ди-t-бутиловый эфир; γ-карбокси-L-глутаминовую кислоту γ,γ-ди-t-бутиловый эфир; Glu(OAll)-OH; L-Asu(OtBu)-OH; и пироглутаминовую кислоту.

Аналоги аминокислот включают аналоги цистеина и метионина. Примеры аминокислотных аналогов цистеина и метионина включают, но не ограничиваются указанным, Cys(фарнезил)-OH, Cys(фарнезил)-OMe, α-метил-метионин, Cys(2-гидроксиэтил)-OH, Cys(3-аминопропил)-OH, 2-амино-4-(этилтио)масляную кислоту, бутионин, бутионинсульфоксимин, этионин, метионин метилсульфония хлорид, селенометионин, цистеиновую кислоту, [2-(4-пиридил)этил]-DL-пеницилламин, [2-(4-пиридил)этил]-L-цистеин, 4-метоксибензил-D-пеницилламин, 4-метоксибензил-L-пеницилламин, 4-метилбензил-D-пеницилламин, 4-метилбензил-L-пеницилламин, бензил-D-цистеин, бензил-L-цистеин, бензил-DL-гомоцистеин, карбамоил-L-цистеин, карбоксиэтил-L-цистеин, карбоксиметил-L-цистеин, дифенилметил-L-цистеин, этил-L-цистеин, метил-L-цистеин, t-бутил-D-цистеин, тритил-L-гомоцистеин, тритил-D-пеницилламин, цистатионин, гомоцистин, L-гомоцистин, (2-аминоэтил)-L-цистеин, селено-L-цистин, цистатионин, Cys(StBu)-OH, и ацетамидометил-D-пеницилламин.

Аналоги аминокислот включают аналоги фенилаланина и тирозина. Примеры аминокислотных аналогов фенилаланина и тирозина включают β-метил-фенилаланин, β-гидроксифенилаланин, α-метил-3-метокси-DL-фенилаланин, α-метил-D-фенилаланин, α-метил-L-фенилаланин, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, 2,4-дихлор-фенилаланин, 2-(трифторметил)-D-фенилаланин, 2-(трифторметил)-L-фенилаланин, 2-бром-D-фенилаланин, 2-бром-L-фенилаланин, 2-хлор-D-фенилаланин, 2-хлор-L-фенилаланин, 2-циано-D-фенилаланин, 2-циано-L-фенилаланин, 2-фтор-D-фенилаланин, 2-фтор-L-фенилаланин, 2-метил-D-фенилаланин, 2-метил-L-фенилаланин, 2-нитро-D-фенилаланин, 2-нитро-L-фенилаланин, 2;4;5-тригидрокси-фенилаланин, 3,4,5-трифтор-D-фенилаланин, 3,4,5-трифтор-L-фенилаланин, 3,4-дихлор-D-фенилаланин, 3,4-дихлор-L-фенилаланин, 3,4-дифтор-D-фенилаланин, 3,4-дифтор-L-фенилаланин, 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин, 3,4-диметокси-L-фенилаланин, 3,5,3'-трийод-L-тиронин, 3,5-дийод-D-тирозин, 3,5-дийод-L-тирозин, 3,5-дийод-L-тиронин, 3-(трифторметил)-D-фенилаланин, 3-(трифторметил)-L-фенилаланин, 3-амино-L-тирозин, 3-бром-D-фенилаланин, 3-бром-L-фенилаланин, 3-хлор-D-фенилаланин, 3-хлор-L-фенилаланин, 3-хлор-L-тирозин, 3-циано-D-фенилаланин, 3-циано-L-фенилаланин, 3-фтор-D-фенилаланин, 3-фтор-L-фенилаланин, 3-фтор-тирозин, 3-йод-D-фенилаланин, 3-йод-L-фенилаланин, 3-йод-L-тирозин, 3-метокси-L-тирозин, 3-метил-D-фенилаланин, 3-метил-L-фенилаланин, 3-нитро-D-фенилаланин, 3-нитро-L-фенилаланин, 3-нитро-L-тирозин, 4-(трифторметил)-D-фенилаланин, 4-(трифторметил)-L-фенилаланин, 4-амино-D-фенилаланин, 4-амино-L-фенилаланин, 4-бензоил-D-фенилаланин, 4-бензоил-L-фенилаланин, 4-бис(2-хлорэтил)амино-L-фенилаланин, 4-бром-D-фенилаланин, 4-бром-L-фенилаланин, 4-хлор-D-фенилаланин, 4-хлор-L-фенилаланин, 4-циано-D-фенилаланин, 4-циано-L-фенилаланин, 4-фтор-D-фенилаланин, 4-фтор-L-фенилаланин, 4-йод-D-фенилаланин, 4-йод-L-фенилаланин, гомофенилаланин, тироксин, 3,3-дифенилаланин, тиронин, этилтирозин, и метилтирозин.

Аналоги аминокислот включают аналоги пролина. Примеры аминокислотных аналогов пролина включают, но не ограничиваются указанными, 3,4-дегидропролин, 4-фторпролин, цис-4-гидроксипролин, тиазолидин-2-карбоновую кислоту, и транс-4-фторпролин.

Аналоги аминокислот включают аналоги серина и треонина. Примеры аминокислотных аналогов серина и треонина включают, но не ограничиваются указанными, 3-амино-2-гидрокси-5-метилгексановую кислоту, 2-амино-3-гидрокси-4-метилпентановую кислоту, 2-амино-3-этоксибутановую кислоту, 2-амино-3-метоксибутановую кислоту, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановую кислоту, 2-амино-3-бензилоксипропионовую кислоту, 2-амино-3-бензилоксипропионовую кислоту, 2-амино-3-этоксипропионовую кислоту, 4-амино-3-гидроксибутановую кислоту, и α-метилсерин.

Аналоги аминокислот включают аналоги триптофана. Примеры аминокислотных аналогов триптофана включают следующие, но не ограничиваются ими: α-метилтриптофан; β-(3-бензотиенил)-D-аланин; β-(3-бензотиенил)-L-аланин; 1-метил-триптофан; 4-метилтриптофан; 5-бензилокситриптофан; 5-бромтриптофан; 5-хлортриптофан; 5-фтортриптофан; 5-гидрокситриптофан; 5-гидрокси-L-триптофан; 5-метокситриптофан; 5-метокси-L-триптофан; 5-метилтриптофан; 6-бромтриптофан; 6-хлор-D-триптофан; 6-хлортриптофан; 6-фтортриптофан; 6-метилтриптофан; 7-бензилoкситриптофан; 7-бромтриптофан; 7-метилтриптофан; D-1,2,3,4-тетрагидроноргарман-3-карбоновую кислоту; 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроноргарман-1-карбоновую кислоту; 7-азатриптофан; L-1,2,3,4-тетрагидроноргарман-3-карбоновую кислоту; 5-метокси-2-метил-триптофан; и 6-хлор-L-триптофан.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотные аналоги являются рацемическими. В некоторых вариантах осуществления используют D-изомер аминокислотного аналога. В некоторых вариантах осуществления используют L-изомер аминокислотного аналога. В других вариантах осуществления аминокислотный аналог содержит хиральные центры, которые находятся в R или S конфигурации. В других вариантах осуществления аминогруппа (аминогруппы) аналога β-аминокислоты замещена защитной группой, например, трет-бутилоксикарбонилом (BOC группа), 9-флуоренилметилоксикарбонилом (FMOC), тозилом и подобной. В других вариантах осуществления функциональная группа карбоновой кислоты аналога β-аминокислоты является защищенной, например, ее сложноэфирным производным. В некоторых вариантах осуществления используют соль аминокислотного аналога.

«Не относящийся к незаменимым» аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен в последовательности полипептида дикого типа без прекращения или существенного изменения его биологической или биохимической активности (например, рецепторного связывания или активации). «Незаменимый» аминокислотный остаток представляет собой остаток, который при изменении в последовательности полипептида дикого типа в результате приводит к прекращению или по существу к прекращению основной биологической или биохимической активности полипептида.

«Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в уровне техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, K, R, H), кислыми боковыми цепями (например, D, E), незаряженными полярными боковыми цепями (например, G, N, Q, S, T, Y, C), неполярными боковыми цепями (например, A, V, L, I, P, F, M, W), бета-разветвленными боковыми цепями (например, T, V, I) и ароматическими боковыми цепями (например, Y, F, W, H). Таким образом, предполагаемый аминокислотный остаток, не относящийся к незаменимым, в полипептиде, например, замещен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Другими примерами подходящих замен являются замены, основанные на изостерических критериях (например, норлейцин для метионина) или других свойствах (например, 2-тиенилаланин для фенилаланина, или 6-Cl-триптофан для триптофана).

Термин «блокирующая группа» относится к химической группе, находящейся либо на карбокси, либо на амино конце полипептидной цепи рассматриваемого пептидомиметического макроцикла. Блокирующая группа карбокси-конца включает немодифицированную карбоновую кислоту (т.е. -COOH) или карбоновую кислоту с заместителем. Например, карбоксильный конец может быть замещен аминогруппой для получения карбоксамида на C-конце. Различные заместители включают, но не ограничиваются указанными, первичные и вторичные амины, включая пэгилированные вторичные амины. Характерные блокирующие группы вторичных аминов для С-конца включают:

Блокирующая группа аминоконца включает немодифицированный амин (т.е.-NH₂) или амин с заместителем. Например, аминоконец может быть замещен ацильной группой для получения карбоксамида на N-конце. Различные заместители включают, но не ограничиваются указанными, замещенные ацильные группы, в том числе, C₁-C₆ карбонилы, C₇-C₃₀ карбонилы и пэгилированные карбаматы. Характерные блокирующие группы для N-конца включают, но не ограничиваются указанными, 4-FBzl (4-фтор-бензил) и следующие:

Термин «член» в контексте настоящего изобретения в сочетании с макроциклами или линкерами, образующими макроцикл, относится к атомам, которые образуют или могут образовывать макроцикл, и исключает атомы заместителя или атомы боковой цепи. По аналогии циклодекан, 1,2-дифтордекан и 1,3-диметилциклодекан все считаются десятичленными макроциклами, поскольку водород или фтор-заместители или метильные боковые цепи не участвуют в образовании макроцикла.

Знак при использовании как части молекулярной структуры относится к одинарной связи или транс- или цис- двойной связи.

Термин «боковая цепь аминокислоты» относится к части, присоединенной к α-углероду (или другому атому скелета) в аминокислоте. Например, аминокислотной боковой цепью для аланина является метил, аминокислотной боковой цепью для фенилаланина является фенилметил, аминокислотной боковой цепью для цистеина является тиометил, аминокислотной боковой цепью для аспартата является карбоксиметил, аминокислотной боковой цепью для тирозина является 4-гидроксифенилметил, и так далее. Также включены другие неприродные аминокислотные боковые цепи, например, те, которые встречаются в природе (например, аминокислотный метаболит) или те, которые получены синтетическим путем (например, α,α-ди-замещенная аминокислота).

Термин «α,α-ди-замещенная аминокислота» относится к молекуле или группе, содержащей как аминогруппу, так и карбоксильную группу, связанную с атомом углерода (α-углерод) который присоединен к двум природным или неприродным аминокислотным боковым цепям.

Термин «полипептид» охватывает две или более природных или неприродных аминокислот, соединенных ковалентной связью (например, амидной связью). Полипептиды, как описано в настоящем изобретении, включают полноразмерные белки (например, полностью процессированные белки), а также более короткие аминокислотные последовательности (например, фрагменты природных белков или фрагменты синтетических полипептидов).

Термин «первая С-концевая аминокислота» относится к аминокислоте, которая является ближайшей к С-концу. Термин «вторая С-концевая аминокислота» относится к аминокислоте, присоединенной на N-конце первой С-концевой аминокислоты.

Термин «реагент для макроциклизации» или «реагент, образующий макроцикл» в контексте настоящего изобретения относится к любому реагенту, который может быть использован для получения пептидомиметического макроцикла, опосредуя реакцию между двумя реакционноспособными группами. Реакционноспособными группами, например, могут быть азид и алкин, в этом случае реагенты для макроциклизации включают, без ограничения, Cu реагенты, такие реагенты, которые обеспечивают реакционноспособные Cu(I) группы, такие как CuBr, CuI или CuOTf, а также Cu(II) соли, такие как Cu(CO₂CH₃)₂, CuSO₄ и CuCl₂, которые могут быть преобразованы in situ в активный Cu(I) реагент путем добавления восстанавливающего агента, такого как аскорбиновая кислота или аскорбат натрия. Реагенты для макроциклизации дополнительно могут включать, например, Ru реагенты, известные из уровня техники, такие как Cp*RuCl(PPh₃)₂, [Cp*RuCl]₄ или другие Ru реагенты, которые могут обеспечивать реакционноспособные Ru(II) группы. В других случаях реакционноспособные группы представляют собой концевые олефины. В таких вариантах осуществления реагенты для макроциклизации или реагенты, образующие макроцикл, представляют собой катализаторы метатезиса, но не ограничиваются этим, стабильные комплексные катализаторы поздние переходные металлы - карбен, такие как катализаторы карбеновые производные переходных металлов Группы VIII. Например, такими катализаторами являются Ru и Os металлические центры, имеющие степень окисления +2, электронный счет 16 и пентакоординированные. В других примерах катализаторы имеют W или Mo центры. Различные катализаторы описаны у Grubbs et al., «Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis» Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452, в патенте США № 5811515; в патенте США № 7932397; в заявке США № 2011/0065915; в заявке США № 2011/0245477; у Yu et al., «Synthesis of Macrocyclic Natural Products by Catalyst-Controlled Stereoselective Ring-Closing Metathesis» Nature 2011, 479, 88; и Peryshkov et al., «Z-Selective Olefin Metathesis Reactions Promoted by Tungsten Oxo Alkylidene Complexes» J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20754. В других случаях реакционноспособными группами являются тиольные группы. В таких вариантах осуществления реагент для макроциклизации, например, представляет собой линкер, функционализированный двумя тиол-реакционноспособными группами, такими как галогеновые группы.

Термин «гало» или «галоген» относится к фтору, хлору, брому или йоду, или их радикалу.

Термин «алкил» относится к углеводородной цепи, которая является прямой цепью или разветвленной цепью, содержащей указанное число атомов углерода. Например, C₁-C₁₀ указывает, что группа содержит в себе от 1 до 10 (включительно) атомов углерода. В отсутствие любого цифрового обозначения «алкил» представляет собой цепь (прямую или разветвленную) содержащую в себе от 1 до 20 (включительно) атомов углерода.

Термин «алкилен» относится к двухвалентному алкилу (т.е. -R-).

Термин «алкенил» относится к углеводородной цепи, которая является прямой цепью или разветвленной цепью, имеющей одну или более углерод-углеродных двойных связей. Алкенильный фрагмент содержит указанное число атомов углерода. Например, C₂-C₁₀ указывает, что группа содержит в себе от 2 до 10 (включительно) атомов углерода. Термин «низший алкенил» относится к C₂-C₆ алкенильной цепи. В отсутствие любого цифрового обозначения «алкенил» представляет собой цепь (прямую или разветвленную) содержащу в себе от 2 до 20 (включительно) атомов углерода.

Термин «алкинил» относится к углеводородной цепи, которая представляет собой прямую или разветвленную цепь, имеющую одну или более углерод-углеродных тройных связей. Алкинильная группа содержит указаное число атомов углерода. Например, C₂-C₁₀ указывает, что группа содержит в себе от 2 до 10 (включительно) атомов углерода. Термин «низший алкинил» относится к C₂-C₆ алкинильной цепи. В отсутствие любого цифрового обозначения «алкинил» представляет собой цепь (прямую или разветвленную), содержащую в себе от 2 до 20 (включительно) атомов углерода.

Термин «арил» относится к 6-углеродной моноциклической или 10-углеродной бициклической ароматической кольцевой системе, в которой 0, 1, 2, 3 или 4 атомов каждого кольца замещено заместителем. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил и подобные. Термин «арилалкокси» относится к алкокси, замещенному арилом.

«Арилалкил» относится к арильной группе, как определено выше, в которой один из атомов водорода арильной группы был замещен C₁-C₅ алкильной группой, как определено выше. Характерные примеры арилалкильной группы включают, но не ограничиваются указанными, 2-метилфенил, 3-метилфенил, 4-метилфенил, 2-этилфенил, 3-этилфенил, 4-этилфенил, 2-пропилфенил, 3-пропилфенил, 4-пропилфенил, 2-бутилфенил, 3-бутилфенил, 4-бутилфенил, 2-пентилфенил, 3-пентилфенил, 4-пентилфенил, 2-изопропилфенил, 3-изопропилфенил, 4-изопропилфенил, 2-изобутилфенил, 3-изобутилфенил, 4-изобутилфенил, 2-втор-бутилфенил, 3-втор-бутилфенил, 4-втор-бутилфенил, 2-т-бутилфенил, 3-т-бутилфенил и 4-т-бутилфенил.

«Ариламидо» относится к арильной группе, как определено выше, где один из атомов водорода арильной группы был замещен одной или более -C(O)NH₂ группами. Характерные примеры ариламидо группы включают 2-C(O)NH₂-фенил, 3-C(O)NH₂-фенил, 4-C(O)NH₂-фенил, 2-C(O)NH₂-пиридил, 3-C(O)NH₂-пиридил и 4-C(O)NH₂-пиридил.

«Алкилгетероцикл» относится к C₁-C₅ алкильной группе, как определено выше, в которой один из атомов водорода C₁-C₅ алкильной группы был замещен гетероциклом. Характерные примеры алкилгетероциклической группы включают, но не ограничиваются указанным, -CH₂CH₂-морфолин, -CH₂CH₂-пиперидин, -CH₂CH₂CH₂-морфолин и -CH₂CH₂CH₂-имидазол.

«Алкиламидо» относится к C₁-C₅ алкильной группе, как определено выше, в которой один из атомов водорода C₁-C₅ алкильной группы был замещен -C(O)NH₂ группой. Характерные примеры алкиламидо группы включают, но не ограничиваются указанным, -CH₂-C(O)NH₂, -CH₂CH₂-C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH(C(O)NH₂)CH₃, -CH₂CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃, -CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃, -C(CH₃)₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃-CH₃ и -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH=CH₂.

«Алканол» относится к C₁-C₅ алкильной группе, как определено выше, в которой один из атомов водорода C₁-C₅ алкильной группы был замещен гидроксильной группой. Характерные примеры алканольной группы включают, но не ограничиваются указанным, -CH₂OH, -CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂ CH₂CH₂OH, -CH₂CH(OH)CH₃, -CH₂CH(OH)CH₂CH₃, -CH(OH)CH₃ и -C(CH₃)₂CH₂OH.

«Алкилкарбокси» относится к C₁-C₅ алкильной группе, как определено выше, в которой один из атомов водорода C₁-C₅ алкильной группы был замещен -COOH группой. Характерные примеры алкилкарбоксильной группы включают, но не ограничиваются указанным, -CH₂COOH, -CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH(COOH)CH₃, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH(COOH)CH₂CH₃, -CH(COOH)CH₂CH₃ и -C(CH₃)₂CH₂COOH.

Термин «циклоалкил» в контексте настоящего изобретения включает насыщенные или частично ненасыщенные циклические углеводородные группы, имеющие от 3 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода, и более предпочтительно от 3 до 6 атомов углерода, где циклоалкильная группа дополнительно является необязательно замещенной. Некоторые циклоалкильные группы включают, без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил и циклооктил.

Термин «гетероарил» относится к ароматической 5-8 членной моноциклической, 8-12 членной бициклической или 11-14 членной трициклической кольцевой системе, имеющей 1-3 гетероатомов в случае моноциклической, 1-6 гетероатомов в случае бициклической, или 1-9 гетероатомов в случае трициклической, указанные гетероатомы выбраны из O, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6, или 1-9 гетероатомов O, N, или S в случае моноциклической, бициклической или трициклической, соответственно), где 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого кольца замещено заместителем. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, фурил или фуранил, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, тиофенил или тиенил, хинолинил, индолинил, тиазолил и подобные.

Термин «гетероарилалкил» или термин «гетероаралкил» относится к алкилу, замещенному гетероарилом. Термин «гетероарилалкокси» относится к алкокси, замещенному гетероарилом.

Термин «гетероарилалкил» или термин «гетероаралкил» относится к алкилу, замещенному гетероарилом. Термин «гетероарилалкокси» относится к алкокси, замещенному гетероарилом.

Термин «гетероциклил» относится к неароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической кольцевой системе, имеющей 1-3 гетероатома в случае моноциклической, 1-6 гетероатомов в случае бициклической, или 1-9 гетероатомов в случае трицикличесокй, указанные гетероатомы выбраны из O, N, или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6, или 1-9 гетероатомов O, N, или S в случае моноциклической, бициклической или трициклической, соответственно), где 0, 1, 2 или 3 атома каждого кольца замещены заместителем. Примеры гетероциклильных групп включают пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрагидрофуранил и подобные.

Термин «заместитель» относится к группе, замещающей второй атом или группу, такой как атом водорода или любую молекулу, соединение или фрагмент. Подходящие заместители включают, без ограничения, гало, гидрокси, меркапто, оксо, нитро, галоалкил, алкил, алкарил, арил, аралкил, алкокси, тиоалкокси, арилокси, амино, алкоксикарбонил, амидо, карбокси, алкансульфонил, алкилкарбонил и циано-группы.

В некоторых вариантах осуществления соединения, описанные в настоящем изобретении, содержат один или более асимметричных центров и, следовательно, встречаются в виде рацематов и рацемических смесей, одиночных энантиомеров, отдельных диастереомеров и диастереомерных смесей. Все такие изомерные формы этих соединений включены, если особым образом не указано иное. В некоторых вариантах осуществления соединения, описанные в настоящем изобретении, также представлены в многочисленных таутомерных формах, в таких случаях эти соединения включают все таутомерные формы соединений, описанных в настоящей заявке (например, если алкилирование кольцевой системы в результате приводит к алкилированию в многочисленных сайтах, настоящее изобретение включает все такие продукты реакции). Все такие изомерные формы таких соединений включены, если особым образом не указано иное. Все кристаллические формы соединений, описанных в настоящей заявке, включены, если особым образом не указано иное.

В контексте настоящего изобретения термины «увеличение» и «уменьшение» означают, соответственно, фактор статистически значимого (т.е. p<0,1) увеличения или уменьшения по меньшей мере 5%.

В контексте настоящего изобретения перечисление числового интервала для переменной направлено на выражение, что указанная переменная равна любому из значений в пределах этого интервала. Таким образом, для переменной, которая является по определению дискретной, переменная равна любому целому значению в пределах численного интервала, включая конечные точки этого интервала. Аналогичным образом, для переменной, которая по определению является непрерывной, переменная равна любому действительному значению в пределах этого числового интервала, включая конечные точки этого интервала. В качестве примера и без ограничения переменная, которая описывается как имеющая значения от 0 до 2, принимает значения 0, 1 или 2, если переменная по определению является дискретной, и принимает значения 0,0, 0,1, 0,01, 0,001, или любое другое действительное значение ≥0 и ≤2, если переменная по определению является непрерывной.

В контексте настоящего изобретения, если особым образом не указано иное, союз «или» используют в включающем смысле «и/или», а не в исключающем смысле «либо/либо».

Термин «в среднем» представляет среднее значение, полученное в результате проведения по меньшей мере трех независимых повторов для каждого измеряемого параметра.

Термин «биологическая активность» охватывает структурные и функциональные свойства макроцикла. Биологическая активность, например, представляет собой структурную стабильность, альфа-спиральность, аффинность в отношении мишени, резистентность к протеолитическому расщеплению, клеточную проницаемость, внутриклеточную стабильность, стабильность in vivo, или любое их сочетание.

Термин «аффинность связывания» относится к силе связывающего взаимодействия, например, между пептидомиметическим макроциклом и мишенью. Аффинность связывания может быть выражена, например, в виде равновесной константы диссоциации («K_D»), которая выражается в единицах, которые представляют собой уровень концентрации (например, M, мM, мкM, нM и т.д.). В цифровом выражении значения аффинности связывания и K_D изменяются обратно пропорционально, таким образом, что более низкая аффинность связывания соответствует более высокому значению K_D, тогда как более высокая аффинность связывания соответствует более низком значению K_D. В тех случаях, когда желательна высокая аффинность связывания, «улучшенная» аффинность связывания относится к более высокой аффинности связывания и, следовательно, более низким значениям K_D.

Термин «эффективность in vitro» относится к степени, до которой тестируемое соединение, такое как пептидомиметический макроцикл, дает благоприятный результат в тест-системе или в анализе in vitro. Эффективность in vitro может быть измерена, например, в виде значения «IC₅₀» или «EC₅₀», которое представляет концентрацию тестируемого соединения, которая оказывает 50% от максимального эффекта в этой тест-системе.

Термин «соотношение эффективности in vitro» или «in vitro эффективное соотношение» относится к отношению значений IC₅₀ или EC₅₀ первого анализа (в числителе) и второго анализа (в знаменателе). Следовательно, улучшенное соотношение эффективности in vitro для Анализа 1 и Анализа 2 относится к более низкому значению для этого соотношения, выраженного как IC₅₀(Анализ 1)/IC₅₀(Анализ 2) или, альтернативно, как EC₅₀(Анализ 1)/EC₅₀(Анализ 2). Эта концепция также может быть охарактеризована как «улучшенная селективность» в Анализе 1 по сравнению с Анализом 2, которая может быть либо вследствие снижения значения IC₅₀ или значения EC₅₀ для Мишени 1, либо увеличения значения IC₅₀ или значения EC₅₀ для Мишени 2.

Подробное изложение одного или более конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения представлено на сопровождающих чертежах и в описании, приведенном ниже. Другие особенности, задачи и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.

Пептидомиметические макроциклы

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет Формулу (I):

Формула I,

где:

каждый A, C, D и E независимо представляет собой аминокислоту (в том числе природные или неприродные аминокислоты, и аминокислотные аналоги) концевой D и E независимо необязательно содержат блокирующую группу;

B представляет собой аминокислоту (в том числе природные или неприродные аминокислоты, и аминокислотные аналоги), , [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

L представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20 или 1-10;

u представляет собой целое число от 1 до 10, например, 1-5, 1-3 или 1-2;

x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10, например, сумма x+y+z равна 2, 3, или 6; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах осуществления v и w представляют собой целые числа от 1 до 30. В некоторых вариантах осуществления w представляет собой целое число от 3 до 1000, например, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, или 3-10. В некоторых вариантах осуществления сумма x+y+z равна 3 или 6. В некоторых вариантах осуществления сумма x+y+z равна 3. В других вариантах осуществления сумма x+y+z равна 6.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы также представлены формулой:

,

где:

каждый из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляет собой индивидуально аминокислоту, где по меньшей мере три из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8), где каждый X представляет собой аминокислоту;

каждый D и E независимо представляет собой аминокислоту;

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L' соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

каждый L или L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v представляет собой целое число от 1 до 1000, например, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20 или 1-10;

w представляет собой целое число от 3 до 1000, например, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, или 3-10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах осуществления v и w представляют собой целые числа от 1 до 30. В некоторых вариантах осуществления w представляет собой целое число от 3 до 1000, например, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, или 3-10. В некоторых вариантах осуществления сумма x+y+z равна 3 или 6. В некоторых вариантах осуществления сумма x+y+z равна 3. В других вариантах осуществления сумма x+y+z равна 6.

В некоторых вариантах осуществления любой из формул, описанных в настоящем изобретении, по меньшей мере три из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8). В других вариантах осуществления по меньшей мере четыре из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8). В других вариантах осуществления по меньшей мере пять из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8). В других вариантах осуществления по меньшей мере шесть из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8). В других вариантах осуществления по меньшей мере семь из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-His₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀-X₁₁-Ser₁₂ (SEQ ID NO: 8).

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл имеет Формулу:

,

где:

каждый из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляет собой индивидуально аминокислоту, где по меньшей мере три из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9), где каждый X представляет собой аминокислоту;

каждый D независимо представляет собой аминокислоту;

каждый E независимо представляет собой аминокислоту, например, аминокислоту, выбранную из Ala (аланин), D-Ala (D-аланин), Aib (α-аминоизомасляная кислота), Sar (N-метилглицин), и Ser (серин);

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

каждый L или L' независимо представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с D остатком;

R₈ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры с Е остатком;

v представляет собой целое число от 1 до 1000, например, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, или 1-10;

w представляет собой целое число от 3 до 1000, например, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, или 3-10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах осуществления указанной выше Формулы, по меньшей мере три из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9). В других вариантах осуществления указанной выше Формулы, по меньшей мере четыре из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9)_. В других вариантах осуществления указанной выше Формулы, по меньшей мере пять из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9)_. В других вариантах осуществления указанной выше Формулы, по меньшей мере шесть из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9)_. В других вариантах осуществления указанной выше Формулы, по меньшей мере семь из Xaa₃, Xaa₅, Xaa₆, Xaa₇, Xaa₈, Xaa₉, и Xaa₁₀ представляют собой ту же аминокислоту, что и аминокислота в соответствующем положении последовательности Phe₃-X₄-Glu₅-Tyr₆-Trp₇-Ala₈-Gln₉-Leu₁₀/Cba₁₀-X₁₁-Ala₁₂ (SEQ ID NO: 9)_.

В некоторых вариантах осуществления w представляет собой целое число от 3 до 10, например, 3-6, 3-8, 6-8, или 6-10. В некоторых вариантах осуществления w равно 3. В других вариантах осуществления w равно 6. В некоторых вариантах осуществления v представляет собой целое число от 1 до 10, например, 2-5. В некоторых вариантах осуществления v равно 2.

В одном из вариантов осуществления любой из Формул, описанных в настоящем изобретении, L₁ и L₂, либо отдельно, либо в сочетании, не образуют триазол или тиоэфир.

В одном примере по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В другом примере оба R₁ и R₂ независимо представляют собой алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой метил. В других вариантах осуществления R₁ и R₂ представляют собой метил.

В некоторых вариантах осуществления x+y+z равно по меньшей мере 3. В других вариантах осуществления x+y+z равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления сумма x+y+z равна 3 или 6. В некоторых вариантах осуществления сумма x+y+z равна 3. В других вариантах осуществления сумма x+y+z равна 6. Каждый раз A, B, C, D или E в макроцикле или предшественнике макроцикла выбирают независимо. Например, последовательность, представленная формулой [A]_x, в тех случаях, когда x равно 3, охватывает варианты осуществления, в которых аминокислоты не являются идентичными, например, Gln-Asp-Ala, а также варианты осуществления, в которых аминокислоты являются идентичными, например, Gln-Gln-Gln. Это применимо для любого значения x, y, или z в указанных диапазонах. Аналогично, в тех случаях, когда u больше 1, каждое соединение может охватывать пептидомиметические макроциклы, которые являются одинаковыми или различными. Например, соединение может содержать пептидомиметические макроциклы, содержащие линкеры различной длины или химического состава.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл включает вторичную структуру, которая представляет собой α-спираль, а R₈ представляет собой -H, допуская образование водородных связей внутри спирали. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой α,α-дизамещенную аминокислоту. В одном примере B представляет собой α,α-дизамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту. В других вариантах осуществления по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой .

В других вариантах осуществления длину линкера L, образующего макроцикл, измеренную от первого Cα до второго Cα, выбирают для стабилизации желаемой вторичной структуры пептида, такой как α-спираль, образованную остатками пептидомиметического макроцикла, включающими, но не обязательно ограниченными, остатки между первым Cα и вторым Cα.

В одном варианте осуществления пептидомиметический макроцикл Формулы (I) представляет собой:

,

где каждый R₁ и R₂ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном.

В связанных вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл Формулы (I) представляет собой:

,

где каждый R₁' и R₂' независимо представляет собой аминокислоту.

В других вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл Формулы (I) представляет собой соединение любой из формул, показанных ниже:

где «AA» представляет любую боковую цепь природной или неприродной аминокислоты, и представляет собой [D]_v, [E]_w как определено выше, и n представляет собой целое число от 0 до 20, 50, 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления n равно 0. В других вариантах осуществления n меньше 50.

Приводимые в качестве примера варианты осуществления линкера L, образующего макроцикл, показаны ниже.

В других вариантах осуществления D и/или E в соединении Формулы I дополнительно модифицированы для облегчения клеточного поглощения. В некоторых вариантах осуществления липидирование или ПЭГилирование пептидомиметического макроцикла облегчает клеточное поглощение, повышает биодоступность, увеличивает циркуляцию крови, изменяет фармакокинетику, снижает иммуногенность и/или снижает необходимую частоту введения.

В других вариантах осуществления по меньшей мере один из [D] и [E] в соединении Формулы I представляет функциональную группу, содержащую дополнительный линкер, образующий макроцикл, таким образом, что пептидомиметический макроцикл содержит по меньшей мере два линкера, образующих макроцикл. В конкретном варианте осуществления пептидомиметический макроцикл содержит два линкера, образующих макроцикл. В одном из вариантов осуществления u равно 2.

В некоторых вариантах осуществления любой из линкеров, образующих макроцикл, описанный в настоящем изобретении, может быть использован в любом сочетании с любой из последовательностей, показанных в Таблице 1, Таблице 1a, Таблице 1b (см. в графической части), или Таблице 1c, а также с любым из R-заместителей, указанных в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл содержит по меньшй мере один α-спиральный мотив. Например, A, B и/или C в соединении Формулы I включают одну или более α-спиралей. В большинстве случаев α-спирали включают от 3 до 4 аминокислотных остатков на виток спирали. В некоторых вариантах осуществления α-спираль пептидомиметического макроцикла включает от 1 до 5 витков, и, следовательно, от 3 до 20 аминокислотных остатков. В конкретных вариантах осуществления, α-спираль содержит 1 виток, 2 витка, 3 витка, 4 витка или 5 витков. В некоторых вариантах осуществления линкер, образующий макроцикл, стабилизирует α-спиральный мотив, включенный в пептидомиметический макроцикл. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления длину линкера L, образующего макроцикл, от первого Cα до второго Cα выбирают для повышения стабильности α-спирали. В некоторых вариантах осуществления линкер, образующий макроцикл, охватывает от 1 витка до 5 витков α-спирали. В некоторых вариантах осуществления линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 1 виток, 2 витка, 3 витка, 4 витка или 5 витков α-спирали. В некоторых вариантах осуществления длина линкера, образующего макроцикл, составляет, приблизительно, от 5 Å до 9 Å на виток α-спирали, или приблизительно от 6 Å до 8 Å на виток α-спирали. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 1 виток α-спирали, длина равна, приблизительно, 5 углерод-углеродным связям - 13 углерод-углеродным связям, приблизительно 7 углерод-углеродным связям - 11 углерод-углеродным связям, или приблизительно 9 углерод-углеродным связям. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 2 витка α-спирали, длина равна, приблизительно, 8 углерод-углеродным связям - 16 углерод-углеродным связям, приблизительно 10 углерод-углеродным связям - 14 углерод-углеродным связям, или приблизительно 12 углерод-углеродным связям. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 3 витка α-спирали, длина равна приблизительно 14 углерод-углеродным связям - 22 углерод-углеродным связям, приблизительно 16 углерод-углеродным связям - 20 углерод-углеродным связям, или приблизительно 18 углерод-углеродным связям. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 4 витка α-спирали, длина равна приблизительно 20 углерод-углеродным связям - 28 углерод-углеродным связям, приблизительно 22 углерод-углеродным связям - 26 углерод-углеродным связям, или приблизительно 24 углерод-углеродным связям. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 5 витков α-спирали, длина равна приблизительно 26 углерод-углеродным связям - 34 углерод-углеродным связям, приблизительно 28 углерод-углеродным связям - 32 углерод-углеродным связям, или приблизительно 30 углерод-углеродным связям. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 1 виток α-спирали, эта связь содержит, приблизительно, от 4 атомов до 12 атомов, приблизительно, от 6 атомов до 10 атомов, или, приблизительно, 8 атомов. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 2 витка α-спирали, эта связь содержит приблизительно от 7 атомов до 15 атомов, приблизительно, от 9 атомов до 13 атомов, или, приблизительно, 11 атомов. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 3 витка α-спирали, эта связь содержит, приблизительно, от 13 атомов до 21 атома, приблизительно, от 15 атомов до 19 атомов, или, приблизительно, 17 атомов. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 4 витка α-спирали, эта связь содержит, приблизительно, от 19 атомов до 27 атомов, приблизительно, от 21 атома до 25 атомов, или, приблизительно, 23 атома. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 5 витков α-спирали, эта связь содержит, приблизительно, от 25 атомов до 33 атомов, приблизительно, от 27 атомов до 31 атомов, или приблизительно 29 атомов. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 1 виток α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, содержащее, приблизительно, от 17 до 25 членов, приблизительно от 19 до 23 членов, или приблизительно 21 член. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 2 витка α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, содержащее, приблизительно, от 29 членов до 37 членов, приблизительно от 31 до 35 членов, или, приблизительно, 33 члена. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 3 витка α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, содержащее, приблизительно, от 44 членов до 52 членов, приблизительно от 46 до 50 членов, или, приблизительно, 48 членов. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 4 витка α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, содержащее приблизительно от 59 членов до 67 членов, приблизительно от 61 до 65 членов, или, приблизительно, 63 члена. В тех случаях, когда линкер, образующий макроцикл, охватывает, приблизительно, 5 витков α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, содержащее приблизительно от 74 до 82 членов, приблизительно от 76 до 80 членов или, приблизительно, 78 членов.

В других вариантах осуществления представлены пептидомиметические макроциклы Формулы (IV) или (IVa):

,

где:

каждый A, C, D, и E независимо представляет собой природную или неприродную аминокислоту, и концевые D и E независимо необязательно содержат блокирующую группу;

B представляет собой природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты, , [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном; или по меньшей мере один из R₁ и R₂ образует формирующий макроцикл линкер L', соединенный с альфа-положением одной из указанных D или Е аминокислот;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

L представляет собой линкер, образующий макроцикл, формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый необязательно замещен R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000;

u представляет собой целое число от 1 до 10;

x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В одном примере, L₁ и L₂, либо отдельно, либо в сочетании, не образуют триазол или тиоэфир.

В одном примере, по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В другом примере, оба R₁ и R₂ независимо представляют собой алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой метил. В других вариантах осуществления R₁ и R₂ представляют собой метил.

В некоторых вариантах осуществления x+y+z равно по меньшей мере 1. В других вариантах осуществления x+y+z равно по меньшей мере 2. В других вариантах осуществления x+y+z равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Каждый раз A, B, C, D или E в макроцикле или предшественнике макроцикла выбирают независимо. Например, последовательность, представленная формулой [A]_x, в тех случаях, когда x равно 3, охватывает варианты осуществления, в которых аминокислоты не являются идентичными, например, Gln-Asp-Ala, а также варианты осуществления, в которых аминокислоты являются идентичными, например, Gln-Gln-Gln. Это применимо для любого значения x, y или z в указанных интервалах.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл содержит вторичную структуру, которая представляет собой α-спираль, а R₈ представляет собой -H, допуская внутриспиральное образование водородных связей. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой α,α-дизамещенную аминокислоту. В одном примере, B представляет собой α,α-дизамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту. В других вариантах осуществления по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой .

В других вариантах осуществления длину линкера L, образующего макроцикл, измеренную от первого Cα до второго Cα, выбирают для стабилизации желаемой вторичной структуры пептида, такой как α-спираль, образованная остатками пептидомиметического макроцикла, включая, но необязательно ограничиваясь, остатки между первым Cα и вторым Cα.

Приводимые в качестве примера варианты осуществления линкера, образующего макроцикл, -L₁-L₂- показаны ниже.

Если не указано иное, считается, что любые соединения (включая пептидомиметические макроциклы, предшественники макроциклов и другие композиции) также охватывают соединения, которые отличаются только присутствием одного или более изотопно-обогащенных атомов. Например, соединения, имеющие описанные структуры, за исключением замены водорода дейтерием или тритием, или замены углерода ¹³C- или ¹⁴C-обогащенным углеродом, входят в объем настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления соединения, описанные в настоящей заявке, могут содержать необычные пропорции атомных изотопов в одном или более атомов, которые составляют такие соединения. Например, соединения могут быть радиоактивно мечены радиоактивными изотопами, например, такими как тритий (³H), йод-125 (¹²⁵I) или углерод-14 (¹⁴C). В других вариантах осуществления один или более атомов углерода заменено атомом кремния. Все изотопные варианты соединений, описанных в настоящей заявке, радиоактивных, или нет, предусмотрены настоящим описанием.

Получение пептидомиметических макроциклов

Пептидомиметические макроциклы могут быть получены любым из целого ряда способов, известных из уровня техники. Например, любой из остатков, обозначенных «$» или «$r8» в Таблице 1, Таблице 1a, Таблице 1b (см. в графической части), или Таблице 1c, может быть замещен остатком, способным образовывать химическое соединение, сшивающее линейные полимеры, вторым остатком в той же молекуле или предшественнике такого остатка.

Различные способы для осуществления формирования пептидомиметических макроциклов известны из уровня техники. Например, получение пептидомиметических макроциклов Формулы I описано у Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); в патенте США № 7192713 и в заявке PCT WO 2008/121767. α,α-дизамещенные аминокислоты и аминокислотные предшественники, описанные в процитированных ссылках, могут быть использованы при синтезе полипептидов-предшественников пептидомиметического макроцикла. Например, «аминокислота S5-олефин» представляет собой (S)-α-(2'-пентенил)аланин, а «аминокислота R8 олефин» представляет собой (R)-α-(2'-октенил)аланин. После включения таких аминокислот в полипептиды-предшественники, концевые олефины взаимодействуют с катализатором метатезиса олефинов, приводя к образованию пептидомиметического макроцикла. В различных вариантах осуществления следующие аминокислоты могут быть использованы в синтезе пептидомиметического макроцикла:

В других вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы представляют собой макроциклы Формулы IV или IVa. Способы получения таких макроциклов описаны, например, в патенте США № 7202332.

Дополнительные способы получения пептидомиметических макроциклов, которые предполагаются как подходящие, включают способы, описанные Mustapa, M. Firouz Mohd et al., J. Org. Chem (2003), 68, pp. 8193-8198; Yang, Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pp. 1403-1406; в патенте США № 5364851; в патенте США № 5446128; в патенте США № 5824483; в патенте США № 6713280; и в патенте США № 7202332. В таких вариантах осуществления используют предшественники аминокислот, содержащие дополнительный заместитель R- в альфа-положении. Такие аминокислоты включены в предшественник макроцикла в желаемых положениях, которые могут быть в положениях, где линкер, сшивающий линейные полимеры, является замещенным или, альтернативно, в других местах в последовательности предшественника макроцикла. Циклизацию предшественника затем проводят в соответствие с указанным способом.

Анализы

Свойства пептидомиметических макроциклов анализируют, например, путем использования способов, описанных ниже. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл обладает улучшенными биологическими свойствами по сравнению с соответствующим полипептидом, лишенным заместителей, описанных в настоящей заявке.

Исследование для определения α-спиральности

В растворе вторичная структура полипептидов с α-спиральными доменами будет достигать динамического равновесия между случайными спиральными структурами и α-спиральными структурами, зачастую выражаемого как «процент спиральности». Таким образом, например, альфа-спиральные домены представляют собой преимущественно случайные клубки в растворе, с содержанием α-спиралей обычно ниже 25%. Пептидомиметические макроциклы с оптимизированными линкерами, с другой стороны, обладают, например, альфа-спиральностью, которая по меньшей мере в два раза выше, чем у соответствующего полипептида без поперечных связей. В некоторых вариантах осуществления макроциклы будут обладать альфа-спиральностью, превышающей 50%. Для анализа спиральности пептидомиметических макроциклов соединения растворяют в водном растворе (например, 50 мM растворе фосфата калия при pH 7, или дистиллированной H₂O, до концентраций 25-50 мкМ). Спектры кругового дихроизма (CD) получают на спектрополяриметре (например, Jasco J-710) используя стандартные параметры измерения (например, температура 20ºC; длина волны 190-260 нм; шаг разрешения 0,5 нм; скорость 20 нм/с; накопление 10; ответ 1 с; ширина полосы 1 нм; длина оптического пути 0,1 см). Содержание α-спиралей каждого пептида вычисляют путем деления средней эллиптичности остатка (например, [Φ]222obs) на полученное значение для модельного спирального декапептида (Yang et al. (1986), Methods Enzymol. 130:208)).

Анализ для определения температуры плавления (Tпл)

Пептидомиметический макроцикл, содержащий вторичную структуру, такую как α-спираль, демонстрирует, например, более высокую температуру плавления, чем соответствующий полипептид без поперечных связей. Обычно пептидомиметические макроциклы демонстрируют Tпл > 60ºC представляя высоко стабильную структуру в водных растворах. Для анализа действия образования макроцикла на температуру плавления, пептидомиметические макроциклы или немодифицированные пептиды растворяют в дистиллированной H₂O (например, в конечной концентрации 50 мкM), и Tпл определяют путем измерения изменения эллиптичности во всем температурном интервале (например, от 4 до 95ºC) на спектрополяриметре (например, Jasco J-710) используя стандартные параметры (например, длина волны 222 нм; шаг разрешения 0,5 нм; скорость 20 нм/с; накопления 10; ответ 1 с; ширина полосы 1 нм; скорость повышения температуры: 1ºC/мин; длина оптического пути 0,1 см).

Анализ резистентности к действию протеаз

Амидная связь пептидного скелета подвержена гидролизу под действием протеаз, тем самым переводя пептидные соединения в состояние, подверженное быстрому разрушению in vivo. Образование пептидной спирали, однако, обычно прячет амидный скелет, и, следовательно, может защитить его от протеолитического расщепления. Пептидомиметические макроциклы могут подврегаться трипсиновому протеолизу in vitro для определения какого-либо изменения в скорости разрушения по сравнению с соответствующим полипептидом без поперечных связей. Например, пептидомиметический макроцикл и соответствующий полипептид без поперечных связей инкубируют с трипсин-агарозой, и реакции гасят в различные моменты времени путем центрифугирования и последующего впрыска ВЭЖХ для количественной оценки остаточного субстрата посредством ультрафиолетового поглощения при 280 нм. Вкратце, пептидомиметический макроцикл и пептидомиметический предшественник (5 мкг) инкубируют с трипсин-агарозой (Pierce) (S/E ~125) в течение 0, 10, 20, 90 и 180 минут. Реакции гасят с помощью настольного центрифугирования с высокой скоростью; остаточный субстрат в выделенном супернатанте количественно оценивают путем определения пика на основе ВЭЖХ при 280 нм. Протеолитическая реакция демонстрирует кинетику первого порядка и константу скорости k определяют по графику зависимости ln[S] от времени (k=-1X угол наклона).

Анализ стабильности ex vivo

Пептидомиметические макроциклы с оптимизированными линкерами имеют, например, период полужизни ex vivo, который по меньшей мере в два раза больше периода полужизни соответствующего полипептида без поперечных связей, и имеет период полужизни ex vivo 12 часов или более. Для исследований стабильности в сыворотке ex vivo можно использовать целый ряд различных анализов. Например, пептидомиметический макроцикл и соответствующий полипептид без поперечных связей (2 мкг) инкубируют со свежей сывороткой мыши, крысы и/или человека (2 мл) при 37ºC в течение 0, 1, 2, 4, 8 и 24 часов. Для определения уровня интактного соединения могут быть использованы следующие процедуры: образцы экстрагируют путем переноса 100 мкл сыворотки в 2 мл центрифужные пробирки с последующим добавлением 10 мкл 50% муравьиной кислоты и 500 мкл ацетонитрила, и центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин при 4±2ºC. Затем супернатанты переносят в новые 2 мл пробирки и выпаривают на Turbovap в атмосфере N₂ < 10 фунтов на квадратный дюйм, 37ºC. Образцы восстанавливают в 100 мкл 50:50 смеси ацетонитрил:вода и подвергают LC-MS/MS анализу.

Анализы связывания in vitro

Для оценки связывания и аффинности пептидомиметических макроциклов и пептидомиметических предшественников в отношении акцепторных белков, использовали, например, флуоресцентный поляризационный анализ (FPA). Методика FPA позволяет определить молекулярную ориентацию и подвижность, используя поляризованный свет и флуоресцентное меченое вещество. Когда возбужденные поляризованным светом флуоресцентные меченые вещества (например, FITC) прикрепляются к молекулам с высокой средней молекулярной массой (например, FITC-меченые пептиды, связанные с крупным белком), они испускают более высокие уровни поляризованной флуоресценции, вследствие своей более низкой скорости вращения по сравнению с флуоресцентными мечеными веществами, прикрепленными к более мелким молекулам (например, FITC-меченые пептиды, которые являются свободными в растворе).

Например, флуоресцирующие пептидомиметические макроциклы (25 нM) инкубируют с акцепторным белком (25-1000 нM) в связывающем буфере (140 мM NaCl, 50 мM Tris-HCL, pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Активность связывания измеряют, например, с помощью флуоресцентной поляризации на люминесцентном спектрофотометре (например, Perkin-Elmer LS50B). Значения Kd можно определить анализом нелинейной регрессии, используя, например, программное обеспечение Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Пептидомиметический макроцикл демонстрирует в некоторых вариантах осуществления сходную или более низкую Kd, чем соответствующий полипептид без поперечных связей.

Анализы смещения для характеристики антагонистов взаимодействий пептид-белок in vitro

Для оценки связывания и аффинности соединений, которые противодействуют взаимодействию между пептидом и акцепторным белком, используют, например, флуоресцентный поляризационный анализ (ФПА), с использованием флуоресцирующего пептидомиметического макроцикла, полученного из последовательности пептидомиметического предшественника. Методика ФПА позволяет определить молекулярную ориентацию и подвижность, используя поляризованный свет и флуоресцентное меченое вещество. Когда возбужденные поляризованным светом флуоресцентные меченые вещества (например, FITC) прикрепляются к молекулам с высокой средней молекулярной массой (например, FITC-меченые пептиды, связанные с крупным белком), они испускают более высокие уровни поляризованной флуоресценции, вследствие своей более низкой скорости вращения по сравнению с флуоресцентными мечеными веществами, прикрепленными к более мелким молекулам (например, FITC-меченые пептиды, которые являются свободными в растворе). Соединение, которое противодействует взаимодействию между флуоресцирующим пептидомиметическим макроциклом и акцепторным белком, будет определено в ФПА эксперименте конкурентного связывания.

Например, предполагаемые антагонистические соединения (1 нM-1 мM) и флуоресцирующий пептидомиметический макроцикл (25 нM) инкубируют с акцепторным белком (50 нM) в связывающем буфере (140 мM NaCl, 50 мM Tris-HCL, pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Активность связывания антагониста измеряют, например, с помощью флуоресцентной поляризации на люминесцентном спектрофотометре (например, Perkin-Elmer LS50B). Значения Kd можно определить анализом нелинейной регрессии, используя, например, программное обеспечение Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Любой класс молекул, такой как органические молекулы с низкой молекулярной массой, пептиды, олигопептиды или белки могут быть проанализированы в качестве предполагаемых антагонистов в этом исследовании.

Анализ связывания белок-лиганд с помощью аффинной селекции-масс-спектрометрии

Для оценки связывания и аффинности тестируемых соединений в отношении белков, например, используют аффинную селекцию-масс-спектрометрический анализ. Эксперименты по связыванию белок-лиганд проводят в соответствии со следующей репрезентативной методикой, предусмотренной для общесистемного контрольного эксперимента, используя 1 мкМ пептидомиметического макроцикла плюс 5 мкл hMDM2. 1 мкл аликвоты DMSO 40 мкМ маточного раствора пептидомиметического макроцикла растворяют в 19 мкл PBS (забуференный фосфатом солевой раствор: 50 мM, pH 7,5 фосфатный буфер, содержащий 150 мM NaCl). Полученный в результате раствор перемешивают повторным пипетированием и осветляют центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. К 4 мкл аликовты полученного в результате супернатанта, добавляют 4 мкл 10 мкM hMDM2 в PBS. Каждый экспериментальный образец 8,0 мкл, таким образом, содержит 40 пмоль (1,5 мкг) белка с концентрацией 5,0 мкМ в PBS плюс 1 мкM пептидомиметический макроцикл и 2,5% DMSO. Таким образом, образцы в двух повторах, полученные для каждого значения концентрации, инкубируют в течение 60 минут при комнатной температуре, а затем охлаждают до 4ºC перед анализом с помощью гель-проникающей хроматографии LC-MS 5,0 мкл образцов. Образцы, содержащие белок-мишень, комплексы белок-лиганд и несвязавшиеся соединения вводят в SEC колонку, где комплексы отделяют от несвязавшегося компонента путем быстрой SEC стадии. Элюат SEC колонки подвергают мониторингу, используя УФ детекторы для подтверждения, что ранее элюирующая фракция белка, которая элюирует в свободный объем SEC колонки, хорошо отделяется от несвязавшихся компонентов, которые удерживаются в колонке. После этого пик, содержащий белок и комплексы белок-лиганд, элюирует из первичного УФ детектора, он входит в пробоотборную петлю, где отделяется от потока на стадии SEC и непосредственно переносится в LC-MS посредством клапанного механизма. (M+3H)³⁺ ион пептидомиметического макроцикла наблюдают с помощью ESI-MS с ожидаемым m/z, подтверждая детекцию комплекса белок-лиганд.

Анализ экспериментов титрования Kd белок-лиганд

Для оценки связывания и аффинности тестируемых соединений в отношении белков, проводили, например, эксперимент титрования Kd белок-лиганд. Эксперимент титрования K_d белок-лиганд проводят следующим образом: готовят 2 мкл аликвоты DMSO серийно разведенного титрирующего маточного раствора пептидомиметического макроцикла (5, 2,5, …, 0,098 мM), затем разводят в 38 мкл PBS. Полученные в результате растворы перемешивают повторным пипетированием и осветляют центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. К 4,0 мкл аликвотам полученных супернатантов добавляют 4,0 мкл 10 мкМ hMDM2 в PBS. Каждый 8,0 мкл экспериментальный образец, таким образом, содержит 40 пмоль (1,5 мкг) белка в концентрации 5,0 мкМ в PBS, различные концентрации (125, 62,5, …, 0,24 мкM) титрирующего раствора пептида и 2,5% DMSO. Полученные таким образом образцы в двух повторах для каждого значения концентрации инкубируют при комнатной температуре, затем охлаждают до 4ºC перед анализом SEC-LC-MS 2,0 мкл образцов. (M+H)¹⁺, (M+2H)²⁺, (M+3H)³⁺, и/или (M+Na)¹⁺ ион наблюдают с помощью ESI-MS; полученные хроматограммы ионов количественно анализируют, затем аппроксимируют к уравнениям для получения K_d аффинности связывания, как описано в «A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures» Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; также в «ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions» D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Под редакцией Wanner K, Höfner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (серийные издания): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Анализ экспериментов конкурентного связывания с помощью аффинной селекции-масс-спектрометрии

Для определения способности тестируемых соединений конкуретно связываться с белками, проводят, например, масс-спектрометрический анализ аффинной селекции. Смесь лигандов в концентрации 40 мкМ на компонент готовят путем объединения 2 мкл аликвот 400 мкМ маточных растворов каждого из трех соединений с 14 мкл DMSO. Затем 1 мкл аликвоты этой смеси 40 мкM на компонент объединяют с 1 мкл аликвотами DMSO серийно разведенного титрационного маточного раствора пептидомиметического макроцикла (10, 5, 2,5, …, 0,078 мM). Эти 2 мкл образцы растворяют в 38 мкл PBS. Полученные в результате растворы перемешивали повторным пипетированием и осветляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. К 4,0 мкл аликвотам полученных в результате супернатантов добавляют 4,0 мкл 10 мкМ белка hMDM2 в PBS. Каждый экспериментальный образец 8,0 мкл, таким образом, содержит 40 пмоль (1,5 мкг) белка с концентрацией 5,0 мкМ в PBS плюс 0,5 мкМ лиганда, 2,5% DMSO и различные концентрации (125, 62,5, …, 0,98 мкM) титрационного раствора пептидомиметического макроцикла. Полученные, таким образом, образцы в двух повторах для каждого значения концентрации инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин, затем охлаждают до 4ºC перед SEC-LC-MS анализом 2,0 мкл образцов. Дополнительные подробности, касающиеся этих и других способов, приведены в «A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures» Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; также в «ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions» D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Под редакцией Wanner K, Höfner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (серийные издания): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Анализы связывания в интактных клетках

Возможно количественное определение связывания пептидов или пептидомиметических макроциклов с их природными акцепторами в интактных клетках с использованием экспериментов по иммунопреципитации. Например, интактные клетки инкубируют с флуоресцирующими (FITC-мечеными) соединениями в течение 4 часов в отсутствие сыворотки с последующей заменой сыворотки и дополнительной инкубации, время которой находится в интервале от 4 до 18 часов. Затем клетки осаждают и инкубируют в лизирующем буфере (50 мM Tris [pH 7,6], 150 мM NaCl, 1% CHAPS и смесь ингибиторов протеаз) в течение 10 минут при 4ºC. Экстракты центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 минут и супернатанты собирают и инкубируют с 10 мкл козьего анти-FITC антитела в течение 2 часов, вращая при 4ºC с последующим дополнительным инкубированием при 4ºC с белком A/G Сефарозой (50 мкл 50% густой суспензии бусин). После быстрого центрифугирования осадки промывают в лизирующем буфере, содержащем возрастающую концентрацию соли (например, 150, 300, 500 мM). Бусины затем повторно уравновешивают при 150 мM NaCl перед добавлением SDS-содержащего буфера для образца и кипячением. После центрифугирования супернатанты необязательно подвергают электрофорезу, используя 4-12% градиент бис-Трис гелей с последующим переносом на мембраны Immobilon-P. После блокирования блоты необязательно инкубируют с антителом, которое выявляет FITC, а также с одним или более антителами, которые выявляют белки, которые связываются с пептидомиметическим макроциклом.

Анализы клеточной проницаемости

Пептидомиметический макроцикл является, например, более доступным для проникновения в клетки по сравнению с соответствующим макроциклом без поперечных связей. Пептидомиметические макроциклы с оптимизированными линкерами обладают, например, клеточной проницаемостью, которая по меньшей мере в два раза выше, чем у соответствующего макроцикла без поперечных связей, а зачастую 20% или более применяемых пептидомиметических макроциклов по наблюдениям проникнет в клетку через 4 часа. Для измерения клеточной проницаемости пептидомиметических макроциклов и соответствующих макроциклов без поперечных связей, интактные клетки инкубируют с флуоресцентно меченными (например, флуоресцирующими) пептидомиметическими макроциклами или соответствующим макроциклом без поперечных связей (10 мкМ) в течение 4 часов в бессывороточной среде при 37ºC, промывают дважды средой и инкубируют с трипсином (0,25%) в течение 10 мин при 37ºC. Клетки снова промывают и ресуспендируют в PBS. Анализируют флуоресценцию клеток, например, используя либо проточный цитометр FACSCalibur, либо Cellomics' KineticScan ® HCS Reader.

Анализы клеточной эффективности

Эффективность определенных пептидомиметических макроциклов определяют, например, в анализах уничтожения клеток, используя различные онкогенные и неонкогенные клеточные линии и первичные клетки, полученные из клеточных популяций людей или мышей. Мониторинг жизнеспособности клеток осуществляют, например, на протяжении 24-96 часов инкубации с пептидомиметическими макроциклами (0,5-50 мкМ) для идентификации тех, которые вызывают уничтожение при EC₅₀<10 мкM. Несколько стандартных анализов, в которых измеряют жизнеспособность клеток, являются коммерчески доступными и необязательно используются для оценки эффективности пептидомиметических макроциклов. Кроме того, анализы, в которых измеряют аннексин V и активацию каспазы, необязательно используют для оценки, уничтожают ли клетки пептидомиметические макроциклы путем активации механизма апоптоза. Например, используют анализ Cell Titer-glo, в котором определяют жизнеспособность клеток как функцию внутриклеточной концентрации АТФ.

Анализ стабильности in vivo

Для исследования стабильности пептидомиметических макроциклов in vivo соединения, например, вводят мышам и/или крысам внутривенным, внутрибрюшинным, пероральным или ингаляционным путем в концентрациях в интервале от 0,1 до 50 мг/кг и образцы крови брали через 0', 5', 15', 30', 1 час, 4 часа, 8 часов и 24 часа после инъекции. Затем измеряли уровни интактного соединения в 25 мкл свежей сыворотки с помощью LC-MS/MS, как описано выше.

In vivo эффективность в животных моделях

Для определения антионкогенной активности пептидомиметических макроциклов in vivo, эти соединения, например, вводят отдельно (внутрибрюшинно, внутривенно, перорально, ингаляционным или назальным путем), или в сочетании с субоптимальными дозами релевантных химиотерапевтических средств (например, циклофосфамидом, доксорубицином, этопозидом). В одном примере, 5×10⁶ RS4; 11 клеток (полученных из костного мозга пациента с острым лимфобластным лейкозом), которые стабильно экспрессируют люциферазу, водят в хвостовую вену мышей с NOD-SCID, через 3 часа их подвергали полному облучению всего тела. Без облучения эта форма лейкоза является смертельной через 3 недели в этой модели. Лейкоз легко подвергается мониторингу, например, путем введения мышам D-люциферина (60 мг/кг) и визуализации анестезированных животных (например, Xenogen In Vivo Imaging System, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Биолюминесценцию всего организма количественно определяют путем интеграции потока фотонов (фотоны/сек) с помощью программного обеспечения Living Image (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Пептидомиметические макроциклы отдельно или в сочетании с субоптимальными дозами релевантных химиотерапевтических средств, например, вводят мышам с лекозом (10 дней после инъекции/день 1 эксперимента в биолюминесцентром диапазоне 14-16) в хвостовую вену или внутрибрюшинным путем в дозах, в интервале от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг в течение от 7 до 21 дня. Необязательно, мышей визуализируют на протяжении всего эксперимента через день, а выживание контролируют ежедневно на протяжении всего эксперимента. Погибших мышей необязательно подвергают некропсии в конце эксперимента. Другая животная модель представляет собой имплантацию DoHH2 мышам с NOD-SCID, клеточной линии, полученной из фолликулярной лимфомы человека, которая стабильно экспрессирует люциферазу. Эти in vivo тесты необязательно предоставляют предварительные фармакокинетические, фармакодинамические и токсикологические данные.

Клинические испытания

Для определения пригодности пептидомиметических макроциклов для лечения людей, проводили клинические испытания. Например, пациенты, у которых диагностировано злокачественное заболевание, и нуждающиеся в лечении, могут быть выбраны и разделены на испытуемые и одну или более контрольные группы, где испытуемой группе вводят пептидомиметический макроцикл, тогда как контрольные группы получают плацебо или известное противоопухолевое лекарственное средство. Безопасность лечения и эффективность пептидомиметических макроциклов, таким образом, можно оценить, проводя сравнение групп пациентов в отношении таких факторов, как выживаемость и качество жизни. В этом примере группа пациентов, получавшая лечение пептидомиметическим макроциклом, может продемонстрировать улучшенное длительное выживание по сравнению с контрольной группой пациентов, получавших плацебо.

Фармацевтические композиции и пути введения

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают пептидомиметические макроциклы и их фармацевтически приемлемые производные и пролекарства. «Фармацевтически приемлемое производное» означает любую фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, соль или сложный эфир, пролекарство или другое производное соединения, описанного в настоящей заявке, которое при введении реципиенту способно обеспечивать (прямо или опосредовано) соединение, описанное в настоящей заявке. Особенно подходящими производными являются те, которые повышают биодоступность соединений при введении млекопитающему (например, путем повышения абсорбции в крови перорально введенного соединения), или которое повышает доставку активного соединения в биологический компартмент (например, головной мозг или лимфатическую систему) по сравнению с исходными типами. Некоторые фармацевтически приемлемые производные включают химическую группу, которая повышает водную растворимость или активный транспорт через слизистую желудочно-кишечного тракта.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы модифицированы путем ковалентного или нековалентного присоединения соответствующих функциональных групп для повышения селективных биологических свойств. Такие модификации включают те, которые повышают биологическое проникновение в заданный биологический компартмент (например, кровь, лимфатическую систему, центральную нервную систему), повышают пероральную доступность, повышают растворимость, для возможности введения путем инъекции, изменяют метаболизм и изменяют скорость экскреции.

Фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных в настоящей заявке, включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислых солей включают ацетат, адипат, бензоат, бензолсульфонат, бутират, цитрат, диглюконат, додецилсульфат, формиат, фумарат, гликолят, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, пальмоат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тозилат и ундеканоат. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли щелочных металлов (например, натрия), щелочноземельных металлов (например, магния), аммония и N-(алкил)₄⁺.

Для получения фармацевтических композиций из соединений, описанных в настоящей заявке, фармацевтически приемлемые носители включают либо твердые, либо жидкие носители. Препараты твердых форм включают порошки, таблетки, пилюли, капсулы, саше, суппозитории и диспергируемые гранулы. Твердый носитель может представлять собой одно вещество или несколько веществ, которые также действуют в качестве разбавителей, вкусо-ароматических веществ, связующих, консервантов, веществ, способствующих распаданию таблетки, или инкапсулирующего вещества. Подробное изложение технологии получения лекарственных средств и введения хорошо описано в научной и патентной литературе, смотри, например, последнее издание Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA.

В порошках носитель представляет собой тонкоизмельченное твердое вещество, которое находится в смеси с тонкоизмельченным активным компонентом. В таблетках активный компонент смешивают с носителем, имеющим необходимые связывающие свойства в подходящих пропорциях, и прессуют в желаемую форму и размер.

Подходящие твердые эксципиенты представляют собой углеводные или белковые наполнители и включают, но не ограничиваются указанным, сахара, в том числе, лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза натрия; и камеди, в том числе, аравийскую и трагакантовую; а также белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости добавляют дезинтегрирующие или солюбилизирующие вещества, такие как поперечносшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соли, такие как альгинат натрия.

Препараты жидких форм включают растворы, суспензии и эмульсии, например, водные растворы или растворы вода/пропиленгликоль. Для парентеральной инъекции жидкие препараты могут быть получены в растворе водного раствора полиэтиленгликоля.

Фармацевтический препарат может быть в единичной дозированной форме. В такой форме препарат подразделен на единичные дозы, содержащие соответствующие количества активного компонента. Единичная дозированная форма может представлять собой упакованный препарат, упаковку, содержащую дискретные количества препарат, например, упакованные таблетки, капсулы и порошки во флаконах или ампулах. Также единичная дозированная форма сама может представлять собой капсулу, таблетку, саше или леденец, или может представлять собой соответствующее число любых из них в упакованной форме.

В тех случаях, когда одна или более композиций, описанных в настоящей заявке, содержат сочетание пептидомиметического макроцикла и одного или более дополнительных терапевтических или профилактических средств, как соединение, так и дополнительное средство должны находится на уровне доз примерно от 1 до 100%, и более предпочтительно примерно от 5 до 95% от дозы, обычно вводимой в режиме монотерапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительные средства вводят отдельно, как часть многократного режима дозирования, от одного или более соединений, описанных в настоящей заявке. Альтернативно, эти средства представляют собой часть лекарственной формы для однократного введения, смешанной вместе с соединениями, описанными в настоящей заявке, в одной композиции.

Способы применения

В одном аспекте в настоящем изобретении представлены новые пептидомиметические макроциклы, которые применимы в анализах конкурентного связывания для идентификации соединений, которые связываются с природным лигандом (лигандами) белков или пептидов, на основании которых смоделированы эти пептидомиметические макроциклы. Например, в системе p53/MDMX меченые пептидомиметические макроциклы основанные на p53, могут быть использованы в анализе связывания MDMX наряду с молекулами с низкой молекулярной массой, которые конкурентно связываются с MDMX. Исследования конкурентного связывания дают возможность in vitro быстро оценить и определить кандидатные лекарственные средства, специфичные в отношении системы p53/MDMX. Такие исследования связывания можно выполнять с любым из пептидомиметических макроциклов, описанных в настоящей заявке, и их партнерами связывания.

Дополнительно представлены способы получения антител против пептидомиметических макроциклов. В некоторых вариантах осуществления эти антитела специфически связываются с пептидомиметическим макроциклом и пептидами-предшественниками, такими как p53, с которыми связаны пептидомиметические макроциклы. Такие антитела, например, нарушают природное взаимодействие белок-белок, например, связывание между p53 и MDMX.

В других аспектах в настоящем изобретении представлены как профилактические, так и терапевтические способы лечения пациента с риском заболевания (или подверженных заболеванию) или страдающих заболеванием, связанным с нарушенной (например, недостаточной или чрезмерной) экспрессией или активностью молекул, включая p53, MDM2 или MDMX.

В другом варианте осуществления нарушение вызвано, по меньшей мере частично, аномальным уровнем p53 или MDM2 или MDMX, (например, гиперэкспрессией или недостаточной экспрессией), или присутствием p53 или MDM2 или MDMX, демонстрирующими аномальную активность. В связи с этим снижение уровня и/или активности p53 или MDM2 или MDMX, или повышение уровня и/или активности p53 или MDM2 или MDMX, под действием пептидомиметических макроциклов, полученных из p53, используют, например, для облегчения состояния или снижения тяжести неблагоприятных симптомов этого нарушения.

В другом аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения или профилактики заболевания, в том числе, гиперпролиферативного заболевания и воспалительного нарушения, путем препятствования взаимодействию или связыванию между партнерами связывания, например, между p53 и MDM2 или p53 и MDMX. Эти способы включают введение эффективного количества соединения теплокровному животному, в том числе, человеку. В некоторых вариантах осуществления введение одного или более соединений, описанных в настоящей заявке, индуцирует задержку клеточного роста или апоптоз.

В контексте настоящего изобретения термин «лечение» определяется как применение или введение терапевтического средства пациенту, или применение или введение терапевтического средства в ткань или клеточную линию, выделенную из пациента, страдающего заболеванием, имеющего симптом заболевания или предрасположенного к заболеванию, с целью лечения, заживления, смягчения, облегчения, изменения, устранения, улучшения состояния, нормализации состояния или негативного воздействия на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы могут быть использованы для лечения, профилактики и/или диагностики злокачественных и неопластических состояний. В контексте настоящего изобретения термины «злокачественный», «гиперпролиферативный» и «неопластический» относится к клеткам, обладающим способностью к автономному росту, т.е. аномальному положению или состоянию, характеризующемуся быстро пролиферирующим клеточным ростом. Гиперпролиферативное и неопластическое патологическое состояние может быть классифицировано как патологическое, т.е. характеризующее или составляющее патологическое состояние, или может быть классифицировано как непатологическое, т.е. отклонение от нормального, не связанное с патологическим состоянием. Подразумевается, что этот термин включает все типы злокачественного роста или онкогенные процессы, метастатические ткани или злокачественно трасформированные клетки, ткани или органы, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Метастатическая опухоль может возникать из большого количества первичных опухолевых типов, включающих, но не ограничивающихся указанными, опухоли, происходящие из тканей груди, легких, печени, кишечника и яичника. «Патологические гиперпролиферативные» клетки возникают при патологических состояниях, характеризующихся ростом злокачественной опухоли. Примеры непатологических гиперпролиферативных клеток включают пролиферацию клеток, связанных с заживлением ран. Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки включают злокачественные заболевания, например, карциному, саркому или метастазирующие нарушения. В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы представляют собой новые терапевтические средства для контроля за раком груди, раком яичников, раком кишечника, раком легких, метастазирования таких злокачественных заболеваний и подобное.

Примеры злокачественных заболеваний или неопластических состояний включают, но не ограничиваются указанными, фибросаркому, миосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, рак желудка, рак пищевода, рак прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, рак матки, рак тканей головы и шеи, рак кожи, рак головного мозга, сквамозно-клеточную карциному, карциному сальной железы, папиллярную карциному, аденокарциному, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак яичек, мелкоклеточную карциному легких, немелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендиому, аденому шишковидного тела, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, лейкоз, лимфому или саркому Капоши.

В некоторых вариантах осуществления злокачественное заболевание представляет собой рак тканей головы и шеи, меланому, рак легких, рак груди или глиому.

Примеры пролиферативных нарушений включают гематопоэтические неопластические нарушения. В контексте настоящего изобретения термин «гематопоэтические неопластические нарушения» включают заболевания, в которые вовлечены гиперпластические/неопластические клетки гематопоэтического происхождения, например, возникающие из миелоидного, лимфоидного или эритроидного ростка, или их клеток-предшественников. Такие заболевания могут возникать в результате низкодифференцированного острого лейкоза, например, эритробластного лейкоза и острого мегакариобластного лейкоза. Дополнительные миелоидные нарушения, приводимые в качестве примера, включают, но не ограничиваются указанным, острый промиелоидный лейкоз (ОПМЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ) и хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) (обзор у Vaickus (1991), Crit Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97); лимфоидные злокачественные заболевания включают, но не ограничиваются указанным, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), который включает В-клеточный ОЛЛ и T-клеточный ОЛЛ, хронический лимфобластный лейкоз (ХЛЛ), пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) и макроглобулинемию Вальденстрема (ВМ). Дополнительные формы злокачественных лимфом включают, но не ограничиваются указанными, неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферическую Т-клеточную лимфому, Т-клеточный лейкоз/лимфому у взрослых (ТКЛ), кожную T-клеточную лимфому (КТКЛ), лимфолейкоз из больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ), болезнь Ходжкина и болезнь Рида-Стернберга.

Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки тканей груди включают, но не ограничиваются указанными, пролиферативное заболевание груди, включающее, например, эпителиальную гиперплазию, склерозирующий аденоз и папилому небольших молочных протоков; опухоли, например, стромальные опухоли, такие как фиброаденома, листовидная цистосаркома и саркомы, и эпителиальные опухоли, такие как папилома крупных молочных протоков; карциному груди, включая in situ (неинвазивную) карциному, которая включает карциному молочных протоков in situ (включая болезнь Педжета) и лобулярную карциному in situ, и инвазивную (инфильтрирующую) карциному, включающую, но не только, инвазивную карциному протоков, инвазивную лобулярную карциному, медуллярную карциному, коллоидную (слизеобразующую) карциному, тубулярную карциному и инвазивную папиллярную карциному, и неоднородные злокачественные новообразования. Нарушения в молочной железе у мужчин включают, но не ограничиваются указанными, гинекомастию и карциному.

Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки кожи включают, но не ограничиваются указанными, кожные пролиферативные заболевания, такие как меланомы, в том числе, меланому слизистых оболочек, поверхностную распространяющуюся меланому, узловую меланому, лентиго (например, злокачественное лентиго, ограниченный предраковый меланоз или акральная лентигиозная меланома), беспигментную меланому, десмопластическую меланому, меланому с характерными признаками невуса Шпица, меланому с небольшими невус-подобными клетками, полиповидную меланому и меланому мягких тканей; базальноклеточныую карциному, включая микроузловую базальноклеточную карциному, поверхностную базальноклеточную карциному, узловую базальноклеточную карциному (разъедающую язву), кистозную базальноклеточную карциному, рубцовую базальноклеточную карциному, пигментированную базальноклеточную карциному, аберрантную базальноклеточную карциному, инфильтрирующую базальноклеточную карциному, синдром базальноклеточного невуса, полипоидную базальноклеточную карциному, порообразную базальноклеточную карциному, и фиброэпителиому Пинкуса; сквамозно-клеточную карциному, в том числе, акантому (крупноклеточную акантому), аденоидную сквамозно-клеточную карциному, базалоидную сквамозно-клеточную карциному, светлоклеточную сквамозно-клеточную карциному, перстневидноклеточную сквамозно-клеточную карциному, веретеноклеточную сквамозно-клеточную карциному, язву Маржолина, эритроплазию Кейра и болезнь Боуэна; или другие кожные и подкожные опухоли.

Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки легочной ткани включают, но не ограничиваются указанными, бронхогенную карциному, включая паранеопластические синдромы, бронхиолоальвеолярную карциному, нейроэндокринные опухоли, такие как бронхиальный карциноид, смешанные опухоли и метастазирующие опухоли; патологические состояния плевры, включая воспалительные плевральные экссудаты, невоспалительные плевральные экссудаты, пневмоторакс и плевральные опухоли, включая солитарные фиброзные опухоли (плевральная фиброма) и злокачественную мезотелиому.

Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки тканей кишечника включают, но не ограничиваются указанными, неопухолевые полипы, аденомы, семейные синдромы, колоректальный карциногенез, колоректальную карциному и карциноидные опухоли.

Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки ткани печени включают, но не ограничиваются указанными, узловые гиперплазии, аденомы и злокачественные опухоли, включая первичную карциному печени и метастазирующие опухоли.

Примеры клеточных пролиферативных заболеваний и/или нарушений дифференцировки тканей яичников включают, но не ограничиваются указанными, опухоли яичников, такие как опухоли целомического эпителия, серозные опухоли, слизеобразующие опухоли, эндометриоидные опухоли, светлоклеточную аденокарциному, цистаденофиброму, опухоль Бреннера, опухоли поверхностного эпителия; эмбрионально-клеточные опухоли, такие как зрелые (доброкачественные) тератомы, монодермальные тератомы, незрелые злокачественные тератомы, эмбриональную карциному яичника, опухоль эндодермального синуса, хориокарциному; опухоли стромы полового тяжа яичников, такие как гранулезатекаклеточные опухоли, текофибромы, андробластомы, опухоли клеток бугорка и гонадобластому; и метастазирующие опухоли, такие как опухоли Крукенберга.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны в настоящей заявке, специалисту в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления представлены только в качестве примера. Многочисленные варианты, изменения и замены и теперь будут очевидны специалистам в данной области, без отступления от изобретения. Должно быть понятно, что различные альтернативы описанным в настоящем документе вариантам осуществления могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения. Предполагается, что следующая формула изобретения определяет объем притязаний, и что способы и структуры, входящие в объем этой формулы изобретения, и их эквиваленты, тем самым, охватываются.

Примеры

Пример 1: Синтез 6-хлортриптофан Fmoc аминокислот

трет-Бутил 6-хлор-3-формил-1H-индол-1-карбоксилат, 1. К перемешанному раствору сухого DMF (12 мл) добавляли по каплям POCl₃ (3,92 мл, 43 ммоль, 1,3 экв.) при 0ºC в атмосфере аргона. Этот раствор перемешивали при той же температуре в течение 20 мин перед добавлением по каплям раствора 6-хлориндола (5,0 г, 33 ммоль, 1 экв.) в сухом DMF (30 мл). Полученную в результате смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 2,5 часов. Добавляли воду (50 мл), и раствор нейтрализовали 4M водным NaOH (pH~8). Полученное в результате твердое вещество отфильтровывали, промывали водой и сушили под вакуумом. Это вещество непосредственно использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. К перемешанному раствору неочищенного формилиндола (33 ммоль, 1 экв.) в THF (150 мл) добавляли последовательно Boc₂O (7,91 г, 36,3 ммоль, 1,1 экв.) и DMAP (0,4 г, 3,3 ммоль, 0,1 экв.) при комнатной температуре в атмосфере N₂. Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток помещали в EtOAc и промывали с использованием 1н HCl, сушили и концентрировали с получением формилиндола 1 (9 г, 98% за 2 стадии) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,70 (с, Boc, 9H); 7,35 (дд, 1H); 8,21 (м, 3H); 10,07 (с, 1H).

трет-Бутил 6-хлор-3-(гидроксиметил)-1H-индол-1-карбоксилат, 2. К раствору соединения 1 (8,86 г, 32 ммоль, 1 экв.) в этаноле (150 мл) добавляли NaBH₄ (2,4 г, 63 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали, и остаток выливали в простой диэтиловый эфир и воду. Органический слой отделяли, сушили над сульфатом магния и концентрировали с получением твердого вещества белого цвета (8,7 г, 98%). Это вещество непосредственно использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,65 (с, Boc, 9H); 4,80 (с, 2H, CH₂); 7,21 (дд, 1H); 7,53 (м, 2H); 8,16 (шир.с, 1H).

трет-Бутил 3-(бромметил)-6-хлор-1H-индол-1-карбоксилат, 3. К раствору соединения 2 (4,1 г, 14,6 ммоль, 1 экв.) в дихлорметане (50 мл) в атмосфере аргона добавляли раствор трифенилфосфина (4,59 г, 17,5 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (50 мл) при -40ºC. Реакционный раствор перемешивали дополнительно 30 мин при 40ºC. Затем добавляли NBS (3,38 г, 19 ммоль, 1,3 экв.). Полученную в результате смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Дихлорметан упаривали, добавляли тетрахлорид углерода (100 мл), и смесь перемешивали в течение 1 часа и фильтровали. Фильтрат концентрировали, загружали на слой силикагеля и быстро элюировали, используя 25% EtOAc в гексане. Этот раствор концентрировали с получением белой пены (3,84 г, 77%). ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,66 (с, Boc, 9H); 4,63 (с, 2H, CH₂); 7,28 (дд, 1H); 7,57 (д, 1H); 7,64 (шир.с, 1H); 8,18 (шир.с, 1H).

αMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4. К S-Ala-Ni-S-BPB (2,66 г, 5,2 ммоль, 1 экв.) и KO-tBu (0,87 г, 7,8 ммоль, 1,5 экв.) добавляли 50 мл DMF в атмосфере аргона. Бромидное производное соединение 3 (2,68 г, 7,8 ммоль, 1,5 экв.) в растворе DMF (5,0 мл) добавляли через шприц. Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Затем этот раствор гасили 5% водной уксусной кислотой и разбавляли водой. Желаемый продукт экстрагировали в дихлорметане, сушили и концентрировали. Масляный продукт 4 очищали с помощью флэш-хроматографии (загрузка твердой фазы) на нормальной фазе, используя EtOAc и гексан в качестве элюентов с получением твердого вещества красного цвета (1,78 г, выход 45%). αMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4: M+H выч. 775,21, M+H набл. 775,26; ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,23 (с, 3H, αMe); 1,56 (м, 11H, Boc + CH₂); 1,82-2,20 (м, 4H, 2CH₂); 3,03 (м, 1H, CHα); 3,24 (м, 2H, CH₂); 3,57 и 4,29 (AB система, 2H, CH₂ (бензил), J=12,8 Гц); 6,62 (д, 2H); 6,98 (д, 1H); 7,14 (м, 2H); 7,23 (м, 1H); 7,32-7,36 (м, 5H); 7,50 (м, 2H); 7,67 (шир.с, 1H); 7,98 (д, 2H); 8,27 (м, 2H).

Fmoc-αMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6. К раствору 3 н HCl/MeOH (1/3, 15 мл) при 50ºC добавляли по каплям раствор соединения 4 (1,75 г, 2,3 ммоль, 1 экв.) в MeOH (5 мл). Исходное вещество исчезало в течение 3-4 часов. Кислый раствор затем охлаждали до 0ºC на ледяной бане и гасили водным раствором Na₂CO₃ (1,21 г, 11,5 ммоль, 5 экв.). Метанол удаляли и в суспензию добавляли еще 8 эквивалентов Na₂CO₃ (1,95 г, 18,4 ммоль). Затем добавляли дигидрат динатриевой соли EDTA, удаляющий примеси никеля (1,68 г, 4,5 ммоль, 2 экв.), и эту суспензию перемешивали в течение 2 ч. Добавляли раствор Fmoc-OSu (0,84 г, 2,5 ммоль, 1,1 экв.) в ацетоне (50 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. После этого реакционную смесь разбавляли диэтиловым простым эфиром и 1 н HCl. Органический слой затем сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Желаемый продукт 6 очищали на нормальной фазе, используя ацетон и дихлорметан в качестве элюентов с получением белой пены (0,9 г, выход 70%). Fmoc-αMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6: M+H выч. 575,19, M+H набл. 575,37; ¹H ЯМР (CDCl₃) 1,59 (с, 9H, Boc); 1,68 (с, 3H, Me); 3,48 (шир.с, 2H, CH₂); 4,22 (м, 1H, CH); 4,39 (шир.с, 2H, CH₂); 5,47 (с, 1H, NH); 7,10 (м, 1H); 7,18 (м, 2H); 7,27 (м, 2H); 7,39 (м, 2H); 7,50 (м, 2H); 7,75 (д, 2H); 8,12 (шир.с, 1H).

6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5. К Gly-Ni-S-BPB (4,6 г, 9,2 ммоль, 1 экв.) и KO-tBu (1,14 г, 10,1 ммоль, 1,1 экв.) добавляли 95 мл DMF в атмосфере аргона. Бромидное производное соединения 3 (3,5 г, 4,6 ммоль, 1,1 экв.) в растворе DMF (10 мл) добавляли через шприц. Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Этот раствор затем гасили 5% водной уксусной кислотой и разбавляли водой. Желаемый продукт экстрагировали в дихлорметане, сушили и концентрировали. Масляный продукт 5 очищали с помощью флэш-хроматографии (загрузка твердой фазы) на нормальной фазе, используя EtOAc и гексан в качестве элюентов с получением твердого вещества красного цвета (5 г, выход 71%). 6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5: M+H выч. 761,20, M+H набл. 761,34; ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,58 (м, 11H, Boc + CH₂); 1,84 (м, 1H); 1,96 (м, 1H); 2,24 (м, 2H, CH₂); 3,00 (м, 1H, CHα); 3,22 (м, 2H, CH₂); 3,45 и 4,25 (AB система, 2H, CH₂ (бензил), J=12,8 Гц); 4,27 (м, 1H, CHα); 6,65 (д, 2H); 6,88 (д, 1H); 7,07 (м, 2H); 7,14 (м, 2H); 7,28 (м, 3H); 7,35-7,39 (м, 2H); 7,52 (м, 2H); 7,96 (д, 2H); 8,28 (м, 2H).

Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7. К раствору 3 н HCl/MeOH (1/3, 44 мл) при 50ºC добавляли по каплям раствор соединения 5 (5 г, 6,6 ммоль, 1 экв.) в MeOH (10 мл). Исходное вещество исчезало в течение 3-4 ч. Кислый раствор затем охлаждали до 0ºC на ледяной бане и гасили водным раствором Na₂CO₃ (3,48 г, 33 ммоль, 5 экв.). Метанол удаляли, и в суспензию добавляли еще 8 эквивалентов Na₂CO₃ (5,57 г, 52 ммоль). Дигидрат динатриевой соли EDTA, удаляющий примеси никеля (4,89 г, 13,1 ммоль, 2 экв.) и эту суспензию перемешивали в течение 2 ч. Добавляли раствор Fmoc-OSu (2,21 г, 6,55 ммоль, 1,1 экв.) в ацетоне (100 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. После этого реакционную смесь разбавляли простым диэтиловым эфиром и 1 н HCl. Органический слой затем сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Желаемый продукт 7 очищали на нормальной фазе, используя ацетон и дихлорметан в качестве элюентов с получением пены белого цвета (2,6 г, выход 69%). Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7: M+H выч. 561,17, M+H набл. 561,37; ¹H ЯМР (CDCl₃) 1,63 (с, 9H, Boc); 3,26 (м, 2H, CH₂); 4,19 (м, 1H, CH); 4,39 (м, 2H, CH₂); 4,76 (м, 1H); 5,35 (д, 1H, NH); 7,18 (м, 2H); 7,28 (м, 2H); 7,39 (м, 3H); 7,50 (м, 2H); 7,75 (д, 2H); 8,14 (шир.с, 1H).

Пример 2: Пептидомиметические макроциклы

Пептидомиметические макроциклы были синтезированы, очищены и проанализированы как описано ранее и как описано ниже (Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); и патент США № 7192713). Пептидомиметические макроциклы были сконструированы путем замены двух или более природных аминокислот соответствующими синтетическими аминокислотами. Замены были сделаны в положениях i и i+4, и i и i+7. Пептидный синтез проводили либо вручную, либо на автоматическом синтезаторе пептидов (Applied Biosystems, модель 433A), используя твердофазные условия, смолу Ринка AM (Novabiochem), и Fmoc химию защитной группы главной цепи. Для соединения природных Fmoc-защищенных аминокислот (Novabiochem) использовали 10 эквивалентов аминокислоты и 1:1:2 молярного соотношения связующего реагента HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA. Неприродные аминокислоты (4 экв.) соединяли с использованием молярного соотношения 1:1:2 HATU (Applied Biosystems)/HOBt/DIEA. N-концы синтетических пептидов ацетилировали, тогда как С-концы были амидированы.

Очистка поперечносшитых соединений достигалась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Varian ProStar) на колонке с обращенной фазой C18 (Varian) для получения на выходе чистых соединений. Химический состав чистых продуктов подтверждали с помощью LC/MS масс-спектрометрии (Micromass LCT связанная с системой Agilent 1100 HPLC) и аминокислотного анализа (Applied Biosystems, модель 420A).

Следующий протокол использовали при синтезе диалкин-поперечносшитых пептидомиметических макроциклов, включая SP662, SP663 и SP664. Полностью защищенные пропитанные смолой пептиды синтезировали на смоле PEG-PS (загрузка 0,45 ммоль/г) в масштабе 0,2 ммоль. Снятие защиты временной Fmoc группы достигалось путем 3×10 мин обработок пропитанного смолой пептида 20% (об./об.) пиперидином в DMF. После промывания с использованием NMP (3x), дихлорметана (3x) и NMP (3x), присоединение каждой последующей аминокислоты достигалось путем 1×60 мин инкубирования с соответствующим предварительно активированным Fmoc-аминокислотным производным. Все защищенные аминокислоты (0,4 ммоль) растворяли в NMP и активировали с использованием HCTU (0,4 ммоль) и DIEA (0,8 ммоль) перед переносом связывающего раствора к пропитанному смолой пептиду со снятой защитой. После завершения присоединения смолу промывали при подготовке для следующего цикла снятия защиты/присоединения. Ацетилирование аминоконцов проводили в присутствии уксусного ангидрида/DIEA в NMP. Анализ LC-MS расщепленного и со снятой защитой образца, полученного из аликвоты полностью собранного пропитанного смолой пептида, осуществляли для верификации завершенности каждого присоединения. В характерном примере тетрагидрофуран (4 мл) и триэтиламин (2 мл) добавляли к пептидной смоле (0,2 ммоль) в 40 мл стеклянной колбе и встряхивали в течение 10 минут. Затем добавляли Pd(PPh₃)₂Cl₂ (0,014 г, 0,02 ммоль) и йодид меди (0,008 г, 0,04 ммоль), и полученную в результате реакционную смесь механически встряхивали 16 часов, сообщаясь с атмосферой. С диин-циклизованных пропитанных смолой пептидов снимали защиту и отщепляли от твердой подложки обработкой с использованием TFA/H₂O/TIS (95/5/5 об/об) в течение 2,5 ч при комнатной температуре. После фильтрования смолы раствор TFA осаждали в холодном диэтиловом простом эфире и центрифугировали с получением на выходе желаемого продукта в виде твердого вещества. Сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Следующий протокол использовали при синтезе отдельных алкин-поперечносшитых пептидомиметических макроциклов, включая SP665. Полностью защищенные пропитанные смолой пептиды синтезировали на смоле Ринка MBHA (загружая 0,62 ммоль/г) в масштабе 0,1 ммоль. Снятие защиты временной Fmoc группы достигалось посредством 2×20 мин обработок пропитанного смолой пептида 25% (об./об.) пиперидином в NMP. После длительного промывания потоком NMP и дихлорметана, присоединение каждой последующей аминокислоты достигалось посредством 1×60 мин инкубирования соответствующим предварительно активированным Fmoc-аминокислотным производным. Все защищенные аминокислоты (1 ммоль) растворяли в NMP и активировали с использованием HCTU (1 ммоль) и DIEA (1 ммоль) перед переносом связующего раствора к пропитанному смолой пептиду со снятой защитой. После завершения присоединения смолу длительно промывали в потоке при подготовке к следующему циклу снятия защиты/присоединения. Ацетилирование аминоконцов проводили в присутствии уксусного ангидрида/DIEA в NMP/NMM. LC-MS анализ расщепленного образца со снятой защитой получали из аликвоты полностью собранного пропитанного смолой пептида проводили для верификации завершенности каждого присоединения. В характерном примере пептидную смолу (0,1 ммоль) промывали с использованием DCM. Смолу загружали в микроволновую пробирку. Из этой пробирки откачивали воздух и продували азотом. Добавляли гексакарбонил молибдена (0,01 экв, Sigma Aldrich 199959). В реакционный сосуд добавляли безводный хлорбензол. Затем добавляли 2-фторфенол (1 экв, Sigma Aldrich F12804). Реакционную смесь затем загружали в микроволновую печь и держали при 130ºC в течение 10 минут. Реакции может потребоваться дополнительное время для завершения. С алкин-метатезированных пропитанных смолой пептидов снимали защиту и отщепляли от твердой подложки посредством обработки с использованием TFA/H₂O/TIS (94/3/3 об./об.) в течение 3 ч при комнатной температуре. После фильтрования смолы раствор TFA осаждали в холодном диэтиловом простом эфире и центрифугировали с получением на выходе желаемого продукта в виде твердого вещества. Сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

В Таблице 1 показан перечень полученных пептидомиметических макроциклов (см. в графической части).

В Таблице 1а показана селекция пептидомиметических макроциклов (см. в графической части).

В Таблице 1b показана дальнейшая селекция пептидомиметических макроциклов (см. в графической части).

В последовательностях, показанных выше и в других местах, используются следующие аббревиатуры: «Nle» представляет норлейцин, «Aib» представляет 2-аминоизомасляную кислоту, «Ac» представляет ацетил, и «Pr» представляет пропионил. Аминокислоты, представленные как «$», представляют собой альфа-Me S5-пентенил-аланинолефин аминокислоты, соединенные все-углеродным сшивающим агентом, содержащим одну двойную связь. Аминокислоты, представленные как «$r5» представляют собой альфа-Me R5-пентенил-аланинолефин аминокислоты, соединенные все-углеродом, содержащим одну двойную связь. Аминокислоты, представленные как «$s8» представляют собой альфа-Me S8-октенил-аланинолефин аминокислоты, соединенные все-углеродным сшивающим агентом, содержащим одну двойную связь. Аминокислоты, представленные как «$r8» представляют собой альфа-Me R8-октенил-аланинолефин аминокислоты, соединенные все-углеродным сшивающим агентом, содержащим одну двойную связь. «Ahx» представляет аминоциклогексильный линкер. Сшивающие агенты представляют собой линейный все-углеродный сшивающий агент, содержащий восемь или одиннадцать атомов углерода между альфа-углеродами каждой аминокислоты. Аминокислоты, представленные как «$/» представляют собой альфа-Me S5-пентенил-аланинолефин аминокислоты, которые не соединены никаким сшивающим агентом. Аминокислоты, представленные как «$/r5» представляют собой альфа-Me R5-пентенил-аланинолефин аминокислоты, которые не соединены никаким сшивающим агентом. Аминокислоты, представленные как «$/s8» представляют собой альфа-Me S8-октенил-аланинолефин аминокислоты, которые не соединены никаким сшивающим агентом. Аминокислоты, представленные как «$/r8», представляют собой альфа-Me R8-октенил-аланинолефин аминокислоты, которые не соединены никаким сшивающим агентом. Аминокислоты, представленные как «Amw» представляют собой альфа-Me триптофан аминокислоты. Аминокислоты, представленные как «Aml», представляют собой альфа-Me лейцин аминокислоты. Аминокислоты, представленные как «Amf», представляют собой альфа-Me фенилаланин аминокислоты. Аминокислоты, представленные как «2ff», представляют собой 2-фтор-фенилаланин аминокислоты. Аминокислоты, представленные как «3ff» представляют собой 3-фтор-фенилаланин аминокислоты. Аминокислоты, представленные как «St», представляют собой аминокислоты, содержащие две пентенил-аланинолефин боковые цепи, каждая из которых поперечно сшита с другой аминокислотой, как указано. Аминокислоты, представленные как «St//», представляют собой аминокислоты, содержащие две пентенил-аланинолефин боковые цепи, которые не являются поперечно сшитыми. Аминокислоты, представленные как «%St», представляют собой аминокислоты, содержащие две пентенил-аланин олефин боковые цепи, каждая из которых поперечно сшита с другой аминокислотой, как указано, через полностью насыщенные углеводородные сшивающие агенты. Аминокислоты, представленные как «Ba», представляют собой бета-аланин. Символ в нижнем регистре «e» или «z» в обозначении поперечносшитой аминокислоты (например, «$er8» или «$zr8») представляет конфигурацию двойной связи (E или Z, соответственно). В другом контексте буквы в нижнем регистре, такие как «a» или «f», представляют D аминокислоты (например, D-аланин, или D-фенилаланин, соответственно). Аминокислоты, обозначенные как «NmW», представляют N-метилтриптофан. Аминокислоты, обозначенные как «NmY», представляют N-метилтирозин. Аминокислоты, обозначенные как «NmA», представляют N-метилаланин. «Kbio» представляет биотиновую группу, присоединенную к аминогруппе боковой цепи остатка лизина. Аминокислоты, обозначенные как «Sar», представляют саркозин. Аминокислоты, обозначенные как «Cha», представляют циклогексилаланин. Аминокислоты, обозначенные как «Cpg», представляют циклопентил глицин. Аминокислоты, обозначенные как «Chg», представляют циклогексилглицин. Аминокислоты, обозначенные как «Cba», представляют циклобутилаланин. Аминокислоты, обозначенные как «F4I», представляют 4-йодфенилаланин. «7L» представляет N15 изотопный лейцин. Аминокислоты, обозначенные как «F3Cl», представляют 3-хлорфенилаланин. Аминокислоты, обозначенные как «F4cooh», представляют 4-карбоксифенилаланин. Аминокислоты, обозначенные как «F34F2», представляют 3,4-дифторфенилаланин. Аминокислоты, обозначенные как «6clW», представляют 6-хлортриптофан. Аминокислоты, обозначенные как «$rda6», представляют альфа-Me R6-гексинил-аланиналкинил аминокислоты, поперечносшитые через диалкиновую связь с другой алкинил аминокислотой. Аминокислоты, обозначенные как «$da5», представляют альфа-Me S5-пентинил-аланиналкинил аминокислоты, в которых алкин образует одну половину диалкиновой связи с другой алкинил аминокислотой. Аминокислоты, обозначенные как «$ra9», представляют альфа-Me R9-нонинил-аланиналкинил аминокислоты, поперечносшитые посредством реакции алкинового метатезиса с другой алкинил аминокислотой. Аминокислоты, обозначенные как «$a6», представляют альфа-Me S6-гексинил-аланиналкинил аминокислоты, перекрестно сшитые посредством реакции алкинового метатезиса с другой алкинил аминокислотой. Обозначение «iso1» или «iso2» показывает, что пептидомиметический макроцикл представляет собой отдельный изомер.

Аминокислоты, обозначенные как «Cit», представляют цитруллин. Аминокислоты, обозначенные как «Cou4», «Cou6», «Cou7» и «Cou8», соответственно, представляют следующие структуры:

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметический макроцикл получают в виде двух или более изомеров, например, вследствие конфигурации двойной связи в структуре сшивающего агента (E vs Z). Такие изомеры могут быть или могут не быть разделены посредством общепринятых хроматографических способов. В некоторых вариантах осуществления один изомер обладает улучшенными биологическими свойствами, по сравнению с другим изомером. В одном варианте осуществления E изомер сшивающего агента олефина пептидомиметического макроцикла обладает лучшей растворимостью, лучшей аффинностью в отношении мишени, лучшей эффективностью in vivo или in vitro, более высокой спиральностью или улучшенной клеточной проницаемостью по сравнению с его Z аналогом. В другом варианте осуществления Z изомер сшивающего агента олефин пептидомиметического макроцикла обладает лучшей растворимостью, лучшей аффинностью в отношении мишени, лучшей эффективностью in vivo или in vitro, более высокой спиральностью или улучшенной клеточной проницаемостью по сравнению с его E аналогом.

В Таблице 1c представлены пептидомиметические макроциклы, приводимые в качестве примера:

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы исключают пептидомиметические макроциклы, представленные в Таблице 2a:

Таблица 2а Номер Последовательность SEQ ID NO: 1 L$r5QETFSD$s8WKLLPEN 693 2 LSQ$r5TFSDLW$s8LLPEN 694 3 LSQE$r5FSDLWK$s8LPEN 695 4 LSQET$r5SDLWKL$s8PEN 696 5 LSQETF$r5DLWKLL$s8EN 697 6 LXQETFS$r5LWKLLP$s8N 698 7 LSQETFSD$r5WKLLPE$s8 699 8 LSQQTF$r5DLWKLL$s8EN 700 9 LSQETF$r5DLWKLL$s8QN 701 10 LSQQTF$r5DLWKLL$s8QN 702 11 LSQETF$r5NLWKLL$s8QN 703 12 LSQQTF$r5NLWKLL$s8QN 704 13 LSQQTF$r5NLWRLL$s8QN 705 14 QSQQTF$r5NLWKLL$s8QN 706 15 QSQQTF$r5NLWRLL$s8QN 707 16 QSQQTA$r5NLWRLL$s8QN 708 17 L$r8QETFSD$WKLLPEN 709 18 LSQ$r8TFSDLW$LLPEN 710 19 LSQE$r8FSDLWK$LPEN 711 20 LSQET$r8SDLWKL$PEN 712 21 LSQETF$r8DLWKLL$EN 713 22 LXQETFS$r8LWKLLP$N 714 23 LSQETFSD$r8WKLLPE$ 715 24 LSQQTF$r8DLWKLL$EN 716 25 LSQETF$r8DLWKLL$QN 717 26 LSQQTF$r8DLWKLL$QN 718 27 LSQETF$r8NLWKLL$QN 719 28 LSQQTF$r8NLWKLL$QN 720 29 LSQQTF$r8NLWRLL$QN 721 30 QSQQTF$r8NLWKLL$QN 722 31 QSQQTF$r8NLWRLL$QN 723 32 QSQQTA$r8NLWRLL$QN 724

33 QSQQTF$r8NLWRKK$QN 725 34 QQTF$r8DLWRLL$EN 726 35 QQTF$r8DLWRLL$ 727 36 LSQQTF$DLW$LL 728 37 QQTF$DLW$LL 729 38 QQTA$r8DLWRLL$EN 730 39 QSQQTF$r5NLWRLL$s8QN
(дигидроксилированный олефин) 731 40 QSQQTA$r5NLWRLL$s8QN
(дигидроксилированный олефин) 732 41 QSQQTF$r8DLWRLL$QN 733 42 QTF$r8NLWRLL$ 734 43 QSQQTF$NLW$LLPQN 735 44 QS$QTF$NLWRLLPQN 736 45 $TFS$LWKLL 737 46 ETF$DLW$LL 738 47 QTF$NLW$LL 739 48 $SQE$FSNLWKLL 740

В Таблице 2a X представляет S или любую аминокислоту. Показанные пептиды могут содержать N-концевую блокирующую группу, такую как ацетил или дополнительный линкер, такой как бета-аланин между блокирующей группой и началом пептидной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы не содержат пептидомиметическую макроциклическую структуру, как показано в Таблице 2a.

В других вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы исключают пептидомиметические макроциклы, представленные в Таблице 2b:

Таблица 2b Номер Последовательность SEQ ID NO: Точная масса M+2 Наблюдае-мая масса (m/e) 1 Ac-LSQETF$r8DLWKLL$EN-NH2 741 2068,13 1035,07 1035,36 2 Ac-LSQETF$r8NLWKLL$QN-NH2 742 2066,16 1034,08 1034,31 3 Ac-LSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 743 2093,18 1047,59 1047,73 4 Ac-QSQQTF$r8NLWKLL$QN-NH2 744 2080,15 1041,08 1041,31 5 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 745 2108,15 1055,08 1055,32 6 Ac-QSQQTA$r8NLWRLL$QN-NH2 746 2032,12 1017,06 1017,24 7 Ac-QAibQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 747 2106,17 1054,09 1054,34 8 Ac-QSQQTFSNLWRLLPQN-NH2 748 2000,02 1001,01 1001,26 9 Ac-QSQQTF$/r8NLWRLL$/QN-NH2 749 2136,18 1069,09 1069,37 10 Ac-QSQAibTF$r8NLWRLL$QN-NH2 750 2065,15 1033,58 1033,71 11 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$AN-NH2 751 2051,13 1026,57 1026,70 12 Ac-ASQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 752 2051,13 1026,57 1026,90 13 Ac-QSQQTF$r8ALWRLL$QN-NH2 753 2065,15 1033,58 1033,41 14 Ac-QSQETF$r8NLWRLL$QN-NH2 754 2109,14 1055,57 1055,70 15 Ac-RSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 755 2136,20 1069,10 1069,17 16 Ac-RSQQTF$r8NLWRLL$EN-NH2 756 2137,18 1069,59 1069,75 17 Ac-LSQETFSDLWKLLPEN-NH2 757 1959,99 981,00 981,24 18 Ac-QSQ$TFS$LWRLLPQN-NH2 758 2008,09 1005,05 1004,97 19 Ac-QSQQ$FSN$WRLLPQN-NH2 759 2036,06 1019,03 1018,86 20 Ac-QSQQT$SNL$RLLPQN-NH2 760 1917,04 959,52 959,32 21 Ac-QSQQTF$NLW$LLPQN-NH2 761 2007,06 1004,53 1004,97 22 Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2 762 2310,26 1156,13 1156,52 23 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$RN-NH2 763 2136,20 1069,10 1068,94 24 Ac-QSQRTF$r8NLWRLL$QN-NH2 764 2136,20 1069,10 1068,94 25 Ac-QSQQTF$r8NNleWRLL$QN-NH2 765 2108,15 1055,08 1055,44 26 Ac-QSQQTF$r8NLWRNleL$QN-NH2 766 2108,15 1055,08 1055,84 27 Ac-QSQQTF$r8NLWRLNle$QN-NH2 767 2108,15 1055,08 1055,12 28 Ac-QSQQTY$r8NLWRLL$QN-NH2 768 2124,15 1063,08 1062,92 29 Ac-RAibQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 769 2134,22 1068,11 1068,65 30 Ac-MPRFMDYWEGLN-NH2 770 1598,70 800,35 800,45 31 Ac-RSQQRF$r8NLWRLL$QN-NH2 771 2191,25 1096,63 1096,83 32 Ac-QSQQRF$r8NLWRLL$QN-NH2 772 2163,21 1082,61 1082,87 33 Ac-RAibQQRF$r8NLWRLL$QN-NH2 773 2189,27 1095,64 1096,37 34 Ac-RSQQRF$r8NFWRLL$QN-NH2 774 2225,23 1113,62 1114,37 35 Ac-RSQQRF$r8NYWRLL$QN-NH2 775 2241,23 1121,62 1122,37 36 Ac-RSQQTF$r8NLWQLL$QN-NH2 776 2108,15 1055,08 1055,29

37 Ac-QSQQTF$r8NLWQAmlL$QN-NH2 777 2094,13 1048,07 1048,32 38 Ac-QSQQTF$r8NAmlWRLL$QN-NH2 778 2122,17 1062,09 1062,35 39 Ac-NlePRF$r8DYWEGL$QN-NH2 779 1869,98 935,99 936,20 40 Ac-NlePRF$r8NYWRLL$QN-NH2 780 1952,12 977,06 977,35 41 Ac-RF$r8NLWRLL$Q-NH2 781 1577,96 789,98 790,18 42 Ac-QSQQTF$r8N2ffWRLL$QN-NH2 782 2160,13 1081,07 1081,40 43 Ac-QSQQTF$r8N3ffWRLL$QN-NH2 783 2160,13 1081,07 1081,34 44 Ac-QSQQTF#r8NLWRLL#QN-NH2 784 2080,12 1041,06 1041,34 45 Ac-RSQQTA$r8NLWRLL$QN-NH2 785 2060,16 1031,08 1031,38 46 Ac-QSQQTF%r8NLWRLL%QN-NH2 786 2110,17 1056,09 1056,55 47 HepQSQ$TFSNLWRLLPQN-NH2 787 2051,10 1026,55 1026,82 48 HepQSQ$TF$r8NLWRLL$QN-NH2 788 2159,23 1080,62 1080,89 49 Ac-QSQQTF$r8NL6clWRLL$QN-NH2 789 2142,11 1072,06 1072,35 50 Ac-QSQQTF$r8NLMe6clwRLL$QN-NH2 790 2156,13 1079,07 1079,27 51 Ac-LTFEHYWAQLTS-NH2 791 1535,74 768,87 768,91 52 Ac-LTF$HYW$QLTS-NH2 792 1585,83 793,92 794,17 53 Ac-LTFE$YWA$LTS-NH2 793 1520,79 761,40 761,67 54 Ac-LTF$zr8HYWAQL$zS-NH2 794 1597,87 799,94 800,06 55 Ac-LTF$r8HYWRQL$S-NH2 795 1682,93 842,47 842,72 56 Ac-QS$QTFStNLWRLL$s8QN-NH2 796 2145,21 1073,61 1073,90 57 Ac-QSQQTASNLWRLLPQN-NH2 797 1923,99 963,00 963,26 58 Ac-QSQQTA$/r8NLWRLL$/QN-NH2 798 2060,15 1031,08 1031,24 59 Ac-ASQQTF$/r8NLWRLL$/QN-NH2 799 2079,16 1040,58 1040,89 60 Ac-$SQQ$FSNLWRLLAibQN-NH2 800 2009,09 1005,55 1005,86 61 Ac-QS$QTF$NLWRLLAibQN-NH2 801 2023,10 1012,55 1012,79 62 Ac-QSQQ$FSN$WRLLAibQN-NH2 802 2024,06 1013,03 1013,31 63 Ac-QSQQTF$NLW$LLAibQN-NH2 803 1995,06 998,53 998,87 64 Ac-QSQQTFS$LWR$LAibQN-NH2 804 2011,06 1006,53 1006,83 65 Ac-QSQQTFSNLW$LLA$N-NH2 805 1940,02 971,01 971,29 66 Ac-$/SQQ$/FSNLWRLLAibQN-NH2 806 2037,12 1019,56 1019,78 67 Ac-QS$/QTF$/NLWRLLAibQN-NH2 807 2051,13 1026,57 1026,90 68 Ac-QSQQ$/FSN$/WRLLAibQN-NH2 808 2052,09 1027,05 1027,36 69 Ac-QSQQTF$/NLW$/LLAibQN-NH2 809 2023,09 1012,55 1013,82 70 Ac-QSQ$TFS$LWRLLAibQN-NH2 810 1996,09 999,05 999,39 71 Ac-QSQ$/TFS$/LWRLLAibQN-NH2 811 2024,12 1013,06 1013,37 72 Ac-QS$/QTFSt//NLWRLL$/s8QN-NH2 812 2201,27 1101,64 1102,00 73 Ac-$r8SQQTFS$LWRLLAibQN-NH2 813 2038,14 1020,07 1020,23 74 Ac-QSQ$r8TFSNLW$LLAibQN-NH2 814 1996,08 999,04 999,32 75 Ac-QSQQTFS$r8LWRLLA$N-NH2 815 2024,12 1013,06 1013,37 76 Ac-QS$r5QTFStNLW$LLAibQN-NH2 816 2032,12 1017,06 1017,39

77 Ac-$/r8SQQTFS$/LWRLLAibQN-NH2 817 2066,17 1034,09 1034,80 78 Ac-QSQ$/r8TFSNLW$/LLAibQN-NH2 818 2024,11 1013,06 1014,34 79 Ac-QSQQTFS$/r8LWRLLA$/N-NH2 819 2052,15 1027,08 1027,16 80 Ac-QS$/r5QTFSt//NLW$/LLAibQN-NH2 820 2088,18 1045,09 1047,10 81 Ac-QSQQTFSNLWRLLAibQN-NH2 821 1988,02 995,01 995,31 82 Hep/QSQ$/TF$/r8NLWRLL$/QN-NH2 822 2215,29 1108,65 1108,93 83 Ac-ASQQTF$r8NLRWLL$QN-NH2 823 2051,13 1026,57 1026,90 84 Ac-QSQQTF$/r8NLWRLL$/Q-NH2 824 2022,14 1012,07 1012,66 85 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$Q-NH2 825 1994,11 998,06 998,42 86 Ac-AAARAA$r8AAARAA$AA-NH2 826 1515,90 758,95 759,21 87 Ac-LTFEHYWAQLTSA-NH2 827 1606,78 804,39 804,59 88 Ac-LTF$r8HYWAQL$SA-NH2 828 1668,90 835,45 835,67 89 Ac-ASQQTFSNLWRLLPQN-NH2 829 1943,00 972,50 973,27 90 Ac-QS$QTFStNLW$r5LLAibQN-NH2 830 2032,12 1017,06 1017,30 91 Ac-QSQQTFAibNLWRLLAibQN-NH2 831 1986,04 994,02 994,19 92 Ac-QSQQTFNleNLWRLLNleQN-NH2 832 2042,11 1022,06 1022,23 93 Ac-QSQQTF$/r8NLWRLLAibQN-NH2 833 2082,14 1042,07 1042,23 94 Ac-QSQQTF$/r8NLWRLLNleQN-NH2 834 2110,17 1056,09 1056,29 95 Ac-QSQQTFAibNLWRLL$/QN-NH2 835 2040,09 1021,05 1021,25 96 Ac-QSQQTFNleNLWRLL$/QN-NH2 836 2068,12 1035,06 1035,31 97 Ac-QSQQTF%r8NL6clWRNleL%QN-NH2 837 2144,13 1073,07 1073,32 98 Ac-QSQQTF%r8NLMe6clWRLL%QN-NH2 838 2158,15 1080,08 1080,31 101 Ac-FNle$YWE$L-NH2 839 1160,63 - 1161,70 102 Ac-F$r8AYWELL$A-NH2 840 1344,75 - 1345,90 103 Ac-F$r8AYWQLL$A-NH2 841 1343,76 - 1344,83 104 Ac-NlePRF$r8NYWELL$QN-NH2 842 1925,06 963,53 963,69 105 Ac-NlePRF$r8DYWRLL$QN-NH2 843 1953,10 977,55 977,68 106 Ac-NlePRF$r8NYWRLL$Q-NH2 844 1838,07 920,04 920,18 107 Ac-NlePRF$r8NYWRLL$-NH2 845 1710,01 856,01 856,13 108 Ac-QSQQTF$r8DLWRLL$QN-NH2 846 2109,14 1055,57 1055,64 109 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$EN-NH2 847 2109,14 1055,57 1055,70 110 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$QD-NH2 848 2109,14 1055,57 1055,64 111 Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$S-NH2 849 1953,08 977,54 977,60 112 Ac-ESQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 850 2109,14 1055,57 1055,70 113 Ac-LTF$r8NLWRNleL$Q-NH2 851 1635,99 819,00 819,10 114 Ac-LRF$r8NLWRNleL$Q-NH2 852 1691,04 846,52 846,68 115 Ac-QSQQTF$r8NWWRNleL$QN-NH2 853 2181,15 1091,58 1091,64 116 Ac-QSQQTF$r8NLWRNleL$Q-NH2 854 1994,11 998,06 998,07 117 Ac-QTF$r8NLWRNleL$QN-NH2 855 1765,00 883,50 883,59 118 Ac-NlePRF$r8NWWRLL$QN-NH2 856 1975,13 988,57 988,75

119 Ac-NlePRF$r8NWWRLL$A-NH2 857 1804,07 903,04 903,08 120 Ac-TSFAEYWNLLNH2 858 1467,70 734,85 734,90 121 Ac-QTF$r8HWWSQL$S-NH2 859 1651,85 826,93 827,12 122 Ac-FM$YWE$L-NH2 860 1178,58 - 1179,64 123 Ac-QTFEHWWSQLLS-NH2 861 1601,76 801,88 801,94 124 Ac-QSQQTF$r8NLAmwRLNle$QN-NH2 862 2122,17 1062,09 1062,24 125 Ac-FMAibY6clWEAc3cL-NH2 863 1130,47 - 1131,53 126 Ac-FNle$Y6clWE$L-NH2 864 1194,59 - 1195,64 127 Ac-F$zr8AY6clWEAc3cL$z-NH2 865 1277,63 639,82 1278,71 128 Ac-F$r8AY6clWEAc3cL$A-NH2 866 1348,66 - 1350,72 129 Ac-NlePRF$r8NY6clWRLL$QN-NH2 867 1986,08 994,04 994,64 130 Ac-AF$r8AAWALA$A-NH2 868 1223,71 - 1224,71 131 Ac-TF$r8AAWRLA$Q-NH2 869 1395,80 698,90 399,04 132 Pr-TF$r8AAWRLA$Q-NH2 870 1409,82 705,91 706,04 133 Ac-QSQQTF%r8NLWRNleL%QN-NH2 871 2110,17 1056,09 1056,22 134 Ac-LTF%r8HYWAQL%SA-NH2 872 1670,92 836,46 836,58 135 Ac-NlePRF%r8NYWRLL%QN-NH2 873 1954,13 978,07 978,19 136 Ac-NlePRF%r8NY6clWRLL%QN-NH2 874 1988,09 995,05 995,68 137 Ac-LTF%r8HY6clWAQL%S-NH2 875 1633,84 817,92 817,93 138 Ac-QS%QTF%StNLWRLL%s8QN-NH2 876 2149,24 1075,62 1075,65 139 Ac-LTF%r8HY6clWRQL%S-NH2 877 1718,91 860,46 860,54 140 Ac-QSQQTF%r8NL6clWRLL%QN-NH2 878 2144,13 1073,07 1073,64 141 Ac-%r8SQQTFS%LWRLLAibQN-NH2 879 2040,15 1021,08 1021,13 142 Ac-LTF%r8HYWAQL%S-NH2 880 1599,88 800,94 801,09 143 Ac-TSF%r8QYWNLL%P-NH2 881 1602,88 802,44 802,58 147 Ac-LTFEHYWAQLTS-NH2 882 1535,74 768,87 769,5 152 Ac-F$er8AY6clWEAc3cL$e-NH2 883 1277,63 639,82 1278,71 153 Ac-AF$r8AAWALA$A-NH2 884 1277,63 639,82 1277,84 154 Ac-TF$r8AAWRLA$Q-NH2 885 1395,80 698,90 699,04 155 Pr-TF$r8AAWRLA$Q-NH2 886 1409,82 705,91 706,04 156 Ac-LTF$er8HYWAQL$eS-NH2 887 1597,87 799,94 800,44 159 Ac-CCPGCCBaQSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2 888 2745,30 1373,65 1372,99 160 Ac-CCPGCCBaQSQQTA$r8NLWRLL$QN-NH2 889 2669,27 1335,64 1336,09 161 Ac-CCPGCCBaNlePRF$r8NYWRLL$QN-NH2 890 2589,26 1295,63 1296,2 162 Ac-LTF$/r8HYWAQL$/S-NH2 891 1625,90 813,95 814,18 163 Ac-F%r8HY6clWRAc3cL%-NH2 892 1372,72 687,36 687,59 164 Ac-QTF%r8HWWSQL%S-NH2 893 1653,87 827,94 827,94 165 Ac-LTA$r8HYWRQL$S-NH2 894 1606,90 804,45 804,66 166 Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2 895 2080,12 1041,06 1041,61

167 Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2 896 2066,11 1034,06 1034,58 168 Ac-F$r8AYWEAc3cL$A-NH2 897 1314,70 658,35 1315,88 169 Ac-F$r8AYWEAc3cL$S-NH2 898 1330,70 666,35 1331,87 170 Ac-F$r8AYWEAc3cL$Q-NH2 899 1371,72 686,86 1372,72 171 Ac-F$r8AYWEAibL$S-NH2 900 1332,71 667,36 1334,83 172 Ac-F$r8AYWEAL$S-NH2 901 1318,70 660,35 1319,73 173 Ac-F$r8AYWEQL$S-NH2 902 1375,72 688,86 1377,53 174 Ac-F$r8HYWEQL$S-NH2 903 1441,74 721,87 1443,48 175 Ac-F$r8HYWAQL$S-NH2 904 1383,73 692,87 1385,38 176 Ac-F$r8HYWAAc3cL$S-NH2 905 1338,71 670,36 1340,82 177 Ac-F$r8HYWRAc3cL$S-NH2 906 1423,78 712,89 713,04 178 Ac-F$r8AYWEAc3cL#A-NH2 907 1300,69 651,35 1302,78 179 Ac-NlePTF%r8NYWRLL%QN-NH2 908 1899,08 950,54 950,56 180 Ac-TF$r8AAWRAL$Q-NH2 909 1395,80 698,90 699,13 181 Ac-TSF%r8HYWAQL%S-NH2 910 1573,83 787,92 787,98 184 Ac-F%r8AY6clWEAc3cL%A-NH2 911 1350,68 676,34 676,91 185 Ac-LTF$r8HYWAQI$S-NH2 912 1597,87 799,94 800,07 186 Ac-LTF$r8HYWAQNle$S-NH2 913 1597,87 799,94 800,07 187 Ac-LTF$r8HYWAQL$A-NH2 914 1581,87 791,94 792,45 188 Ac-LTF$r8HYWAQL$Abu-NH2 915 1595,89 798,95 799,03 189 Ac-LTF$r8HYWAbuQL$S-NH2 916 1611,88 806,94 807,47 190 Ac-LTF$er8AYWAQL$eS-NH2 917 1531,84 766,92 766,96 191 Ac-LAF$r8HYWAQL$S-NH2 918 1567,86 784,93 785,49 192 Ac-LAF$r8AYWAQL$S-NH2 919 1501,83 751,92 752,01 193 Ac-LTF$er8AYWAQL$eA-NH2 920 1515,85 758,93 758,97 194 Ac-LAF$r8AYWAQL$A-NH2 921 1485,84 743,92 744,05 195 Ac-LTF$r8NLWANleL$Q-NH2 922 1550,92 776,46 776,61 196 Ac-LTF$r8NLWANleL$A-NH2 923 1493,90 747,95 1495,6 197 Ac-LTF$r8ALWANleL$Q-NH2 924 1507,92 754,96 755 198 Ac-LAF$r8NLWANleL$Q-NH2 925 1520,91 761,46 761,96 199 Ac-LAF$r8ALWANleL$A-NH2 926 1420,89 711,45 1421,74 200 Ac-A$r8AYWEAc3cL$A-NH2 927 1238,67 620,34 1239,65 201 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AA-NH2 928 1385,74 693,87 1386,64 202 Ac-F$r8AYWEAc3cL$Abu-NH2 929 1328,72 665,36 1330,17 203 Ac-F$r8AYWEAc3cL$Nle-NH2 930 1356,75 679,38 1358,22 204 Ac-F$r5AYWEAc3cL$s8A-NH2 931 1314,70 658,35 1315,51 205 Ac-F$AYWEAc3cL$r8A-NH2 932 1314,70 658,35 1315,66 206 Ac-F$r8AYWEAc3cI$A-NH2 933 1314,70 658,35 1316,18 207 Ac-F$r8AYWEAc3cNle$A-NH2 934 1314,70 658,35 1315,66 208 Ac-F$r8AYWEAmlL$A-NH2 935 1358,76 680,38 1360,21

209 Ac-F$r8AYWENleL$A-NH2 936 1344,75 673,38 1345,71 210 Ac-F$r8AYWQAc3cL$A-NH2 937 1313,72 657,86 1314,7 211 Ac-F$r8AYWAAc3cL$A-NH2 938 1256,70 629,35 1257,56 212 Ac-F$r8AYWAbuAc3cL$A-NH2 939 1270,71 636,36 1272,14 213 Ac-F$r8AYWNleAc3cL$A-NH2 940 1298,74 650,37 1299,67 214 Ac-F$r8AbuYWEAc3cL$A-NH2 941 1328,72 665,36 1329,65 215 Ac-F$r8NleYWEAc3cL$A-NH2 942 1356,75 679,38 1358,66 216 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 943 1922,82 962,41 962,87 217 5-FAM-BaLTF%r8HYWAQL%S-NH2 944 1986,96 994,48 994,97 218 Ac-LTF$r8HYWAQhL$S-NH2 945 1611,88 806,94 807 219 Ac-LTF$r8HYWAQTle$S-NH2 946 1597,87 799,94 799,97 220 Ac-LTF$r8HYWAQAdm$S-NH2 947 1675,91 838,96 839,09 221 Ac-LTF$r8HYWAQhCha$S-NH2 948 1651,91 826,96 826,98 222 Ac-LTF$r8HYWAQCha$S-NH2 949 1637,90 819,95 820,02 223 Ac-LTF$r8HYWAc6cQL$S-NH2 950 1651,91 826,96 826,98 224 Ac-LTF$r8HYWAc5cQL$S-NH2 951 1637,90 819,95 820,02 225 Ac-LThF$r8HYWAQL$S-NH2 952 1611,88 806,94 807 226 Ac-LTIgl$r8HYWAQL$S-NH2 953 1625,90 813,95 812,99 227 Ac-LTF$r8HYWAQChg$S-NH2 954 1623,88 812,94 812,99 228 Ac-LTF$r8HYWAQF$S-NH2 955 1631,85 816,93 816,99 229 Ac-LTF$r8HYWAQIgl$S-NH2 956 1659,88 830,94 829,94 230 Ac-LTF$r8HYWAQCba$S-NH2 957 1609,87 805,94 805,96 231 Ac-LTF$r8HYWAQCpg$S-NH2 958 1609,87 805,94 805,96 232 Ac-LTF$r8HhYWAQL$S-NH2 959 1611,88 806,94 807 233 Ac-F$r8AYWEAc3chL$A-NH2 960 1328,72 665,36 665,43 234 Ac-F$r8AYWEAc3cTle$A-NH2 961 1314,70 658,35 1315,62 235 Ac-F$r8AYWEAc3cAdm$A-NH2 962 1392,75 697,38 697,47 236 Ac-F$r8AYWEAc3chCha$A-NH2 963 1368,75 685,38 685,34 237 Ac-F$r8AYWEAc3cCha$A-NH2 964 1354,73 678,37 678,38 238 Ac-F$r8AYWEAc6cL$A-NH2 965 1356,75 679,38 679,42 239 Ac-F$r8AYWEAc5cL$A-NH2 966 1342,73 672,37 672,46 240 Ac-hF$r8AYWEAc3cL$A-NH2 967 1328,72 665,36 665,43 241 Ac-Igl$r8AYWEAc3cL$A-NH2 968 1342,73 672,37 671,5 243 Ac-F$r8AYWEAc3cF$A-NH2 969 1348,69 675,35 675,35 244 Ac-F$r8AYWEAc3cIgl$A-NH2 970 1376,72 689,36 688,37 245 Ac-F$r8AYWEAc3cCba$A-NH2 971 1326,70 664,35 664,47 246 Ac-F$r8AYWEAc3cCpg$A-NH2 972 1326,70 664,35 664,39 247 Ac-F$r8AhYWEAc3cL$A-NH2 973 1328,72 665,36 665,43 248 Ac-F$r8AYWEAc3cL$Q-NH2 974 1371,72 686,86 1372,87 249 Ac-F$r8AYWEAibL$A-NH2 975 1316,72 659,36 1318,18

250 Ac-F$r8AYWEAL$A-NH2 976 1302,70 652,35 1303,75 251 Ac-LAF$r8AYWAAL$A-NH2 977 1428,82 715,41 715,49 252 Ac-LTF$r8HYWAAc3cL$S-NH2 978 1552,84 777,42 777,5 253 Ac-NleTF$r8HYWAQL$S-NH2 979 1597,87 799,94 800,04 254 Ac-VTF$r8HYWAQL$S-NH2 980 1583,85 792,93 793,04 255 Ac-FTF$r8HYWAQL$S-NH2 981 1631,85 816,93 817,02 256 Ac-WTF$r8HYWAQL$S-NH2 982 1670,86 836,43 836,85 257 Ac-RTF$r8HYWAQL$S-NH2 983 1640,88 821,44 821,9 258 Ac-KTF$r8HYWAQL$S-NH2 984 1612,88 807,44 807,91 259 Ac-LNleF$r8HYWAQL$S-NH2 985 1609,90 805,95 806,43 260 Ac-LVF$r8HYWAQL$S-NH2 986 1595,89 798,95 798,93 261 Ac-LFF$r8HYWAQL$S-NH2 987 1643,89 822,95 823,38 262 Ac-LWF$r8HYWAQL$S-NH2 988 1682,90 842,45 842,55 263 Ac-LRF$r8HYWAQL$S-NH2 989 1652,92 827,46 827,52 264 Ac-LKF$r8HYWAQL$S-NH2 990 1624,91 813,46 813,51 265 Ac-LTF$r8NleYWAQL$S-NH2 991 1573,89 787,95 788,05 266 Ac-LTF$r8VYWAQL$S-NH2 992 1559,88 780,94 780,98 267 Ac-LTF$r8FYWAQL$S-NH2 993 1607,88 804,94 805,32 268 Ac-LTF$r8WYWAQL$S-NH2 994 1646,89 824,45 824,86 269 Ac-LTF$r8RYWAQL$S-NH2 995 1616,91 809,46 809,51 270 Ac-LTF$r8KYWAQL$S-NH2 996 1588,90 795,45 795,48 271 Ac-LTF$r8HNleWAQL$S-NH2 997 1547,89 774,95 774,98 272 Ac-LTF$r8HVWAQL$S-NH2 998 1533,87 767,94 767,95 273 Ac-LTF$r8HFWAQL$S-NH2 999 1581,87 791,94 792,3 274 Ac-LTF$r8HWWAQL$S-NH2 1000 1620,88 811,44 811,54 275 Ac-LTF$r8HRWAQL$S-NH2 1001 1590,90 796,45 796,52 276 Ac-LTF$r8HKWAQL$S-NH2 1002 1562,90 782,45 782,53 277 Ac-LTF$r8HYWNleQL$S-NH2 1003 1639,91 820,96 820,98 278 Ac-LTF$r8HYWVQL$S-NH2 1004 1625,90 813,95 814,03 279 Ac-LTF$r8HYWFQL$S-NH2 1005 1673,90 837,95 838,03 280 Ac-LTF$r8HYWWQL$S-NH2 1006 1712,91 857,46 857,5 281 Ac-LTF$r8HYWKQL$S-NH2 1007 1654,92 828,46 828,49 282 Ac-LTF$r8HYWANleL$S-NH2 1008 1582,89 792,45 792,52 283 Ac-LTF$r8HYWAVL$S-NH2 1009 1568,88 785,44 785,49 284 Ac-LTF$r8HYWAFL$S-NH2 1010 1616,88 809,44 809,47 285 Ac-LTF$r8HYWAWL$S-NH2 1011 1655,89 828,95 829 286 Ac-LTF$r8HYWARL$S-NH2 1012 1625,91 813,96 813,98 287 Ac-LTF$r8HYWAQL$Nle-NH2 1013 1623,92 812,96 813,39 288 Ac-LTF$r8HYWAQL$V-NH2 1014 1609,90 805,95 805,99 289 Ac-LTF$r8HYWAQL$F-NH2 1015 1657,90 829,95 830,26

290 Ac-LTF$r8HYWAQL$W-NH2 1016 1696,91 849,46 849,5 291 Ac-LTF$r8HYWAQL$R-NH2 1017 1666,94 834,47 834,56 292 Ac-LTF$r8HYWAQL$K-NH2 1018 1638,93 820,47 820,49 293 Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2 1019 2080,12 1041,06 1041,54 294 Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2 1020 2066,11 1034,06 1034,58 295 Ac-LT2Pal$r8HYWAQL$S-NH2 1021 1598,86 800,43 800,49 296 Ac-LT3Pal$r8HYWAQL$S-NH2 1022 1598,86 800,43 800,49 297 Ac-LT4Pal$r8HYWAQL$S-NH2 1023 1598,86 800,43 800,49 298 Ac-LTF2CF3$r8HYWAQL$S-NH2 1024 1665,85 833,93 834,01 299 Ac-LTF2CN$r8HYWAQL$S-NH2 1025 1622,86 812,43 812,47 300 Ac-LTF2Me$r8HYWAQL$S-NH2 1026 1611,88 806,94 807 301 Ac-LTF3Cl$r8HYWAQL$S-NH2 1027 1631,83 816,92 816,99 302 Ac-LTF4CF3$r8HYWAQL$S-NH2 1028 1665,85 833,93 833,94 303 Ac-LTF4tBu$r8HYWAQL$S-NH2 1029 1653,93 827,97 828,02 304 Ac-LTF5F$r8HYWAQL$S-NH2 1030 1687,82 844,91 844,96 305 Ac-LTF$r8HY3BthAAQL$S-NH2 1031 1614,83 808,42 808,48 306 Ac-LTF2Br$r8HYWAQL$S-NH2 1032 1675,78 838,89 838,97 307 Ac-LTF4Br$r8HYWAQL$S-NH2 1033 1675,78 838,89 839,86 308 Ac-LTF2Cl$r8HYWAQL$S-NH2 1034 1631,83 816,92 816,99 309 Ac-LTF4Cl$r8HYWAQL$S-NH2 1035 1631,83 816,92 817,36 310 Ac-LTF3CN$r8HYWAQL$S-NH2 1036 1622,86 812,43 812,47 311 Ac-LTF4CN$r8HYWAQL$S-NH2 1037 1622,86 812,43 812,47 312 Ac-LTF34Cl2$r8HYWAQL$S-NH2 1038 1665,79 833,90 833,94 313 Ac-LTF34F2$r8HYWAQL$S-NH2 1039 1633,85 817,93 817,95 314 Ac-LTF35F2$r8HYWAQL$S-NH2 1040 1633,85 817,93 817,95 315 Ac-LTDip$r8HYWAQL$S-NH2 1041 1673,90 837,95 838,01 316 Ac-LTF2F$r8HYWAQL$S-NH2 1042 1615,86 808,93 809 317 Ac-LTF3F$r8HYWAQL$S-NH2 1043 1615,86 808,93 809 318 Ac-LTF4F$r8HYWAQL$S-NH2 1044 1615,86 808,93 809 319 Ac-LTF4I$r8HYWAQL$S-NH2 1045 1723,76 862,88 862,94 320 Ac-LTF3Me$r8HYWAQL$S-NH2 1046 1611,88 806,94 807,07 321 Ac-LTF4Me$r8HYWAQL$S-NH2 1047 1611,88 806,94 807 322 Ac-LT1Nal$r8HYWAQL$S-NH2 1048 1647,88 824,94 824,98 323 Ac-LT2Nal$r8HYWAQL$S-NH2 1049 1647,88 824,94 825,06 324 Ac-LTF3CF3$r8HYWAQL$S-NH2 1050 1665,85 833,93 834,01 325 Ac-LTF4NO2$r8HYWAQL$S-NH2 1051 1642,85 822,43 822,46 326 Ac-LTF3NO2$r8HYWAQL$S-NH2 1052 1642,85 822,43 822,46 327 Ac-LTF$r82ThiYWAQL$S-NH2 1053 1613,83 807,92 807,96 328 Ac-LTF$r8HBipWAQL$S-NH2 1054 1657,90 829,95 830,01 329 Ac-LTF$r8HF4tBuWAQL$S-NH2 1055 1637,93 819,97 820,02

330 Ac-LTF$r8HF4CF3WAQL$S-NH2 1056 1649,86 825,93 826,02 331 Ac-LTF$r8HF4ClWAQL$S-NH2 1057 1615,83 808,92 809,37 332 Ac-LTF$r8HF4MeWAQL$S-NH2 1058 1595,89 798,95 799,01 333 Ac-LTF$r8HF4BrWAQL$S-NH2 1059 1659,78 830,89 830,98 334 Ac-LTF$r8HF4CNWAQL$S-NH2 1060 1606,87 804,44 804,56 335 Ac-LTF$r8HF4NO2WAQL$S-NH2 1061 1626,86 814,43 814,55 336 Ac-LTF$r8H1NalWAQL$S-NH2 1062 1631,89 816,95 817,06 337 Ac-LTF$r8H2NalWAQL$S-NH2 1063 1631,89 816,95 816,99 338 Ac-LTF$r8HWAQL$S-NH2 1064 1434,80 718,40 718,49 339 Ac-LTF$r8HY1NalAQL$S-NH2 1065 1608,87 805,44 805,52 340 Ac-LTF$r8HY2NalAQL$S-NH2 1066 1608,87 805,44 805,52 341 Ac-LTF$r8HYWAQI$S-NH2 1067 1597,87 799,94 800,07 342 Ac-LTF$r8HYWAQNle$S-NH2 1068 1597,87 799,94 800,44 343 Ac-LTF$er8HYWAQL$eA-NH2 1069 1581,87 791,94 791,98 344 Ac-LTF$r8HYWAQL$Abu-NH2 1070 1595,89 798,95 799,03 345 Ac-LTF$r8HYWAbuQL$S-NH2 1071 1611,88 806,94 804,47 346 Ac-LAF$r8HYWAQL$S-NH2 1072 1567,86 784,93 785,49 347 Ac-LTF$r8NLWANleL$Q-NH2 1073 1550,92 776,46 777,5 348 Ac-LTF$r8ALWANleL$Q-NH2 1074 1507,92 754,96 755,52 349 Ac-LAF$r8NLWANleL$Q-NH2 1075 1520,91 761,46 762,48 350 Ac-F$r8AYWAAc3cL$A-NH2 1076 1256,70 629,35 1257,56 351 Ac-LTF$r8AYWAAL$S-NH2 1077 1474,82 738,41 738,55 352 Ac-LVF$r8AYWAQL$S-NH2 1078 1529,87 765,94 766 353 Ac-LTF$r8AYWAbuQL$S-NH2 1079 1545,86 773,93 773,92 354 Ac-LTF$r8AYWNleQL$S-NH2 1080 1573,89 787,95 788,17 355 Ac-LTF$r8AbuYWAQL$S-NH2 1081 1545,86 773,93 773,99 356 Ac-LTF$r8AYWHQL$S-NH2 1082 1597,87 799,94 799,97 357 Ac-LTF$r8AYWKQL$S-NH2 1083 1588,90 795,45 795,53 358 Ac-LTF$r8AYWOQL$S-NH2 1084 1574,89 788,45 788,5 359 Ac-LTF$r8AYWRQL$S-NH2 1085 1616,91 809,46 809,51 360 Ac-LTF$r8AYWSQL$S-NH2 1086 1547,84 774,92 774,96 361 Ac-LTF$r8AYWRAL$S-NH2 1087 1559,89 780,95 780,95 362 Ac-LTF$r8AYWRQL$A-NH2 1088 1600,91 801,46 801,52 363 Ac-LTF$r8AYWRAL$A-NH2 1089 1543,89 772,95 773,03 364 Ac-LTF$r5HYWAQL$s8S-NH2 1090 1597,87 799,94 799,97 365 Ac-LTF$HYWAQL$r8S-NH2 1091 1597,87 799,94 799,97 366 Ac-LTF$r8HYWAAL$S-NH2 1092 1540,84 771,42 771,48 367 Ac-LTF$r8HYWAAbuL$S-NH2 1093 1554,86 778,43 778,51 368 Ac-LTF$r8HYWALL$S-NH2 1094 1582,89 792,45 792,49 369 Ac-F$r8AYWHAL$A-NH2 1095 1310,72 656,36 656,4

370 Ac-F$r8AYWAAL$A-NH2 1096 1244,70 623,35 1245,61 371 Ac-F$r8AYWSAL$A-NH2 1097 1260,69 631,35 1261,6 372 Ac-F$r8AYWRAL$A-NH2 1098 1329,76 665,88 1330,72 373 Ac-F$r8AYWKAL$A-NH2 1099 1301,75 651,88 1302,67 374 Ac-F$r8AYWOAL$A-NH2 1100 1287,74 644,87 1289,13 375 Ac-F$r8VYWEAc3cL$A-NH2 1101 1342,73 672,37 1343,67 376 Ac-F$r8FYWEAc3cL$A-NH2 1102 1390,73 696,37 1392,14 377 Ac-F$r8WYWEAc3cL$A-NH2 1103 1429,74 715,87 1431,44 378 Ac-F$r8RYWEAc3cL$A-NH2 1104 1399,77 700,89 700,95 379 Ac-F$r8KYWEAc3cL$A-NH2 1105 1371,76 686,88 686,97 380 Ac-F$r8ANleWEAc3cL$A-NH2 1106 1264,72 633,36 1265,59 381 Ac-F$r8AVWEAc3cL$A-NH2 1107 1250,71 626,36 1252,2 382 Ac-F$r8AFWEAc3cL$A-NH2 1108 1298,71 650,36 1299,64 383 Ac-F$r8AWWEAc3cL$A-NH2 1109 1337,72 669,86 1338,64 384 Ac-F$r8ARWEAc3cL$A-NH2 1110 1307,74 654,87 655 385 Ac-F$r8AKWEAc3cL$A-NH2 1111 1279,73 640,87 641,01 386 Ac-F$r8AYWVAc3cL$A-NH2 1112 1284,73 643,37 643,38 387 Ac-F$r8AYWFAc3cL$A-NH2 1113 1332,73 667,37 667,43 388 Ac-F$r8AYWWAc3cL$A-NH2 1114 1371,74 686,87 686,97 389 Ac-F$r8AYWRAc3cL$A-NH2 1115 1341,76 671,88 671,94 390 Ac-F$r8AYWKAc3cL$A-NH2 1116 1313,75 657,88 657,88 391 Ac-F$r8AYWEVL$A-NH2 1117 1330,73 666,37 666,47 392 Ac-F$r8AYWEFL$A-NH2 1118 1378,73 690,37 690,44 393 Ac-F$r8AYWEWL$A-NH2 1119 1417,74 709,87 709,91 394 Ac-F$r8AYWERL$A-NH2 1120 1387,77 694,89 1388,66 395 Ac-F$r8AYWEKL$A-NH2 1121 1359,76 680,88 1361,21 396 Ac-F$r8AYWEAc3cL$V-NH2 1122 1342,73 672,37 1343,59 397 Ac-F$r8AYWEAc3cL$F-NH2 1123 1390,73 696,37 1392,58 398 Ac-F$r8AYWEAc3cL$W-NH2 1124 1429,74 715,87 1431,29 399 Ac-F$r8AYWEAc3cL$R-NH2 1125 1399,77 700,89 700,95 400 Ac-F$r8AYWEAc3cL$K-NH2 1126 1371,76 686,88 686,97 401 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AV-NH2 1127 1413,77 707,89 707,91 402 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AF-NH2 1128 1461,77 731,89 731,96 403 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AW-NH2 1129 1500,78 751,39 751,5 404 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AR-NH2 1130 1470,80 736,40 736,47 405 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AK-NH2 1131 1442,80 722,40 722,41 406 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AH-NH2 1132 1451,76 726,88 726,93 407 Ac-LTF2NO2$r8HYWAQL$S-NH2 1133 1642,85 822,43 822,54 408 Ac-LTA$r8HYAAQL$S-NH2 1134 1406,79 704,40 704,5 409 Ac-LTF$r8HYAAQL$S-NH2 1135 1482,82 742,41 742,47

410 Ac-QSQQTF$r8NLWALL$AN-NH2 1136 1966,07 984,04 984,38 411 Ac-QAibQQTF$r8NLWALL$AN-NH2 1137 1964,09 983,05 983,42 412 Ac-QAibQQTF$r8ALWALL$AN-NH2 1138 1921,08 961,54 961,59 413 Ac-AAAATF$r8AAWAAL$AA-NH2 1139 1608,90 805,45 805,52 414 Ac-F$r8AAWRAL$Q-NH2 1140 1294,76 648,38 648,48 415 Ac-TF$r8AAWAAL$Q-NH2 1141 1310,74 656,37 1311,62 416 Ac-TF$r8AAWRAL$A-NH2 1142 1338,78 670,39 670,46 417 Ac-VF$r8AAWRAL$Q-NH2 1143 1393,82 697,91 697,99 418 Ac-AF$r8AAWAAL$A-NH2 1144 1223,71 612,86 1224,67 420 Ac-TF$r8AAWKAL$Q-NH2 1145 1367,80 684,90 684,97 421 Ac-TF$r8AAWOAL$Q-NH2 1146 1353,78 677,89 678,01 422 Ac-TF$r8AAWSAL$Q-NH2 1147 1326,73 664,37 664,47 423 Ac-LTF$r8AAWRAL$Q-NH2 1148 1508,89 755,45 755,49 424 Ac-F$r8AYWAQL$A-NH2 1149 1301,72 651,86 651,96 425 Ac-F$r8AWWAAL$A-NH2 1150 1267,71 634,86 634,87 426 Ac-F$r8AWWAQL$A-NH2 1151 1324,73 663,37 663,43 427 Ac-F$r8AYWEAL$-NH2 1152 1231,66 616,83 1232,93 428 Ac-F$r8AYWAAL$-NH2 1153 1173,66 587,83 1175,09 429 Ac-F$r8AYWKAL$-NH2 1154 1230,72 616,36 616,44 430 Ac-F$r8AYWOAL$-NH2 1155 1216,70 609,35 609,48 431 Ac-F$r8AYWQAL$-NH2 1156 1230,68 616,34 616,44 432 Ac-F$r8AYWAQL$-NH2 1157 1230,68 616,34 616,37 433 Ac-F$r8HYWDQL$S-NH2 1158 1427,72 714,86 714,86 434 Ac-F$r8HFWEQL$S-NH2 1159 1425,74 713,87 713,98 435 Ac-F$r8AYWHQL$S-NH2 1160 1383,73 692,87 692,96 436 Ac-F$r8AYWKQL$S-NH2 1161 1374,77 688,39 688,45 437 Ac-F$r8AYWOQL$S-NH2 1162 1360,75 681,38 681,49 438 Ac-F$r8HYWSQL$S-NH2 1163 1399,73 700,87 700,95 439 Ac-F$r8HWWEQL$S-NH2 1164 1464,76 733,38 733,44 440 Ac-F$r8HWWAQL$S-NH2 1165 1406,75 704,38 704,43 441 Ac-F$r8AWWHQL$S-NH2 1166 1406,75 704,38 704,43 442 Ac-F$r8AWWKQL$S-NH2 1167 1397,79 699,90 699,92 443 Ac-F$r8AWWOQL$S-NH2 1168 1383,77 692,89 692,96 444 Ac-F$r8HWWSQL$S-NH2 1169 1422,75 712,38 712,42 445 Ac-LTF$r8NYWANleL$Q-NH2 1170 1600,90 801,45 801,52 446 Ac-LTF$r8NLWAQL$Q-NH2 1171 1565,90 783,95 784,06 447 Ac-LTF$r8NYWANleL$A-NH2 1172 1543,88 772,94 773,03 448 Ac-LTF$r8NLWAQL$A-NH2 1173 1508,88 755,44 755,49 449 Ac-LTF$r8AYWANleL$Q-NH2 1174 1557,90 779,95 780,06 450 Ac-LTF$r8ALWAQL$Q-NH2 1175 1522,89 762,45 762,45

451 Ac-LAF$r8NYWANleL$Q-NH2 1176 1570,89 786,45 786,5 452 Ac-LAF$r8NLWAQL$Q-NH2 1177 1535,89 768,95 769,03 453 Ac-LAF$r8AYWANleL$A-NH2 1178 1470,86 736,43 736,47 454 Ac-LAF$r8ALWAQL$A-NH2 1179 1435,86 718,93 719,01 455 Ac-LAF$r8AYWAAL$A-NH2 1180 1428,82 715,41 715,41 456 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AAib-NH2 1181 1399,75 700,88 700,95 457 Ac-F$r8AYWAQL$AA-NH2 1182 1372,75 687,38 687,78 458 Ac-F$r8AYWAAc3cL$AA-NH2 1183 1327,73 664,87 664,84 459 Ac-F$r8AYWSAc3cL$AA-NH2 1184 1343,73 672,87 672,9 460 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AS-NH2 1185 1401,73 701,87 701,84 461 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AT-NH2 1186 1415,75 708,88 708,87 462 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AL-NH2 1187 1427,79 714,90 714,94 463 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AQ-NH2 1188 1442,76 722,38 722,41 464 Ac-F$r8AFWEAc3cL$AA-NH2 1189 1369,74 685,87 685,93 465 Ac-F$r8AWWEAc3cL$AA-NH2 1190 1408,75 705,38 705,39 466 Ac-F$r8AYWEAc3cL$SA-NH2 1191 1401,73 701,87 701,99 467 Ac-F$r8AYWEAL$AA-NH2 1192 1373,74 687,87 687,93 468 Ac-F$r8AYWENleL$AA-NH2 1193 1415,79 708,90 708,94 469 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AbuA-NH2 1194 1399,75 700,88 700,95 470 Ac-F$r8AYWEAc3cL$NleA-NH2 1195 1427,79 714,90 714,86 471 Ac-F$r8AYWEAibL$NleA-NH2 1196 1429,80 715,90 715,97 472 Ac-F$r8AYWEAL$NleA-NH2 1197 1415,79 708,90 708,94 473 Ac-F$r8AYWENleL$NleA-NH2 1198 1457,83 729,92 729,96 474 Ac-F$r8AYWEAibL$Abu-NH2 1199 1330,73 666,37 666,39 475 Ac-F$r8AYWENleL$Abu-NH2 1200 1358,76 680,38 680,39 476 Ac-F$r8AYWEAL$Abu-NH2 1201 1316,72 659,36 659,36 477 Ac-LTF$r8AFWAQL$S-NH2 1202 1515,85 758,93 759,12 478 Ac-LTF$r8AWWAQL$S-NH2 1203 1554,86 778,43 778,51 479 Ac-LTF$r8AYWAQI$S-NH2 1204 1531,84 766,92 766,96 480 Ac-LTF$r8AYWAQNle$S-NH2 1205 1531,84 766,92 766,96 481 Ac-LTF$r8AYWAQL$SA-NH2 1206 1602,88 802,44 802,48 482 Ac-LTF$r8AWWAQL$A-NH2 1207 1538,87 770,44 770,89 483 Ac-LTF$r8AYWAQI$A-NH2 1208 1515,85 758,93 759,42 484 Ac-LTF$r8AYWAQNle$A-NH2 1209 1515,85 758,93 759,42 485 Ac-LTF$r8AYWAQL$AA-NH2 1210 1586,89 794,45 794,94 486 Ac-LTF$r8HWWAQL$S-NH2 1211 1620,88 811,44 811,47 487 Ac-LTF$r8HRWAQL$S-NH2 1212 1590,90 796,45 796,52 488 Ac-LTF$r8HKWAQL$S-NH2 1213 1562,90 782,45 782,53 489 Ac-LTF$r8HYWAQL$W-NH2 1214 1696,91 849,46 849,5 491 Ac-F$r8AYWAbuAL$A-NH2 1215 1258,71 630,36 630,5

492 Ac-F$r8AbuYWEAL$A-NH2 1216 1316,72 659,36 659,51 493 Ac-NlePRF%r8NYWRLL%QN-NH2 1217 1954,13 978,07 978,54 494 Ac-TSF%r8HYWAQL%S-NH2 1218 1573,83 787,92 787,98 495 Ac-LTF%r8AYWAQL%S-NH2 1219 1533,86 767,93 768 496 Ac-HTF$r8HYWAQL$S-NH2 1220 1621,84 811,92 811,96 497 Ac-LHF$r8HYWAQL$S-NH2 1221 1633,88 817,94 818,02 498 Ac-LTF$r8HHWAQL$S-NH2 1222 1571,86 786,93 786,94 499 Ac-LTF$r8HYWHQL$S-NH2 1223 1663,89 832,95 832,38 500 Ac-LTF$r8HYWAHL$S-NH2 1224 1606,87 804,44 804,48 501 Ac-LTF$r8HYWAQL$H-NH2 1225 1647,89 824,95 824,98 502 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHPr 1226 1639,91 820,96 820,98 503 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHsBu 1227 1653,93 827,97 828,02 504 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHiBu 1228 1653,93 827,97 828,02 505 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHBn 1229 1687,91 844,96 844,44 506 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHPe 1230 1700,92 851,46 851,99 507 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHChx 1231 1679,94 840,97 841,04 508 Ac-ETF$r8AYWAQL$S-NH2 1232 1547,80 774,90 774,96 509 Ac-STF$r8AYWAQL$S-NH2 1233 1505,79 753,90 753,94 510 Ac-LEF$r8AYWAQL$S-NH2 1234 1559,84 780,92 781,25 511 Ac-LSF$r8AYWAQL$S-NH2 1235 1517,83 759,92 759,93 512 Ac-LTF$r8EYWAQL$S-NH2 1236 1589,85 795,93 795,97 513 Ac-LTF$r8SYWAQL$S-NH2 1237 1547,84 774,92 774,96 514 Ac-LTF$r8AYWEQL$S-NH2 1238 1589,85 795,93 795,9 515 Ac-LTF$r8AYWAEL$S-NH2 1239 1532,83 767,42 766,96 516 Ac-LTF$r8AYWASL$S-NH2 1240 1490,82 746,41 746,46 517 Ac-LTF$r8AYWAQL$E-NH2 1241 1573,85 787,93 787,98 518 Ac-LTF2CN$r8HYWAQL$S-NH2 1242 1622,86 812,43 812,47 519 Ac-LTF3Cl$r8HYWAQL$S-NH2 1243 1631,83 816,92 816,99 520 Ac-LTDip$r8HYWAQL$S-NH2 1244 1673,90 837,95 838,01 521 Ac-LTF$r8HYWAQTle$S-NH2 1245 1597,87 799,94 800,04 522 Ac-F$r8AY6clWEAL$A-NH2 1246 1336,66 669,33 1338,56 523 Ac-F$r8AYdl6brWEAL$A-NH2 1247 1380,61 691,31 692,2 524 Ac-F$r8AYdl6fWEAL$A-NH2 1248 1320,69 661,35 1321,61 525 Ac-F$r8AYdl4mWEAL$A-NH2 1249 1316,72 659,36 659,36 526 Ac-F$r8AYdl5clWEAL$A-NH2 1250 1336,66 669,33 669,35 527 Ac-F$r8AYdl7mWEAL$A-NH2 1251 1316,72 659,36 659,36 528 Ac-LTF%r8HYWAQL%A-NH2 1252 1583,89 792,95 793,01 529 Ac-LTF$r8HCouWAQL$S-NH2 1253 1679,87 840,94 841,38 530 Ac-LTFEHCouWAQLTS-NH2 1254 1617,75 809,88 809,96 531 Ac-LTA$r8HCouWAQL$S-NH2 1255 1603,84 802,92 803,36

532 Ac-F$r8AYWEAL$AbuA-NH2 1256 1387,75 694,88 694,88 533 Ac-F$r8AYWEAI$AA-NH2 1257 1373,74 687,87 687,93 534 Ac-F$r8AYWEANle$AA-NH2 1258 1373,74 687,87 687,93 535 Ac-F$r8AYWEAmlL$AA-NH2 1259 1429,80 715,90 715,97 536 Ac-F$r8AYWQAL$AA-NH2 1260 1372,75 687,38 687,48 537 Ac-F$r8AYWAAL$AA-NH2 1261 1315,73 658,87 658,92 538 Ac-F$r8AYWAbuAL$AA-NH2 1262 1329,75 665,88 665,95 539 Ac-F$r8AYWNleAL$AA-NH2 1263 1357,78 679,89 679,94 540 Ac-F$r8AbuYWEAL$AA-NH2 1264 1387,75 694,88 694,96 541 Ac-F$r8NleYWEAL$AA-NH2 1265 1415,79 708,90 708,94 542 Ac-F$r8FYWEAL$AA-NH2 1266 1449,77 725,89 725,97 543 Ac-LTF$r8HYWAQhL$S-NH2 1267 1611,88 806,94 807 544 Ac-LTF$r8HYWAQAdm$S-NH2 1268 1675,91 838,96 839,04 545 Ac-LTF$r8HYWAQIgl$S-NH2 1269 1659,88 830,94 829,94 546 Ac-F$r8AYWAQL$AA-NH2 1270 1372,75 687,38 687,48 547 Ac-LTF$r8ALWAQL$Q-NH2 1271 1522,89 762,45 762,52 548 Ac-F$r8AYWEAL$AA-NH2 1272 1373,74 687,87 687,93 549 Ac-F$r8AYWENleL$AA-NH2 1273 1415,79 708,90 708,94 550 Ac-F$r8AYWEAibL$Abu-NH2 1274 1330,73 666,37 666,39 551 Ac-F$r8AYWENleL$Abu-NH2 1275 1358,76 680,38 680,38 552 Ac-F$r8AYWEAL$Abu-NH2 1276 1316,72 659,36 659,36 553 Ac-F$r8AYWEAc3cL$AbuA-NH2 1277 1399,75 700,88 700,95 554 Ac-F$r8AYWEAc3cL$NleA-NH2 1278 1427,79 714,90 715,01 555 H-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1279 1489,83 745,92 745,95 556 mdPEG3-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1280 1679,92 840,96 840,97 557 mdPEG7-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1281 1856,02 929,01 929,03 558 Ac-F$r8ApmpEt6clWEAL$A-NH2 1282 1470,71 736,36 788,17 559 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQL$S-NH2 1283 1565,81 783,91 809,18 560 Ac-LTF3Cl$r8HYWAQL$A-NH2 1284 1615,83 808,92 875,24 561 Ac-LTF3Cl$r8HYWWQL$S-NH2 1285 1746,87 874,44 841,65 562 Ac-LTF3Cl$r8AYWWQL$S-NH2 1286 1680,85 841,43 824,63 563 Ac-LTF$r8AYWWQL$S-NH2 1287 1646,89 824,45 849,98 564 Ac-LTF$r8HYWWQL$A-NH2 1288 1696,91 849,46 816,67 565 Ac-LTF$r8AYWWQL$A-NH2 1289 1630,89 816,45 776,15 566 Ac-LTF4F$r8AYWAQL$S-NH2 1290 1549,83 775,92 776,15 567 Ac-LTF2F$r8AYWAQL$S-NH2 1291 1549,83 775,92 776,15 568 Ac-LTF3F$r8AYWAQL$S-NH2 1292 1549,83 775,92 785,12 569 Ac-LTF34F2$r8AYWAQL$S-NH2 1293 1567,83 784,92 785,12 570 Ac-LTF35F2$r8AYWAQL$S-NH2 1294 1567,83 784,92 1338,74 571 Ac-F3Cl$r8AYWEAL$A-NH2 1295 1336,66 669,33 705,28

572 Ac-F3Cl$r8AYWEAL$AA-NH2 1296 1407,70 704,85 680,11 573 Ac-F$r8AY6clWEAL$AA-NH2 1297 1407,70 704,85 736,83 574 Ac-F$r8AY6clWEAL$-NH2 1298 1265,63 633,82 784,1 575 Ac-LTF$r8HYWAQLSt/S-NH2 1299 16,03 9,02 826,98 576 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHsBu 1300 1653,93 827,97 828,02 577 Ac-STF$r8AYWAQL$S-NH2 1301 1505,79 753,90 753,94 578 Ac-LTF$r8AYWAEL$S-NH2 1302 1532,83 767,42 767,41 579 Ac-LTF$r8AYWAQL$E-NH2 1303 1573,85 787,93 787,98 580 mdPEG3-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1304 1679,92 840,96 840,97 581 Ac-LTF$r8AYWAQhL$S-NH2 1305 1545,86 773,93 774,31 583 Ac-LTF$r8AYWAQCha$S-NH2 1306 1571,88 786,94 787,3 584 Ac-LTF$r8AYWAQChg$S-NH2 1307 1557,86 779,93 780,4 585 Ac-LTF$r8AYWAQCba$S-NH2 1308 1543,84 772,92 780,13 586 Ac-LTF$r8AYWAQF$S-NH2 1309 1565,83 783,92 784,2 587 Ac-LTF4F$r8HYWAQhL$S-NH2 1310 1629,87 815,94 815,36 588 Ac-LTF4F$r8HYWAQCha$S-NH2 1311 1655,89 828,95 828,39 589 Ac-LTF4F$r8HYWAQChg$S-NH2 1312 1641,87 821,94 821,35 590 Ac-LTF4F$r8HYWAQCba$S-NH2 1313 1627,86 814,93 814,32 591 Ac-LTF4F$r8AYWAQhL$S-NH2 1314 1563,85 782,93 782,36 592 Ac-LTF4F$r8AYWAQCha$S-NH2 1315 1589,87 795,94 795,38 593 Ac-LTF4F$r8AYWAQChg$S-NH2 1316 1575,85 788,93 788,35 594 Ac-LTF4F$r8AYWAQCba$S-NH2 1317 1561,83 781,92 781,39 595 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQhL$S-NH2 1318 1579,82 790,91 790,35 596 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCha$S-NH2 1319 1605,84 803,92 803,67 597 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQChg$S-NH2 1320 1591,82 796,91 796,34 598 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCba$S-NH2 1321 1577,81 789,91 789,39 599 Ac-LTF$r8AYWAQhF$S-NH2 1322 1579,84 790,92 791,14 600 Ac-LTF$r8AYWAQF3CF3$S-NH2 1323 1633,82 817,91 818,15 601 Ac-LTF$r8AYWAQF3Me$S-NH2 1324 1581,86 791,93 791,32 602 Ac-LTF$r8AYWAQ1Nal$S-NH2 1325 1615,84 808,92 809,18 603 Ac-LTF$r8AYWAQBip$S-NH2 1326 1641,86 821,93 822,13 604 Ac-LTF$r8FYWAQL$A-NH2 1327 1591,88 796,94 797,33 605 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHAm 1328 1667,94 834,97 835,92 606 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHiAm 1329 1667,94 834,97 835,55 607 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr3Ph 1330 1715,94 858,97 859,79 608 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnBu3,3Me 1331 1681,96 841,98 842,49 610 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr 1332 1639,91 820,96 821,58 611 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnEt2Ch 1333 1707,98 854,99 855,35 612 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHHex 1334 1681,96 841,98 842,4 613 Ac-LTF$r8AYWAQL$S-NHmdPeg2 1335 1633,91 817,96 818,35

614 Ac-LTF$r8AYWAQL$A-NHmdPeg2 1336 1617,92 809,96 810,3 615 Ac-LTF$r8AYWAQL$A-NHmdPeg4 1337 1705,97 853,99 854,33 616 Ac-F$r8AYdl4mWEAL$A-NH2 1338 1316,72 659,36 659,44 617 Ac-F$r8AYdl5clWEAL$A-NH2 1339 1336,66 669,33 669,43 618 Ac-LThF$r8AYWAQL$S-NH2 1340 1545,86 773,93 774,11 619 Ac-LT2Nal$r8AYWAQL$S-NH2 1341 1581,86 791,93 792,43 620 Ac-LTA$r8AYWAQL$S-NH2 1342 1455,81 728,91 729,15 621 Ac-LTF$r8AYWVQL$S-NH2 1343 1559,88 780,94 781,24 622 Ac-LTF$r8HYWAAL$A-NH2 1344 1524,85 763,43 763,86 623 Ac-LTF$r8VYWAQL$A-NH2 1345 1543,88 772,94 773,37 624 Ac-LTF$r8IYWAQL$S-NH2 1346 1573,89 787,95 788,17 625 Ac-FTF$r8VYWSQL$S-NH2 1347 1609,85 805,93 806,22 626 Ac-ITF$r8FYWAQL$S-NH2 1348 1607,88 804,94 805,2 627 Ac-2NalTF$r8VYWSQL$S-NH2 1349 1659,87 830,94 831,2 628 Ac-ITF$r8LYWSQL$S-NH2 1350 1589,89 795,95 796,13 629 Ac-FTF$r8FYWAQL$S-NH2 1351 1641,86 821,93 822,13 630 Ac-WTF$r8VYWAQL$S-NH2 1352 1632,87 817,44 817,69 631 Ac-WTF$r8WYWAQL$S-NH2 1353 1719,88 860,94 861,36 632 Ac-VTF$r8AYWSQL$S-NH2 1354 1533,82 767,91 768,19 633 Ac-WTF$r8FYWSQL$S-NH2 1355 1696,87 849,44 849,7 634 Ac-FTF$r8IYWAQL$S-NH2 1356 1607,88 804,94 805,2 635 Ac-WTF$r8VYWSQL$S-NH2 1357 1648,87 825,44 824,8 636 Ac-FTF$r8LYWSQL$S-NH2 1358 1623,87 812,94 812,8 637 Ac-YTF$r8FYWSQL$S-NH2 1359 1673,85 837,93 837,8 638 Ac-LTF$r8AY6clWEAL$A-NH2 1360 1550,79 776,40 776,14 639 Ac-LTF$r8AY6clWSQL$S-NH2 1361 1581,80 791,90 791,68 640 Ac-F$r8AY6clWSAL$A-NH2 1362 1294,65 648,33 647,67 641 Ac-F$r8AY6clWQAL$AA-NH2 1363 1406,72 704,36 703,84 642 Ac-LHF$r8AYWAQL$S-NH2 1364 1567,86 784,93 785,21 643 Ac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1365 1531,84 766,92 767,17 644 Ac-LTF$r8AHWAQL$S-NH2 1366 1505,84 753,92 754,13 645 Ac-LTF$r8AYWAHL$S-NH2 1367 1540,84 771,42 771,61 646 Ac-LTF$r8AYWAQL$H-NH2 1368 1581,87 791,94 792,15 647 H-LTF$r8AYWAQL$A-NH2 1369 1473,84 737,92 737,29 648 Ac-HHF$r8AYWAQL$S-NH2 1370 1591,83 796,92 797,35 649 Ac-aAibWTF$r8VYWSQL$S-NH2 1371 1804,96 903,48 903,64 650 Ac-AibWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1372 1755,91 878,96 879,4 651 Ac-AibAWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1373 1826,95 914,48 914,7 652 Ac-fWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1374 1817,93 909,97 910,1 653 Ac-AibWWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1375 1941,99 972,00 972,2

654 Ac-WTF$r8LYWSQL$S-NH2 1376 1662,88 832,44 832,8 655 Ac-WTF$r8NleYWSQL$S-NH2 1377 1662,88 832,44 832,6 656 Ac-LTF$r8AYWSQL$a-NH2 1378 1531,84 766,92 767,2 657 Ac-LTF$r8EYWARL$A-NH2 1379 1601,90 801,95 802,1 658 Ac-LTF$r8EYWAHL$A-NH2 1380 1582,86 792,43 792,6 659 Ac-aTF$r8AYWAQL$S-NH2 1381 1489,80 745,90 746,08 660 Ac-AibTF$r8AYWAQL$S-NH2 1382 1503,81 752,91 753,11 661 Ac-AmfTF$r8AYWAQL$S-NH2 1383 1579,84 790,92 791,14 662 Ac-AmwTF$r8AYWAQL$S-NH2 1384 1618,86 810,43 810,66 663 Ac-NmLTF$r8AYWAQL$S-NH2 1385 1545,86 773,93 774,11 664 Ac-LNmTF$r8AYWAQL$S-NH2 1386 1545,86 773,93 774,11 665 Ac-LSarF$r8AYWAQL$S-NH2 1387 1501,83 751,92 752,18 667 Ac-LGF$r8AYWAQL$S-NH2 1388 1487,82 744,91 745,15 668 Ac-LTNmF$r8AYWAQL$S-NH2 1389 1545,86 773,93 774,2 669 Ac-TF$r8AYWAQL$S-NH2 1390 1418,76 710,38 710,64 670 Ac-ETF$r8AYWAQL$A-NH2 1391 1531,81 766,91 767,2 671 Ac-LTF$r8EYWAQL$A-NH2 1392 1573,85 787,93 788,1 672 Ac-LT2Nal$r8AYWSQL$S-NH2 1393 1597,85 799,93 800,4 673 Ac-LTF$r8AYWAAL$S-NH2 1394 1474,82 738,41 738,68 674 Ac-LTF$r8AYWAQhCha$S-NH2 1395 1585,89 793,95 794,19 675 Ac-LTF$r8AYWAQChg$S-NH2 1396 1557,86 779,93 780,97 676 Ac-LTF$r8AYWAQCba$S-NH2 1397 1543,84 772,92 773,19 677 Ac-LTF$r8AYWAQF3CF3$S-NH2 1398 1633,82 817,91 818,15 678 Ac-LTF$r8AYWAQ1Nal$S-NH2 1399 1615,84 808,92 809,18 679 Ac-LTF$r8AYWAQBip$S-NH2 1400 1641,86 821,93 822,32 680 Ac-LT2Nal$r8AYWAQL$S-NH2 1401 1581,86 791,93 792,15 681 Ac-LTF$r8AYWVQL$S-NH2 1402 1559,88 780,94 781,62 682 Ac-LTF$r8AWWAQL$S-NH2 1403 1554,86 778,43 778,65 683 Ac-FTF$r8VYWSQL$S-NH2 1404 1609,85 805,93 806,12 684 Ac-ITF$r8FYWAQL$S-NH2 1405 1607,88 804,94 805,2 685 Ac-ITF$r8LYWSQL$S-NH2 1406 1589,89 795,95 796,22 686 Ac-FTF$r8FYWAQL$S-NH2 1407 1641,86 821,93 822,41 687 Ac-VTF$r8AYWSQL$S-NH2 1408 1533,82 767,91 768,19 688 Ac-LTF$r8AHWAQL$S-NH2 1409 1505,84 753,92 754,31 689 Ac-LTF$r8AYWAQL$H-NH2 1410 1581,87 791,94 791,94 690 Ac-LTF$r8AYWAHL$S-NH2 1411 1540,84 771,42 771,61 691 Ac-aAibWTF$r8VYWSQL$S-NH2 1412 1804,96 903,48 903,9 692 Ac-AibWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1413 1755,91 878,96 879,5 693 Ac-AibAWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1414 1826,95 914,48 914,7 694 Ac-fWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1415 1817,93 909,97 910,2

695 Ac-AibWWTF$r8HYWAQL$S-NH2 1416 1941,99 972,00 972,7 696 Ac-WTF$r8LYWSQL$S-NH2 1417 1662,88 832,44 832,7 697 Ac-WTF$r8NleYWSQL$S-NH2 1418 1662,88 832,44 832,7 698 Ac-LTF$r8AYWSQL$a-NH2 1419 1531,84 766,92 767,2 699 Ac-LTF$r8EYWARL$A-NH2 1420 1601,90 801,95 802,2 700 Ac-LTF$r8EYWAHL$A-NH2 1421 1582,86 792,43 792,6 701 Ac-aTF$r8AYWAQL$S-NH2 1422 1489,80 745,90 746,1 702 Ac-AibTF$r8AYWAQL$S-NH2 1423 1503,81 752,91 753,2 703 Ac-AmfTF$r8AYWAQL$S-NH2 1424 1579,84 790,92 791,2 704 Ac-AmwTF$r8AYWAQL$S-NH2 1425 1618,86 810,43 810,7 705 Ac-NmLTF$r8AYWAQL$S-NH2 1426 1545,86 773,93 774,1 706 Ac-LNmTF$r8AYWAQL$S-NH2 1427 1545,86 773,93 774,4 707 Ac-LSarF$r8AYWAQL$S-NH2 1428 1501,83 751,92 752,1 708 Ac-TF$r8AYWAQL$S-NH2 1429 1418,76 710,38 710,8 709 Ac-ETF$r8AYWAQL$A-NH2 1430 1531,81 766,91 767,4 710 Ac-LTF$r8EYWAQL$A-NH2 1431 1573,85 787,93 788,2 711 Ac-WTF$r8VYWSQL$S-NH2 1432 1648,87 825,44 825,2 713 Ac-YTF$r8FYWSQL$S-NH2 1433 1673,85 837,93 837,3 714 Ac-F$r8AY6clWSAL$A-NH2 1434 1294,65 648,33 647,74 715 Ac-ETF$r8EYWVQL$S-NH2 1435 1633,84 817,92 817,36 716 Ac-ETF$r8EHWAQL$A-NH2 1436 1563,81 782,91 782,36 717 Ac-ITF$r8EYWAQL$S-NH2 1437 1589,85 795,93 795,38 718 Ac-ITF$r8EHWVQL$A-NH2 1438 1575,88 788,94 788,42 719 Ac-ITF$r8EHWAQL$S-NH2 1439 1563,85 782,93 782,43 720 Ac-LTF4F$r8AYWAQCba$S-NH2 1440 1561,83 781,92 781,32 721 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQhL$S-NH2 1441 1579,82 790,91 790,64 722 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCha$S-NH2 1442 1605,84 803,92 803,37 723 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQChg$S-NH2 1443 1591,82 796,91 796,27 724 Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCba$S-NH2 1444 1577,81 789,91 789,83 725 Ac-LTF$r8AY6clWSQL$S-NH2 1445 1581,80 791,90 791,75 726 Ac-LTF4F$r8HYWAQhL$S-NH2 1446 1629,87 815,94 815,36 727 Ac-LTF4F$r8HYWAQCba$S-NH2 1447 1627,86 814,93 814,32 728 Ac-LTF4F$r8AYWAQhL$S-NH2 1448 1563,85 782,93 782,36 729 Ac-LTF4F$r8AYWAQChg$S-NH2 1449 1575,85 788,93 788,35 730 Ac-ETF$r8EYWVAL$S-NH2 1450 1576,82 789,41 788,79 731 Ac-ETF$r8EHWAAL$A-NH2 1451 1506,79 754,40 754,8 732 Ac-ITF$r8EYWAAL$S-NH2 1452 1532,83 767,42 767,75 733 Ac-ITF$r8EHWVAL$A-NH2 1453 1518,86 760,43 760,81 734 Ac-ITF$r8EHWAAL$S-NH2 1454 1506,82 754,41 754,8 735 Pam-LTF$r8EYWAQL$S-NH2 1455 1786,07 894,04 894,48

736 Pam-ETF$r8EYWAQL$S-NH2 1456 1802,03 902,02 902,34 737 Ac-LTF$r8AYWLQL$S-NH2 1457 1573,89 787,95 787,39 738 Ac-LTF$r8EYWLQL$S-NH2 1458 1631,90 816,95 817,33 739 Ac-LTF$r8EHWLQL$S-NH2 1459 1605,89 803,95 804,29 740 Ac-LTF$r8VYWAQL$S-NH2 1460 1559,88 780,94 781,34 741 Ac-LTF$r8AYWSQL$S-NH2 1461 1547,84 774,92 775,33 742 Ac-ETF$r8AYWAQL$S-NH2 1462 1547,80 774,90 775,7 743 Ac-LTF$r8EYWAQL$S-NH2 1463 1589,85 795,93 796,33 744 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHAm 1464 1667,94 834,97 835,37 745 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHiAm 1465 1667,94 834,97 835,27 746 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr3Ph 1466 1715,94 858,97 859,42 747 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnBu3,3Me 1467 1681,96 841,98 842,67 748 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnBu 1468 1653,93 827,97 828,24 749 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr 1469 1639,91 820,96 821,31 750 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnEt2Ch 1470 1707,98 854,99 855,35 751 Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHHex 1471 1681,96 841,98 842,4 752 Ac-LTF$r8AYWAQL$S-NHmdPeg2 1472 1633,91 817,96 855,35 753 Ac-LTF$r8AYWAQL$A-NHmdPeg2 1473 1617,92 809,96 810,58 754 Ac-LTF$r5AYWAAL$s8S-NH2 1474 1474,82 738,41 738,79 755 Ac-LTF$r8AYWCouQL$S-NH2 1475 1705,88 853,94 854,61 756 Ac-LTF$r8CouYWAQL$S-NH2 1476 1705,88 853,94 854,7 757 Ac-CouTF$r8AYWAQL$S-NH2 1477 1663,83 832,92 833,33 758 H-LTF$r8AYWAQL$A-NH2 1478 1473,84 737,92 737,29 759 Ac-HHF$r8AYWAQL$S-NH2 1479 1591,83 796,92 797,72 760 Ac-LT2Nal$r8AYWSQL$S-NH2 1480 1597,85 799,93 800,68 761 Ac-LTF$r8HCouWAQL$S-NH2 1481 1679,87 840,94 841,38 762 Ac-LTF$r8AYWCou2QL$S-NH2 1482 1789,94 895,97 896,51 763 Ac-LTF$r8Cou2YWAQL$S-NH2 1483 1789,94 895,97 896,5 764 Ac-Cou2TF$r8AYWAQL$S-NH2 1484 1747,90 874,95 875,42 765 Ac-LTF$r8ACou2WAQL$S-NH2 1485 1697,92 849,96 850,82 766 Dmaac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1486 1574,89 788,45 788,82 767 Hexac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1487 1587,91 794,96 795,11 768 Napac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1488 1657,89 829,95 830,36 769 Pam-LTF$r8AYWAQL$S-NH2 1489 1728,06 865,03 865,45 770 Ac-LT2Nal$r8HYAAQL$S-NH2 1490 1532,84 767,42 767,61 771 Ac-LT2Nal$/r8HYWAQL$/S-NH2 1491 1675,91 838,96 839,1 772 Ac-LT2Nal$r8HYFAQL$S-NH2 1492 1608,87 805,44 805,9 773 Ac-LT2Nal$r8HWAAQL$S-NH2 1493 1555,86 778,93 779,08 774 Ac-LT2Nal$r8HYAWQL$S-NH2 1494 1647,88 824,94 825,04 775 Ac-LT2Nal$r8HYAAQW$S-NH2 1495 1605,83 803,92 804,05

776 Ac-LTW$r8HYWAQL$S-NH2 1496 1636,88 819,44 819,95 777 Ac-LT1Nal$r8HYWAQL$S-NH2 1497 1647,88 824,94 825,41

В некоторых вариантах осуществления пептидомиметические макроциклы, описанные в настоящем изобретении, не содержат пептидомиметическую макроциклическую структуру, как показано в Таблице 2b.

В Таблице 2c представлены примеры полипептидов без поперечных связей, содержащие D-аминокислоты.

Таблица 2с SP Последовательность SEQ ID NO: Изомер Точная масса Найденная масса Выч. (M+1)/1 Выч. (M+2)/2 Выч. (M+3)/3 SP765 Ac-tawyanfekllr-NH2 1498 777,46 SP766 Ac-tawyanf4CF3ekllr-NH2 1499 811,41

Пример 3: совмещенная рентгеновская кристаллография пептидомиметических макроциклов в комплексе с MDMX

Для совмещенной кристаллизации с пептидом 46 (Таблица 2b), стехиометрическое количество соединения из 100 мM маточного раствора в DMSO добавляли к раствору белка MDMX данио и оставляли стоять в течение ночи при 4ºC до подготовки экспериментов по кристаллизации. Процедуры были аналогичны таковым, описанным Popowicz et al. с некоторыми изменениями, как отмечено ниже. Белок (остатки 15-129, L46V/V95L) получали из экспрессионной системы E. coli BL21(DE3), используя вектор pET15b. Клетки выращивали при 37ºC и индуцировали 1 мM IPTG при OD₆₀₀ 0,7. Клетки оставляли расти еще 18 часов при 23ºC. Белок очищали, используя Ni-NT агарозу, затем Superdex 75 забуференным 50 мM NaPO₄, pH 8,0, 150 мM NaCl, 2 мM TCEP, а затем концентрировали до 24 мг/мл. Буфер меняли на 20 мM Tris, pH 8,0, 50 мM NaCl, 2 мM DTT для экспериментов по кристаллизации. Начальные кристаллы получали с использованием Nextal (Qiagen) AMS сито #94, а конечный оптимизированный резервуар представлял собой 2,6 M AMS, 75 мM Hepes, pH 7,5. Кристаллы выращивали обычным способом в виде тонких пластин при 4ºC и им обеспечивали криозащиту путем пропускания их через раствор, содержащий концентрированный (3,4 M) малонат с последующим мгновенным охлаждением, и погружали в жидкий азот.

Сбор данных проводили на APS с каналом синхронного излучения 31-ID (SGX-CAT) при 100ºK и длине волны 0,97929Å. Канал синхронного излучения был снабжен детектором Rayonix 225-HE. Для сбора данных кристаллы поворачивали на угол 180º с 1º возрастанием, используя время экспозиции 0,8 секунд. Данные обрабатывали и преобразовывали, используя Mosflm/scala (CCP4; смотри CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallogr. D50, 760-763 (1994); P.R. Evans. Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter 33, 22-24 (1997)) в пространственной группе C2 (элементарная ячейка: a = 109,2786, b = 81,0836, c = 30,9058Å, α = 90, β = 89,8577, γ = 90º). Молекулярное замещение с использованием программы Molrep (CCP4; смотри A.Vagin & A. Teplyakov. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997)) проводили с использованием MDMX компонента структуры, определенного Popowicz et al. (2Z5S; смотри G.M. Popowicz, A. Czarna, U. Rothweiler, A. Szwagierczak, M. Krajewski, L. Weber & T.A. Holak. Cell Cycle 6, 2386-2392 (2007)) и идентифицировали две молекулы в асимметричном звене. Начальное уточнение только двух молекул MDMX данио с использованием программы Refmac (CCP4; смотри G.N. Murshudov, A.A. Vagin & E.J. Dodson. Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997)) с получением в результате R-фактора 0,3424 (R_free = 0,3712) и величин rmsd для связей (0,018 Å) и углов (1,698º). Электронная плотность для скрепленных пептидных компонентов, начиная с Gln¹⁹ и включая все алифатические скобки, была очень светлой. Дальнейшее уточнение с использованием CNX (Accelrys), используя данные до 2,3 Å разрешения давало в результате модель (состоящую из 1448 атомов из MDMX, 272 атомов из скрепленных пептидов и 46 молекул воды), которая является очищенной (R_f = 0,2601, R_free = 0,3162, rmsd связи = 0,007 Å и rmsd углы = 0,916º).

Результаты этого примера показаны на Фигурах 1 и 2.

Пример 4: Анализ кругового дихроизма (CD) альфа-спиральности

Пептидные растворы анализировали с помощью CD спектроскопии, используя спектрополяриметр Jasco J-815 (Jasco Inc., Easton, MD) с программным обеспечением Jasco Spectra Manager Ver.2 system. Терморегулятор Пельтье использовали для поддержания температурного контроля оптической ячейки. Результаты выражают как среднюю молярную эллиптичность [θ] (град см² дмоль^-1) вычисленную по уравнению [θ]=θнабл·MRW/10*l*c, где θнабл представляет собой наблюдаемую эллиптичность в миллиградусах, MRW представляет собой среднюю остаточную массу пептида (молекулярная масса пептида/количество остатков), l представляет собой длину оптического пути ячейки в сантиметрах, и c представляет собой концентрацию пептида в мг/мл. Концентрации пептида определяли аминокислотным анализом. Маточные растворы пептидов получали в слабом CD буфере (20 мM фосфорной кислоты, pH 2). Исходные растворы использовали для получения пептидных растворов 0,05 мг/мл либо в слабом CD буфере, либо CD буфере с 50% трифторэтанолом (TFE) для анализов в ячейке с 10 мм длиной оптического пути. Измерения различных длин волн пептидных растворов сканировали при 4ºC от 195 до 250 нм, с 0,2 нм увеличениями, и скоростью сканирования 50 нм в минуту. Регистрировали среднее шести сканирований.

В Таблице 3 представлены данные кругового дихроизма для выбранных пептидомиметических макроциклов:

Таблица 3 SP# Слабая молярная эллиптичность (222 в 0% TFE) Молярная эллиптичность 50% TFE (222 в 50% TFE) Молярная эллиптичность TFE - слабая молярная эллиптичность % Спиральности 50% TFE по сравнению с 50% TFE исходно (CD) % слабой спиральности по сравнению с 50% TFE исходно (CD) 7 124 -19921,4 -20045,4 137,3 -0,9 11 -398,2 -16623,4 16225,2 106,1 2,5 41 -909 -21319,4 20410,4 136 5,8 43 -15334,5 -18247,4 2912,9 116,4 97,8 69 -102,6 -21509,7 -21407,1 148,2 0,7 71 -121,2 -17957 -17835,9 123,7 0,8 154 -916,2 -30965,1 -30048,9 213,4 6,3 230 -213,2 -17974 -17760,8 123,9 1,5 233 -477,9 -19032,6 -18554,7 131,2 3,3

Пример 5: Анализ прямого связывания MDM2 с помощью флуоресцентной поляризации (ФП)

Это исследование проводили в соответствии со следующим общим протоколом:

1. Разбавить MDM2 (полученный в лаборатории, 41 кДа) в ФП буфере (высококонцентрированный солевой буфер-200 мМ NaCl, 5 мМ CHAPS, pH 7,5) для получения 10 мкM рабочего маточного раствора.

2. Добавить 30 мкл 10 мкM маточного раствора белка в A1 и B1 лунки 96-луночного черного НЕ микропланшета (Molecular Devices).

3. Внести 30 мкл FP буфера в колонку A2 - A12, B2 - B12, C1 - C12, и D1 - D12.

4. 2- или 3-кратное серийное разведение маточного раствора белка из A1, B1 в A2, B2; A2, B2 в A3, B3; … до достижения однозначного числа нМ концентрации в точке последнего разведения.

5. Разбавить 1 мМ (в 100% DMSO) FAM-меченого линейного пептида с использованием DMSO до 100 мкM (разбавление 1:10). Затем, разбавить от 100 мкM до 10 мкM водой (разбавление 1:10) и затем разбавить ФП-буфером от 10 мкM до 40 нM (разбавление 1:250). Это рабочий раствор, который будет представлять собой 10 нМ концентрацию в лунке (разбавление 1:4). Хранить разбавленный FAM-меченый пептид в темноте до использования.

6. Добавить 10 мкл 10 нм FAM-меченого пептида в каждую лунку и инкубировать, и снимали показания в различные моменты времени. Kd с 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH₂ (SEQ ID NO: 943) составляет ~13,38 нМ.

Пример 6: Анализ конкурентной флуоресцентной поляризации для MDM2

Это исследование проводили в соответствии со следующим общим протоколом:

1. Разбавить MDM2 (полученный в лаборатории, 41 кДа) в ФП-буфере (высококонцентрированный солевой буфер-200 мМ NaСl, 5 мМ CHAPS, pH 7,5) для получения 84 нМ (2X) рабочего маточного раствора.

2. Добавить 20 мкл 84 нМ (2X) маточного раствора белка в каждую лунку 96-луночного черного НЕ микропланшета (Molecular Devices).

3. Разбавить 1 мМ (в 100% DMSO) FAM-меченого линейного пептида с использованием DMSO до 100 мкМ (разбавление 1:10). Затем, разбавить от 100 мкМ до 10 мкМ водой (разбавление 1:10) и затем разбавить ФП-буфером от 10 мкМ до 40 нМ (разбавление 1:250). Это рабочий раствор, который будет представлять собой 10 нМ концентрацию в лунке (разбавление 1:4). Хранить разбавленный FAM-меченый пептид в темноте до использования.

4. Получить планшет с дозой немеченного пептида с ФП-буфером, начиная с 1 мкМ (конечная) пептида и делая 5-кратные серийные разведения для 6 точек, используя следующую схему разбавления.

Разбавить 10 мМ (в 100% DMSO) с использованием DMSO до 5 мМ (разбавление 1:2). Затем, разбавить от 5 мМ до 500 мкМ с использованием H₂O (разбавление 1:10), а затем разбавить ФП-буфером от 500 мкМ до 20 мкМ (разбавление 1:25). Делать 5-кратные серийные разведения 4 мкМ (4X) для 6 точек.

5. Перенести 10 мкл серийно разведенных немеченных пептидов в каждую лунку, которую заполняют 20 мкл 84 нМ белка.

6. Добавить 10 мкл 10нМ (4X) FAM-меченого пептида в каждую лунку и инкубировать в течение 3 часов для снятия показаний.

Пример 7: анализ прямого связывания MDMX с помощью флуоресцентной поляризации (ФП)

Это исследование проводили в соответствии со следующим общим протоколом:

1. Разбавить MDMX (полученный в лаборатории, 40 кДа) в ФП-буфере (высококонцентрированный солевой буфер-200 мМ NaCl,5 мМ CHAPS, pH 7,5) для получения 10 мкМ рабочего маточного раствора.

2. Добавить 30 мкл 10 мкМ маточного раствора белка в A1 и B1 лунки 96-луночного черного НЕ микропланшета (Molecular Devices).

3. Внести 30 мкл ФП-буфера в колонку A2 - A12, B2 - B12, C1 - C12, и D1 - D12.

4. 2- или 3-кратное серийное разведение маточного раствора белка из A1, B1 в A2, B2; A2, B2 в A3, B3; … до достижения однозначного числа нМ концентрации в точке последнего разведения.

5. Разбавить 1 мМ (в 100% DMSO) FAM-меченого линейного пептида с использованием DMSO до 100 мкМ (разбавление 1:10). Затем, разбавить от 100 мкМ до 10 мкМ водой (разбавление 1:10) и затем разбавить ФП-буфером от 10 мкМ до 40нМ (разбавление 1:250). Это рабочий раствор, который будет представлять собой 10 нМ концентрацию в лунке (разбавление 1:4). Хранить разбавленный FAM-меченый пептид в темноте до использования.

6. Добавить 10 мкл 10 нМ FAM-меченого пептида в каждую лунку и инкубировать, и показания снимали в различные моменты времени.

Kd с 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH₂ (SEQ ID NO: 943) составляет ~51 нМ.

Пример 8: Анализ конкурентной флуоресцентной поляризации для MDMX

Это исследование проводили в соответствии со следующим общим протоколом:

1. Разбавить MDMX (полученный в лаборатории, 40 кДа) в ФП-буфере (высококонцентрированный солевой буфер-200мМ NaCl, 5 мМ CHAPS, pH 7,5) для получения 300 нМ (2X) рабочего маточного раствора.

2. Добавить 20 мкл 300 нМ (2X) маточного раствора белка в каждую лунку 96-луночного черного НЕ микропланшета (Molecular Devices).

3. Разбавить 1 мМ (в 100% DMSO) FAM-меченого линейного пептида с использованием DMSO до 100 мкМ (разбавление 1:10). Затем, разбавить от 100 мкМ до 10 мкМ водой (разбавление 1:10) и затем разбавить ФП-буфером от 10 мкМ до 40 нМ (разбавление 1:250). Это рабочий раствор, который будет представлять собой 10 нМ концентрацию в лунке (разбавление 1:4). Хранить разбавленный FAM-меченый пептид в темноте до использования.

4. Получить планшет с дозой немеченного пептида с ФП-буфером, начиная с 5 мкМ (конечная) пептида и делая 5-кратные серийные разведения для 6 точек, используя следующую схему разбавления.

5. Разбавить 10 мМ (в 100% DMSO) с использованием DMSO до 5 мМ (разбавление 1:2). Затем, разбавить от 5 мМ до 500 мкМ с использованием H₂O (разбавление 1:10) и затем разбавить ФП-буфером от 500 мкМ до 20 мкМ (разбавление 1:25). Делать 5-кратные серийные разведения 20 мкМ (4X) для 6 точек.

6. Перенести 10 мкл серийно разведенных немеченных пептидов в каждую лунку, которую заполняют 20 мкл 300 нМ белка.

7. Добавить 10 мкл 10 нМ (4X) FAM-меченого пептида в каждую лунку и инкубировать в течение 3 часов для считывания показаний.

Результаты Примеров 5-8 показаны в Таблице 4. Используют следующую шкалу: «+» представляет значение, превышающее 1000 нМ, «++» представляет значение, превышающее 100 и менее или равное 1000 нМ, «+++» представляет значение, превышающее 10 нМ и менее или равное 100 нМ, и «++++» представляет значение, менее или равное 10 нМ.

Таблица 4 SP# IC50 (MDM2) IC50 (MDMX) Ki (MDM2) Ki (MDMX) 3 ++ ++ +++ +++ 4 +++ ++ ++++ +++ 5 +++ ++ ++++ +++ 6 ++ ++ +++ +++ 7 +++ +++ ++++ +++ 8 ++ ++ +++ +++ 9 ++ ++ +++ +++ 10 ++ ++ +++ +++ 11 +++ ++ ++++ +++ 12 + + +++ ++ 13 ++ ++ +++ ++ 14 +++ +++ ++++ ++++ 15 +++ ++ +++ +++ 16 +++ +++ ++++ +++ 17 +++ +++ ++++ +++ 18 +++ +++ ++++ ++++ 19 ++ +++ +++ +++ 20 ++ ++ +++ +++ 21 ++ +++ +++ +++ 22 +++ +++ ++++ +++ 23 ++ ++ +++ +++

24 +++ ++ ++++ +++ 26 +++ ++ ++++ +++ 28 +++ +++ ++++ +++ 30 ++ ++ +++ +++ 32 +++ ++ ++++ +++ 38 + ++ ++ +++ 39 + ++ ++ ++ 40 ++ ++ ++ +++ 41 ++ +++ +++ +++ 42 ++ ++ +++ ++ 43 +++ +++ ++++ +++ 45 +++ +++ ++++ ++++ 46 +++ +++ ++++ +++ 47 ++ ++ +++ +++ 48 ++ ++ +++ +++ 49 ++ ++ +++ +++ 50 +++ ++ ++++ +++ 52 +++ +++ ++++ ++++ 54 ++ ++ +++ +++ 55 + + ++ ++ 65 +++ ++ ++++ +++ 68 ++ ++ +++ +++ 69 +++ ++ ++++ +++ 70 ++ ++ ++++ +++ 71 +++ ++ ++++ +++ 75 +++ ++ ++++ +++ 77 +++ ++ ++++ +++ 80 +++ ++ ++++ +++ 81 ++ ++ +++ +++ 82 ++ ++ +++ +++ 85 +++ ++ ++++ +++ 99 ++++ ++ ++++ +++ 100 ++ ++ ++++ +++ 101 +++ ++ ++++ +++