Способ диагностики метастазов рака толстой кишки Российский патент 2018 года по МПК G01N33/574 C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2647470C2

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может найти применение в диагностике риска возникновения метастазов при раке толстой кишки.

Фермент-зависимое метилирование ДНК в организме человека, как правило, наблюдается по основаниям цитозина в CpG-островках. Это событие в регуляторных районах (промоторах) обычно связано с транскрипционной инактивацией ассоциированного с промотором гена. Аберрантное метилирование онко-ассоциированных генов - частое событие в опухолях человека. Частота случаев изменения статуса метилирования генов в спорадических колоректальных опухолях, по разным оценкам, колеблется от 15 до 80% (см. Kim M.S., Lee J., Sidransky D. DNA methylation markers in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 2010; Vol. 29: 181-206), что позволяет использовать этот показатель для разработки новых молекулярных маркеров диагностики, скрининга и клинического прогноза опухолей. Аберрантное метилирование ДНК присутствует не только на ранних этапах канцерогенеза, но и является признаком дальнейшей прогрессии и метастазирования.

CDH13 - один из генов-онкосупрессоров, активность которых часто подавляется в опухолях человека посредством транскрипционной инактивации в результате гиперметилирования собственных промоторных участков. Ранее, было показано, что статус гиперметилирования гена CDH13 коррелирует с более продвинутой стадией заболевания, большим размером опухоли и риском развития рецидива и метастазирования у пациентов с раком мочевого пузыря (см. Lin Y.L., Xie P.G., Ma J.G. Aberrant methylation of CDH13 is a potential biomarker for predicting the recurrence and progression of non muscle invasive bladder cancer. Med Sci Monit. 2014. 20: 1572-7).

В работе Konishi K et al. (2011) (DNA Methylation Profiles of Primary Colorectal Carcinoma and Matched Liver Metastasis. PLoS ONE 6(11): e27889) представлены результаты исследования метилирования 79 случаев КРР с использованием бисульфит-пиросеквенирования 13-ти генов (MINT1, MINT2, MINT3J, MLH1, р16, р14, TIMP3, CDH1, CDH13, THBS1, MGMT, НРР1 и ERα) и микрочипов (МСАМ) с целью идентификации различий между первичными опухолями и метастазами, локализованными в печени. Сравнивая аберрантное метилирование 13-ти генов как непрерывную переменную в двух группах (без и с наличием метастазов в печени) статистически значимый эффект был получен только для MGMT (27,4% в метастазах печени [95% ДИ, 42,6% до 12,2%] против 13,4% в первичных опухолях [95% ДИ, 22,8% - 4,2%], Р=0,013). Тем не менее, авторами был сделан вывод об отсутствии значимых различий в уровне и паттерне метилирования между первичной опухолью и парным метастазом. Описываемый отрицательный результат не согласуется с данными, полученными ранее для 13 генов, которые свидетельствовали о прогностической значимости выбранных биомаркеров и их корреляции со стадией заболевания (Ogino S. et al. CpG island methylation, response to combination chemotherapy, and patient survival in advanced microsatellite stable colorectal carcinoma. Virchows Arch 450:529-537; Shen L. et al. Association between DNA methylation and shortened survival in patients with advanced colorectal cancer treated with 5-fluorouracil based chemotherapy. Clin Cancer Res. 2007 13: 6093-6098; Lin Y.L. et al. Aberrant methylation of CDH13 is a potential biomarker for predicting the recurrence and progression of non muscle invasive bladder cancer. Med Sci Monit. 2014 Sep 4;20:1572-7. doi: 10.12659/MSM.892130).

Анализ патентных источников показал наличие следующих изобретений близких по тематике к заявленному:

1) «Способ интраоперационной лапароскопической ультразвуковой диагностики распространения рака толстой кишки» (см. заявка на изобретение 2001132943/14, А61В 8/12, опубл. 10.08.2003). Авторами предложено в ходе оперативного вмешательства по поводу колоректального рака проводить лапароскопическое ультразвуковое исследование, в результате которого оценивают состояние регионарных и некоторых отдаленных лимфатических узлов и органов на предмет наличия метастазов. Способ является инвазивным и выполняется во время операции.

2) «Изоформы BARD1 при раке легкого и колоректальном раке и их применение» (см. заявка на изобретение 2013104137/15, 17.08.2010 US 61/374,370, опубл. 27.09.2014) включает последовательное определение изоформ указанного белка, наличие которых позволяет прогнозировать развитие рецидива колоректального рака. Отметим, что предлагаемый способ осуществляется с помощью многоступенчатых, сложных и дорогостоящих методов (электрофорез с антителами, секвенирование), требующих специализированного оборудования, и не является специфичным для рака толстой кишки.

Изобретение «Способ диагностики метастазов рака толстой кишки» является новым, так как сам методический подход и указанный маркер CpG-метилирования не использовали для заявленной в способе цели и для выбранной нозологии. Способ может быть осуществлен на оборудовании и реактивах компании Qiagen, имеющих регистрационное удостоверение Минздрава РФ.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, дооперационного, эффективного способа выявления метастазов у больных раком толстой кишки, не требующего дополнительных инвазивных процедур.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что используют высокоспецифичные праймеры для регуляторных последовательностей гена CDH13, анализируют полученные данные и вычисляют медиану метилирования Met (%) CpG-сайтов, сравнивают Met с контрольными значениями и в случае превышения Met установленной нормы по генетическому локусу CDH13 подтверждают наличие метастазов.

Способ основан на патогенетическом факторе канцерогенеза - метилировании регуляторных районов генов, ассоциированных с инициацией и развитием злокачественного процесса, что приводит к их инактивации без нарушения структуры ДНК.

Заявленный способ включает следующие этапы: отбор биопсийного материала, выделение тотальной ДНК из тканевых проб с помощью метода фенол-хлороформной экстракции; бисульфитное конвертирование ДНК с последующим использованием ее в качестве матрицы для амплификации участков регуляторных районов в присутствии ген-специфичных праймеров; пиросеквенирование полученных ампликонов в присутствии специфичного праймера; статистическая обработка данных на соответствие контрольным значениям уровня метилирования, рассчитанным на основании экспериментальных данных для условно нормальных и опухолевых тканей толстой кишки.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

У пациента производят забор биопсийного образца опухолевой ткани. Образцы замораживают в жидком азоте для транспортировки в лабораторию и для хранения.

Выделение геномной ДНК из ткани проводят следующим образом: фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, помещают в лизирующий раствор. Дальнейшее выделение ДНК проводят по методу фенол-хлороформной экстракции (см. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. Ростов н/Д: ООО «Ростиздат». 2001. 256 с.).

Выделенную ДНК обрабатывают в ходе бисульфитной конверсии с помощью набора EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Scientific) согласно протоколу производителя или по методу Patterson et al. (2011) (см. Patterson K., Molloy L., Qu W., Clark S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis // J. Vis. Exp. 2011. Vol. 56. e3170.).

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 35 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1 х ПЦР-буфер, 0,2 mM dNTPs, MgCl2 (см. табл. 1), 1 ед. акт. Taq-DNA-полимеразы, по 0,4 mkM прямого и обратного праймеров. Последовательности праймеров и оптимизированные условия амплификации приведены в таблице 1.

Амплификацию проводят на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе:

- первичная денатурация: 95°С 5 мин.

- 45 циклов:

- 95°С 20 с;

- 60°С 20 с;

- 72°С 20 с.

- терминальное удлинение цепи 72°С 10 мин.

Ампликоны, полученные после постановки ПЦР на матрице бисульфит-конвертированной ДНК, подвергают очистке, денатурации и отмывке с последующим отжигом с секвенирующим праймером при 80°С и постановкой реакции пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMark Q24 (Qiagen, Germany) согласно инструкции производителя. Постановку пиросеквенирования каждого образца проводят, как минимум, в двух повторах. Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany). Значение метилирования отдельного CpG-сайта, рассчитанного как отношение содержания нуклеотидов С/Т (рисунок), используют для вычисления усредненного метилирования промоторного участка каждого гена (Met, %).

Вывод об изменении статуса метилирования делают, сравнивая значения Met, полученные для опухоли, с контрольным значением. Под контрольным значением понимают нижнюю границу 95%-ого доверительного интервала, вычисленного для опухолей толстой кишки, гиперметилированных по исследованному локусу. Генетический локус признают гиперметилированным, если вычисленное Met равно или превышает контрольное значение. В нашем случае были получены следующие значения (см. таблица 2).

В целях оценки потенциальной значимости выбранного маркера была рассчитана чувствительность и специфичность. Показано, что для дифференциации случаев колоректального рака с метастазами и без метастазов маркер CDH13 имеет чувствительность 86% и специфичность 50%. Поскольку предложенная система открытая, есть возможность увеличить ее специфичность и чувствительность при расширении паттерна метилирования за счет других генетических локусов.

Для доказательства прогностической ценности предложенного метода приводится 2 выписки из историй болезни.

Пример №1

Больной Ш. обратился в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ с жалобами на частые позывы на дефекацию до 6 раз в сутки, примесь крови в кале, слабость.

Считает себя больным с марта 2015 г, когда появились вышеуказанные симптомы. Обратился за медицинской помощью по месту жительства, направлен в РНИОИ. При обследовании в РНИОИ: СРКТ ОГК, ОБП и МТ от 14.05.2015 г.: легочная ткань: в нижней доле справа кальцинат 0,3 см; простата: 4,9×6,3 см с кальцинатами; остеохондроз L3-L5; в правой доле щитовидной железы киста 2,0 см, опухоль сигмовидной кишки и ректосигмоидного отдела 9,0×4,5 см.

Колоноскопия от 17.04.2015 г.: опухоль ректо-сигмоидного отдела толстой кишки и сигмовидной кишки (на 18 см от ануса нижний край опухоли). Гистологическое исследование биоптата при ФКС №28467-72/15 от 15.05.2015 г.: аденокарцинома.

С диагнозом (С 19) Рак ректо-сигмоидного отдела ободочной кишки T3-4NxM0 стадия 2-3, клиническая группа 2 госпитализирован для оперативного лечения.

28.05.2015 г. больному выполнена операция: резекция ректо-сигмоидного отдела толстой кишки. При интраоперационной ревизии отдаленных метастазов не выявлено.

Послеоперационный гисто-анализ от 28.05.15 - муцинозная аденокарцинома с инвазией в клетчатку, в лимфоузлах и линиях резекции опухоли нет.

Послеоперационный диагноз: (С19) Рак ректосигмоидного отдела ободочной кишки pT4N0M0 стадия 2, клиническая группа 3.

Участок удаленной опухоли был направлен на исследование метилирования гена CDH13 Результат исследования выявил аномальное метилирование гена CDH13.

Больной консультирован химиотерапевтом, учитывая стадию заболевания, химиотерапия не показана.

Однако, учитывая данные генетического исследования, больному рекомендовано дополнительное обследование. При обследовании: СРКТ ОГК, ОБП и МТ от 23.06.15, легочная ткань без очагов. Просвет трахеи и бронхов свободен. Плевра не изменена. Печень - в обеих долях множественные метастазы от 0,5 до 1,5 см в диаметре. Селезенка не изменена. Поджелудочная железа не увеличена, структура однородна. Надпочечники не изменены. Почки не изменены. Брюшина не изменена. Асцита нет. Сальник не изменен. Желчный пузырь без патологии. Мочевой пузырь не изменен. Забрюшинные лимфоузлы не увеличены. Внутригрудные лимфоузлы: не увеличены. Простата 6×6 см. Заключение: метастатическое поражение печени.

В связи с развитием отдаленных метастазов опухоли больной был повторно консультирован химиотерапевтом, рекомендовано проведение многокурсовой химиотерапии.

Учитывая выявление метастатического поражения печени через короткий промежуток времени после оперативного вмешательства (3 месяца), при котором визуально очаговое поражение печени было не обнаружено, можно предложить наличие субклинического метастатического поражения печени уже во время оперативного вмешательства, не определяемого визуально, пальпаторно и при СРКТ. Информация о возможном метастатическом поражении печени после операции могла изменить тактику лечения больного, которому была бы назначена полихимиотерапия, которая должна была увеличить бессобытийный период у данного пациента.

Анализ представленного клинического случая свидетельствует о важности установления метастатического поражения при раке толстой кишки для определения правильной тактики лечения.

Пример №2

Больной К. 06.08.1961 г. р., обратился в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ с жалобами на периодические тупые боли в надлобковой области, вздутие живота, урчание в животе, позывы на дефекацию до 4 раз в сутки, примесь крови в кале.

Считает себя больным с марта 2015 г. Обратился к участковому терапевту по месту жительства, направлен в РНИОИ. При обследовании: СРКТ ОГК, ОБП, ОМТ 15.05.2015: опухоль сигмовидной кишки до 11 см, инфильтрация окружающей клетчатки, забрюшинные лимфоузлы до 2 см.

8.05.15 ФКС: опухоль на 40 см от ануса. Гистоанализ - аденокарцинома со слизеобразованием.

Биопсийный материал был направлен на исследование метилирования гена CDH13. Результат исследования не выявил аномального метилирования указанного гена.

С диагнозом: (С18) рак сигмовидной кишки T4N1M0 ст 3, гр 2, госпитализирован для оперативного лечения.

04.06.2015 г. выполнена операция - лапаротомия, при ревизии органов брюшной полости выявлена: опухоль сигмовидной кишки 8×6 см, прорастающая серозную оболочку, стенозирующая просвет кишки, забрюшинные лимфоузлы в плотном инфильтрате. Выполнена резекция сигмовидной кишки, попытка удаления забрюшинных лимфоузлов сопровождалась диффузным обильным кровотечением из инфильтрата, в связи с чем попытка удаления лимфоузлов прекращена.

Послеоперационный гистоанализ от 04.06.15 - слизеобразующая аденокарцинома толстой кишки, инвазия всех слоев; по линиям резекции опухоли нет; в лимфоузлах брыжейки метастазов нет.

Консультация химиотерапевта от 11.06.2015: учитывая отсутствие метастазов опухоли, химиотерапия не показана.

Послеоперационный диагноз: (С 18) рак сигмовидной кишки T4N0M0 ст 2, гр 3. В связи с неуточненным состоянием забрюшинных лимфоузлов больной находился под динамическим наблюдением, каждые 2-3 месяца выполнялось СРКТ и УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства. При наблюдении за больным в течение 9 месяцев патологии в брюшной полости и забрюшинном пространстве не выявлено.

Анализ представленного клинического случая также свидетельствует о возможности установления наличия или отсутствия метастатического поражения лимфоузлов с использованием исследования метилирования гена CDH13.

Под нашим наблюдением находилось 25 больных раком толстой кишки, которым дополнительно к гистологическому исследованию интраоперационного биопсийного материала, было выполнено исследование метилирования регуляторных участков гена CDH13. В итоге было установлено, что статистически достоверно чаще гиперметилирование данного маркера встречается при КРР с метастазами (χ2=7,5 при р<0,05), кроме того, гиперметилирование CDH13 в опухоли повышает риск метастазирования в 6 раз (OR=6,00; CI95% 1,56-23,11).

«Способ диагностики метастазов рака толстой кишки» позволяет идентифицировать рак толстой кишки с метастазами (в регионарные лимфоузлы и/или отдаленные лимфоузлы и органы), что способствует установлению правильного диагноза и определению правильной тактики лечения, а также будет способствовать улучшению результатов лечения больных раком толстой кишки. Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения диагноза до операционного вмешательства и дает возможность скорректировать тактику лечения в после операционном периоде; обладает высокой чувствительностью (86%), его осуществление возможно на материале, полученном во время диагностической биопсии, способ занимает менее 20 часов.

Похожие патенты RU2647470C2

название год авторы номер документа
Способ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки 2021
  • Кит Олег Иванович
  • Колесников Евгений Николаевич
  • Трифанов Владимир Сергеевич
  • Гвалдин Дмитрий Юрьевич
  • Мещерякова Милана Юрьевна
RU2771421C1
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ МЕТАСТАЗОВ В ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ 2018
  • Кит Олег Иванович
  • Солдатова Кристина Игоревна
  • Колесников Евгений Николаевич
  • Кутилин Денис Сергеевич
RU2686687C1
Способ дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов 2015
  • Водолажский Дмитрий Игоревич
  • Кутилин Денис Сергеевич
  • Тимошкина Наталья Николаевна
  • Гудуева Елена Николаевна
  • Двадненко Константин Владимирович
  • Геворкян Юрий Артушевич
  • Солдаткина Наталья Васильевна
RU2613139C1
Метод определения уровня метилирования промоторной области гена COL1A2 для диагностики рака толстой кишки 2015
  • Боярских Ульяна Александровна
  • Соколова Екатерина Алексеевна
  • Ширшова Арина Николаевна
  • Кель Александр Эдуардович
  • Филипенко Максим Леонидович
RU2612890C1
Способ определения продолжительности адъювантной химиотерапии при местно-распространенном колоректальном раке с метастазами в регионарные лимфоузлы после радикальных оперативных вмешательств 2015
  • Кит Олег Иванович
  • Геворкян Юрий Артушевич
  • Солдаткина Наталья Васильевна
  • Новикова Инна Арнольдовна
  • Шуликов Павел Борисович
RU2618405C1
Способ ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки при мониторинге течения заболевания 2023
  • Пономарева Анастасия Алексеевна
  • Тарасова Анна Сергеевна
  • Костромицкий Дмитрий Николаевич
  • Добродеев Алексей Юрьевич
  • Афанасьев Сергей Геннадьевич
  • Чердынцева Надежда Викторовна
RU2813653C1
Способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки 2015
  • Кит Олег Иванович
  • Геворкян Юрий Артушевич
  • Солдаткина Наталья Васильевна
  • Новикова Инна Арнольдовна
  • Водолажский Дмитрий Игоревич
  • Шуликов Павел Борисович
RU2613142C1
Способы скрининга рака 2012
  • Лай Хунчэн
RU2700088C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ САЙТОВ PuCGPy РЕГУЛЯТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ-ОНКОМАРКЕРОВ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА МЕТОДОМ GLAD-ПЦР-АНАЛИЗА И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА 2015
  • Абдурашитов Мурат Абдурашитович
  • Акишев Александр Григорьевич
  • Давидович Евгения Сергеевна
  • Дегтярев Сергей Харитонович
  • Дубинин Евгений Викторович
  • Евдокимов Алексей Альбертович
  • Кузнецов Виталий Викторович
  • Михеев Валерий Николаевич
  • Нетесова Нина Александровна
  • Сметанникова Наталья Анатольевна
  • Карпов Андрей Борисович
  • Тахауов Равиль Манихович
  • Сазонов Алексей Эдуардович
  • Халюзова Мария Вячеславовна
  • Альбах Елена Николаевна
  • Исубакова Дарья Сергеевна
RU2596404C1
Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка 2016
  • Кит Олег Иванович
  • Водолажский Дмитрий Игоревич
  • Кутилин Денис Сергеевич
  • Татимов Мартин Замирович
  • Маслов Андрей Александрович
RU2624505C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 647 470 C2

Реферат патента 2018 года Способ диагностики метастазов рака толстой кишки

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для диагностики метастазов рака толстой кишки. Из тканевых проб толстой кишки выделяют тотальную ДНК. Осуществляют бисульфитную конверсию препаратов ДНК и последующую амплификацию и пиросеквенирование. Используют высокоспецифичные праймеры для регуляторных последовательностей гена CDH13. Вычисляют медиану метилирования Met (%) CpG-сайтов. В случае превышения Met установленной нормы по генетическому локусу CDH13 подтверждают наличие метастазов. Изобретение обеспечивает создание эффективного способа выявления метастазов у больных раком толстой кишки, не требующего дополнительных инвазивных процедур. 2 табл., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 647 470 C2

Способ диагностики метастазов рака толстой кишки, включающий выделение тотальной ДНК из тканевых проб толстой кишки, бисульфитную конверсию препаратов ДНК и последующую амплификацию и пиросеквенирование, характеризующийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для регуляторных последовательностей гена CDH13, анализируют полученные данные и вычисляют медиану метилирования Met (%) CpG-сайтов, сравнивают Met с контрольными значениями установленной нормы и в случае превышения Met установленной нормы по генетическому локусу CDH13 подтверждают наличие метастазов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2647470C2

KONISHI K
et al
DNA methylation profiles of primary colorectal carcinoma and matched liver metastasis
PLoS One
Способ приготовления лака 1924
  • Петров Г.С.
SU2011A1
Способ приготовления лака 1924
  • Петров Г.С.
SU2011A1
Выбрасывающий ячеистый аппарат для рядовых сеялок 1922
  • Лапинский(-Ая Б.
  • Лапинский(-Ая Ю.
SU21A1
Найдено в Интернете: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22132162
WO 2013104990 A1, 18.07.2013
SILVA T.D
et al
DNA methylation as an epigenetic biomarker in colorectal cancer
Oncol Lett
Многоступенчатая активно-реактивная турбина 1924
  • Ф. Лезель
SU2013A1
Многоступенчатая активно-реактивная турбина 1924
  • Ф. Лезель
SU2013A1
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов 1921
  • Ланговой С.П.
  • Рейзнек А.Р.
SU7A1
Опухоль сигмовидной кишки
Прибор для получения стереоскопических впечатлений от двух изображений различного масштаба 1917
  • Кауфман А.К.
SU26A1
Найдено в Интернете: URL: https://www.no-onco.ru/opuxoli/rakovye-opuxoli/opuxol-sigmovidnoj-kishki.html.

RU 2 647 470 C2

Авторы

Кит Олег Иванович

Водолажский Дмитрий Игоревич

Тимошкина Наталья Николаевна

Двадненко Константин Владимирович

Солдаткина Наталья Васильевна

Геворкян Юрий Артушевич

Даты

2018-03-15Публикация

2016-04-21Подача