Способы скрининга рака Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/6886 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу III скрининга рака.

Уровень техники

Рак шейки матки является одной из основных причин смертности женщин во всем мире и на Тайване. По статистике Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2002 год, рак шейки матки является второй по значимости причиной смертности женщин от онкологических заболеваний во всем мире (после рака молочной железы). Периодический скрининг рака шейки матки является их лучшей профилактикой. В настоящее время существует два способа скрининга рака шейки матки. Одним из них является широко известный мазок по Папаниколау, другим - анализ на вирус папилломы человека (ВПЧ). Мазок по Папаниколау заключается во взятии образца со слизистой оболочки шейки матки и последующем изучении его под микроскопом для выявления злокачественных изменений в отдельных клетках эпителия, что позволяет выявлять рак шейки матки на ранней стадии. Анализ на ВПЧ выполняется методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) или гибридной ловушки для определения наличия в образце вируса папилломы человека (ВПЧ).

Однако для этого врачу необходимо взять образец (мазок), который будут анализировать и интерпретировать лаборанты/патоморфологи, к тому же довольно часто результаты оказываются ложноотрицательными, что приводит к задержке постановки диагноза и начала лечения предопухолевых изменений, поэтому требования к качеству работы кадров и затраты слишком высоки. Во многих развивающихся странах такие возможности трудно изыскать. С другой стороны, хотя анализ на ВПЧ и обладает высокой чувствительностью, существует высокая вероятность ложноположительного результата. В этом случае напрасными оказываются не только волнения пациентов, но и медицинские затраты на последующее наблюдение за этими пациентами. В связи с этим актуальным остается вопрос, как повысить точность и удобство методов скрининга рака шейки матки, чтобы популяризовать скрининг рака шейки матки.

Делеции в геноме считаются важным фактором образования опухолей. Люди привыкли считать, что в основе генетического кода лежат перестановки и комбинации четырех оснований. Еще в 1975 году А. Кнудсон предложил гипотезу двух ударов, подчеркивая, что некоторые мутации и делеции, возникающие в гомологичных копиях генов-супрессоров опухолей, могут или склонны вызывать рак. Однако на фенотип также может влиять другая информация, которую может нести модифицированное основание 5-метилцитозин. Было установлено, что 5-метилцитозин присутствует в палиндромной последовательности 5'-CpG-3' в клетках млекопитающих. В клетках млекопитающих помимо участков ДНК, называемых CpG-островками, большинство пар динуклеотидов CpG метилированы. CpG-островки - это участки ДНК размером до 1000 пар оснований (1 Кб), содержащие большое количество кластеров GC и CpG. Как правило, они располагаются вблизи генов и окружают промоторы генов с широкой экспрессией. Метилирование цитозина происходит после синтеза ДНК и заключается в переносе метильной группы от донора метильной группы S-аденозилметионина (SAM) на пятый атом углерода в молекуле цитозина. Эта ферментативная реакция катализируется ДНК-метилтрансферазами(ОММТ). DNMT1 является основной метилтрансферазой млекопитающих, отвечает за превращение полуметилированных сайтов в полностью метилированные и, таким образом, поддерживает метилирование. В то же время DNMT3A и DNMT3B отвечают за метилирование новых сайтов, то есть метилирование de novo.

Известно, что потеря метилирования в CpG динуклеотидных парах приводит к низкому уровню метилирования, что является основной эпигенетической аномалией опухолевых клеток. Однако исследования последних лет указывают на то, что сайт-специфическое гиперметилирование (например, в некоторых генах-супрессорах опухолей) связано с потерей функции гена. Это может дать селективные преимущества в процессе формирования опухоли. Гиперметилирование CpG-островков в промоторной области способно вызывать ремоделирование хроматина за счет подавления экспрессии гена с одновременной модификацией гистонов. Помимо делеции хромосом и генетических мутаций эпигенетическое подавление экспрессии генов-супрессоров опухолей, вызванное гиперметилированием промотора, также распространено в опухолевых клетках человека.

Результаты недавно проведенных исследований в области эпидемиологии указывают на то, что существует взаимосвязь между концентрацией фолиевой кислоты (основного источника метильной группы) в сыворотке крови и инфицированием и клиренсом ВПЧ. Также сообщалось, что в метаболизме метильного цикла генетический полиморфизм ферментов связан с возникновением изменений в эпителии шейки матки. Подобно концепции эволюции супергена, исследования взаимосвязи между метилированием ДНК и раком шейки матки выходят на первый план. Количество исследований метилирования ДНК при раке шейки матки со временем увеличивается, что свидетельствует о возможности использовать метилирование для скрининга рака шейки матки. Поскольку гены взаимодействуют с окружающей средой, уровень метилирования генов-супрессоров опухолей варьирует у различных генов и в различных популяциях. Различные заболевания могут иметь различные метиляторные фенотипы. Однако метиляторный фенотип рака шейки матки и взаимосвязь с ВПЧ пока не изучены. Какие именно гены подвергнутся метилированию при раке шейки матки и сколько генов нужно изучить для удовлетворения потребностей клинической практики на эти вопросы предстоит найти ответы в будущем.

Исходя из вышеизложенного, существующие на данный момент способы скрининга рака шейки матки имеют ряд существенных недостатков и нуждаются в усовершенствовании.

Авторы настоящей заявки подали соответствующие заявки на выдачу патента на Тайване (TW Pat. Pub. No. 200831900, TW Pat. Pub. No. 201038739), в Китае (CN Appl. No. 200810094659.2, CN Appl. No. 200910135501.X), Малайзии (UI 20085354) и США (US Pat. Pub. No. 20080311570, US Pat. Pub. No. 20110045465) (здесь и далее именуемые предшествующие заявки). Заявка на способ III скрининга рака является продолжением предшествующих заявок. Авторы настоящей заявки обнаружили новые биомаркеры для скрининга рака и способы скрининга.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание способа скрининга рака шейки матки, который будет применяться в качестве скрининга первой линии для рака шейки матки.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является создание способа скрининга рака шейки матки. Данный способ может применяться в диагностике рака шейки матки в качестве скрининга не только первой, но и второй линии, чтобы облегчить проведение анализа на ВПЧ или интерпретацию сомнительных результатов мазка и тем самым добиться более точных результатов скрининга рака шейки матки.

Другой дополнительной задачей настоящего изобретения является создание способа скрининга рака. Помимо скрининга рака шейки матки способ может применяться для скрининга других видов рака (таких как рак яичников, печени, толстой кишки, молочных желез, полости рта и эндометрия, а также саркома), чтобы упростить выявление образца с отклонениями от нормы.

Способ скрининга рака, позволяющий реализовать вышеперечисленные задачи настоящего изобретения, заключается в детектировании статуса метилирования целевого гена в клетках образца для детектирования. Детектирование является скрининговым показателем наличия или отсутствия рака. Способ включает в себя следующие этапы:

этап 1: обеспечение образца для детектирования;

этап 2: детектирование статуса метилирования последовательности CpG хотя бы в одном целевом гене, которыми являются ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR, SOX17 и SYT9 в геномной ДНК образца;

этап 3: определение наличия в образце рака или предопухолевых изменений по статусу метилирования целевого гена или использование статуса метилирования в качестве прогностического индикатора после лечения.

Образцом для детектирования является мазок по Папаниколау, ткани опухолей яичников, асцитическая жидкость, кровь, моча, кал, мокрота, клетки слизистой оболочки полости рта, желудочный сок, желчь, клетки эпителия шейки матки или ткани опухоли после хирургического вмешательства.

Способ детектирования статуса метилирования последовательности CpG целевого гена представляет собой в том числе, но не только специфичную для метилирования полимеразную цепную реакцию (мет-ПЦР), специфичную для метилирования количественную полимеразную цепную реакцию (мет-кПЦР), бисульфитное секвенирование (БС), микроматричный анализ, масс-спектрометрию, денатурирующую высокоэффективную жидкостную хроматографию (дВЭЖХ).

Целевой ген ADRA1D имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 1.

Целевой ген AJAP1 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 2.

Целевой ген HS3ST2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 3.

Целевой ген MAGI2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 4.

Целевой ген POU4F2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 5.

Целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6.

Целевой ген PTGDR имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 7.

Целевой ген S0X17 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 8.

Целевой ген SYT9 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 9.

Статус метилирования целевого гена ADRA1D детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 10-11.

Статус метилирования целевого гена AJAP1 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 12-13.

Статус метилирования целевого гена HS3ST2 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 14-15.

Статус метилирования целевого гена MAGI2 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 16-17.

Статус метилирования целевого гена POU4F2 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 18-19.

Статус метилирования целевого гена POU4F3 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 20-21.

Статус метилирования целевого гена PTGDR детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 22-23.

Статус метилирования целевого гена S0X17 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 24-25.

Статус метилирования целевого гена SYT9 детектируется парами праймеров с последовательностями нуклеотидов по SEQ ID NO: 26-27.

Праймеры содержат последовательности, которые не менее чем на 80% идентичны, комплементарны или имеют не менее 10 последовательных нуклеотидов, идентичных последовательностям соответствующих генов.

Кроме того, вышеуказанные скрининговые маркеры и способ скрининга могут также применяться для скрининга рака шейки матки, яичников, печени, толстой кишки, молочных желез, полости рта и эндометрия, а также саркомы.

Термин "образец для детектирования" означает пробу in vitro для детектирования. Проба включает в себя пробу in vitro образца мазка по Папаниколау, асцитической жидкости, крови, мочи, кала, мокроты, клеток слизистой оболочки полости рта, желудочного сока, желчи, клеток эпителия шейки матки или тканей опухоли после хирургического вмешательства. Способ скрининга рака по настоящему изобретению применяется для детектирования статуса метилирования целевых генов в клетках проб in vitro и может служить скрининговы м индикатором различных разновидностей рака. Способ скрининга рака и скрининговые маркеры по настоящему изобретению могут применяться исследователями для проведения скрининга в лаборатории.

Термин "ген-индикатор" означает целевой ген, в котором последовательности CpG метилированы. Статус метилирования целевого гена в клетках образца для детектирования детектируется и применяется в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака.

Способ скрининга рака по настоящему изобретению имеет следующие преимущества по сравнению с вышеописанным известным уровнем техники:

1. Способ скрининга рака по настоящему изобретению подразумевает применение уровня метилирования специфических генов в образце in vitro в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака. По сравнению с мазком по Папаниколау и анализом на ВПЧ способ скрининга рака по настоящему изобретению обладает более высокими уровнями чувствительности и специфичности.

2. Способ скрининга рака по настоящему изобретению, помимо детектирования рака шейки матки, может применяться для скрининга других видов рака (таких как рак яичников, печени, толстой кишки, молочных желез, полости рта и эндометрия, а также саркома), чтобы упростить выявление образца с отклонениями от нормы.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан результат определения уровня метилирования целевого гена ADRA1D, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) печени; (D) толстой кишки; (Е) молочной железы; (F) полости рта.

На фиг. 2 показан результат определения уровня метилирования целевого гена AJAP1, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) толстой кишки; (D) молочной железы; (Е) полости рта; (F) эндометрия.

На фиг. 3 показан результат определения уровня метилирования целевого гена HS3ST2, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) толстой кишки; (D) молочной железы; (Е) полости рта; (F) эндометрия.

На фиг. 4 показан результат определения уровня метилирования целевого гена MAGI2, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) толстой кишки; (D) молочной железы; (Е) полости рта; (F) эндометрия; (G) саркомы.

На фиг. 5 показан результат определения уровня метилирования целевого гена POU4F2, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) печени; (D) толстой кишки; (Е) молочной железы; (F) полости рта; (G) эндометрия.

На фиг. 6 показан результат определения уровня метилирования целевого гена POU4F3, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) толстой кишки; (D) молочной железы; (Е) эндометрия; (F) саркомы.

На фиг. 7 показан результат определения уровня метилирования целевого гена PTGDR, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) яичников; (С) печени; (D) молочной железы; (Е) полости рта; (F) эндометрия.

На фиг. 8 показан результат определения уровня метилирования целевого гена SOX17, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (B) печени; (С) толстой кишки; (D) молочной железы.

На фиг. 9 показан результат определения уровня метилирования целевого гена SYT9, используемого по способу скрининга рака по настоящему изобретению, методом бисульфитного секвенирования (БС) в различных образцах нормальных тканей и тканей опухоли: (А) шейки матки; (В) печени; (C) толстой кишки; (D) молочной железы; (Е) полости рта; (F) эндометрия.

Осуществление изобретения Настоящее изобретение будет проиллюстрировано нижеуказанными примерами. Однако эти примеры приводятся только в качестве иллюстрации и не должны быть истолкованы как ограничения настоящего изобретения.

Пример 1: Материалы и методы

1. Материалы

Анализируемые материалы включают интактные образцы ткани шейки матки с патологическими изменениями, в том числе плоскоклеточной карциномы (ПКК)и аденокарциномы (АК), и образцы нормальной ткани шейки матки. Все образцы ткани шейки матки (ПКК+АК, n=20; норма, n=20), яичников (рак яичников, n=19; норма, n=14), толстой кишки (3Н толстой кишки, n=18; норма, n=18), печени (гепатоцеллюлярная карцинома, n=18; норма, n=18), полости рта (3Н полости рта, n=20; норма, n=19), эндометрия (3Н эндометрия, n=20; норма, n=20), молочной железы (3Н молочной железы, n=17; норма, n=17), саркомы (саркома, n=18; норма, n=16) получены в Многопрофильной больнице Три-Сервис г. Тайбэй. Геномную ДНК каждого образца выделяли с применением набора QIAamp DNA kit, затем набора DNA modification kit (CpGenome™ DNA Modification Kit, производитель - Millipore, г. Темекула, штат Калифорния, США) для проведения бисульфитной модификации для анализа метилирования ДНК всего генома. 2. Анализ метилирования ДНК с использованием чипа для анализа метилирования всего генома (Infinium HumanMethylation27 BeadChip компании Illumina)

Выделяли ДНК из образцов опухолевых и нормальных тканей, соответственно. Подвергали выделенную ДНК бисульфитной модификации, доводили концентрацию продуктов до одинакового уровня (нг/мкл). Перемешивали ДНК опухолевой ткани или ДНК нормальной ткани, имеющие одинаковую концентрацию, для получения двух образцов для детектирования и анализировали уровень метилирования всего генома с помощью чипа Infinium HumanMethylation27 (производитель - Illumina, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США). Этапы эксперимента выполняли согласно указаниям производителя. Анализировали уровень метилирования генов на каждом чипе с помощью сканера чипов (считывателя микропланшет Illumina BeadArray Reader) и программного обеспечения GenomeStudio (производитель -Illumina).

Чип для анализа метилирования Infinium HumanMethylation27 содержит 14 475 генов и способен определять уровень метилирования 27 578 CpG-сайтов в этих генах. Анализ уровня метилирования CpG-сайтов представляется в виде "β-значений", β-значение каждого CpG-сайта составляет от 0 до 1, где 0 соответствует отсутствию метилирования, а 1 соответствует 100% метилированию.

3. Бисульфитная модификация, специфичная для метилирования количественная полимеразная цепная реакция (мет-кПЦР) и пиросеквенирование

Использовали набор для модификации ДНК (CpGenome™ DNA Modification Kit, производитель - Millipore, г. Темекула, штат Калифорния, США) для проведения бисульфитной модификации: брали образец геномной ДНК массой 1 мкг и выполняли химическую модификацию геномной ДНК бисульфитом натрия. В случае одноцепочечной ДНК весь неметилированный цитозин дезаминируется и преобразуется в урацил. Метилированный цитозин не подвергается модификации и остается в виде 5-метилцитозина. Наконец, растворяли образец ДНК после реакции в 70 мкл ТАЕ буфера с температурой 55°С для проведения специфичной для метилирования количественной ПЦР.

Применяли нормальную ДНК периферической крови человека для бисульфитной модификации, а также в качестве контроля, содержащего неметилированную последовательность промотора.

Применяли праймеры и зонды мет-кПЦР для проведения специфичной для метилирования количественной ПЦР образца массой 1 мкг геномной ДНК, модифицированной бисульфитом, и контрольной ДНК. Праймеры и зонды мет-кПЦР специфично распознают метилированную последовательность гена. Последовательности праймеров и зондов мет-кПЦР для каждого целевого гена указаны в табл. 1. Общий объем продукта специфичной для метилирования количественной ПЦР составляет 20 мкл, в том числе 1 мкл модифицированной матричной ДНК, 250 нмоль каждого праймера, 225 нмоль флуоресцентного зонда и смесь в двукратном буфере 2Х FastStart Universal Probe Master (Rox) (производитель - Roche). Смешанные реагенты помещали в систему ABI 7900НТ для проведения "быстрой" ПЦР в реальном времени. Вначале выполняли предварительную денатурацию при 95°С в течение 10 минут, затем денатурацию при 95°С в течение 15 секунд, отжиг при 60°С и синтез в течение 1 минуты, что составляло один цикл. Этапы денатурации, отжига и синтеза повторяли 45 циклов. Количественный анализ данных метилирования выполняли с помощью программного обеспечения SDS 2.3, установив порог=0,128 и базовую линию от 3 до 15. На основании формулы расчета индекса метилирования (мет-индекса): [100,002]([(пороговый цикл СOL2А)-(пороговый цикл Гена)]), подвергали данные внутреннего контрольного образца гена COL2A и количественные данные специфичных для метилирования генов вычислениям для определения уровня метилирования целевых генов в образцах.

Вид праймера, обозначенный буквой М, соответствует праймеру, который можетспецифично распознавать метилированные последовательности генов.

Цель применения пиросеквенирования для анализа фрагмента целевого гена заключается в том, чтобы точно определить в количественной форме выраженный в процентах уровень метилирования CpG-сайтов целевых генов. Перед проведением пиросеквенирования необходимо использовать программное обеспечение PyroMark Assay Design 2.0 (производитель - QIAGEN), чтобы выполнить дизайн праймеров для маркера биотина. Использовали методамплификации фрагмента гена с помощью ПЦР для CpG-сайтов целевых генов, затем проводили пиросеквенирование, чтобы определить выраженный в процентах уровень метилирования CpG-сайтов целевых генов. Вначале добавляли модифицированную бисульфитом ДНК клеток ПАП-мазка или образца ткани к парам праймеров, меченых биотином, и реакционному раствору для ПЦР из набора PyroMark PCR kit (производитель - QIAGEN). После амплификации целевого фрагмента гена с помощью ПЦР использовали 2,0%-ный агаровый гель для проверки правильности амплифицированного фрагмента. Выполняли очистку и денатурацию образца ДНК в станции вакуумной пробоподготовки PyroMark Q24 Vacuum Workstation (производитель - QIAGEN). После добавления секвенирующих праймеров выполняли пиросеквенирование и анализ метилирования в системе PyroMark Q24 (производитель - QIAGEN).

Пример 2: Скрининг метилированных целевых генов Выполняли скрининг 14 475 генов, используя чипы для анализа метилирования Infinium HumanMethylation27K.

(1) Отбирали гены с наиболее высокой скоростью метилирования (β-значение >0,4 и <0,4), составляли базу данных экспрессии генов (GE07803) и выполняли анализ насыщения генов (DAVID база данных для аннотации, визуализации и интегрированных исследований). Было отобрано 92 гена;

(2) Клетки опухолевых линий обрабатывали 5-азацитидином и трихостатином А. Анализировали 92 гена методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией, чтобы подтвердить, что на экспрессию генов влияет метилирование. Остался 61 ген;

(3) Перемешали образцы для детектирования и с помощью мет-ПЦР анализировали метилирование ДНК в 61 гене. Осталось 26 генов;

(4) Анализировали метилирование ДНК в образцах опухолей для 26 генов с помощью мет-ПЦР. Остался 21 ген;

(5) Анализировали метилирование ДНК в тканях опухолей для 21 гена с помощью мет-ПЦР. Осталось 16 генов;

(6) Анализировали метилирование ДНК в образцах опухолей для 16 генов с помощью мет-кПЦР. Осталось 14 генов.

Подтверждали статус метилирования генов пиросеквенированием. Отобранные в итоге девять целевых генов могут иметь высокий уровень метилирования в опухолевых клетках. Этими генами являются ADRA1D (SEQ ID No: 1), AJAP1 (SEQ ID No: 2), HS3ST2 (SEQ ID No: 3), MAG 12 (SEQ ID No: 4), POU4F2 (SEQ ID No: 5), POU4F3 (SEQ ID No: 6), PTGDR (SEQ ID No: 7), SOX17 (SEQ ID No: 8) и SYT9 (SEQ ID No: 9). Подробная информация приведена в табл.3. Из табл.3 можно узнать, что хотя известна взаимосвязь гена HS3ST2 с раком толстой кишки и молочной железы, а генов POU4F2 и SOX17 - с раком молочной железы и печени, существует мало исследований, демонстрирующих взаимосвязь этих генов с раком шейки матки и другими видами рака.

Пример 3: Анализ метилирования целевых генов в образцах рака шейки матки Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования девяти целевых генов в образцах плоскоклеточной карциномы шейки матки. Результаты показывают уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR, SOX17 и SYT9 в нормальных образцах с шейки матки (N) (медиана составила 0;34; 0,18; 0,19; 2,58; 7,62; 0,77; 0,16; 0,17 и 0,31 соответственно) и уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR, SOX17 и SYT9 в образцах рака шейки матки (Т) (медиана составила 911,37; 1558,97; 1088,65; 713,92; 535,01; 1552,71; 305,84; 248,29 и 551,84 соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,0001. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 1(A), фиг. 2(A), фиг. 3(A), фиг. 4(A), фиг. 5(A), фиг. 6(A), фиг. 7(A), фиг. 8(A) и фиг. 9(A).

Пример 4: Анализ метилирования целевых генов в образцах новообразований яичников

Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования семи целевых генов в образцах новообразований яичников. Результаты показывают уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3 и PTGDR в образцах доброкачественных новообразований яичников (N) (медиана составила 4,25; 5,19; 0,00; 10,91; 2,06; 3,60 и 1,57 соответственно) и уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3 и PTGDR в образцах рака яичников (Т) (медиана составила 13,62; 10,76; 114,38; 33,08; 4,28; 21,97 и 28,40 соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0.05. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 1(B), фиг. 2(B), фиг. 3(B), фиг. 4(B), фиг. 5(B), фиг. 6(B) и фиг. 7(B). Пример 5: Анализ метилирования целевых генов в образцах рака печени

Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования пяти целевых генов в образцах рака печени. Результаты показывают уровень метилирования генов ADRA1D, POU4F2, PTGDR, SOX17 и SYT9 в образцах нормальных тканей печени (N) (медиана составила 35,29; 6,25; 49,30; 20,15 и 19,70 соответственно) и уровень метилирования генов ADRA1D, POU4F2, PTGDR, SOX17 и SYT9 в образцах рака печени (Т) (медиана составила 202,10; 53,73; 275,76; 111,25 и 154,65 соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,0001. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 1(C), фиг. 5(C), фиг. 7(C), фиг. 8(B) и фиг. 9(B).

Пример 6: Анализ метилирования целевых генов в образцах рака толстой кишки

Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования восьми целевых генов в образцах рака толстой кишки. Результаты показывают уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, SOX17 и SYT9 в образцах нормальных тканей толстой кишки (N) (медиана составила 59,21; 228,97; 292,95; 123,44; 591,64; 249,72; 80,12 и 52,63 соответственно) и уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, SOX17 и SYT9 в образцах рака толстой кишки (Т) (медиана составила 83,47; 2312,91; 2301,12; 799,41; 1615,48; 1058,53; 751,06 и 601,65 соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,05. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 1(D), фиг. 2(C), фиг. 3(C), фиг. 4(C), фиг. 5(D), фиг. 6(C), фиг. 8(C) и фиг. 9(C).

Пример 7: Анализ метилирования целевых генов в образцах рака молочной железы Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования девяти целевых генов в образцах рака молочной железы. Результаты показывают уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR, SOX17 и SYT9 в образцах нормальных тканей молочной железы (N) (медиана составила 11,78; 22,28; 112,81; 24,55; 30,23; 31,29; 43,64; 12,02 and 5,53, соответственно) и уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR, SOX17 и SYT9 в образцах рака молочной железы (Т) (медиана составила 57,19; 260,96; 281,64; 193,70; 77,06; 310,34; 341,97; 77,05 и 25,24 соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,01. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 1(E), фиг. 2(D), фиг. 3(D), фиг. 4(D), фиг. 5(E), фиг. 6(D), фиг. 7(D), фиг. 8(D) и фиг. 9(D).

Пример 8: Анализ метилирования целевых генов в образцах рака полости рта

Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования семи целевых генов в образцах рака полости рта. Результаты показывают уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR и SYT9 в образцах нормальных тканей полости рта (N) (медиана составила 10,25; 0,0065; 115,98; 0,00; 30,23; 10,47 и 0,00 соответственно) и уровень метилирования генов ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR и SYT9 в образцах рака полости рта (Т) (медиана составила 26,44; 0,0107; 381,49; 54,59; 77,06; 32,78 и 10,85, соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,05. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 1(F), фиг. 2(E), фиг. 3(E), фиг. 4(E), фиг. 5(F), фиг. 7(E) и фиг. 9(E).

Пример 9: Анализ метилирования целевых генов в образцах рака эндометрия

Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования семи целевых генов в образцах рака эндометрия. Результаты показывают уровень метилирования генов AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR и SYT9 в образцах нормальных тканей эндометрия (N) (медиана составила 0,00; 0,00; 0,00; 16,42; 0,31; 0,00 и 0,63 соответственно) и уровень метилирования генов AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, POU4F3, PTGDR и SYT9 в образцах рака эндометрия (Т) (медиана составила 535,78; 1456,23; 504,15; 248,83; 89,86; 148,19 и 0,43, соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,05. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 2(F), фиг. 3(F), фиг. 4(F), фиг. 5(G), фиг. 6(E), фиг. 7(F) и фиг. 9(F).

Пример 10: Анализ метилирования целевых генов в образцах саркомы

Применяли специфичную для метилирования ПЦР (мет-ПЦР) для анализа статуса метилирования двух целевых генов в образцах саркомы. Результаты показывают уровень метилирования генов MAGI2 и POU4F3 в образцах доброкачественных сарком (N) (медиана составила 0,00 и 0,31 соответственно) и уровень метилирования генов MAGI2 и POU4F3 в образцах злокачественных сарком (Т) (медиана составила 5,20 и 89,86 соответственно). После применения критерия Манна-Уитни значимость различий между данными двух групп достигла Р<0,05. Различия являются статистически достоверными. Вышеописанное показано на фиг. 4(G) и фиг. 6(F).

Вышеуказанные подробные описания являются частными случаями осуществления настоящего изобретения. Однако примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Эквивалентная практика или изменения, которые не отклоняются от настоящего изобретения, такие как изменение способа определения уровня метилирования каждого целевого гена в образце для детектирования и эквивалентных образцах, должны входить в объем изобретения.

Группа изобретений относится к способам скрининга рака, такого как рак шейки матки, рак яичников, рак толстой кишки, рак эндометрия, саркома, рак молочной железы. Способы включают следующие этапы: предоставление образца для детектирования; детектирование статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 в геномной ДНК образца, где статус метелирования детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, и необязательно детектирование статуса метилирования последовательности CpG в по крайней мере одном гене, выбранном из ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR, SOX17 и SYT9, в геномной ДНК образца; определение наличия в образце рака или предопухолевых изменений по гиперметилированию целевого гена. Изобретения позволяют детектировать рак шейки матки, рак яичников, толстой кишки, молочных желез, эндометрия, а также саркому с высокими уровнями чувствительности и специфичности, что упрощает выявление образца с отклонениями от нормы. 6 н. и 25 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 10 пр.

1. Способ скрининга рака шейки матки, включающий детектирование статуса метилирования целевого гена в клетках образца для детектирования в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака шейки матки, отличающийся тем, что он включает в себя сначала обеспечение образца для детектирования, затем проведение детектирования статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 и необязательно в по крайней мере одном гене, выбранном из ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR, SOX17 и SYT9 в геномной ДНК образца, где статус метелирования целевого гена POU4F3 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, и после этого определение наличия в образце рака шейки матки или предопухолевых изменений шейки матки по гиперметилированию целевого гена.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцом для детектирования является мазок по Папаниколау, кровь, моча, клетки эпителия шейки матки или in vitro образец ткани опухоли после хирургического вмешательства.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцом для детектирования является мазок по Папаниколау с отклонениями от нормы.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцом для детектирования является образец клеток эпителия шейки матки с положительным результатом анализа на вирус папилломы человека.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена осуществляют в специфичной для метилирования полимеразной цепной реакции, специфичной для метилирования количественной полимеразной цепной реакции, бисульфитном секвенировании, микроматричномй анализе, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии или пиросеквенировании.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой ген ADRA1D имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 1; целевой ген AJAP1 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 2; целевой ген HS3ST2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 3; целевой ген MAGI2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 4; целевой ген POU4F2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 5; целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6; целевой ген PTGDR имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 7; целевой ген SOX17 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 8; целевой ген SYT9 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 9.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что статус метилирования целевого гена ADRA1D детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 10-11, статус метилирования целевого гена AJAP1 детектируют парой праймеров, имеющими последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 12-13; статус метилирования целевого гена HS3ST2 детектируют парой праймеров, имеющими последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 14-15; статус метилирования целевого гена MAGI2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 16-17; статус метилирования целевого гена POU4F2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 18-19; статус метилирования целевого гена PTGDR детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 22-23; статус метилирования целевого гена SOX17 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 24-25; статус метилирования целевого гена SYT9 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 26-27.

8. Способ скрининга рака яичников, включающий детектирование статуса метилирования целевого гена в клетках образца в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака яичников, отличающийся тем, что он включает в себя сначала обеспечение образца для детектирования, затем проведение детектирования статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 и необязательно в по крайней мере одном гене, выбранном из ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR в геномной ДНК образца, где статус метелирования целевого гена POU4F3 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, после этого определение наличия в образце рака яичников по гиперметилированию целевого гена.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что образцом для детектирования является ткань новообразования яичников, асцитическая жидкость, кровь, моча или in vitro образец ткани опухоли после хирургического вмешательства.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена осуществляют в специфичной для метилирования полимеразной цепной реакции, специфичной для метилирования количественной полимеразной цепной реакции, бисульфитном секвенировании, микроматричном анализе, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии или пиросеквенировании.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что целевой ген ADRA1D имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 1; целевой ген AJAP1 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 2; целевой ген HS3ST2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 3; целевой ген MAGI2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 4; целевой ген POU4F2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 5; целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6; целевой ген PTGDR имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 7.

12. Способ по п. 8, отличающийся тем, что статус метилирования целевого гена ADRA1D детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 10-11; статус метилирования целевого гена AJAP1 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 12-13; статус метилирования целевого гена HS3ST2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 14-15; статус метилирования целевого гена MAGI2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 16-17; статус метилирования целевого гена POU4F2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 18-19; статус метилирования целевого гена PTGDR детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 22-23.

13. Способ скрининга рака толстой кишки, включающий детектирование статуса метилирования целевого гена в клетках образца в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака толстой кишки, отличающийся тем, что он включает в себя сначала обеспечение образца для детектирования, затем проведение детектирования статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 и необязательно в по крайней мере одном гене, выбранном из ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, SOX17 и SYT9 в геномной ДНК образца, где статус метелирования целевого гена POU4F3 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, и после этого определение наличия в образце рака толстой кишки или предопухолевых изменений толстой кишки по гиперметилированию целевого гена.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что образцом для детектирования является ткань толстой кишки, асцитическая жидкость, кровь, моча, кал или in vitro образец ткани опухоли после хирургического вмешательства.

15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена осуществляют в специфичной для метилирования полимеразной цепной реакции, специфичной для метилирования количественной полимеразной цепной реакции, бисульфитном секвенировании, микроматричном анализе, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии или пиросеквенировании.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что целевой ген ADRA1D имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 1; целевой ген AJAP1 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 2; целевой ген HS3ST2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 3; целевой ген MAGI2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 4; целевой ген POU4F2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 5; целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6; целевой ген SOX17 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 8; целевой ген SYT9 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 9.

17. Способ по п. 13, отличающийся тем, что статус метилирования целевого гена ADRA1D детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 10-11; статус метилирования целевого гена AJAP1 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 12-13; статус метилирования целевого гена HS3ST2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 14-15; статус метилирования целевого гена MAGI2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 16-17; статус метилирования целевого гена POU4F2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 18-19; статус метилирования целевого гена SOX17 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 24-25; статус метилирования целевого гена SYT9 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 26-27.

18. Способ скрининга рака эндометрия, включающий детектирование статуса метилирования целевого гена в клетках образца в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака эндометрия, отличающийся тем, что он включает в себя сначала обеспечение образца для детектирования, затем проведение детектирования статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 и необязательно в по крайней мере одном гене, выбранном из AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR и SYT9 в геномной ДНК образца, где статус метелирования целевого гена POU4F3 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, и после этого определение наличия в образце рака эндометрия по гиперметилированию целевого гена.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что образцом для детектирования является кровь, моча, смывы из влагалища, менструальные выделения, ткани, полученные при дилатации и кюретаже матки или in vitro образец ткани опухоли после хирургического вмешательства.

20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена осуществляют в специфичной для метилирования полимеразной цепной реакции, специфичной для метилирования количественной полимеразной цепной реакции, бисульфитном секвенировании, микроматричном анализе, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии или пиросеквенировании.

21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что целевой ген AJAP1 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 2; целевой ген HS3ST2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 3; целевой ген MAGI2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 4; целевой ген POU4F2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 5; целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6; целевой ген PTGDR имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 7; целевой ген SYT9 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 9.

22. Способ по п. 18, отличающийся тем, что статус метилирования целевого гена AJAP1 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 12-13; статус метилирования целевого гена HS3ST2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 14-15; статус метилирования целевого гена MAGI2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 16-17; статус метилирования целевого гена POU4F2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 18-19; статус метилирования целевого гена PTGDR детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 22-23; статус метилирования целевого гена SYT9 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 26-27.

23. Способ скрининга саркомы, включающий детектирование статуса метилирования целевого гена в клетках образца в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия саркомы; отличающийся тем, что он включает в себя сначала обеспечение образца для детектирования, затем проведение детектирования статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 и необязательно в гене MAGI2 в геномной ДНК образца, где статус метелирования целевого гена POU4F3 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, и после этого определение наличия в образце саркомы по гиперметилированию целевого гена.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что образцом для детектирования является кровь, моча или in vitro образец ткани опухоли после хирургического вмешательства.

25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена осуществляют в специфичной для метилирования полимеразной цепной реакции, специфичной для метилирования количественной полимеразной цепной реакции, бисульфитном секвенировании, микроматричном анализе, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии или пиросеквенировании.

26. Способ по п. 23, отличающийся тем, что целевой ген MAGI2 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 4; целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6.

27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что статус метилирования целевого гена MAGI2 детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 16-17.

28. Способ скрининга рака молочной железы, включающий детектирование статуса метилирования целевого гена в клетках образца в качестве скринингового показателя наличия или отсутствия рака молочной железы, отличающийся тем, что он включает в себя сначала обеспечение образца для детектирования, затем детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена POU4F3 в геномной ДНК образца, с использованием пары праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 20-21 и необязательно детектирование статуса метилирования последовательности CpG в по крайней мере одном гене, выбранном из ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR, SOX17 и SYT9 в геномной ДНК образца, и после этого определение наличия в образце рака молочной железы по гиперметилированию целевого гена.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что образцом для детектирования является кровь, моча, грудное молоко, выделения из молочных желез, киста, пунктат или биоптат или in vitro образец ткани опухоли после хирургического вмешательства.

30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что детектирование статуса метилирования последовательности CpG целевого гена осуществляют в специфичной для метилирования полимеразной цепной реакции, специфичной для метилирования количественной полимеразной цепной реакции, бисульфитном секвенировании, микроматричном анализе, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии или пиросеквенировании.

31. Способ по п. 28, отличающийся тем, что целевой ген POU4F3 имеет последовательность нуклеотидов по SEQ ID NO: 6.