СПОСОБ ОБРАБОТКИ СЕМЕНИ РАСТЕНИЯ Российский патент 2018 года по МПК A01N63/02 C12N1/20 C12R1/01 

ССЫЛКА НА ДЕПОНИРОВАННЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ

Эта заявка содержит ссылку на депонированный биологический материал, который приведен здесь в качестве ссылки. Полную информацию см. в таблице 1.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенной бактерии Bradyrhizobium, обладающей улучшенными характеристиками, включая, но без ограничения, улучшенную устойчивость к обезвоживанию.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для поддержания здорового роста растения должны экстрагировать множество элементов из почвы, на которой они растут. Эти элементы включают в себя азот и так называемые питательные микроэлементы (например, медь, железо и цинк), но многие виды почвы являются дефицитными по таким элементам или содержат их только в формах, которые не могут легко поглощаться растениями (как правило, считают, что необходимые элементы не могут легко поглощаться растениями, если они не присутствуют в почве в растворенной форме). Азот является необходимым элементом для большинства растений, поскольку он играет роль в синтезе аминокислот, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, хлорофилла, коферментов и в общем росте и здоровье растения. Чтобы противостоять этому дефициту, источники дефицитных элементов обычно вводят в почву для улучшения скорости роста и урожая, полученного от сельскохозяйственных растений. Например, нитрат и/или аммоний часто добавляют в почву, чтобы противостоять отсутствию доступного азота.

В области растениеводства хорошо известно, что для многих сельскохозяйственных культур необходимо, чтобы почва предоставляла растению относительно большие количества азота. Заметными исключениями из растений, требующих азота из почвы, являются растения из семейства бобовых.

Конкретно, бобовые растения являются уникальными по сравнению с не относящимися к бобовым растениями по их способности фиксировать атмосферный азот в аммиак. Способность растения фиксировать атмосферный азот в применимый источник азота устраняет необходимость растения получать азот из почвы. Для фиксации азота, однако, необходима симбиотическая взаимосвязь между бобовым растением и природной бактерией внутри почвы. Одними из наиболее интенсивно исследуемых партнеров в этой симбиотической взаимосвязи являются бактерии, принадлежащие к роду Bradyrhizobium или Rhizobium. Gresshoff, P. (1999). Identification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions. Stacey, G. & Keen, T. (Ed.), Plant-Microbe Interactions (4th ed.) (Ch. 6). St. Paul: APS Press.

Симбиоз, как правило, достигается посредством сложного двустороннего обмена сигналами между растением и микроорганизмом и между микроорганизмом и растением. Как правило, растительные факторы, такие как флавоноиды и флавоноидоподобные вещества, индуцируют колонизацию бактерий в корневом клубеньке бобового растения. (Gresshoff, 1999). После колонизации бактерий в корневом клубеньке, бактерии вызывают морфологические изменения растения, а именно закручивание корневого волоска и развитие нового корневого органа - клубенька (Gresshoff, 1999). Клубенек позволяет образование нового физиологического окружения для клубенька, индуцирующего дифференцировку бактерий в фиксирующий азот эндосимбионт, или бактериод, для колонизированного растения. (Gresshoff, 1999).

Чтобы способствовать симбиотическому двустороннему обмену сигналами между растением и микроорганизмом, бактериями, такими как Bradyrhizobia sp., часто покрывают семена. Для продления жизнеспособности микроорганизма на семени является желательным, чтобы микроорганизм являлся устойчивым к обезвоживанию и в общем к сухим условиям внешней среды.

Остается необходимость в микроорганизмах с улучшенной устойчивостью к обезвоживанию.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описаны новые бактериальные штаммы, обладающие улучшенной устойчивостью к обезвоживанию, особенно когда новые штаммы сравнивают с их родительским штаммом, например родительским штаммом Bradyrhizobium sp., USDA 532C. Авторы изобретения выделили и тестировали значительное количество бактериальных штаммов по их свойствам устойчивости к обезвоживанию.

Как обсуждают на протяжении настоящего документа, выделенные штаммы представляют собой штаммы из рода Bradyrhizobium spp. В частности, выделенные штаммы представляют собой штаммы Bradyrhizobium japonicum. Еще более конкретно, выделенные штаммы представляют собой выделенные штаммы Bradyrhizobium japonicum, выбранные из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612, или комбинации по меньшей мере двух или более из вышеуказанных депонированных штаммов.

В настоящем документе описаны также композиции, содержащие носитель и один или несколько из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления композиция содержит одну или несколько сигнальных молекул растений. В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один липохитоолигосахарид (LCO). В другом варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один хитоолигосахарид (CO). В другом варианте осуществления, композиция содержит по меньшей мере один флавоноид. В другом варианте осуществления композиция содержит жасминовую кислоту или ее производное. В другом варианте осуществления композиция содержит линолеиновую кислоту или ее производное. В другом варианте осуществления композиция содержит линоленовую кислоту или ее производное. В другом варианте осуществления композиция содержит каррикин.

Кроме того, в настоящем документе описан способ улучшения роста растения или части растения, включающий в себя контакт растения или части растения с одним или несколькими из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. Способ включает в себя введение в почву инокулята одного или нескольких из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. В другом варианте осуществления способ включает в себя введение в почву инокулята одного или нескольких из бактериальных штаммов в форме покрытия семян.

В настоящем документе описан также способ улучшения фиксации азота в растении (растениях), включающий в себя выращивание растения(растений) в почве, содержащей один или несколько из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления растение(растения) представляет собой бобовое растение(растения), не относящееся к бобовым растение(растения) или их комбинацию. В другом варианте осуществления растение представляет собой растение, выбранное из группы, состоящей из сои, фасоли, люцерны, клевера, кукурузы, латука, томатов, картофеля, огурцов и их комбинаций.

Кроме того, в настоящем документе описаны семена, покрытые бактериальными штаммами, описанными в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой графическое представление предварительного скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг.2 представляет собой графическое представление второго скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг.3 представляет собой графическое представление третьего скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг.4 представляет собой графическое представление четвертого скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг.5 представляет собой столбчатую диаграмму, представляющую устойчивость к обезвоживанию отобранных сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C на нулевые (0) и четырнадцатые (14) сутки.

Фиг.6 представляет собой столбчатую диаграмму, представляющую устойчивость к обезвоживанию отобранных сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C на седьмые (7) и четырнадцатые (14) сутки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанные бактериальные штаммы выделены и тестированы по их способности солюбилизировать фосфор. Это подробно описано в разделе «Примеры», представленном ниже. Кроме того, описанные варианты осуществления относятся к композициям, покрытиям семян, способам увеличения доступности фосфора для поглощения растением из почвы и к способам увеличения поглощения фосфора растениями, включающим в себя выращивание растений в почве, содержащей источник фосфора.

Определения

Как применяют в настоящем документе, формы единственного числа «a», «an» и «the» предназначены, чтобы включать в себя также формы множественного числа, если контекст явно не требует иного.

Как применяют в настоящем документе, термин «биологически чистая культура» предназначен для обозначения культуры, в основном свободной от биологического загрязнения и обладающей генетической однородностью, так что для взятых из нее различных субкультур показывают по существу идентичные генотипы и фенотипы (например, культуры, обладающие чистотой по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, вплоть до 100% чистоты).

Как применяют в настоящем документе, термин «изолят, изоляты, выделение и/или выделенный и т.д.» предназначены для обозначения того, что материал, на который ссылаются, является удаленным из среды, в которой его обнаруживают в норме.

Как применяют в настоящем документе, термин «инокулят» предназначен для обозначения любой формы бактериальных клеток или спор, которая является способной к размножению на или в почве, когда условия температуры, влажности и т.д. являются благоприятными для роста бактерий.

Как применяют в настоящем документе, термин «спора» имеет свое обычное значение, которое является хорошо известным и понятным специалистам в данной области и в общем относится к микроорганизму в его дремлющем, защищенном состоянии.

Как применяют в настоящем документе, термин «источник» конкретного элемента предназначен для обозначения соединения этого элемента, которое, по меньшей мере в рассматриваемых условиях почвы, не делает этот элемент полностью доступным для поглощения растением.

Как применяют в настоящем документе, термины «эффективное количество», «эффективная концентрация» или «эффективная доза» предназначены для обозначения количества, концентрации или дозы одного или нескольких бактериальных изолятов, достаточные, чтобы вызывать увеличение роста растения или части растения или увеличение фиксации азота. Абсолютное значение действительной эффективной дозы зависит от факторов, включая, но без ограничения, размер (например, площадь, общую площадь в акрах и т.д.) поля для введения бактериальных изолятов, синергические или антагонистические взаимодействия с другими активными или инертными ингредиентами, которые могут увеличивать или уменьшать активность бактериальных изолятов, и стабильность бактериальных изолятов в композициях и/или в формах для обработки семян. «Эффективное количество», «эффективную концентрацию» или «эффективную дозу» бактериальной композиции можно определять, например, посредством общепринятого эксперимента зависимости от дозы.

Как применяют в настоящем документе, термины «носитель» или «агрономически приемлемый носитель» предназначены для обозначения любого материала, который можно использовать для доставки активных средств (например, бактериального штамма) к семени, почве, растению или части растения.

Как применяют в настоящем документе, термин «совместимый с почвой носитель» предназначен для обозначения любого материала, который можно добавлять в почву без вызова/наличия неблагоприятного эффекта на рост растений, структуру почвы, дренирование почвы или т.п.

Как применяют в настоящем документе, термин «совместимый с семенами носитель» предназначен для обозначения любого материала, который можно добавлять к семени без вызова/наличия неблагоприятного эффекта на семя, вырастающее из семени растение, прорастание семени или т.п.

Как применяют в настоящем документе, термин «обеспечивающий преимущество для сельского хозяйства ингредиент(ы)» предназначен для обозначения любого средства или комбинации средств, способных вызывать или обеспечивать преимущественный и/или полезный эффект в сельском хозяйстве.

Как применяют в настоящем документе, «по меньшей мере один биологически активный ингредиент» предназначен для обозначения биологически активных ингредиентов, например сигнальных молекул, других микроорганизмов и т.д., отличных от одного или нескольких бактериальных изолятов, описанных в настоящем документе.

Как применяют в настоящем документе, термин «обезвоживание» предназначен для обозначения состояния необычайной сухости, например условий без влаги и/или воды. Термины «устойчивость к обезвоживанию» и/или «переносимость обезвоживания» предназначены, чтобы включать в себя способность организма противостоять условиям, и/или выживать в условиях, и/или выдерживать условия необычайной сухости.

Как применяют в настоящем документе, термины «фиксация азота», «фиксация атмосферного азота» или «связывание азота» и т.д. предназначены, чтобы включать в себя биологические процессы, в которых молекулярный азот или азот в атмосфере переводится в одно или несколько азотных (N) соединений, включая, но без ограничения, аммиак, соли аммония, мочевину и нитраты.

Как применяют в настоящем документе, термин «фиксирующий азот организм» предназначен для обозначения любого организма (например, диазотрофов), способного переводить молекулярный азот или азот в атмосфере в одно или несколько азотных (N) соединений, включая, но без ограничения, аммиак, соли аммония, мочевину и нитраты.

Как применяют в настоящем документе, термины «солюбилизация фосфата» или «повышение растворимости фосфата» и т.д. предназначены для обозначения перевода нерастворимого фосфата (например, минерального фосфата и т.д.) в растворимую форму фосфата.

Как применяют в настоящем документе, термин «солюбилизирующий фосфат организм» предназначен для обозначения любого организма, способного переводить нерастворимый фосфат в растворимую форму фосфата.

Как применяют в настоящем документе, термины «растение(растения)» и «часть(части) растения» предназначены для обозначения всех растений и популяций растений, таких как желательные и нежелательные дикие растения или сельскохозяйственные растения (включая встречающиеся в природе сельскохозяйственные растения). Сельскохозяйственные растения могут представлять собой растения, которые можно получать общепринятыми способами разведения и оптимизации растений, или способами биотехнологии и генной инженерии, или посредством комбинации этих способов, включая трансгенные растения и включая культивары растений, охраняемые или не охраняемые правами растениеводов-селекционеров. Части растения следует понимать как обозначающие все части и органы растений над и под землей, такие как побег, лист, цветок и корень, в качестве примеров которых можно упомянуть листья, иглы, черенки, стволы, цветы, плодовые тела, плоды, семена, корни, клубеньки, клубни и корневища. Части растения включают в себя также собранный материал и материал для вегетативного и генеративного размножения (например, черенки, клубни, корневища, отростки и семена и т.д.).

Как применяют в настоящем документе, термин «клубенек» предназначен для обозначения, но без ограничения, детерминированных клубеньков, недетерминированных клубеньков или их комбинации. Примеры детерминированных клубеньков и недетерминированных клубеньков хорошо известны в данной области и описаны в Denison, R. F., 2000, The Amer. Naturalist. 156 (6): 567-576. Детерминированные клубеньки обнаружены у видов Glycine, Lotus или Phaseolus и являются округлыми и сферическими по форме (Denison, 2000). Детерминированные клубеньки растут только в течение ограниченного периода времени, как правило, несколько недель (Denison, 2000). В отличие от детерминированных клубеньков, недетерминированные клубеньки обнаружены у видов Medicago, Trifolium и Pisium, имеют вытянутую форму и растут непрерывно (Denison, 2000). Термин «заселение клубенька» является термином, известным в данной области. McDermott T.R. & Graham P.H., Appl. and Environ. Microbiol. 55(10): 2493-2498. В данной области хорошо известно, что, несмотря на редкие исключения, отдельный клубенек содержит только один бактериальный штамм. Johnston A.W.B. et al., 1974, J. Gen. Microbiol 87: 343-350; Dunham D.H. & Baldwin I.L., 1931, Soil Science 32: 235-249; Johnson H.W. et al., 1963, Agrono. J. 55: 269-271; Dudman W.F. & Brockwell J., 1968, J. Agricul. Res. 19: 739-747; Nicol H. & Thorton H.G., 1941, Proc. Roy. Soc. В 130, 32-59; Hughes D.Q. & Vincent J.M., 1942, Proc. of the Linnenan Soc. of New South Wales 67: 142-152; и Vincent J.M. & Waters L.M., 1953, J. Gen. Microbiol. 9: 357-370.

Как применяют в настоящем документе, термин «усиленный рост растения» предназначен для обозначения увеличенного урожая растения (например, увеличенной биомассы, увеличенного количества плодов или их комбинации, как измерено в бушелях на акр), увеличенного количества корней, увеличенной массы корней, увеличенного объема корней, увеличенной площади листьев, увеличенной густоты стояния растений, увеличенной мощности растения, увеличенной массы растения (например, общей массы в сухом состоянии растения или части растения, общей массы свежего растения или части растения и т.д.) или их комбинаций.

Как применяют в настоящем документе, «усиленная конкурентоспособность» и/или «усиленное образование клубеньков» представляет собой определение для обозначения бактериального штамма(штаммов), обладающего процентом заселения клубеньков, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, вплоть до 100% заселения клубеньков.

Как применяют в настоящем документе, термин «температурная устойчивость» предназначен для обозначения диапазона температур, при котором бактериальный штамм(ы) является способным расти, например максимальной и минимальной температур, при которых бактериальный штамм может расти.

Как применяют в настоящем документе, термин «коммерчески доступный штамм(ы)» предназначен для обозначения коммерчески доступных бактериальных штаммов, например USDA 532C, USDA 110, USDA 123, USDA 127, USDA 129 и т.д. Cregan P.В. et al., 1989, Appl. и Enviro. Microbiol. 55 (10): 2532-2536.

Как применяют в настоящем документе, термин «питательный микроэлемент(ы)» предназначен для обозначения питательных веществ, необходимых для роста растения, здоровья растения и/или развития растения.

Как применяют в настоящем документе, термин «биостимулятор(ы)» предназначен для обозначения любого вещества, способного усиливать метаболические или физиологические процессы внутри растений и почвы.

Как применяют в настоящем документе, термин «увлажняющее средство(средства)» предназначен для обозначения любого вещества, способного снижать и/или уменьшать поверхностное натяжение воды.

ШТАММЫ

В одном варианте осуществления выделенный штамм(ы), описанный в настоящем документе, представляет собой фиксирующий азот бактериальный штамм(ы). В другом варианте осуществления штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobum sp. В следующем аспекте штамм получен из штамма Bradyrhizobium, включая, но без ограничения, штамм, выбранный из группы, состоящей из Bradyrhizobium bete, Bradyrhizobium canariense, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium iriomotense, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium jicamae, Bradyrhizobium liaoningense, Bradyrhizobium pachyrhizi и Bradyrhizobium yuanmingense. В другом варианте осуществления штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobum japonicum.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенным/увеличенным процентом выживаемости бактерий в по существу безводной внешней среде, когда процент выживаемости выделенного штамма(штаммов) Bradyrhizobium сравнивают с процентом выживаемости родительского штамма(штаммов), например родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532C, в течение периода времени, например по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделя, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 год или более.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенным/увеличенным процентом выживаемости в по существу безводной внешней среде, где увеличенный процент выживаемости в по существу безводной внешней среде включает в себя увеличенный процент выживаемости бактерий во внешней среде, которая является по меньшей мере на 70% безводной, например, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, вплоть до 100% безводной внешней средой, когда процент выживаемости выделенного штамма(штаммов) Bradyrhizobium сравнивают с процентом выживаемости родительского штамма(штаммов), например родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532С.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий следующими улучшенными/превосходными характеристиками при сравнении с коммерчески доступными штаммами, например коммерческим штаммом Bradyrhizobium japonicum USDA 532C, где улучшенные/превосходные характеристики включают в себя, но без ограничения:

a) улучшенную конкурентоспособность для колонизации растения сои; и

b) улучшенную эффективность в стимуляции роста растения сои.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной конкурентоспособностью для колонизации растения. В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной эффективностью для стимуляции роста растения. В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной конкурентоспособностью для колонизации растения и улучшенной/превосходной эффективностью для стимуляции роста растения.

В другом аспекте настоящего изобретения выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной температурной устойчивостью.

В другом аспекте настоящего изобретения выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий природной устойчивостью к глифосату.

В другом варианте осуществления штаммы представляют собой штаммы Bradyrhizobum japonicum, выбранные из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611; и

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В конкретном варианте осуществления штамм(ы) может представлять собой один или несколько из вышеупомянутых депонированных штаммов (например, включая по меньшей мере два из вышеупомянутых штаммов, по меньшей мере три из вышеупомянутых штаммов, по меньшей мере четыре из вышеупомянутых штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеупомянутых штаммов).

В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50608. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50609. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50610. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50611. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В другом варианте осуществления бактериальная культура(культуры) обладает свойствами/характеристиками, идентичными по меньшей мере одному из депонированных штаммов или комбинации по меньшей мере двух из вышеупомянутых депонированных штаммов, включая более двух, например, по меньшей мере три из вышеупомянутых штаммов, по меньшей мере четыре из вышеупомянутых штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеупомянутых штаммов. Свойства/характеристики бактериальной культуры включают в себя, но без ограничения, бактериальные штаммы, обладающие улучшенной и/или превосходной устойчивостью к обезвоживанию. В другом варианте осуществления штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium, обладающий улучшенной и/или превосходной устойчивостью к обезвоживанию, когда устойчивость к обезвоживанию сравнивают с устойчивостью к обезвоживанию и/или с переносимостью обезвоживания родительского штамма(штаммов) бактерий, например родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532C.

В другом аспекте выделенный бактериальный штамм(ы) по настоящему изобретению включает в себя штамм(ы), близко родственный любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S. См. Stackebrandt E. et al. «Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology», Int J Syst Evol Microbiol. 52(3):1043-7 (2002), относительно использования идентичности последовательности рДНК 16S для определения родства у бактерий. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один штамм является по меньшей мере на 95% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 96% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 97% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 98% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 98,5% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 99% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S или по меньшей мере на 99,5% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S.

Бактерию Bradyrhizobium, описанную здесь, и, в частности, штаммы с депозитарными номерами доступа NRRL B-50608, NRRL B-50609, NRRL B-50610, NRRL B-50611 и NRRL B-50612 можно выращивать способами, известными в данной области.

Полученный материал можно использовать непосредственно в композиции, в качестве обработки семян, или споры можно собирать, концентрировать центрифугированием, составлять и затем высушивать с использованием способов сушки воздухом, лиофилизации или сушки в псевдоожиженном слое (Friesen Т., Hill G., Pugsley Т., Holloway G. and Zimmerman D. 2005, Experimental determination of viability loss of Penicillium bilaiae conidia during convective air-drying Appl Microbiol Biotechnol 68: 397-404) для получения смачиваемого порошка.

Вышеупомянутые депонированные штаммы депонированы 1 октября 2012 г., как более подробно указано ниже в разделе «Материалы и методы», согласно условиям Будапештского Соглашения о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Американской коллекции типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA.

КОМПОЗИЦИИ

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей носитель и инокулят одного или нескольких из депонированных штаммов (либо в форме спор, либо штаммов в вегетативном состоянии), описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления композиция может находиться в форме жидкости, суспензии, твердого вещества или порошка (смачиваемого порошка или сухого порошка). В другом варианте осуществления композиция может находиться в форме покрытия семян. Композиции в форме жидкости, суспензии или порошка (например, смачиваемого порошка) могут являться пригодными для покрытия семян. При использовании для покрытия семян, композицию можно наносить на семена и позволять высохнуть. В вариантах осуществления, когда композиция представляет собой порошок (например, смачиваемый порошок), жидкость, такая как вода, может являться необходимой для добавления к порошку перед нанесением на семена. Примеры других носителей включают в себя увлажненные отруби, высушенные, просеянные и нанесенные на семена до покрытия адгезивным средством, например гуммиарабиком.

Носители

Носители, описанные в настоящем документе, позволяют депонированному бактериальному штамму(штаммам) оставаться эффективным (например, способным фиксировать азот) и жизнеспособным после составления. Носители, описанные в настоящем документе, включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, жидкости, суспензии или твердые вещества (включая смачиваемые порошки или сухие порошки). В одном из вариантов осуществления носитель представляет собой совместимый с почвой носитель, как описано в настоящем документе.

В одном варианте осуществления носитель представляет собой жидкий носитель. Жидкости, пригодные в качестве носителей для композиций, описанных в настоящем документе, включают в себя в качестве неограничивающих примеров воду, водный раствор или неводный раствор. В одном варианте осуществления носитель представляет собой воду. В другом варианте осуществления носитель представляет собой водный раствор, такой как водный раствор сахара. В другом варианте осуществления носитель представляет собой неводный раствор. Если используют жидкий носитель, жидкий (например, водный) носитель может дополнительно включать в себя среду для роста для культивирования депонированных бактериальных штаммов. Неограничивающие примеры пригодной среды для роста для депонированных бактериальных штаммов включают в себя среду с арабинозой-глюконатом (AG), среду с дрожжевым экстрактом и маннитом (YEM), среду G16 или любую среду, известную специалистам в данной области как совместимую с питательными веществами и/или предоставляющую питательные вещества для депонированных бактериальных штаммов.

В другом варианте осуществления носитель представляет собой суспензию. В одном из вариантов осуществления суспензия может содержать клейкое вещество, жидкость или их комбинацию. Предусматривают, что клейкое вещество может представлять собой любое средство, способное приклеивать инокулят (например, один или несколько из депонированных штаммов) к интересующему субстрату (например, семени). Клейкие вещества включают в себя в качестве неограничивающих примеров альгинат, минеральное масло, сироп, гуммиарабик, мед, метилцеллюлозу, молоко, обойный клей и их комбинации. Жидкости, пригодные для суспензии, включают в себя в качестве неограничивающих примеров воду или водный раствор сахара.

В другом варианте осуществления носитель представляет собой твердое вещество. В конкретном варианте осуществления твердое вещество представляет собой порошок. В одном варианте осуществления порошок представляет собой смачиваемый порошок. В другом варианте осуществления порошок представляет собой сухой порошок. В другом варианте осуществления твердое вещество представляет собой гранулы. Твердые вещества, пригодные в качестве носителей для композиций, обсуждаемых в настоящем документе, включают в себя в качестве неограничивающих примеров торф, пшеницу, пшеничную сечку, молотую пшеничную солому, отруби (например, увлажненные отруби, не увлажненные отруби), вермикулит, целлюлозу, крахмал, почву (пастеризованную или не пастеризованную), гипс, тальк, глины (например, каолин, бентонит, монтмориллонит) и силикагели.

Необязательные преимущественные с точки зрения сельского хозяйства ингредиенты

Композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько необязательных ингредиентов. Необязательные ингредиенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров один или несколько биологически активных ингредиентов, микроэлементов, биостимуляторов, консервантов, полимеров, увлажняющих средств, поверхностно-активных веществ или их комбинаций.

Биологически активный ингредиент(ы)

Композиции, описанные в настоящем документе, могут, необязательно, включать в себя один или несколько биологически активных ингредиентов, как описано в настоящем документе. Биологически активные ингредиенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров сигнальные молекулы (например, липохитоолигосахариды (LCO), хитоолигосахариды (CO), хитиновые соединения, флавоноиды, жасминовую кислоту или ее производные, линолеиновую кислоту или ее производные, линоленовую кислоту или ее производные, каррикины и т.д.) и обеспечивающие преимущество микроорганизмы (например, Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Sinorhizobium spp., Azorhizobium spp. и т.д.).

Сигнальная молекула(молекулы)

В одном из вариантов осуществления композиции, описанные в настоящем документе, включают одну или несколько сигнальных молекул. В одном варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько LCO. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой одно или несколько хитиновых соединений. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько CO. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько флавоноидов или их производных. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько не относящихся к флавоноидам индукторов гена nod (например, жасминовую кислоту, линолеиновую кислоту, линоленовую кислоту и их производные). В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько каррикинов или их производных. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько LCO, одно или несколько хитиновых соединений, один или несколько CO, один или несколько флавоноидов и их производных, один или несколько не относящихся к флавоноидом индукторов гена nod и их производных, один или несколько каррикинов и их производных или любую комбинацию сигнальных молекул из них.

LCO

Соединения липохитоолигосахаридов (LCO), также известные в данной области как симбиотические сигналы Nod или факторы Nod, состоят из олигосахаридного остова из β-1,4-связанных остатков N-ацетил-D-глюкозамина («GlcNAc») с N-связанной цепью жирного ацила, конденсированной с невосстанавливающим концом. LCO отличаются по количеству остатков GlcNAc в остове, по длине и степени насыщенности цепи жирного ацила, и по замещениям восстанавливающих и невосстанавливающих остатков сахара. Пример LCO представлен ниже в виде формулы I:

,

в которой

G представляет собой гексозамин, который может являться замещенным, например, ацетильной группой на атоме азота, сульфатной группой, ацетильной группой и/или эфирной группой на атоме кислорода,

R₁, R₂, R₃, R₅, R₆ и R₇, которые могут являться идентичными или различными, представляют собой H, CH₃CO-, C_xH_yCO-, где x представляет собой целое число между 0 и 17, и y представляет собой целое число между 1 и 35, или любую другую ацильную группу, например, такую как карбамил,

R₄ представляет собой моно-, ди- или триненасыщенную алифатическую цепь, содержащую по меньшей мере 12 атомов углерода, и n представляет собой целое число между 1 и 4.

LCO можно получать (выделять и/или очищать) из таких бактерий, как Rhizobia, например, Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Sinorhizobium spp. и Azorhizobium spp. Структура LCO является характерной для каждого такого вида бактерий, и каждый штамм может продуцировать множество LCO с различными структурами. Например, специфические LCO из S. meliloti описаны также в патенте США 5549718 как имеющие формулу II:

,

в которой R представляет собой H или CH₃CO-, и n является равным 2 или 3.

Даже более специфические LCO включают в себя NodRM, NodRM-1, NodRM-3. При ацетилировании (R=CH₃CO-) они становятся AcNodRM-1 и AcNodRM-3 соответственно (патент США 5545718).

LCO из Bradyrhizobium japonicum описаны в Патентах США 5175149 и 5321011. В широком смысле, они представляют собой пентасахаридные фитогормоны, содержащие метилфукозу. Описан ряд этих происходящих из B. japonicum LCO: BjNod-V (C_18:1); BjNod-V (A_C, C_18:1), BjNod-V (C_16:1); и BjNod-V (A_C, C_16:0), где «V» обозначает присутствие пяти групп N-ацетилглюкозамина; «Ac» - ацетилирование; число после «C» обозначает количество атомов углерода в боковой цепи жирной кислоты; и число после «:» - количество двойных связей.

LCO, используемые в композициях по изобретению, можно получать (т.е. выделять и/или очищать) из бактериальных штаммов, продуцирующих LCO, таких как штаммы Azorhizobium, Bradyrhizobium (включая B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (включая R. leguminosarum), Sinorhizobium (включая S. meliloti), и бактериальных штаммов, генетически модифицированных для продукции LCO.

Настоящее изобретение относится также к композициям с использованием LCO, полученных (т.е. выделенных и/или очищенных) из микоризных грибов, таких как грибы из группы Glomerocycota, например, Glomus intraradicus. Структуры репрезентативных LCO, полученных из этих грибов, описаны в WO 2010/049751 и WO 2010/049751 (LCO, описанные в том документе, обозначают также как «факторы Мус»).

Кроме того, в композиции по настоящему изобретению включено использование синтетических соединений LCO, таких как соединения, описанные в WO 2005/063784, и рекомбинантных LCO, полученных посредством генной инженерии. Главная, природная структура LCO может содержать модификации или замены, обнаруженные в природных LCO, такие как описанные в Spaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000) и D'Haeze et al. Glycobiology 72:79R-105R (2002). Молекулы предшественников олигосахаридов (CO, которые, как описано ниже, также являются пригодными в качестве сигнальных молекул растений по настоящему изобретению) для конструирования LCO, также можно синтезировать посредством генетически модифицированных организмов, например, как в Samain et al. Carb. Res. 302:35-42 (1997); Samain et al. J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).

LCO можно использовать в формах различной чистоты, и их можно использовать отдельно или в форме культуры продуцирующих LCO бактерий или грибов. Способы получения по существу чистых LCO включают в себя простое удаление клеток микроорганизмов из смеси LCO и микроорганизмов, или продолжение выделения и очистки молекул LCO посредством разделения фаз LCO - растворитель с последующей хроматографией HPLC, как описано, например, в патенте США 5549718. Очистку можно улучшать посредством повторной HPLC, и очищенные молекулы LCO можно лиофилизировать для длительного хранения.

CO

Хитоолигосахариды (CO) известны в данной области как β-1-4 связанные N-актилглюкозаминовые структуры, идентифицированные как хитиновые олигомеры, также как N-ацетилхитоолигосахариды. CO обладают уникальными и различными дополнительными группами боковых цепей, которые делают их отличными от молекул хитина [(C₈H₁₃NO₅)n, CAS No. 1398-61-4] и молекул хитозана [(C₅H₁₁NO₄)n, CAS No. 9012-76-4]. Репрезентативные литературные источники, описывающие структуру и получение CO, представляют собой следующие: Van der Hoist et al. Current Opinion in Structural Biology, 77:608-616 (2001); Robina et al. Tetrahedron 58:521-530 (2002); Hanel et al. Planta 232:787-806 (2010); Rouge et al. Chapter 27, «The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates» in Advances in Experimental Medicine и Biology, Springer Science; Wan et al. Plant Cell 27:1053-69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); и Demont-Caulet et al. Plant Physiol. 120(1):83-92 (1999). CO могут являться синтетическими или рекомбинантными. Способы получения рекомбинантных CO известны в данной области. См., например, Samain et al. (выше); Cottaz et al. Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) и Samain et al. J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).

Хитиновые соединения

Хитины и хитозаны, которые являются главными компонентами клеточных стенок грибов и экзоскелетов насекомых и ракообразных, также состоят из остатков GlcNAc. Хитиновые соединения включают в себя хитин, (IUPAC: N-[5-[[3-ацетиламино-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-2-ил]метоксиметил]-2-[[5-ацетиламино-4,6-дигидрокси-2-(гидроксиметил)оксан-3-ил]метоксиметил]-4-гидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-3-ис]этанамид), и хитозан, (IUPAC: 5-амино-6-[5-амино-6-[5-амино-4,6-дигидрокси-2-гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-4-гидрокси-2-(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-2(гидроксиметил)оксан-3,4-диол).

Эти соединения можно получать коммерчески, например, из Sigma-Aldrich, или получать из насекомых, раковин ракообразных или клеточных стенок грибов. Способы получения хитина и хитозана известны в данной области и описаны, например, в патенте США 4536207 (получение из раковин ракообразных), Pochanavanich et al. Lett. Appl. Microbiol. 35:17-21 (2002) (получение из клеточных стенок грибов), и в патенте США 5965545 (получение из панцирей крабов и гидролиз коммерческого хитозана). Деацетилированные хитины и хитозаны можно получать в диапазоне от менее 35% до более 90% деацетилирования, и они охватывают широкий спектр молекулярной массы, например, низкомолекулярные олигомеры хитозана менее 15 кДа и олигомеры хитина 0,5-2 кДа; хитозан «практического класса» с молекулярной массой приблизительно 15 кДа; и высокомолекулярный хитозан вплоть до 70 кДа. Композиции хитина и хитозана, составленные для обработки семян, также являются коммерчески доступным. Коммерческие продукты включают в себя, например, ELEXA® (Plant Defense Boosters, Inc.) и BEYOND™ (Agrihouse, Inc.).

Флавоноиды

Флавоноиды представляют собой фенольные соединения, имеющие общую структуру из двух ароматических колец, соединенных мостиком из трех атомов углерода. Флавоноиды продуцированы растениями и обладают множеством функций, например, в качестве преимущественных сигнальных молекул, и в качестве защиты против насекомых, животных, грибов и бактерий. Классы флавоноидов включают в себя хальконы, антоцианидины, кумарины, флавоны, флаванолы, флавонолы, флаваноны и изофлавоны. См., Jain et al. J. Plant Biochem. & Biotechnol. 77:1-10 (2002); Shaw et al. Environmental Microbiol. 77:1867-80 (2006).

Репрезентативные флавоноиды, которые могут являться пригодными в композициях по настоящему изобретению, включают в себя лютеолин, апигенин, тангеритин, кверцетин, кемпферол, мирицетин, физетин, изорамнетин, пачиподол, рамназин, гесперетин, нарингенин, формононетин, эриодиктиол, гомоэриодиктиол, таксифолин, дигидрокверцетин, дигидрокемпферол, генистеин, дайдзеин, глицитеин, катехин, галлокатехин, 3-галлат катехина, 3-галлат галлокатехина, эпикатехин, эпигаллокатехин, 3-галлат эпикатехина, 3-галлат эпигаллокатехина, цианидин, дельфинидин, мальвидин, пеларгонидин, пеонидин, петунидин или их производные. Соединения флавоноидов являются коммерчески доступными, например, из Natland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, Irvine, CA; LC Laboratories, Woburn MA. Соединения флавоноидов можно выделять из растений или семян, например, как описано в патентах США 5702752; 5990291; и 6146668. Соединения флавоноидов могут также продуцировать генетически модифицированные организмы, такие как дрожжи, как описано в Ralston et al. Plant Physiology 737:1375-88 (2005).

Не относящийся к флавоноидам индуктор(ы) гена Nod

Жасминовую кислоту (JA, [1R-[1α,2β(Z)]]-3-оксо-2-(пентенил)циклопентануксусную кислоту) и ее производные, линолеиновую кислоту ((Z,Z)-9,12-октадекадиеновую кислоту) и ее производные, и линоленовую кислоту ((Z,Z,Z)-9,12,15-октадекатриеновую кислоту) и ее производные также можно использовать в композициях по настоящему изобретению. Жасминовая кислота и ее метиловый сложный эфир, метилжасмонат (MeJA), вместе известные как жасмонаты, представляют собой соединения на основе октадекана, встречающиеся в природе в растениях. Жасминовую кислоту продуцируют корни сеянцев пшеницы и микроорганизмы-грибы, такие как Botryodiplodia theobromae и Gibbrella fujikuroi, дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), и патогенные и непатогенные штаммы Escherichia coli. Линолеиновая кислота и линоленовая кислота образуются в ходе биосинтеза жасминовой кислоты. Опубликовано, что жасмонаты, линолеиновая кислота и линолеиновая кислота (и их производные) являются индукторами экспрессии гена nod или продукции LCO ризобактериями. См., например, Mabood, Fazli, Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum, May 17, 2001; и Mabood, Fazli, «Linoleic and linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum», USDA 3, May 17, 2001.

Пригодные производные линолеиновой кислоты, линоленовой кислоты и жасминовой кислоты, которые могут являться пригодными в композициях по настоящему изобретению, включают в себя сложные эфиры, амиды, гликозиды и соли. Репрезентативные сложные эфиры представляют собой соединения, в которых карбоксильная группа линолеиновой кислоты, линоленовой кислоты или жасминовой кислоты заменена на группу -COR, где R представляет собой группу -OR¹, в которой R¹ представляет собой: алкильную группу, такую как С₁-С₈ неразветвленная или разветвленная алкильная группа, например, метильная, этильная или пропильная группа; алкенильную группу, такую как C₂-C₈ неразветвленная или разветвленная алкенильная группа; алкинильную группу, такая как C₂-C₈ неразветвленная или разветвленная алкинильная группа; арильную группу, имеющую, например, 6-10 атомов углерода; или гетероарильную группу, имеющую, например, 4-9 атомов углерода, где гетероатомы в гетероарильной группе могут представлять собой, например, N, О, P или S. Репрезентативные амиды представляют собой соединения, в которых карбоксильная группа линолеиновой кислоты, линоленовой кислоты или жасминовой кислоты заменена на группу -COR, где R представляет собой группу NR²R³ , в которой R² и R³ независимо представляют собой: водород; алкильную группу, такую как С₁-С₈ неразветвленная или разветвленная алкильная группа, например, метильная, этильная или пропильная группа; алкенильную группу, такую как C₂-C₈ неразветвленная или разветвленная алкенильная группа; алкинильную группу, такую как C₂-C₈ неразветвленная или разветвленная алкинильная группа; арильную группу, имеющую, например, 6-10 атомов углерода; или гетероарильную группу, имеющую, например, 4-9 атомов углерода, где гетероатомы в гетероарильной группе могут представлять собой, например, N, О, P или S. Сложные эфиры можно получать известными способами, такими как катализируемое кислотой добавление нуклеофила, где проводят реакцию карбоновой кислоты со спиртом в присутствии каталитического количества неорганической кислоты. Амиды также можно получать известными способами, такими как проведение реакции карбоновой кислоты с подходящим амином в присутствии способствующего реакции сочетания средства, такого как дициклогексилкарбодиимид (DCC), в нейтральных условиях. Пригодные соли линолеиновой кислоты, линоленовой кислоты и жасминовой кислоты включают в себя, например, основно-аддитивные соли. Основания, которые можно использовать в качестве реагентов для получения метаболически приемлемых основных солей этих соединений, включают в себя основания, полученные из катионов, таких как катионы щелочных металлов (например, калия и натрия) и катионы щелочно-земельных металлов (например, кальция и магния). Эти соли можно легко получать смешиванием вместе раствора линолеиновой кислоты, линоленовой кислоты или жасминовой кислоты с раствором основания. Соль можно преципитировать из раствора и собирать фильтрацией или можно выделять другими способами, такими как выпаривание растворителя.

Каррикин(ы)

Каррикины представляют собой винилогические 4H-пироны, например, 2H-фуро[2,3-c]пиран-2-оны, включая их производные и аналоги. Примеры этих соединений представлены следующей структурой:

,

где Z представляет собой О, S или NR₅; R₁, R₂, R₃ и R₄ каждый независимо представляет собой H, алкил, алкенил, алкинил, фенил, бензил, гидрокси, гидроксиалкил, алкокси, фенилокси, бензилокси, CN, COR₆, COOR=, галоген, NR₆R₇, или NO₂; и R₅, R₆ и R₇ каждый независимо представляет собой H, алкил или алкенил, или их биологически приемлемую соль. Примеры биологически приемлемых солей этих соединений могут включать в себя кислотно-аддитивные соли, образованные с биологически приемлемыми кислотами, примеры которых включают в себя гидрохлорид, гидробромид, сульфат или бисульфат, фосфат или гидрофосфат, ацетат, бензоат, сукцинат, фумарат, малеат, лактат, цитрат, тартрат, глюконат; метансульфонат, бензолсульфонат и п-толуолсульфоновую кислоту. Дополнительные биологически приемлемые соли металлов включают в себя соли щелочных металлов, с основаниями, примеры которых включают в себя соли натрия и калия. Примеры соединений, которые охвачены структурой и которые могут являться пригодными для использования по настоящему изобретению, включают в себя следующие: 3-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁=CH₃, R₂, R₃, R₄=H), 2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₂, R3, R4=H), 7-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₂, R₄=H, R₃=CH₃), 5-метил-2H- фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₂, R₃=H, R₄=CH₃), 3,7-диметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₃=CH₃, R₂, R₄=H), 3,5-диметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₄=CH₃, R₂, R₃=H), 3,5,7-триметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₃, R₄=CH₃, R₂=H), 5-метоксиметил-3-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁=CH₃, R₂, R₃=H, R₄=CH₂OCH₃), 4-бром-3,7-диметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-он (где R₁, R₃=CH₃, R₂=Br, R₄=H), 3-метилфуро[2,3-c]пиридин-2(3H)-он (где Z=NH, R₁=CH₃, R₂, R₃, R₄=H), 3,6-диметилфуро[2,3-c]пиридин-2(6H)-он (где Z=N-CH₃, R₁=CH₃, R₂, R₃, R₄=H). См. патент США 7576213. Эти молекулы также известны как каррикины. См. Halford, «Smoke Signals», in Chem. Eng. News (April 12, 2010), на страницах 37-38 (где опубликовано, что каррикины или бутенолиды, содержащиеся в дыме, действуют как стимуляторы роста и прорастания побегов из семян после лесного пожара и могут стимулировать семена, например, кукурузы, томатов, латука и лука после хранения). Эти молекулы являются объектом патента США 7576213.

Обеспечивающий преимущества микроорганизм(ы)

В одном из вариантов осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько обеспечивающих преимущества микроорганизмов. Один или несколько обеспечивающих преимущества микроорганизмов могут иметь одно или несколько обеспечивающих преимущества свойств (например, продуцировать одну или несколько сигнальных молекул, описанных в настоящем документе, усиливать поглощение питательных веществ и воды, усиливать рост, усиливать прорастание семян, усиливать появление всходов, прерывать дремлющее состояние или состояние покоя растения и т.д.).

В одном варианте осуществления обеспечивающий преимущества микроорганизм(ы) содержат одну или несколько бактерий, продуцирующих одну или несколько сигнальных молекул, описанных в настоящем документе. В другом варианте осуществления бактерии представляют собой бактерии из рода Rhizobium spp. (например, R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, R. lupini, R. lusitanum, R. meliloti, R. mongolense, R. miluonense, R. sullae, R. tropici, R. undicola и/или R. yanglingense), Azorhizobium spp. (например, A. caulinodans и/или A. doebereinerae), Sinorhizobium spp. (например, S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. aboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meliloti, S. mexicanus, S. morelense, S. saheli, S. terangae и/или S. xinjiangense), Mesorhizobium spp., (M. albiziae, M. amorphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. pluifarium, M. septentrionale, M. temperatum и/или M. tianshanense) и их комбинации. В конкретном варианте осуществления обеспечивающий преимущества микроорганизм выбран из группы, состоящей из R. leguminosarum, R. meliloti, S. meliloti и их комбинаций. В другом варианте осуществления обеспечивающий преимущества микроорганизм представляет собой R. leguminosarum. В другом варианте осуществления обеспечивающий преимущества микроорганизм представляет собой R. meliloti. В другом варианте осуществления обеспечивающий преимущества микроорганизм представляет собой S. meliloti.

В другом варианте осуществления один или несколько обеспечивающих преимущества микроорганизмов содержат один или несколько солюбилизирующих фосфат микроорганизмов. Солюбилизирующие фосфат микроорганизмы включают в себя штаммы грибов и бактерий. В одном из вариантов осуществления солюбилизирующий фосфат микроорганизм включает в себя виды из рода, выбранного из группы, состоящей из Acinetobacter spp. (например, Acinetobacter calcoaceticus и т.д.), Arthrobacter spp, Arthrobotrys spp. (например, Arthrobotrys oligospora и т.д.), Aspergillus spp. (например, Aspergillus niger и т.д.), Azospirillum spp. (например, Azospirillum halopraeferans и т.д.), Bacillus spp. (например, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis и т.д.), Burkholderia spp. (например, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis и т.д.), Candida spp. (например, Candida krissii и т.д.), Chryseomonas spp. (например, Chryseomonas luteola и т.д.), Enterobacter spp.(например, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter spp., Enterobacter taylorae и т.д.), Eupenicillium spp. (например, Eupenicillium parvum и т.д.), Exiguobacterium spp., Klebsiella spp., Kluyvera spp. (например, Kluyvera cryocrescens и т.д.), Microbacterium spp., Mucor spp. (например, Mucor ramosissimus и т.д.), Paecilomyces spp. (например, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii и т.д.), Paenibacillus spp. (например, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus и т.д.), Penicillium spp. (например, Penicillium bilaiae (ранее известного как Penicillium bilaii), Penicillium albidum, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium chrysogenum, Penicillium citreonigrum, Penicillium citrinum, Penicillium digitatum, Penicillium frequentas, Penicillium fuscum, Penicillium gaestrivorus, Penicillium glabrum, Penicillium griseofulvum, Penicillium implicatum, Penicillium janthinellum, Penicillium lilacinum, Penicillium minioluteum, Penicillium montanense, Penicillium nigricans, Penicillium oxalicum, Penicillium pinetorum, Penicillium pinophilum, Penicillium purpurogenum, Penicillium radicans, Penicillium radicum, Penicillium raistrickii, Penicillium rugulosum, Penicillium simplicissimum, Penicillium solitum, Penicillium variabile, Penicillium velutinum, Penicillium viridicatum, Penicillium glaucum, Penicillium fussiporus и Penicillium expansum и т.д.), Pseudomonas spp. (например, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis и т.д.), Serratia spp.(например, Serratia marcescens и т.д.), Stenotrophomonas spp. (например, Stenotrophomonas maltophilia и т.д.), Streptomyces spp., Streptosporangium spp., Swaminathania spp.(например, Swaminathania salitolerans и т.д.), Thiobacillus spp. (например, Thiobacillus ferrooxidans и т.д.), Torulospora spp. (например, Torulospora globosa и т.д.), Vibrio spp. (например, Vibrio proteolyticus и т.д.), Xanthobacter spp. (например, Xanthobacter agilis и т.д.), Xanthomonas spp. (например, Xanthomonas campestris и т.д.) и их комбинаций.

В конкретном варианте осуществления один или несколько солюбилизирующих фосфат микроорганизмов представляет собой штамм гриба Penicillium. В другом варианте осуществления один или несколько видов Penicillium представляет собой P. bilaiae, P. gaestrivorus или их комбинации.

В другом варианте осуществления обеспечивающий преимущества микроорганизм представляет собой одну или несколько микориз. В частности, одна или несколько микориз представляет собой эндомикоризу (называемую также везикулярной древовидной микоризой, VAM, древовидной микоризой, или AM), эктомикоризу или их сочетание.

В одном варианте осуществления одна или несколько микориз представляет собой эндомикоризу филюма Glomeromycota и родов Glomus и Gigaspora. В другом варианте осуществления эндомикориза представляет собой штамм Glomus aggregatum, Glomus brasilianum, Glomus clarum, Glomus deserticola, Glomus etunicatum, Glomus fasciculatum, Glomus intraradices, Glomus monosporum или Glomus mosseae, Gigaspora margarita или их комбинацию.

В другом варианте осуществления одна или несколько микориз представляет собой эктомикоризу филюма Basidiomycota, Ascomycota и Zygomycota. В другом варианте осуществления эктомикориза представляет собой штамм Basidiomycota, Ascomycota и Zygomycota. В другом варианте осуществления эктомикориза представляет собой штамм Laccaria bicolor, Laccaria laccata, Pisolithus tinctorius, Rhizopogon amylopogon, Rhizopogon fulvigleba, Rhizopogon luteolus, Rhizopogon villosuli, Scleroderma cepa, Scleroderma citrinum или их комбинацию.

В другом варианте осуществления, одна или несколько микориз представляет собой эрикоидную микоризу, арбутоидную микоризу или монотропоидную микоризу. Арбускулярные микоризы и эктомикоризы образуют эрикоидную микоризу со многими растениями, принадлежащими к порядку Ericales, в то время как некоторые Ericales образуют арбутоидные и монотропоидные микоризы. Все орхидные являются микогетеротрофными на некоторых стадиях в ходе их жизненного цикла и образуют орхидные микоризы с рядом базидиомицетных грибов. В одном варианте осуществления микориза может представлять собой эрикоидную микоризу, предпочтительно филюма Ascomycota, например, Hymenoscyphous ericae или Oidiodendron sp. В другом варианте осуществления микориза также может представлять собой арбутоидную микоризу, предпочтительно филюма Basidiomycota. В другом варианте осуществления микориза может представлять собой монотропоидную микоризу, предпочтительно филюма Basidiomycota. В другом варианте осуществления микориза может представлять собой орхидную микоризу, предпочтительно рода Rhizoctonia.

Питательный микроэлемент(ы)

В другом варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько обеспечивающих преимущество микроэлементов. Микроэлементы для использования в композициях, описанных в настоящем документе, включают в себя в качестве неограничивающих примеров витамины (например, витамин A, комплекс витамина В (т.е. витамин B₁, витамин B₂, витамин B₃, витамин B₅, витамин B₆, витамин B₇, витамин B₈, витамин B₉, витамин B₁₂, холин)), витамин C, витамин D, витамин E, витамин K, каротеноиды (α-каротен, β-каротен, криптоксантин, лютеин, ликопен, зеаксантин и т.д.), макроминералы (например, фосфор, кальций, магний, калий, натрий, железо и т.д.), микроэлементы (например, бор, кобальт, хлорид, хром, медь, фторид, йод, железо, марганец, молибден, селен, цинк и т.д.), органические кислоты (например, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, яблочная кислота, таурин и т.д.) и их комбинации. В конкретном варианте осуществления композиции могут содержать фосфор, бор, хлор, медь, железо, марганец, молибден, цинк или их сочетания.

В конкретных вариантах осуществления, где композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать фосфор, предусматривают, что можно предоставлять любой пригодный источник фосфора. В одном варианте осуществления фосфор может быть получен из источника. В другом варианте осуществления пригодные источники фосфора включают в себя источники фосфора, способные к солюбилизации одним или несколькими микроорганизмами (например, Penicillium bilaiae и т.д.).

В одном варианте осуществления фосфор может быть получен из источника минерального фосфата. В другом варианте осуществления фосфор может быть получен из удобрений, содержащих один или несколько источников фосфора. Коммерчески доступные промышленные фосфатные удобрения существуют многих типов. Некоторыми общепринятыми являются удобрения, содержащие фосфорит, фосфат моноаммония, фосфат диаммония, монофосфат кальция, суперфосфат, тройной суперфосфат и/или полифосфат аммония. Все эти удобрения получают химической переработкой нерастворимых природных фосфоритов на предприятиях крупномасштабного производства удобрений, и продукт является дорогим. Посредством способов по настоящему изобретению является возможным уменьшить количество этих удобрений, вносимых в почву, при сохранении тем не менее поглощения такого же количества фосфора из почвы.

В другом варианте осуществления фосфор может быть получен из органического источника фосфора. В дополнительном конкретном варианте осуществления источник фосфора может включать в себя органическое удобрение. Органическое удобрение относится к добавке в почву, полученной из природных источников, которая обеспечивает по меньшей мере минимальные проценты азота, фосфата и углекислого калия. Неограничивающие примеры органических удобрений включают в себя побочные продукты из растений и животных, минеральные порошки, водоросли, модификаторы и структурообразователи. Они часто являются доступными в садоводческих центрах и через компании по снабжению садоводов. В частности, органический источник фосфора представляет собой источник из костной муки, мясной муки, навоза, компоста, осадков сточных вод или гуано или их комбинаций.

В другом варианте осуществления фосфор может быть получен из комбинации источников фосфора, включая, но без ограничения, минеральный фосфат, удобрения, содержащие один или несколько источников фосфора (например, фосфат моноаммония, фосфат диаммония, монофосфат кальция, суперфосфат, тройной суперфосфат, полифосфат аммония и т.д.), один или несколько органических источников фосфора и их комбинации.

Биостимулятор(ы)

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько обеспечивающих преимущества биостимуляторов. Биостимуляторы могут усиливать метаболические или физиологические процессы, такие как дыхание, фотосинтез, поглощение нуклеиновых кислот, поглощение ионов, доставка питательных веществ или их комбинация. Биостимуляторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров экстракты водорослей (например, ascophyllum nodosum), гуминовые кислоты (например, гумат калия), фульвокислоты, миоинозитол, глицин и их комбинации. В другом варианте осуществления композиции содержат экстракты водорослей, гуминовые кислоты, фульвокислоты, миоинозитол, глицин и их комбинации.

Полимер(ы)

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или несколько полимеров. Неограничивающие применения полимеров в сельскохозяйственном производстве включают в себя доставку агрохимических средств, удаление тяжелых металлов, удержание воды и/или доставку воды и их комбинации. Pouci et al. Am. J. Agri. & Biol. Sci., 3(7):299-314 (2008). В одном варианте осуществления один или несколько полимеров представляет собой природный полимер (например, агар, крахмал, альгинат, пектин, целлюлозу и т.д.), синтетический полимер, биоразлагаемый полимер (например, поликапролактон, полилактид, поли(виниловый спирт) и т.д.) или их комбинацию.

Неограничивающий список полимеров, пригодных для композиций, описанных в настоящем документе, см. в Pouci et al. Am. J. Agri. & Biol. Sci., 3(7):299-314 (2008). В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, содержат целлюлозу, производные целлюлозы, метилцеллюлозу, производные метилцеллюлозы, крахмал, агар, альгинат, пектин, поливинилпирролидон и их комбинации.

Увлажняющее средство(средства):

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать одно или несколько увлажняющих средств. Увлажняющие средства являются общепринятыми для использования в почвах, в частности в гидрофобных почвах, для улучшения инфильтрации и/или проникновения воды в почву. Увлажняющее средство может представлять собой адъювант, масло, поверхностно-активное вещество, буфер, подкислитель или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления увлажняющее средство представляет собой поверхностно-активное вещество. В одном из вариантов осуществления увлажняющее средство представляет собой одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, одно или несколько анионных поверхностно-активных веществ или их комбинацию. В другом варианте осуществления увлажняющее средство представляет собой одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ.

Поверхностно-активные вещества, пригодные для композиций, описанных в настоящем документе, представлены в разделе «Поверхностно-активные вещества».

Поверхностно-активное вещество(вещества)

Поверхностно-активные вещества, пригодные для композиций, описанных в настоящем документе, могут представлять собой неионные поверхностно-активные вещества (например, семиполярные, и/или анионные, и/или катионные, и/или цвиттерионные). Предусматривают, что поверхностно-активное вещество(вещества) может приносить настолько мало вреда для активности одного или нескольких депонированных штаммов и/или одного или нескольких обеспечивающих преимущество микроорганизмов, насколько возможно. Поверхностно-активные вещества могут увлажнять и эмульгировать почву(почвы) и/или грунт(ы). Предусматривают, что поверхностно-активные вещества, используемые в описанной композиции, имеют низкую токсичность для микроорганизмов, содержащихся в составе. Кроме того, предусматривают, что поверхностно-активные вещества, используемые в описанной композиции, имеют низкую фитотоксичность (т.е. степень токсичности вещества или комбинации веществ, имеющуюся для растения). Можно использовать отдельное поверхностно-активное вещество или смесь нескольких поверхностно-активных веществ.

Анионные поверхностно-активные вещества

Анионные поверхностно-активные вещества или смеси анионных и неионных поверхностно-активных веществ также можно использовать в композициях. Анионные поверхностно-активные вещества представляют собой поверхностно-активные вещества, имеющие гидрофильную группу в анионном или отрицательно заряженном состоянии в водном растворе. Композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать одно или несколько анионных поверхностно-активных веществ. Анионное поверхностно-активное вещество(вещества) может представлять собой водорастворимые анионные поверхностно-активные вещества, нерастворимые в воде анионные поверхностно-активные вещества или комбинацию водорастворимых анионных поверхностно-активных веществ и нерастворимых анионных поверхностно-активных веществ. Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают в себя сульфоновые кислоты, сложные эфиры серной кислоты, карбоновые кислоты и их соли. Водорастворимые анионные поверхностно-активные вещества включают в себя в качестве неограничивающих примеров алкилсульфаты, сульфаты алкиловых эфиров, сульфаты алкиламидоэфиров, сульфаты алкиларилполиэфиров, алкиларилсульфаты, алкиларилсульфонаты, сульфаты моноглицеридов, алкилсульфонаты, алкиламидсульфонаты, алкиларилсульфонаты, бензолсульфонаты, толуолсульфонаты, ксилолсульфонаты, кумолсульфонаты, алкилбензолсульфонаты, алкилдифенилоксидсульфонаты, альфа-олефинсульфонаты, алкилнафталинсульфонаты, парафинсульфонаты, лигнинсульфонаты, алкилсульфосукцинаты, этоксилированные сульфосукцинаты, сульфосукцинаты алкиловых эфиров, алкиламидсульфосукцинаты, алкилсульфосукцинамат, алкилсульфоацетаты, алкилфосфаты, фосфаты сложных эфиров, фосфаты алкиловых эфиров, ацил саркозинаты, ацилизетионаты, N-ацилтаураты, N-ацил-N-алкилтаураты, алкилкарбоксилаты или их комбинацию.

Неионные поверхностно-активные вещества

Неионные поверхностно-активные вещества представляют собой поверхностно-активные вещества, не имеющие электрического заряда при растворении или диспергировании в водной среде. По меньшей мере в одном варианте осуществления композиции, описанной в настоящем документе, используют одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, поскольку они обеспечивают желательные действия увлажнения и эмульгации и не ингибируют значительно стабильность и активность спор. Неионное поверхностно-активное вещество(вещества) может представлять собой водорастворимые неионные поверхностно-активные вещества, нерастворимые в воде неионные поверхностно-активные вещества или комбинацию водорастворимых неионных поверхностно-активных веществ и нерастворимых в воде неионных поверхностно-активных веществ.

Нерастворимые в воде неионные поверхностно-активные вещества

Неограничивающие примеры нерастворимых в воде неионных поверхностно-активных веществ включают в себя алкильные и арильные: эфиры глицерина, эфиры гликоля, этаноламиды, сульфаниламиды, спирты, амиды, этоксилаты спиртов, сложные эфиры глицерина, сложные эфиры гликоля, этоксилаты сложных эфиров глицерина и сложных эфиров гликоля, алкилполигликозиды на основе сахаров, полиоксиэтиленированные жирные кислоты, конденсированные соединения алканоламина, алканоламиды, третичные ацетиленовые гликоли, полиоксиэтиленированные меркаптаны, сложные эфиры карбоновой кислоты, полиоксиэтиленированные полиоксипропиленгликоли, жирные сложные эфиры сорбитана или их комбинации. Включены также блок-сополимеры EO/PO (EO представляет собой этиленоксид, PO представляет собой пропиленоксид), полимеры и сополимеры EO, полиамины и поливинилпирролидоны.

Водорастворимые неионные поверхностно-активные вещества

Неограничивающие примеры водорастворимых неионных поверхностно-активных веществ включают в себя этоксилаты жирных кислот, спиртов и сорбитана и этоксилаты сложных эфиров жирных кислот и сорбитана.

Комбинация неионных поверхностно-активных веществ

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, содержат по меньшей мере одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ. В одном варианте осуществления композиции содержат по меньшей мере одно нерастворимое в воде неионное поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно водорастворимое неионное поверхностно-активное вещество. В другом варианте осуществления композиции содержат комбинацию неионных поверхностно-активных веществ, имеющих углеводородные цепи по существу одинаковой длины.

Другие поверхностно-активные вещества

В другом варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать также кремнийорганические поверхностно-активные вещества, противовспениватели на основе силикона, используемые в качестве поверхностно-активных веществ в противовспенивателях на основе силикона и в противовспенивателях на основе минерального масла. В другом варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать также соли щелочных металлов жирных кислот (например, водорастворимые соли щелочных металлов жирных кислот и/или нерастворимые в воде соли щелочных металлов жирных кислот).

Гербицид(ы)

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или несколько гербицидов. В конкретном варианте осуществления гербицид может представлять собой довсходовый гербицид, послевсходовый гербицид или их комбинацию.

Пригодные гербициды включают в себя химические гербициды, природные гербициды (например, биогербициды, органические гербициды и т.д.) или их комбинацию. Неограничивающие примеры пригодных гербицидов включают в себя бентазон, ацифторфен, хлоримурон, лактофен, кломазон, флуазифоп, глуфосинат, глифосат, сетоксидим, имазетапир, имазамокс, фомезафен, фумиклорак, имазаквин, клетодим, пендиметалин; 3,4-диметил-2,6-динитро-N-пентан-3-ил-анилин; N-(1-этилпропил)-2,6-динитро-3,4-ксилидин; пронамид; пропизамид; 3,5-дихлор-N-(1,1-диметилпропинил)бензамид; 3,5-дихлор-N-(1,1-диметил-2-пропинил)бензамид; N-(1,1-диметилпропинил)-3,5-дихлорбензамид; S-этил-N-этилтиоциклогексанкарбамат; трифлуралин; 2,6-динитро-N,N-дипропил-4-(трифторметил)анилин; глифосат; N-(фосфонометил)глицин; и их производные. В одном варианте осуществления один или несколько гербицидов для использования в соответствии с этим описанием включают в себя пронамид (коммерческое обозначение Kerb®); пропизамид; 3,5-дихлор-N-(1,1- диметилпропинил)бензамид; 3,5-дихлор-N-(1,1-диметил-2-пропинил)бензамид; N-(1,1-диметилпропинил)-3,5-дихлорбензамид; циклоaт, S-этил-N-этилтиоциклогексанкарбамат (коммерческое обозначение Ro-Neet®); трифлуралин; 2,6-динитро-N,N-дипропил-4-(трифторметил)анилин; глифосат; N-(фосфонометил)глицин; и их производные. Коммерческие продукты, содержащие каждое из этих соединений, являются легко доступными. Концентрация гербицидов в композиции, как правило, соответствует отмеченной на этикетке частоте использования конкретного гербицида.

Фунгицид(ы)

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или несколько фунгицидов. Фунгициды, пригодные для композиций, описанных в настоящем документе, пригодным образом обладают активностью против широкого диапазона патогенов, включая, но без ограничения, Phytophthora, Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Phomopsis или Selerotinia и Phakopsora и их комбинации.

Неограничивающие примеры коммерческих фунгицидов, которые могут являться пригодными для композиций, описанных в настоящем документе, включают в себя РRОТÉGÉ, RIVAL или ALLEGIANCE FL или LS (Gustafson, Piano, TX), WARDEN RTA (Agrilance, St. Paul, MN), APRON XL, APRON MAXX RTA или RFC, MAXIM 4FS или XL (Syngenta, Wilmington, DE), CAPTAN (Arvesta, Guelph, Ontario) и PROTREAT (Nitragin Argentina, Buenos Ares, Argentina). Активные ингредиенты в этих и других коммерческих фунгицидах включают в себя, но без ограничения, флудиоксонил, мефеноксам, азоксистробин и металаксил. Коммерческие фунгициды наиболее подходящим образом используют в соответствии с инструкциями производителя в рекомендованных концентрациях.

Инсектицид(ы)

В одном варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или несколько инсектицидов. Инсектициды, пригодные для композиций, описанных в настоящем документе, пригодным образом обладают активностью против широкого диапазона насекомых, включая, но без ограничения, проволочников, совок, червовидных личинок, повреждающих корни кукурузы личинок, личинок мухи ростковой, земляных блошек, земляных клопов, тлей, листогрызов, щитников и их сочетания.

Неограничивающие примеры коммерческих инсектицидов, которые могут являться пригодными для композиций, описанных в настоящем документе, включают в себя CRUISER (Syngenta, Wilmington, DE), GAUCHO и PONCHO (Gustafson, Piano, TX). Активные ингредиенты в этих и других коммерческих инсектицидах включают в себя тиаметоксам, клотианидин и имидаклоприд. Коммерческие инсектициды наиболее подходящим образом используют в соответствии с инструкциями производителя в рекомендованных концентрациях.

СПОСОБЫ

В другом аспекте описаны способы использования депонированных штаммов и композиций, описанных в настоящем документе.

В одном варианте осуществления описан способ усиления роста растения. Способ включает в себя контакт растения или части растения с инокулятом одного или нескольких бактериальных штаммов, выбранных из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612, или

смеси двух или нескольких штаммов.

В конкретном варианте осуществления инокулят может содержать один или несколько из вышеупомянутых депонированных штаммов (например, включая по меньшей мере два из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере три из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере четыре из вышеуказанных штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеуказанных штаммов).

В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штаммы с депозитарным номером доступа NRRL B-50608. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50609. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50610. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50611. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В другом варианте осуществления стадия контакта растения или части растения с инокулятом одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов включает в себя контакт растения или части растения с одной или несколькими из композиций, описанных в настоящем документе. Инокулят(ы) или композиции можно получать для контакта с растением или частью растения в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Неограничивающие примеры включают в себя введение в борозды, покрытие семян и т.д. В конкретном варианте осуществления стадия контакта включает в себя введение в борозды инокулята или композиций, описанных в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления стадия контакта включает в себя нанесение на семя (покрытие семян) инокулята или композиций, описанных в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления стадия контакта растения или части растения с инокулятом одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов включает в себя введение инокулята в почву в количестве 1×10¹-1×10⁸, более предпочтительно 1×10⁶-1×10¹² колониеобразующих единиц на гектар. В других конкретных вариантах осуществления стадия контакта растения или части растения с инокулятом одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов включает в себя введение депонированных бактериальных штаммов в форме семени, покрытого 1×10¹-1×10⁸, более предпочтительно 1×10²-1×10⁶ колониеобразующих единиц на семя.

В другом аспекте способ включает в себя выращивание растений в почве, содержащей один или несколько бактериальных штаммов. Способ включает в себя:

a) обработку почвы инокулятом одного или нескольких бактериальных штаммов, выбранных из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612; или смеси двух или более штаммов; и

b) выращивание растения в обработанной почве.

В конкретном варианте осуществления инокулят может содержать один или несколько из вышеуказанных депонированных штаммов (например, включая по меньшей мере два из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере три из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере четыре из вышеуказанных штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеуказанных штаммов).

В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50608. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50609. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50610. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50611. В одном из вариантов осуществления инокулят содержит штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

Стадия обработки почвы инокулятом одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов включает в себя обработку почвы одной или несколькими из композиций, описанных в настоящем документе. Инокулят(ы) или композиции можно вводить в почву в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Неограничивающие примеры включают в себя введение в борозды, покрытие семян и т.д. В конкретном варианте осуществления стадия обработки включает в себя введение в борозды инокулята или композиций, описанных в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления стадия обработки включает в себя нанесение на семя (покрытие семян) инокулята или композиций, описанных в настоящем документе.

В конкретном варианте осуществления стадия обработки почвы инокулятом одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов включает в себя обработку почвы одной или несколькими из композиций, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления стадия обработки почвы инокулятом одного или нескольких депонированных бактериальных штаммов включает в себя обработку почвы инокулятом в количестве 1×10¹-1×10⁸, более предпочтительно 1×10⁶-1×10¹² колониеобразующих единиц на гектар. В других конкретных вариантах осуществления стадия обработки почвы инокулятом одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов включает в себя введение депонированных бактериальных штаммов в форме семени, покрытого 1×10¹-1×10⁸, более предпочтительно 1×10²-1×10⁶ колониеобразующих единиц на семя.

В другом варианте осуществления способ дополнительно включает в себя стадию посадки растения или части растения. Стадия посадки может происходить до, после или во время стадии обработки. В одном варианте осуществления стадия посадки происходит до стадии обработки. В другом варианте осуществления стадия посадки происходит во время стадии обработки (например, стадия посадки происходит одновременно со стадией обработки, стадия посадки происходит по существу одновременно со стадией обработки и т.д.). В другом варианте осуществления стадия посадки происходит после стадии обработки.

В другом варианте осуществления способ дополнительно включает в себя стадию воздействия на почву одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов, описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления стадия воздействия на почву одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов происходит до, во время, после стадии обработки или одновременно со стадией обработки. В одном варианте осуществления, стадия воздействия на почву одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов, как описано в настоящем документе, происходит до стадии обработки. В другом варианте осуществления стадия воздействия на почву одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов, как описано в настоящем документе, происходит во время стадии обработки. В другом варианте осуществления стадия воздействия на почву одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов, как описано в настоящем документе, происходит после стадии обработки. В другом варианте осуществления стадия воздействия на почву одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов, как описано в настоящем документе, происходит одновременно со стадией обработки (например, обработки почвы одной или несколькими из композиций, описанных в настоящем документе и т.д.).

В другом варианте осуществления изобретение включает в себя способ обработки семян, включающий в себя нанесение на семена инокулята одного или нескольких бактериальных штаммов, выбранных из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612; или смеси из двух или более штаммов.

В конкретном варианте осуществления способ обработки семян может включать в себя один или несколько из вышеупомянутых депонированных штаммов (например, включая по меньшей мере два из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере три из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере четыре из вышеуказанных штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеуказанных штаммов).

В одном из вариантов осуществления способ обработки семян включает в себя нанесение на семя штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608. В одном из вариантов осуществления, способ обработки семян включает в себя нанесение на семя штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609. В одном из вариантов осуществления способ обработки семян включает в себя нанесение на семя штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610. В одном из вариантов осуществления способ обработки семян включает в себя нанесение на семя штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611. В одном из вариантов осуществления способ обработки семян включает в себя нанесение на семя штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В другом варианте осуществления, способ дополнительно включает в себя стадию нанесения на семена одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов. В другом варианте осуществления способ включает в себя нанесение на семена любой из композиций, описанных в настоящем документе.

В другом варианте осуществления способ включает в себя хранение семян с инокулятом по меньшей мере одного или нескольких из выделенных бактериальных штаммов в по существу безводной внешней среде в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделя, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 год или более. В одном аспекте способа семена представляют собой семена бобового растения. В другом аспекте семена бобового растения представляют собой семена сои.

Способы, описанные в настоящем документе, потенциально являются пригодными для улучшения условий роста, приводящего в результате к увеличению поглощения фосфора и/или урожая для любого типа растения. В одном конкретном варианте осуществления растение выбрано из группы, состоящей из не относящихся к бобовым, бобовых, Brassica spp., злаков, фруктов, овощей, орехов, цветов и газонной травы. В частности, злаки представляют собой пшеницу, кукурузу, рис, овес, рожь, ячмень. В частности, бобовые представляют собой чечевицу, нут, бобы, сою, горох и люцерну.

В другом конкретном варианте осуществления растения выбраны из группы, состоящей из люцерны, риса, пшеницы, ячменя, ржи, овса, хлопка, подсолнечника, арахиса, кукурузы, картофеля, сладкого картофеля, бобов, гороха, нута, чечевицы, цикория, латука, эндивия, капусты, брюссельской капусты, свеклы, пастернака, репы, цветной капусты, брокколи, брюквы, редиса, шпината, лука, чеснока, баклажана, перца, сельдерея, моркови, тыквы крупноплодной, тыквы, цуккини, огурца, яблони, груши, дыни, цитрусовых, клубники, винограда, малины, ананаса, сои, табака, томата, сорго и сахарного тростника.

ПОКРЫТИЯ СЕМЯН

В другом аспекте семена покрывают одним или несколькими бактериальными штаммами, выбранными из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612; или смеси двух или более штаммов.

В конкретном варианте осуществления семя(семена) покрывают одним или несколькими из вышеупомянутых депонированных штаммов (например, включая по меньшей мере два из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере три из вышеуказанных штаммов, по меньшей мере четыре из вышеуказанных штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеуказанных штаммов).

В одном из вариантов осуществления семя(семена) покрывают штаммом с депозитарным номером доступа NRRL B-50608. В одном из вариантов осуществления семя(семена) покрывают штаммом с депозитарным номером доступа NRRL B-50609. В одном из вариантов осуществления семя(семена) покрывают штаммом с депозитарным номером доступа NRRL B-50610. В одном из вариантов осуществления семя(семена) покрывают штаммом с депозитарным номером доступа NRRL B-50611. В одном из вариантов осуществления семя(семена) покрывают штаммом с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В одном варианте осуществления семена можно обрабатывать любой из композиции(композиций), описанных в настоящем документе, несколькими способами, но предпочтительно посредством распыления или смачивания. Обработку распылением и смачиванием можно проводить посредством составления композиций, описанных в настоящем документе, и распыления композиции(композиций) на семя(семена) или смачивания композицией(композициями) семени(семян) посредством системы для непрерывной обработки (которую калибруют для проведения обработки с предопределенной частотой пропорционально непрерывному потоку семян), например, в аппарате для обработки барабанного типа. Системы периодического действия, в которых предопределенный размер партии семян и композиции(композиций), как описано в настоящем документе, доставляют в миксер, также можно использовать. Системы и аппараты для проведения этих процессов являются коммерчески доступными от ряда производителей, например Bayer CropScience (Gustafson).

В другом варианте осуществления обработка включает в себя покрытие семян. Один из таких способов включает в себя покрытие внутренней стенки круглого контейнера композицией(композициями), описанной в настоящем документе, добавление семян, затем вращение контейнера, чтобы заставить семена контактировать со стенкой и композицией(композициями), способ, известный в данной области как «покрытие в контейнере». Семена можно покрывать посредством комбинации способов покрытия. Смачивание, как правило, включает в себя использование жидких форм описанных композиций. Например, семена можно смачивать в течение от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч (например, в течение по меньшей мере 1 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 80 мин, 3 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч).

В конкретных вариантах осуществления семя(семена), покрытые одной или несколькими из композиций, описанных в настоящем документе, может содержать 1×10¹-1×10⁸, более предпочтительно 1×10²-1×10⁶ колониеобразующих единиц одного или нескольких из депонированных бактериальных штаммов на семя.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения, как изложено в формуле изобретения в настоящем документе. Любые варианты в проиллюстрированных примерах, которые являются очевидными для специалиста в данной области, предназначены для включения в объем настоящего изобретения.

Материалы и методы

Депонированный биологический материал

Следующий биологический материал депонирован согласно условиям Будапештского Соглашения в Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit (NRRL) National Center for Agricultural Utilization Research 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA, и ему присвоен следующий номер доступа:

Таблица 1
Депонированный биологический материал Идентификатор Номер доступа Дата депонирования Bradyrhizobia japonicum NRRL B-50612 30 ноября 2011 г. Bradyrhizobia japonicum NRRL B-50611 30 ноября 2011 г. Bradyrhizobia japonicum NRRL B-50610 30 ноября 2011 г. Bradyrhizobia japonicum NRRL B-50609 30 ноября 2011 г. Bradyrhizobia japonicum NRRL B-50608 30 ноября 2011 г.

Штаммы депонированы в условиях, обеспечивающих то, что доступ к культуре является возможным на протяжении рассмотрения этой патентной заявки для лица, определенного членом комиссии по патентам и товарным знакам как указанного для данной цели согласно 37 C.F.R. §1.14 и 35 U.S.C. §122. Депонированный биологический материал представляет собой чистую культуру депонированного штамма. Депонированный биологический материал является доступным, как требует иностранное патентное законодательство в тех странах, где поданы эквиваленты рассматриваемой заявки или ее продолжение. Однако, следует понимать, что доступность депонированного биологического материала не представляет собой лицензию на осуществление рассматриваемого изобретения на практике с уменьшением патентных прав, предоставленных органом государственной власти.

Среды

Таблица 2
Компоненты среды G16 Составляющие G16 (г/л дистилированной деионизированной воды (DDW)) г/л Фосфат калия двухосновный K₂HPO₄ 0,550 Сульфат магния гептагидрат MgSO₄·7H₂O 0,200 Хлорид кальция дигидрат CaCl₂·2H₂O 0,130 Дрожжевой экстракт Oxoid (LP0021) 0,750 Хлорид аммония NH₄Cl 0,200 Мононатрий L-глутаминовой кислоты моногидрат 0,250 Сахароза 1,500 Декстроза безводная 4,500 Хлорид железа (III) гексагидрат FeCl₃·6H₂O. Исходный раствор (80 г/л DDW), хранящийся при 4°C вплоть до 6 месяцев 0,200 Твердый кукурузный экстракт (Sigma) 0,400 Исходный раствор микроэлементов (см. ниже)* 365 мкл Исходный раствор витаминов (см. ниже) ** 365 мкл pH 6,800

Таблица 3
Исходный раствор микроэлементов хранить при 4°C вплоть до 6 месяцев Составляющее (г/л DDW) г/л Хлорид никеля (II) гексагидрат NiCl₂·6H₂O 0,69 Сульфат меди пентагидрат CuSO₄ 5H₂O 0,22 Борная кислота H₃BO₃ 7,87 Сульфат марганца моногидрат MnSO₄·H₂O 5,06 Сульфат цинка гептагидрат ZnSO₄·7H₂O 0,61 Молибдат натрия Na₂MoO₄·2H₂O 0,61 Гексагидрат кобальта (II) CoCl₂·6H₂O 0,66 * Микроэлементы добавляют вместе с другими компонентами до стерилизации.

Таблица 4
Исходный раствор витаминов - стерилизованный фильтрованием с последующим хранением при 4°C вплоть до 6 месяцев Составляющее (г/л DDW) г/л Гидрохлорид тиамина 1,38 Пантотеновая кислота 0,55 ** Витамины добавляют после стерилизации и охлаждения среды, как правило, во время инокуляции.

Таблица 5
Компоненты среды из дрожжевого экстракта и маннита (YEM) Составляющие агара из дрожжевого экстракта и маннита (YEMA) (г/л DDW) г/л или мл/л Маннит 10,0 г Дрожжевой экстракт Oxoid (LP0021) 0,50 г Хлорид натрия NaCl 0,10 г ИСХОДНЫЙ РАСТВОР - Фосфат калия двухосновный K₂HPO₄ (50 г/1000 мл) 10 мл ИСХОДНЫЙ РАСТВОР - Сульфат магния гептагидрат MgSO₄ ⋅7H₂O (20 г/1000 мл) 10 мл pH 6,8

Пример I: Определение 99,99% процента уничтожения для USDA 532C

Следующий эксперимент(ы), состоящий из трех (3) исследований, проводили для определения 99,99% процента уничтожения для родительского штамма Bradyrhizobia japonicum USDA 532C.

Родительский штамм USDA 532C выращивали в двух 10-мл одноразовых культуральных пробирках с G16 (таблицы 2-4) и YEM (таблица 5) (VWR, 18×150 мм, #47729-583) в течение двух суток и собирали для получения наивысшей концентрации клеток. Этого достигали объединением обоих культуральных пробирок в одну пробирку и концентрированием клеток осаждением до 2 мл. Приблизительно пятьдесят семян (сорт Stine RR 1108-4) поверхностно стерилизовали в 50-мл стерильной одноразовой пробирке для центрифугирования (Fisher brand, #06-443-18), содержащей 5%-ный раствор хозяйственного отбеливателя, в течение 30 с и промывали стерильной деионизированной (DI) водой. Стадию стерилизации повторяли пять раз. Семена немедленно помещали в стерилизованную чашку Петри и высушивали в ламинарном шкафу. После полного высыхания семян и переноса в 250-мл мерный стакан, 1,5 мл культуры концентрированного родительского штамма USDA 532C добавляли к семенам. Семена вращали в мерном стакане, чтобы полностью покрыть семена, и позволяли высохнуть под ламинаром. Мерный стакан, содержащий семена, оборачивали синей бумагой для стерилизации и оставляли под ламинаром до завершения эксперимента. Временные точки отбирали в нулевое время, каждые двое суток в течение одной недели, и каждую неделю до наступления полной гибели клеток. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6
КОЕ на семя и процент уничтожения для исследования 1 Количество суток КОЕ на семя Процент уничтожения 0 3,06×10⁸ 0,00 3 3,72×10⁷ 87,86 7 4,20×10⁶ 98,63 14 3,07×10⁶ 99,00 18 6,43×10⁵ 99,79 24 2,87×10⁵ 99,91 37 2,64×10⁴ 99,99

Как показано в таблице 6, исходное КОЕ на семя для родительского штамма USDA 532C составляло 3,06×10⁸, и на сутки 37 КОЕ составляло 2,64×10⁸. Процент уничтожения от времени 0 до 37 суток рассчитывали как 99,99%.

Процедуру повторяли, за исключением того, что G16 использовали в качестве исходной среды для роста. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7
КОЕ на семя и процент уничтожения для исследования 2 Количество суток КОЕ на семя Процент уничтожения 0 2,01×10⁹ 0,00 2 3,13×10⁸ 84,41 6 3,26×10⁷ 98,38 10 9,14×10⁶ 99,55 16 3,50×10⁶ 99,83 22 1,40×10⁶ 99,93 29 3,38×10⁵ 99,98 37 6,23×10⁴ 100,00

Как показано в таблице 7, когда G16 использовали в качестве исходной среды для роста, для достижения процента уничтожения 99,99% требовалось от 29 до 37 суток.

Третье исследование обезвоживания завершали для определения того, влияют ли среды G16 и YEM на скорость обезвоживания родительского штамма USDA 532C. Результаты представлены в таблицах 8 и 9 соответственно.

Таблица 8
КОЕ на семя и процент уничтожения для родительского штамма USDA 532C, выращенного на среде G16 Количество суток КОЕ на семя Процент уничтожения 0 2,95×10⁹ 0,00 2 8,69×10⁷ 97,06 7 2,93×10⁷ 99,01 14 1,68×10⁷ 99,43 21 2,11×10⁶ 99,93 28 7,50×10⁴ 100,00

Таблица 9
КОЕ на семя и процент уничтожения для родительского штамма USDA 532C, выращенного на среде YEM Количество суток КОЕ на семя Процент уничтожения 0 2,90×10⁸ 0,00 2 3,46×10⁶ 98,81 7 1,81×10⁶ 99,38 14 1,31×10⁶ 99,55 21 7,33×10⁵ 99,75 28 7,00×10⁴ 99,98

Как показано в таблицах 8 и 9, не присутствовало различий в скорости обезвоживания родительского штамма USDA 532C при выращивании на G16 или YEM. Процент уничтожения 99,99% наблюдали для третьего исследования приблизительно на 28 сутки, что является сходным с процентом уничтожения, наблюдаемым в исследованиях один (1) и два (2) выше.

Пример II: Определение процента уничтожения USDA532C с использованием этилметансульфоната (EMS)

Следующий эксперимент(ы) проводили для определения уровня введения мутагена, этилметансульфоната (EMS), дающего процент уничтожения 99,9-99,99 для родительского штамма USDA 532C. Это определение уровня может являться частью протокола мутагенеза, используемого для получения устойчивых к обезвоживанию предполагаемых мутантов, хотя способ мутагенеза можно расширять для эффективности.

Получение инокулята

Родительский штамм USDA 532C выращивали в шести 10-мл одноразовых культуральных пробирках с YEM в течение двух суток, и 5 мл культуры инокулировали в четыре 250-мл колбы, содержащие по 50 мл среды YEM. Колбы инкубировали в течение двух суток при 30°C во встряхивателе. Затем культуру из колб центрифугировали в 50-мл одноразовых стерильных пробирках при 8000 об/мин в течение десяти минут в центрифуге Sorvall RC 6 Plus® и объединяли в одну пробирку. Осадок ресуспендировали в 4 мл свежей среды YEM и разделяли на четыре 1,5-мл пробирки для центрифугирования. Каждая из пробирок представляет различные уровни нанесения, используемые для способа мутагенеза.

Способ мутагенеза

После помещения аликвот культуры в отдельные пробирки и добавления мутагена EMS (Sigma, C3H803S, FW 124.16, #M0880-1G) в каждую пробирку, пробирки интенсивно встряхивали и помещали в пустую 250-мл колбу. Колбу, содержащую реакционные пробирки, инкубировали в течение 30 мин при 30°C во встряхивателе. Немедленно после периода инкубации пробирки промывали пять раз раствором 0,16 М тиосульфата натрия (STS, Fisher Chemical, Na₂S₂О₃⋅5H₂О, FW 248.18, #S445-3)) для инактивации мутагена. После промывки клетки в реакционных пробирках измельчали шприцом с иглой 21 калибра (BD 1 мл 21G1 Latex Free Syringe PrecisionGlide® Needle, 0,8 мм × 25 мм, #309624), и разведения завершали и рассевали в планшеты с YEMA. Подсчет клеток являлся доступным после пяти суток инкубации при 30°C, и рассчитывали процент уничтожения для уровня нанесения EMS. Для расчета процента уничтожения для каждого уровня нанесения использовали следующее уравнение: ([количество клеток для 0 мкл EMS (контроль) - (количество клеток для мкл EMS (обработка)) + количество клеток для 0 мкл EMS (контроль)] × 100%). Во всех других экспериментах после этого эксперимента использовали это уравнение для расчета процента уничтожения. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10
Исходные уровни EMS для определения верхнего предела мутагенеза для родительского штамма USDA 532C Уровень нанесения Количества клеток (приблизительное КОЕ/мл) 0 мкл EMS (контроль) 10⁸ КОЕ/мл 1 мкл EMS сходные результаты с 0 мкл EMS 10⁷ КОЕ/мл 10 мкл EMS сходные результаты с 1 мкл EMS 100 мкл EMS 100% процент уничтожения

Как показано в таблице 10, использованные исходные уровни EMS составляли 0 мкл, 1 мкл, 10 мкл и 100 мкл. Не присутствовало различий между 0 мкл, 1 мкл и 10 мкл EMS, но 100 мкл EMS приводили в результате к 100% уничтожению.

Эксперименты повторяли и уточняли для определения приемлемого процента уничтожения (см. таблицы 11-17).

Таблица 11
Уточнение уровней EMS для определения 99,9% процента уничтожения для родительского штамма USDA 532C Уровень нанесения Количества клеток (приблизительное КОЕ/мл) Процент уничтожения 0 мкл EMS (контроль) 2,49×10⁹ КОЕ/мл 15 мкл EMS 2,24×10⁹ КОЕ/мл 10,17% 25 мкл EMS 1,72×10⁹ КОЕ/мл 30,92% 50 мкл EMS 1,67×10¹ КОЕ/мл 100%

По первоначальным результатам количество использованного EMS сузили до 0 мкл, 15 мкл, 25 мкл и 50 мкл EMS. Как показано в таблице 11, процент уничтожения составлял 10,17%-30,92% для нанесения 15 мкл и 25 мкл EMS и 100% для 50 мкл.

Таблица 12
Дополнительное уточнение уровней нанесения EMS для родительского штамма USDA 532C Уровень нанесения Количества клеток (приблизительное КОЕ/мл) Процент уничтожения 0 мкл EMS (контроль) 4,70×10⁹ КОЕ/мл 25 мкл EMS 1,27×10⁹ КОЕ/мл 73,09% 35 мкл EMS 5,37×10⁸ КОЕ/мл 88,58% 50 мкл EMS 2,93×10² КОЕ/мл 100%

Из таблицы 11 определили, что 25 мкл EMS обладали еще слишком низким процентом уничтожения. Наносимые количества для таблицы 12 составляли 0 мкл, 25 мкл, 35 мкл и 50 мкл EMS. Нанесение 25 мкл EMS обладало более высоким процентом уничтожения, чем результаты в таблице 11, из-за уменьшения промывки; таким образом, процент уничтожения являлся более высоким, чем ожидали. Однако процент уничтожения являлся еще слишком низким при 88,58% уничтожении, даже при использовании 35 мкл EMS (см. таблицу 12).

Таблица 13
Дополнительное уточнение уровней нанесения EMS для родительского штамма USDA 532C Уровень нанесения Количества клеток (приблизительное КОЕ/мл) Процент уничтожения 0 мкл EMS (контроль) 3,93×10⁹ КОЕ/мл 40 мкл EMS 6,97×10⁸ КОЕ/мл 82,26% 45 мкл EMS 8,57×10⁷ КОЕ/мл 97,82% 50 мкл EMS 2,65×10⁵ КОЕ/мл 99,99%

Использованное количество EMS увеличивали до 40 мкл, 45 мкл и 50 мкл EMS. Уровни дозы EMS приводили к диапазону процента уничтожения 82,26%-99,99% (см. таблицу 13).

Таблица 14
Повтор уровней нанесения, использованных в таблице 13 Уровень нанесения Количества клеток (приблизительное КОЕ/мл) Процент уничтожения 0 мкл EMS (контроль) 7,07×10¹¹ КОЕ/мл 40 мкл EMS 1,35×10⁹ КОЕ/мл 99,81% 45 мкл EMS 5,27×10⁸ КОЕ/мл 99,93% 50 мкл EMS 2,19×10⁶ КОЕ/мл 100%

Результаты, представленные в таблице 13, снова повторяли в таблице 14 с использованием таких же уровней EMS, и в этот раз процент уничтожения составлял 99,81% для 40 мкл EMS и 99,93% для 45 мкл EMS, и 100% для 50 мкл EMS. Желательный процент уничтожения 99,9% наблюдали при использовании 45 мкл EMS, так что нанесение повторяли (см. таблицу 15).

Таблица 15
Повтор уровня нанесения, использованного в таблице 14 Уровень нанесения Количества клеток (приблизительное КОЕ/мл) Процент уничтожения 0 мкл EMS (контроль) 1,51×10⁸ КОЕ/мл 45 мкл EMS 3,33×10⁴ КОЕ/мл 99,98% 50 мкл EMS 4,33×10¹ КОЕ/мл 100%

Уровень нанесения 45 мкл EMS удваивали для определения, являются ли результаты в таблице 14 воспроизводимыми. Процент уничтожения для 45 мкл EMS составлял 99,98% (см. таблицу 15).

Пример III: Мутагенез

Следующий эксперимент(ы) проводили для получения предположительных устойчивых к обезвоживанию мутантов штаммов из родительского штамма USDA 532C с использованием классического, например химического, мутагенеза.

Получение инокулята

Суспензию клеток родительского штамма USDA 532C получали отбором петли клеток со свежего планшета USDA 532C с использованием 10-мкл стерильной пластиковой петли (Fisher brand, #22-363-600) и перемешиванием клеток в 1 мл стерильной, деионизированной (DI) воды в 1,5-мл одноразовой пробирке для микроцентрифугирования. Суспензию клеток инокулировали в две 250-мл колбы, содержащие 50 мл среды YEM, для достижения конечной оптической плотности (OD) OD_600нм 0,01. Колбы инкубировали при 30°C в течение трех суток, и культуры из двух колб объединяли. Культуру центрифугировали в течение двадцати минут при 8000 об/мин в центрифуге Sorvall RC 6 Plus. Супернатант выбрасывали, и осадок ресуспендировали в 30 мл DI воды. Определяли OD концентрированной культуры и инокулировали в десять 250-мл колб, содержащих 50 мл среды YEM при OD=0,05. Эти колбы инкубировали при 30°C во встряхивателе в течение двух суток до использования культуры для мутагенеза.

Способ мутагенеза

Культуры из десяти колб объединяли в 1-л бутыли для центрифугирования. Регистрировали оптическую плотность объединенных культур, и культуры центрифугировали в течение 20 мин при 8000 об/мин в центрифуге Sorvall RC 6 Plus®. Большую часть супернатанта выбрасывали, оставляя приблизительно 30 мл супернатанта в бутыли для центрифугирования. Супернатант смешивали с осадком и переносили в 50-мл стерильную одноразовую пробирку для центрифугирования. Определяли и регистрировали OD концентрированной культуры. По 1 мл концентрированной культуры помещали в шесть 1,5-мл одноразовых пробирок для микроцентрифугирования. Пробирки для микроцентрифугирования центрифугировали, и супернатант выбрасывали. Это повторяли еще три раза или пока размер осадка не достигал отметки 0,1 мл на пробирке для микроцентрифугирования. Клетки хорошо смешивали с 1 мл свежей среды YEM с использованием стерильного 1-мл шприца с иглой 21 калибра перед добавлением мутагена, этилметансульфоната (EMS). Уровни мутагена, добавляемые в каждую пробирку, включали в себя высокую и низкую дозу со средними дозами между высокой и низкой дозами, как указано в эксперименте II.

Немедленно после добавления EMS реакционные пробирки помещали в пустую 250-мл колбу и инкубировали при 30°C в течение 30 мин. После инкубации реакционные пробирки центрифугировали в течение одной минуты при 13200 об/мин с использованием центрифуги Eppendorf 5415D. Супернатант из реакционных пробирок выбрасывали. Мутаген в реакционных пробирках инактивировали промывкой пять раз 1 мл 0,16 М тиосульфата натрия (STS) и интенсивным смешиванием посредством встряхивания пробирок. Для каждого цикла промывки реакционные пробирки центрифугировали после встряхивания, и супернатант выбрасывали. После пятого раза все реакционные пробирки объединяли в одну 15-мл одноразовую пробирку для использования в способе обогащения.

Пример IV: Обогащение и обезвоживание

Следующий эксперимент(ы) проводили для обогащения и обезвоживания мутированных клеток родительского штамма USDA 532C для исключения спасения дикого типа и увеличения популяции предположительных мутантов и для упрощения выделения мутанта(мутантов), обладающих характеристиками устойчивости к обезвоживанию.

Родительский штамм USDA 532C подвергали процессу мутагенеза, упомянутому в примере III. Мутировавшую популяцию родительского штамма USDA 532C обогащали инокуляцией 0,5 мл реакционной смеси в две 50-мл колбы с YEM и инкубацией клеток в течение двух суток во встряхивателе при 30°C. Через двое суток культуры подвергали обезвоживанию посредством покрытия клетками семян сои и мембранных фильтров и подвергания условиям высушивания. Культуру со стадии обогащения доводили до OD_600нм 0,5 до ее использования для покрытия семян сои и мембранных фильтров.

Покрытие семян сои

Сорок стерилизованных семян сои покрывали 0,5 мл культуры. Семена помещали в 100-мл стерильный мерный стакан для высушивания в ламинарном шкафу и накрывали бумагой для автоклавирования. Отбирали образцы семян в трех повторах для получения исходных КОЕ семян. Для каждого образца три семени помещали в 15-мл одноразовую пробирку, содержащую 5 мл стерильной DI воды, и позволяли набухнуть в пробирке в течение приблизительно двух часов перед стерильным разведением суспензии и распределением по чашкам с YEMA. Остальные семена, оставшиеся в накрытом мерном стакане, помещали в ламинар на четверо суток перед обогащением семян.

Для обогащения семян двадцать семян помещали в 250-мл колбу, содержащую 50 мл свежей YEM. Определяли также конечные КОЕ после обогащения семян для определения процента уничтожения для популяции клеток. Такой же отбор образцов, как в исходной временной точке, завершали во второй временной точке. После инкубации культуры, содержащей семена, в течение двух суток культуру собирали посредством удаления всего дебриса семян, позволяя дебрису осесть перед удалением супернатанта. Супернатант культуры центрифугировали, и осадок промывали стерильной DI водой до использования культуры для покрытия новых партий семян сои. Этот процесс повторяли, пока рассчитанный процент уничтожения культуры клеток не составлял менее 80%. При достижении 80% популяция клеток являлась готовой для выделения предположительных мутантов для подтверждающего эксперимента.

Покрытие мембранных фильтров

Для контроля в исследованиях нарушения целостности и загрязнения семян сои, мембранные фильтры использовали в качестве альтернативной среды для покрытия клетками. Для мембранных фильтров 1 мл культуры использовали для покрытия как дюрапоровых (Millipore, 0,22 мкм, PVDF, #GVWP02500), так и изопоровых (Millipore, 0,4 мкм, поликарбонат, # HTTP02500) мембранных фильтров. Для каждого типа фильтра, пятнадцать фильтров покрывали с использованием 25-м шприцевого держателя фильтров Easy Pressure (VWR, #28144-109), и фильтры помещали в стерильную чашку Петри, содержащую два куска стерильной, качественной 125-мм бумаги Whatman (Whatman, #1001125). После высушивания фильтров в ламинаре, исходные КОЕ определяли в трех повторах для каждого типа фильтра посредством помещения одного фильтра в 15-л одноразовую пробирку, содержащую 5 мл стерильной DI воды, и перемешивания посредством встряхивания. После двух часов смачивания в 15-л пробирке суспензию фильтра разводили и высевали в планшеты с YEMA. После высушивания фильтров в ламинаре в течение трех суток восемь фильтров добавляли в 250-л колбу с 50 мл свежей YEM и инкубировали при 30°C в течение трех суток.

Конечные КОЕ определяли в то же самое время после обогащения на фильтрах для получения расчетов процента уничтожения. Такой же способ, как для исходных КОЕ, использовали для конечных КОЕ. Процесс покрытия и высушивания повторяли, пока процент уничтожения не составлял менее 80%. После достижения 80% изоляты отдельных колоний отбирали для дальнейшего подтверждения.

Пример V: Подтверждение предположительных мутантов

Следующий эксперимент(ы) проводили для подтверждения предположительных устойчивых к обезвоживанию мутантов посредством сравнения их жизнеспособности на семени после нанесения на семя с жизнеспособностью оригинального родительского штамма Bradyrhizobium japonicum штамм USDA 532C.

Когда 80% процент уничтожения наблюдали для семян или фильтров, отдельные колонии случайным образом отбирали в конечной временной точке, и предположительные мутанты из партии после мутагенеза анализировали по характеристикам устойчивости к обезвоживанию. Двадцать отдельных колоний, отобранных для каждой партии, полученной после мутагенеза, по отдельности выращивали в 250-л колбе, содержащей 50 мл среды YEM. Каждый предположительно мутантный штамм инкубировали во встряхивателе при 30°C в течение трех суток, и OD для каждого штамма доводили до 0,5. Каждый штамм использовали для покрытия тридцати нестерильных семян сои 0,5 мл культуры в 100-л мерном стакане, накрытом бумагой для автоклавирования. Временные точки отбирали при T=0, T=3 и T=7 суток для первого раунда. Образцы семян в трех повторах отбирали для каждой временной точки, где каждый образец состоял из трех семян, помещенных в 5 мл стерильной DI воды в 15-мл одноразовой пробирке. Семенам позволяли набухнуть в течение двух часов перед разведением каждого образца и посевом в планшеты с YEMA. После сравнения количества клеток, восстановившихся в каждой временной точке, по отношению к родительскому штамму USDA 532C, все штаммы с лучшей эффективностью, чем родительский штамм, подвергали второму раунду подтверждения (см. Фиг.1). Для второго раунда штаммы, обладающие наилучшей устойчивостью к обезвоживанию по сравнению с диким типом, снова тестировали на обезвоживание (см. Фиг.2). Временные точки отбирали на T=0, T=7 и T=14 суток. Для партии предположительных мутантов из второго раунда дополнительно подтверждали устойчивость к обезвоживанию еще два раза (см. Фиг.3-6).

Двадцать предположительных мутантов родительского штамма USDA 532C выделяли и отбирали по устойчивости к обезвоживанию (см. Фиг.1-3). Из двадцати тестированных предположительных штаммов, для пяти предположительно мутантных штаммов подтвердили их характеристики устойчивости к обезвоживанию по сравнению с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма, Bradyrhizobium japonicum штамм USDA 532C (см. Фиг 4-6).

Пример VI: Тестирование в теплице подтвержденных мутантных штаммов

Следующий эксперимент(ы) проводили для тестирования предположительно мутантных штаммов в теплице для тестирования эффективности мутантных штаммов по сравнению с эффективностью родительского штамма, USDA 532C.

Мутантные штаммы, обладающие наилучшей устойчивостью к обезвоживанию по сравнению с родительским штаммом USDA 532C, тестировали в теплице по эффективности по сравнению с родительским штаммом USDA 532C. Мутантный и родительский штаммы выращивали в 50 мл YEM в течение двух суток перед покрытием семян. Каждый штамм высевали в три различных периода времени; T=0, T=7 и T=14 суток после покрытия семян. Все временные точки устанавливали в одно и то же время, но семена высевали в указанные периоды времени. Для установления временных точек тридцать семян сои покрывали 0,5 мл культуры при OD_600нм=0,5 в 100-мл мерном стакане, и для временной точки T=0 суток позволяли находиться в ламинаре в течение 30 мин перед посевом. Для двух других временных точек позволяли полное высушивание и накрывали бумагой для автоклавирования. Семена из двух последних временных точек высевали в более поздние даты. В каждой временной точке высевали два семени на горшок для десяти горшков для штамма. Оставшиеся семена использовали для получения КОЕ для сравнения с T=0. После девяти недель выращивания в теплице стручки сои собирали с каждого растения в каждой временной точке, и массу в сухом состоянии анализировали для статистической значимости.

Когда массу стручков сои мутантных штаммов сравнивали с родительским штаммом в любой из временных точек, не присутствовало статистической значимости для 95% достоверности. Это указывает на отсутствие различий в эффективности между мутантными штаммами и родительским штаммом, которые могут влиять на продукцию стручков сои при использовании мутантных штаммов для покрытия семян сои.

ПУНКТЫ КРАТКОГО ОПИСАНИЯ

Настоящее изобретение определено в формуле изобретения и сопутствующем описании. Дополнительные аспекты настоящего изобретения представлены в настоящем документе посредством пронумерованных пунктов.

1. Биологически чистая культура штамма Bradyrhizobium japonicum, выбранного из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608, или комбинации по меньшей мере двух или более штаммов.

2. Штаммы из пункта 1, где указанные штаммы обладают превосходной устойчивостью к обезвоживанию.

3. Штаммы из пункта 2, где указанную устойчивость к обезвоживанию сравнивают с указанной устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма указанных выделенных штаммов, например, родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532С.

4. Штаммы из пункта 2, где указанная превосходная устойчивость к обезвоживанию включает в себя увеличенный процент выживаемости бактерий в по существу безводной внешней среде, когда указанный процент выживаемости указанного выделенного штамма(штаммов) Bradyrhizobium сравнивают с указанным процентом выживаемости родительского штамма указанных изолятов, например, родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532C, в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделя, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 год или более.

5. Штаммы из любого из пунктов 2-4, где указанный увеличенный процент выживаемости в указанной по существу безводной внешней среде включает в себя увеличенный процент выживаемости бактерий во внешней среде, которая является по меньшей мере на 70% безводной, например, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, вплоть до 100% безводной внешней средой, когда указанный процент выживаемости указанного выделенного штамма(штаммов) Bradyrhizobium сравнивают с указанным процентом выживаемости родительского штамма указанных изолятов, например, родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532C.

6. Композиция, содержащая один или несколько из указанных выделенных бактериальных штамма(штаммов) в соответствии с пунктами 1-5 и приемлемый для сельского хозяйства носитель.

7. Композиция из пункта 6, где композиция содержит по меньшей мере один преимущественный с точки зрения сельского хозяйства ингредиент.

8. Композиция из пункта 7, где указанный по меньшей мере один преимущественный с точки зрения сельского хозяйства ингредиент включает в себя одну или несколько сигнальных молекул растений.

9. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой липохитоолигосахарид (LCO).

10. Композиция из пункта 9, где LCO является синтетическим.

11. Композиция из пункта 9, где LCO является рекомбинантным.

12. Композиция из пункта 9, где LCO является природным.

13. Композиция из пункта 9, где LCO получен из видов Rhizobia, выбранных из Rhizobium spp., Sinorhizobium spp. и Azorhizobium spp.

14. Композиция из пункта 9, где LCO получен из Bradyrhizobium japonicum.

15. Композиция из пункта 9, где LCO получен из гриба с древовидной микоризой.

16. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой хитиновое соединение.

17. Композиция из пункта 16, где хитиновое соединение представляет собой хито-олигомер (CO).

18. Композиция из пункта 17, где CO является синтетическим.

19. Композиция из пункта 18, где CO является рекомбинантным.

20. Композиция из пункта 18, где CO является природным.

21. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой флавоноид.

22. Композиция из пункта 21, где флавоноид выбран из группы, состоящей из лютеолина, апигенина, тангеритина, кверцетина, кемпферола, мирицетина, физетина, изорамнетина, пачиподола, рамназина, гесперетина, нарингенина, формононетина, эриодиктиола, гомоэриодиктиола, таксифолина, дигидрокверцетина, дигидрокемпферола, генистеина, дайдзеина, глицитеина, катехина, галлокатехина, 3-галлата катехина, 3-галлата галлокатехина, эпикатехина, эпигаллокатехина, 3-галлата эпикатехина, 3-галлата эпигаллокатехина, цианидина, дельфинидина, мальвидина, пеларгонидина, пеонидина, петунидина или их производных.

23. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой жасминовую кислоту или ее производное.

24. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой линолеиновую кислоту или ее производное.

25. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой линоленовую кислоту или ее производное.

26. Композиция из пункта 8, где сигнальная молекула растения представляет собой каррикин.

27. Композиция по любому из пунктов 8-26, где композиция включает в себя по меньшей мере две различных сигнальных молекулы растений.

28. Композиция из пункта 27, где обеспечивающий преимущество для сельского хозяйства ингредиент представляет собой гербицид, инсектицид или фунгицид.

29. Композиция из пункта 27, где обеспечивающий преимущество для сельского хозяйства ингредиент представляет собой по меньшей мере один солюбилизирующий фосфат микроорганизм.

30. Композиция из пункта 29, где по меньшей мере один солюбилизирующий фосфат микроорганизм содержит штамм гриба Penicillium.

31. Композиция из пункта 30, где по меньшей мере один солюбилизирующий фосфат микроорганизм содержит штамм P. bilaiae.

32. Композиция из пункта 31, где штамм P. bilaiae выбран из группы, состоящей из NRRL 50162, NRRL 50169, ATCC 20851, ATCC 22348 и ATCC 18309.

33. Композиция из пункта 30, где по меньшей мере один солюбилизирующий фосфат микроорганизм содержит штамм P. gaestrivorus.

34. Композиция из пункта 33, где штамм P. gaestrivorus представляет собой NRRL 50170.

35. Способ обработки семян, включающий в себя нанесение на указанные семена инокулята одного или нескольких из выделенного бактериального штамма(штаммов) согласно пункту 1.

36. Способ согласно пункту 35, где композицию согласно любому из пунктов 6-34 наносят на семя.

37. Способ согласно любому из пунктов 35-36, где способ дополнительно включает в себя стадию хранения указанных обработанных семян в по существу безводной внешней среде в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделя, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 год или более.

38. Способ согласно пункту 37, где указанные семена представляют собой семена бобового растения.

39. Способ согласно пункту 38, где указанные семена бобового растения представляют собой семена сои.

40. Способ усиления роста растения, включающий в себя нанесение на растения, семена растений или почву, окружающую растения или семена растений, композиции согласно любому из пунктов 6-34.

41. Способ согласно пункту 40, где указанные семена представляют собой семена бобового растения.

42. Способ согласно пункту 41, где указанные семена бобового растения представляют собой семена сои.

43. Способ усиления роста растения или части растения, включающий в себя контакт растения или части растения с инокулятом одного или нескольких штаммов из пункта 1.

44. Способ из пункта 43, где способ дополнительно включает в себя стадию подвергания почвы воздействию одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов.

45. Способ из пункта 43, где стадия обработки включает в себя введение инокулята одного или нескольких штаммов из пункта 1 в форме композиции.

46. Способ из пункта 43, где композиция представляет собой композицию по любому из пунктов 6-34.

47. Способ из пункта 43, где часть растения представляет собой семя растения.

48. Способ согласно пункту 47, где указанные семена представляют собой семена бобового растения.

49. Способ согласно пункту 48, где указанные семена бобового растения представляют собой семена сои.

50. Способ усиления роста растения или части растения, включающий в себя

a) обработку почвы инокулятом одного или нескольких штаммов из пункта 1; и

b) выращивание растения или части растения в обработанной почве.

51. Способ из пункта 50, где способ дополнительно включает в себя стадию посадки растения или части растения до, во время или после стадии обработки.

52. Способ из пункта 50, где способ дополнительно включает в себя стадию подвергания почвы воздействию одного или нескольких преимущественных с точки зрения сельского хозяйства ингредиентов.

53. Способ из пункта 50, где обработки включает в себя введение одного или нескольких штаммов из пункта 1 в форме композиции.

54. Способ из пункта 50, где композиция представляет собой композицию по любому из пунктов 6-34.

55. Семя, покрытое композицией по любому из пунктов 6-34.

Изобретение, описанное и заявленное в формуле изобретения в настоящем документе, не предназначено для ограничения по объему конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, поскольку эти варианты осуществления предназначены в качестве иллюстраций некоторых аспектов изобретения. Любые эквивалентные варианты осуществления предназначены для включения в объем этого изобретения. Действительно, различные модификации по изобретению в дополнение к модификациям, показанным и описанным в настоящем документе, будут очевидными для специалистов в данной области из вышеизложенного описания. Такие модификации также предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае конфликта, настоящее описание, включая определения, обладает преимуществом.

В настоящем документе процитированы различные ссылки, полное содержание которых приведено в качестве ссылки.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложен способ обработки семени растения. На семя наносят инокулят, включающий один или несколько мутированных штаммов Bradyrhizobium japonicum, выбранных из группы, состоящей из штамма NRRL B-50612, штамма NRRL B-50611, штамма NRRL B-50610, штамма NRRL B-50609 и штамма NRRL B-50608. Новые изоляты Bradyrhizobium japonicum стимулируют рост ризобактерий, обладают превосходной переносимостью обезвоживания. Изобретение позволяет усилить общую эффективность роста растений. 67 з.п. ф-лы, 6 ил., 15 табл., 6 пр.

1. Способ обработки семени растения, включающий нанесение на указанное семя инокулята, включающего один или несколько мутированных штаммов Bradyrhizobium japonicum, выбранных из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609; и

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608.

2. Способ по п.1, где указанный инокулят содержит по меньшей мере два мутированных штамма Bradyrhizobium japonicum.

3. Способ по п.1, где указанный инокулят содержит по меньшей мере три мутированных штамма Bradyrhizobium japonicum.

4. Способ по п.1, где указанный инокулят содержит по меньшей мере четыре мутированных штамма Bradyrhizobium japonicum.

5. Способ по п.1, где указанный инокулят содержит по меньшей мере пять мутированных штаммов Bradyrhizobium japonicum.

6. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение одной или нескольких сигнальных молекул растения на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

7. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного липохитоолигосахарида (LCO) на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

8. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает синтетический LCO.

9. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает рекомбинантный LCO.

10. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один природный LCO.

11. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из штамма Rhizobium, Sinorhizobium, Azorrhizobium, Mesorhizobium или Bradyrhizobium.

12. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из штамма Bradyrhizobium japonicum.

13. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из штамма Sinorhizobium meliloti.

14. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из штамма Rhizobium leguminosarum.

15. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из микоризных грибов.

16. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из штамма Glomerocycota.

17. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, полученный из штамма Glomus intraradicus.

18. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, представленный формулой:

в которой

G представляет собой гексозамин, который может быть замещен ацетильной группой на атоме азота, сульфатной группой, ацетильной группой и/или эфирной группой на атоме кислорода;

R₁, R₂, R₃, R₅, R₆ и R₇, которые могут являться идентичными или различными, представляют собой H, CH₃CO-, C_xH_yCO-, где x представляет собой целое число между 0 и 17, и y представляет собой целое число между 1 и 35, или любую другую ацильную группу;

R₄ представляет собой моно-, ди- или триненасыщенную алифатическую цепь, содержащую по меньшей мере 12 атомов углерода; и

n представляет собой целое число между 1 и 4.

19. Способ по п.7, в котором указанный по меньшей мере один LCO включает по меньшей мере один LCO, представленный формулой:

в которой

R представляет собой H или CH₃CO-; и

n является равным 2 или 3.

20. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного хитина на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

21. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного хитозана на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

22. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного хитоолигосахарида (CO) на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

23. Способ по п.22, в котором по меньшей мере один CO включает синтетический CO.

24. Способ по п.22, в котором по меньшей мере один CO включает рекомбинантный CO.

25. Способ по п.22, в котором по меньшей мере один CO включает природный CO.

26. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного флавоноида на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

27. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одной жасминовой кислоты или ее производного на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

28. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одной линолеиновой кислоты или ее производного на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

29. Способ по п.1, дополнительно включающий введение по меньшей мере одной линоленовой кислоты или ее производного.

30. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного каррикина на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

31. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного гербицида на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

32. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного фунгицида на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

33. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного инсектицида на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

34. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Bradyrhizobium на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

35. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Rhizobium на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

36. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Sinorhizobium на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

37. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Mesorhizobium на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

38. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Azorrhizobium на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

39. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного микоризного гриба на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

40. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Glomerocycota на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

41. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Penicillium на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

42. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Penicillium bilaiae на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

43. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Penicillium gaestrivorus на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

44. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного штамма Streptomyces на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

45. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одного солюбилизирующего фосфат микроорганизма на указанное семя и/или растение, которое произрастает из указанного семени.

46. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя до посадки.

47. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя по меньшей мере за 1 месяц до посадки.

48. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя по меньшей мере за 2 месяца до посадки.

49. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя по меньшей мере за 3 месяца до посадки.

50. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя по меньшей мере за 6 месяцев до посадки.

51. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя по меньшей мере за 1 год до посадки.

52. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя в борозде.

53. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя в количестве 1×10¹-1×10⁸ колониеобразующих единиц на семя.

54. Способ по п.1, в котором указанный инокулят наносят на указанное семя в количестве 1×10²-1×10⁶ колониеобразующих единиц на семя.

55. Способ по п.1, дополнительно включающий выращивание указанного семени в почве.

56. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является бобовым.

57. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является не относящимся к бобовым.

58. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем пшеницы.

59. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем ячменя.

60. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем овса.

61. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем ржи.

62. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем картофеля.

63. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем подсолнечника.

64. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем сои.

65. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем капусты.

66. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем томата.

67. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем моркови.

68. Способ по любому из пп.1-55, где указанное семя является семенем яблони.