Способ моделирования повышенной устойчивости миокарда крыс к ишемическим-реперфузионным повреждениям Российский патент 2017 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к разделу экспериментальной медицины и может быть использовано для моделирования повышенной устойчивости сердца крыс к ишемическим-реперфузионным повреждениям с помощью хронического воздействия холода.

Актуальной проблемой кардиологии является защита миокарда от ишемических и следующих за ними реперфузионных повреждений. Следовательно, следует признать необходимой разработку способов повышения естественной устойчивости сердца к ишемии. Для исследования механизмов формирования ишемических-реперфузионных повреждений миокарда и способов их предупреждения используют моделирование в эксперименте на лабораторных животных. Вместе с тем в последние годы уделяется большое внимание проблемам адаптации человека к условиям Крайнего Севера. Известно, что частота заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями в популяции людей, проживающих в северных широтах России, значительно выше, чем у остального населения [1]. Так, заболеваемость артериальной гипертонией среди мигрантов на Крайнем Севере возрастает по мере увеличения длительности проживания в Заполярье и достигает 61% у людей, проживших в этом регионе более 15 лет [2]. Однако механизмы этого явления остаются неизвестными. Для изучения возможности повышения естественной устойчивости миокарда к хроническому действию холода и механизмов этого явления необходимо использовать экспериментальные исследования на лабораторных животных, в том числе адекватные модели хронического холодового воздействия, показывающие выраженный инфаркт-лимитирующий и кардиопротекторный эффект. Однако до настоящего времени не существует моделей для подобных исследований. Это обусловлено тем, что ни на одной из моделей хронической адаптации экспериментальных животных к холоду не был выявлен инфаркт-лимитирующий эффект.

Известно несколько способов моделирования хронического холодового воздействия (адаптации к холоду). В первом случае животные постоянно находятся в холодильной камере при +4°С в течение 4-х недель [3]. Во втором случае животные подвергаются воздействию температуры +4°С по 8 ч ежедневно в течение 4-х недель [4]. И третий вариант, крысы находятся в холодильной камере при +4°С по 1,5 часа ежедневно в течение 28 дней [5].

Недостатком, при использовании этих моделей, является отсутствие инфаркт-лимитирующего эффекта, то есть не доказана возможность их использования для проведения исследований механизмов кардиопротекторного эффекта адаптации к холоду.

Задачей изобретения является разработка способа моделирования повышенной устойчивости миокарда крыс к ишемическим-реперфузионным повреждениям с помощью хронического воздействия холода.

Представленная задача была решена нами применением хронического воздействия холода при температуре +2°С в течение 4 недель в качестве метода, увеличивающего устойчивость миокарда крыс к ишемическим-реперфузионным повреждениям. Данный способ является ннаиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

В ходе экспериментов мы определили, что постоянное воздействие холода при +2°С в течение 4-х недель вызывает инфаркт-лимитирующий эффект у крыс и может быть использовано для моделирования повышенной устойчивости сердца к ишемическим-реперфузионным повреждениям. Другие способы адаптации крыс к холоду, наиболее близкие к заявляемому по технической сущности, не показали инфаркт-лимитирующего действия. Полученные результаты показывают, что представленный в качестве изобретения метод обладает существенным преимуществом перед ближайшими аналогами, а именно обладает инфаркт-лимитирующим действием.

В патентной и научно-медицинской литературе не найдено сведений о том, что использованный способ хронического холодового воздействия, так же как и иной другой способ хронического холодового воздействия, увеличивает устойчивость сердца к ишемическим-реперфузионным повреждениям. Данное свойство хронического холодового воздействия не вытекает из уровня техники в данной области и неочевидно для специалиста.

Изобретение может быть использовано в экспериментальных исследованиях для защиты миокарда при ишемии-реперфузии и изучения механизмов кардиопротекторного эффекта хронического холодового воздействия; для разработки нового метода защиты миокарда человека от ишемических-реперфузионных повреждений.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Методы исследования

Эксперименты проведены на крысах самцах линии Вистар массой 180-200 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов мы руководствовались рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Приказе МЗ СССР за №755 от 12 августа 1977 г. Все болезненные процедуры проводили на наркотизированных крысах.

Исследование кардиопротекторного эффекта хронического холодового воздействия проводилось по следующей схеме. В группу подопытных животных включено 8 крыс, которые в течение четырех недель находились в холодильной камере при температуре +2°С по две крысы в клетке. Животные получали стандартный рацион питания и воду в свободном доступе, в камере соблюдался световой режим 12 ч день/12 ч ночь. В качестве контрольной группы использовали 15 животных, не подвергавшихся хроническому холодовому воздействию, находящихся по 2 в клетке в стандартных условиях вивария при температуре 23±1°С.

В качестве групп сравнения использовали крыс, подвергавшихся холодовому воздействию в следующих режимах: +2°С по 8 ч ежедневно в течение 4-х недель (группа сравнения 1, n=10); +2°С по 1,5 часа ежедневно в течение 28 дней (группа сравнения 2, n=10). В остальное время крысы групп сравнения находились в стандартных условиях вивария.

Крысы всех экспериментальных групп подвергались острой коронароокклюзии-реперфузии. Для этого крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением альфа-хлоралозы в дозе 50 мг/кг. В ходе эксперимента осуществляли искусственную вентиляцию легких через интубационную трубку с помощью модифицированного аппарата "SAR-830 Series" (CWE Inc. США). Для записи ЭКГ использовали аппарат для электрофизиологических исследований МР35 (Biopac System Inc., Goleta, США). Количественную обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения INSTBSL-W компании Biopac System Inc., (Goleta, США).

Моделировали 45-минутную ишемию, используя технику, описанную ранее J.E.J Schultz и соавт. [6]. Для этого выполнялась левосторонняя торакотомия и перикард удалялся для получения доступа к левой нисходящей коронарной артерии. На левую нисходящую коронарную артерию накладывалась лигатура на 1-2 мм ниже ушка левого предсердия. Коронароокклюзию верифицировали по появлению эпикардиального цианоза и подъему сегмента ST. После 45 минут ишемии лигатуру ослабляли, при этом восстановление кровотока подтверждалось появлением эпикардиальной гиперемии. Продолжительность реперфузии составляла 2 часа.

При оценке нарушений ритма сердца принимали во внимание только желудочковые формы аритмий: единичные желудочковые экстрасистолы (6-16 за 10 мин); множественные желудочковые экстрасистолы (более 16 за 10 мин или 3-4 следующих друг за другом преждевременных сокращения); желудочковая тахикардия (более 4 последовательных желудочковых экстрасистол); желудочковая фибрилляция.

Определение размера инфаркта (соотношение зоны некроза и зоны риска) проводили по методу J. Neckar и соавт. [7]. После реперфузии сердца удаляли из грудной клетки и промывали с помощью шприца через канюлированную аорту физиологическим раствором, содержащим 125 МЕ/мл гепарина. Для определения зоны риска (ЗР) лигатуру, наложенную ранее на левую нисходящую коронарную артерию, вновь затягивали и миокард окрашивали струйно через аорту 5% перманганатом калия, затем промывали. Таким образом, в результате первого этапа окраски зона риска оказывалась неокрашенной перманганатом калия. Для выявления зоны некроза изготавливали срезы сердца толщиной в 1 мм перпендикулярно к продольной оси с помощью слайсера HSRA001-1 (Zivic Instruments, Pittsburgh, США). Зону некроза выявляли окрашиванием срезов 1%-ным раствором 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида в течение 30 минут при 37°С. Некротизированный миокард не окрашивался, поскольку в погибших кардиомиоцитах отсутствовали дегидрогеназы. После окончания окраски срезы помещали в 10% раствор формальдегида на 1 сутки. На следующий день после окрашивания срезы миокарда сканировали с обеих сторон сканером HP Scanjet G4050. Размер области риска и зоны инфаркта (ЗИ) определяли компьютеризированным планиметрическим методом. Размер инфаркта определяли как соотношение зоны некроза к зоне риска в процентах.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и критерия χ² для проверки гипотезы о равенстве средних для частотных тестов.

Исследование кардиопротекторного эффекта хронического холодового воздействия. Во всех исследованных группах после 45-минутной коронароокклюзии и последующей 2-часовой реперфузии 34% от общей массы левого желудочка оказалось в состоянии гипоперфузии (зона риска). В контрольной серии экспериментов зона некроза (размер инфаркта) составила 47,1% от размера зоны риска (Таблица 1). В подопытной группе животных, подвергавшихся непрерывному холодовому воздействию (+2°С, 4 недели), размер инфаркта составлял 32,6% от размера области риска, что было статистически значимо меньше аналогичного показателя группы контроля. У крыс в группах сравнения размер инфаркта при моделировании ишемии-реперфузии не отличался от этого показателя контрольной группы (Таблица 1).

Исследование влияния хронического холодового воздействия на частоту возникновения ишемических и реперфузионных нарушений ритма. При моделировании коронароокклюзии в первые 10 минут ишемии желудочковые нарушения ритма возникали у 87% экспериментальных животных (Таблица 2). При этом в 87% случаев наблюдалась желудочковая экстрасистолия, в 67% наблюдений - желудочковая тахикардия, а у 40% животных наблюдалась фибрилляция желудочков. Во второй фазе ишемии (11-45 минута) мы наблюдали сходные показатели (Таблица 2). В период реперфузии, последовавший за 45-минутной ишемией, лишь у 9% крыс возникали нарушения желудочкового ритма, в 13% случаев наблюдалась желудочковая экстрасистолия (Таблица 2). Обнаружено, что хроническое холодовое воздействие статистически значимо не влияет на частоту возникновения желудочковых аритмий при ишемии-реперфузии (Таблица 2).

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что хроническое холодовое воздействие, моделируемое непрерывным содержанием крыс при +2°С в течение 4 недель, способствует ограничению размеров зоны инфаркта при ишемии-реперфузии и оказывает кардиопротекторный эффект. При моделировании хронического холодового воздействия не наблюдается усугубления аритмогенного действия ишемии-реперфузии.

Применение предлагаемого изобретения позволит проводить научные исследования, направленные на изучение рецепторных и молекулярных механизмов инфаркт-лиммитирующего эффекта адаптации к хроническому непрерывному холодовому воздействию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маслов Л.Н., Вычужанова Е.А., Горбунов А.С., Цибульников С.Ю. Роль дислипидемии в патогенезе сосудистых катастроф среди населения Заполярья. Вестник РАМН 2014; 7-8: 133-136.

2. Скавронская Т.В., Леус А.И., Федосеева Л.А., Кумановская Т.А., Преображенский Д.В. Распространенность артериальной гипертонии среди работников предприятий газовой промышленности в районе Крайнего Севера. Кардиология. 2005; 45(3): 84.

3. Kvetnansky R., Ukropec J., Laukova M., Manz В., Pacak K., Vargovic P. Stress stimulates production of catecholamines in rat adipocytes. Cell. Mol. Neurobiol. 2012; 32(5): 801-813.

4. van Bergen P., Fregly M.J., Rossi F., Shechtman O. The effect of intermittent exposure to cold on the development of hypertension in the rat. Am. J. Hypertens. 1992; 5(8): 548-555.

5. Божко А.П., Городецкая И.В. Значение тиреоидных гормонов в реализации защитных эффектов холодовой адаптации. Пат. физиол. экспер. тер. 1994. №4: 29-32.

6. Schultz J.E.J., Yao Z., Cavero I., Gross G.J. Glibenclamide induced blockade of ischemic preconditioning is time dependent in intact rat heart. Am. J. Physiol. 1997; 272(6 Pt 2); H2607-H2615.

7. J., O., Herget J., В., F. Cardioprotective effect of chronic hypoxia is blunted by concomitant hypercapnia. Physiol Res. 2003; 52(2): 171-

Приложение 1.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования повышенной устойчивости сердца крыс к ишемическим-реперфузионным повреждениям. Способ заключается в том, что предварительно крыс подвергают непрерывному воздействию холодом при температуре +2°С в течение 4 недель при стандартном рационе питания и световом режиме. Затем проводят 45-минутную коронароокклюзию с последующей 2-часовой реперфузией. Способ создает возможность проводить исследования, направленные на изучение рецепторных и молекулярных механизмов инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к хроническому непрерывному холодовому воздействию. 2 табл.

Способ моделирования повышенной устойчивости миокарда крыс к ишемическим-реперфузионным повреждениям, заключающийся в том, что предварительно крыс подвергают непрерывному воздействию холодом при температуре +2°С в течение 4 недель при стандартном рационе питания и световом режиме, затем проводят 45-минутную коронароокклюзию с последующей 2-часовой реперфузией.