Способ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки Российский патент 2022 года по МПК G01N33/574 C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2771421C1

Изобретение относится к медицине, а именно к области генетики и молекулярной онкологии, и касается способа прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки.

Нейроэндокринные новообразования толстой кишки представляют собой группу опухолей с различными клинико-патологическими характеристиками (Tirosh A, Killian JK, Petersen D, Zhu YJ, Walker RL, Blau JE, Nilubol N, Patel D, Agarwal SK, Weinstein LS, Meltzer P, Kebebew E. Distinct DNA Methylation Signatures in Neuroendocrine Tumors Specific for Primary Site and Inherited Predisposition. J Clin Endocrinol Metab. 2020 Oct 1;105(10):dgaa477. doi: 10.1210/clinem/dgaa477. PMID: 32706863; PMCID: PMC7456345). Как в Российской Федерации, так и зарубежом, в области НЭН толстой кишки до сих не проводилось масштабных эпигенетических и молекулярно-генетических исследований. Тем не менее со стороны клиницистов интерес к данной группе неоплазий не ослабевает (Lakis V, Lawlor RT, Newell F, Patch AM, Mafficini A, Sadanandam A, Koufariotis LT, Johnston RL, Leonard C, Wood S, Rusev B, Corbo V, Luchini C, Cingarlini S, Landoni L, Salvia R, Milella M, Chang D, Bailey P, Jamieson NB, Duthie F, Gingras MC, Muzny DM, Wheeler DA, Gibbs RA, Milione M; APGI; ARC-Net, Pederzoli P, Samra JS, Gill AJ, Johns AL, Pearson JV, Biankin AV, Grimmond SM, Waddell N, Nones K, Scarpa A. DNA methylation patterns identify subgroups of pancreatic neuroendocrine tumors with clinical association. Commun Biol. 2021 Feb 3;4(1):155. doi: 10.1038/s42003-020-01469-0. PMID: 33536587; PMCID: PMC7859232). В отсутствии специфических лабораторных биомаркеров сложность составляет прогнозирование клинического течения НЭН толстой кишки, выбор тактики лечения (Della Monica R, Cuomo M, Visconti R, di Mauro A, Buonaiuto M, Costabile D, De Riso G, Di Risi T, Guadagno E, Tafuto R, Lamia S, Ottaiano A, Cappabianca P, Del Basso de Caro ML, Tatangelo F, Hench J, Frank S, Tafuto S, Chiariotti L. Evaluation of MGMT gene methylation in neuroendocrine neoplasms. Oncol Res. 2021 May 20. doi: 10.3727/096504021X16214197880808. Epub ahead of print. PMID: 34016221; Colao A, de Nigris F, Modica R, Napoli C. Clinical Epigenetics of Neuroendocrine Tumors: The Road Ahead. Front Endocrinol (Lausanne). 2020 Dec 15;11:604341. doi: 10.3389/fendo.2020.604341. PMID: 33384663; PMCID: PMC7770585).

Известно, что наряду с изменением структуры ДНК вследствие генетических мутаций, большое значение для патогенеза опухолей имеют и эпигенетические альтерации (Mitsuhashi K, Yamamoto I, Kurihara H, Kanno S, Ito M, Igarashi H, Ishigami K, Sukawa Y, Tachibana M, Takahashi H, Tokino T, Maruyama R, Suzuki H, Imai K, Shinomura Y, Yamamoto H, Nosho K. Analysis of the molecular features of rectal carcinoid tumors to identify new biomarkers that predict biological malignancy. Oncotarget. 2015 Sep 8;6(26):22114-25. doi: 10.18632/oncotarget.4294. PMID: 26090613; PMCID: PMC4673150). Фенотип метилирования CpG-островков в зависимости от гистологического типа опухоли может быть связан как с положительным, так и с отрицательным прогнозом (Furlan D, Sahnane N, Mazzoni M, Pastorino R, Carnevali I, Stefanoli M, Ferretti A, Chiaravalli AM, La Rosa S, Capella C. Diagnostic utility of MS-MLPA in DNA methylation profiling of adenocarcinomas and neuroendocrine carcinomas of the colon-rectum. Virchows Arch. 2013 Jan;462(1):47-56. doi: 10.1007/s00428-012-1348-2. Epub 2012 Dec 9. PMID: 23224118; Karpathakis A, Dibra H, Thirlwell C. Neuroendocrine tumours: cracking the epigenetic code. Endocr Relat Cancer. 2013 May 20;20(3):R65-82. doi: 10.1530/ERC-12-0338. PMID: 23429748). Wang Y. et al. в 2020 году опубликовали результаты изучения полногеномного метилирования ДНК с попыткой создания математической модели колоректального рака, основанной только на эпигенетических характеристиках опухоли без учета клинических характеристик (Wang Y, Zhang M, Hu X, Qin W, Wu H, Wei M. Colon cancer-specific diagnostic and prognostic biomarkers based on genome-wide abnormal DNA methylation. Aging (Albany NY). 2020 Nov 17;12(22):22626-22655. doi: 10.18632/aging.103874. Epub 2020 Nov 17. PMID: 33202377; PMCID: PMC7746390).

Обширный поиск не выявил зарегистрированного способа мониторинга клинического течения нейроэндокринных неоплазий толстой кишки. Из литературных источников известна работа Ohki и соавторов, где сообщалось, что потеря гетерозиготности онкосупрессора PHLDA3 ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и высоким риском метастазирования нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (Ohki R, Saito K, Chen Y, Kawase T, Hiraoka N, Saigawa R, Minegishi M, Aita Y, Yanai G, Shimizu H, Yachida S, Sakata N, Doi R, Kosuge T, Shimada K, Tycko B, Tsukada T, Kanai Y, Sumi S, Namiki H, Taya Y, Shibata T, Nakagama H. PHLDA3 is a novel tumor suppressor of pancreatic neuroendocrine tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jun 10;111(23):E2404-13. doi: 10.1073/pnas.1319962111. Epub 2014 May 27. PMID: 24912192; PMCID: PMC4060701). Позднее Kojima и соавторы проверили наличие данной ассоциации в случае ректальных НЭН (Kojima M, Chen Y, Ikeda K, Tsukada Y, Takahashi D, Kawano S, Amemiya K, Ito M, Ohki R, Ochiai A. Recommendation of long-term and systemic management according to the risk factors in rectal NETs patients. Sci Rep. 2019 Feb 20;9(1):2404. doi: 10.1038/s41598-018-37707-z. PMID: 30787304; PMCID: PMC6382938). Авторы исследовали потерю гетерозиготности в генах MEN1 и PHLDA3 у 79 пациентов японской популяции с ректальными НЭН. Выборка пациентов была представлена 58 (73,4%) мужчинами и 21 (26,6%) женщиной. Средний возраст составил 58,5±12,8 лет. По гистоморфологическим характеристикам 72 (91,1%) опухолевых образца имели признаки НЭН G1, 7 (8,9%) – признаки НЭН G2. Лимфатическая инвазия составила 16,5% случаев, рецидив отмечен в 3,8% случаев. Авторами было показано, что лимфатическая инвазия является независимым риском метастазирования лимфатических узлов, а потеря гетерозиготности PHLDA3 ассоциирована с наличием нескольких первично множественных опухолей (p = 0,02). Несмотря на то, что потеря гетерозиготности PHLDA3 является эффективным прогностическим маркером клинического течения НЭН поджелудочной железы, данный показатель не позволяет оценить риски лимфатической инвазии и возможного метастазирования в случае ректальных НЭН.

Тем не менее, определение статуса метилирования генов давно зарекомендовало себя как метод диагностики различных онкозаболеваний.

В качестве прототипа был выбран способ диагностики колоректального рака, основанный на определении статуса метилирования BOLL, CDX1, CLIC4, DCC, ESR1, GATA4, GDNF, HLA-G, JUB, MYOD1, NKX2-1, PENK, PITX2, PTGS2, RARB, S100A2, SALL3, SEZ6L, SFRP2, SPARC, TCEB2, TFPI2, THEBD, TJP2, TMEFF2, TP53, TWIST1, WT1 (US 2016/0355885 A1). Метод предполагает использование технологии RT-PCR или microarray для определения статуса метилирования вышеперечисленных генов. Данные о метилировании необходимо загрузить в классификатор, разработанный на основе байесовской модели, для получения сведений об образцах - наличие или отсутствие колоректального рака. Такой способ имеет несколько недостатков:

1. Большой набор генов, необходимых для исследования.

2. Обучение и постоянное обновление модели, лежащей в основе классификатора.

3. Точность способа зависит от числа и определенных сочетаний генов с высоким процентом метилирования и может сильно варьировать.

Изобретение «Cпособ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки» является новым, так как изучение прогностической роли статуса метилирования 8 генов-онкосупрессоров AHR, APCA, DAPK, MGMT, MLH1, P16, RASSF1A, RUNX3 и ретротранспозона LINE1 ранее не использовалось для прогнозирования клинического течения НЭН толстой кишки.

Задачей изобретения является определение различных молекулярных подтипов нейроэндокринных новообразований толстой кишки на дооперационном этапе для прогноза клинического течения заболевания.

Техническим результатом является разработка способа прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки.

Технический результат достигается тем, что у пациента производят забор биопсийного образца опухолевой ткани, образцы замораживают в жидком азоте для транспортировки в лабораторию и для хранения, выделение геномной ДНК из ткани проводят следующим образом: фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, помещают в лизирующий раствор, дальнейшее выделение ДНК проводят по методу фенол-хлороформной экстракции, выделенную ДНК обрабатывают в ходе бисульфитной конверсии с помощью набора EpiJET Bisulfite Conversion Kit, Thermo Scientific, анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 35 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1x ПЦР-буфер,0,2 mМ dNTPs, MgCl2, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 0,4mkM прямого и обратного праймеров. амплификацию проводят на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: первичная денатурация: 95°С 5 мин, 45 циклов: 95°С 20 с; 72°С 20 с. терминальное удлинение цепи 72°С 10 мин, ампликоны, полученные после постановки ПЦР на матрице бисульфит-конвертированной ДНК, подвергают очистке, денатурации и отмывке с последующим отжигом с секвенирующим праймером при 80°С и постановкой реакции пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMark Q24, Qiagen, Germany согласно инструкции производителя, постановку пиросеквенирования каждого образца проводят, как минимум, в двух повторах, полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software, Qiagen, Germany, значение метилирования отдельного CpG-сайта используют для вычисления усредненного метилирования промоторного участка каждого гена (Met, %), при статусе метилирования MеtLINE1 более 72%, MеtАРС1 менее 11%, MеtMGМT менее 10,5%, MеtRАSSF1А менее 12% и MеtRUNX3 менее 10% следует ожидать благоприятного клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки, а при значениях MetLINЕ меньше или равно 72%, MetАPС1 больше или равно 11%, MetМGМТ больше или равно 10,5%, MetRАSSF1А больше или равно 12% и MetRUNX3 больше или равно 10%, напротив, следует ожидать неблагоприятного клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки.

Способ основан на феномене эпигенетических изменений ДНК, заключающихся в метилировании определенных регуляторных сайтов генов, что способствует инициации неопластического процесса.

Заявленный способ включает следующие этапы: отбор биопсийного материала, выделение тотальной ДНК из тканевых проб с помощью метода фенол-хлороформной экстракции; бисульфитное конвертирование ДНК с последующим использованием её в качестве матрицы для амплификации участков регуляторных районов в присутствии ген-специфичных праймеров; пиросеквенирование полученных ампликонов в присутствии специфичного праймера; статистическая обработка данных на соответствие контрольным значениям уровня метилирования, рассчитанным на основании экспериментальных данных для условно нормальных и опухолевых тканей толстой кишки.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

У пациента производят забор биопсийного образца опухолевой ткани. Образцы замораживают в жидком азоте для транспортировки в лабораторию и для хранения.

Выделение геномной ДНК из ткани проводят следующим образом: фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, помещают в лизирующий раствор. Дальнейшее выделение ДНК проводят по методу фенол-хлороформной экстракции.

Выделенную ДНК обрабатывают в ходе бисульфитной конверсии с помощью набора EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Scientific).

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 35 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1x ПЦР-буфер,0,2 mМ dNTPs, MgCl2, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 0,4mkM прямого и обратного праймеров.

Амплификацию проводят на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе:

- первичная денатурация: 95°С 5 мин.

- 45 циклов:

- 95°С 20 с;

- 72°С 20 с.

- терминальное удлинение цепи 72°С 10мин.

Ампликоны, полученные после постановки ПЦР на матрице бисульфит-конвертированной ДНК, подвергают очистке, денатурации и отмывке с последующим отжигом с секвенирующим праймером при 80°С и постановкой реакции пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMark Q24 (Qiagen, Germany) согласно инструкции производителя. Постановку пиросеквенирования каждого образца проводят, как минимум, в двух повторах. Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany). Значение метилирования отдельного CpG-сайта используют для вычисления усредненного метилирования промоторного участка каждого гена (Met, %).

Вывод об изменении статуса метилирования делают, сравнивая значения Met, полученные для опухоли, с контрольным значением. Под контрольным значением понимают нижнюю границу 95%-ого доверительного интервала, вычисленного для опухолей толстой кишки, гиперметилированных по исследованному локусу. Генетический локус признают гиперметилированным, если вычисленное Met равно или превышает контрольное значение.

Считая пороговое значение для метилирования промоторного региона гена показатель 10%, было установлено, что наиболее часто в статусе гиперметилирования находились гены APC, RASSF1А, RUNX3, MGMT и, соответственно, гипометилирования - DAPK, MLH1, AHR, Р16. Благоприятное клиническое течение наблюдали в случаях НЭН толстой кишки со следующими показателями: MеtLINE1>72%, MеtАРС1<11%, MеtMGМT<10,5%, MеtRАSSF1А<12% и MеtRUNX3<10%. Напротив, при значениях MetLINЕ ≤ 72%, MetАPС1≥11%, MetМGМТ≥10,5%, MetRАSSF1А≥12% и MetRUNX3≥10% НЭН толстой кишки характеризовались неблагоприятным исходом заболевания.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример №1

Пациентка Б., 75 лет, считала себя больной с февраля 2016 года, когда появились жалобы на нарушение стула по типу запоров. В июле 2016 года в лечебно-профилактическом учреждении по месту жительства была выполнена колоноскопия с биопсией, на которой был визуализирован полип прямой кишки. Гистологическое заключение содержало описание хронического воспаления в стенке кишки с гиперсекрецией слизи. Было рекомендовано эндоскопическое электрохирургического удаление полипа. Патоморфологическое заключение исследования операционного материала указывало на наличие низкодифференцированной нейроэндокринной карциномы солидного строения с глубоким инвазивным ростом в подслизистом слое. Диагноз был подтвержден иммуногистохимическим методом, значение Ki-67 45%. В послеоперационном периоде пациентка была дообследована в НМИЦ онкологии г. Ростов-на-Дону. По данным МРТ органов малого таза в прямой кишке на уровне нижне-ампулярного отдела и анального канала отмечалось циркулярное утолщение стенок до 0,8 см. На ПЭТ-КТ в прямой кишке отчетливо визуализировалась очаговая активность злокачественного характера. По данным молекулярно-генетического исследования в опухоли отмечалось гипометилирование генов APC1, MGMT, RASSF1A, RUNX3 и гиперметилирование ретротранспозона LINE-1 (MеtLINE1>72%, MеtАРС1<11%, MеtMGМT<10,5%, MеtRАSSF1А<12% и MеtRUNX3<10%). Прогнозируя благоприятное течение заболевания на основании эпигенетического статуса опухоли, пациентке было предложено проведение консервативного лечения и диспансерное наблюдение. По данным контрольных обследований признаков прогрессирования заболевания не наблюдается.

Пример №2

Пациент А., 49 лет, поступил в отделение 26.03.2019 года с диагнозом: нейроэндокринная опухоль (Ki-67 1%) восходящей ободочной кишки T2N0M0 stI, кл.гр.2. Согласно клиническим рекомендациям, была выполнена гемиколэктомия правосторонняя с расширенной лимфаденэктомией. По результатам патоморфологического исследования операционного материала был подтвержден диагноз нейроэндокринной опухоли на основании положительной экспрессии стандартных иммуногистохимических маркеров: хромогранина А, синаптофизина. При молекулярно-генетическом исследовании опухоли подтвержден статус гиперметилирования генов APC1, MGMT, RASSF1A, RUNX3 и гипометилирование ретротранспозона LINE-1 (MetLINЕ ≤ 72%, MetАPС1≥11%, MetМGМТ≥10,5%, MetRАSSF1А≥12% и MetRUNX3≥10%). Ожидая неблагоприятное течение заболевания, больному выполнялась компьютерная томография органов брюшной полости с интервалом в 1 месяц. В мае 2020 года у пациента было выявлено прогрессирование заболевания с метастатическим поражением S5-S6 сегментов печени. Пациент умер спустя 1 месяц после выявления прогрессирования. Таким образом, несмотря на верифицированный диагноз нейроэндокринной опухоли ободочной кишки (G1, Ki-67 = 1%), традиционно считающейся новообразованием с относительно доброкачественным клиническим течением, онкологический процесс отличился агрессивным характером. Оценка эпигенетического статуса генов позволило спрогнозировать риск неблагоприятного исхода заболевания.

Технико-экономическая эффективность «Способа прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки» позволяет на дооперационном этапе выделять две категории пациентов на основании благоприятного и неблагоприятного прогноза клинического течения заболевания, соответственно, и определять рациональную тактику ведения пациента.

Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения предоперационного диагноза, позволяет своевременно определить молекулярный подтип нейроэндокринного новообразования толстой кишки.

Похожие патенты RU2771421C1

название год авторы номер документа
Способ диагностики метастазов рака толстой кишки 2016
  • Кит Олег Иванович
  • Водолажский Дмитрий Игоревич
  • Тимошкина Наталья Николаевна
  • Двадненко Константин Владимирович
  • Солдаткина Наталья Васильевна
  • Геворкян Юрий Артушевич
RU2647470C2
Метод определения уровня метилирования промоторной области гена COL1A2 для диагностики рака толстой кишки 2015
  • Боярских Ульяна Александровна
  • Соколова Екатерина Алексеевна
  • Ширшова Арина Николаевна
  • Кель Александр Эдуардович
  • Филипенко Максим Леонидович
RU2612890C1
Способы скрининга рака 2012
  • Лай Хунчэн
RU2700088C2
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ 2012
  • Шеймс Дэвид
  • Джануарио Томас Е.
RU2614254C2
Тест-система и способ выявления делеций гена SESN1 2021
  • Сычевская Ксения Андреевна
  • Кравченко Сергей Кириллович
  • Судариков Андрей Борисович
RU2772504C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НАРУШЕНИЮ БАРЬЕРНОЙ ФУНКЦИИ КОЖИ 2015
  • Кузьмина Людмила Павловна
  • Измерова Наталья Ивановна
  • Коляскина Мария Михайловна
  • Шипулин Герман Александрович
  • Миронов Константин Олегович
  • Ивченко Елена Васильевна
  • Дунаева Елена Алексеевна
  • Петинати Яна Александровна
  • Кузьмин Сергей Николаевич
  • Коляскин Михаил Владимирович
RU2585960C1
СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЙ НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ 2015
  • Можей Олег Игоревич
  • Королёва Юлия Александровна
  • Мазунин Илья Олегович
RU2633752C2
Способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы 2020
  • Кит Олег Иванович
  • Трифанов Владимир Сергеевич
  • Колесников Евгений Николаевич
  • Тимошкина Наталья Николаевна
  • Гвалдин Дмитрий Юрьевич
  • Трифанов Дмитрий Сергеевич
RU2747679C1
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ПАТОЛОГИИ 2010
  • Измеров Николай Федотович
  • Кузьмина Людмила Павловна
  • Шипулин Герман Александрович
  • Миронов Константин Олегович
  • Фомина Валерия Сергеевна
  • Безрукавникова Людмила Михайловна
  • Коляскина Мария Михайловна
  • Дунаева Елена Алексеевна
  • Дедков Владимир Георгиевич
RU2459585C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ САЙТОВ PuCGPy РЕГУЛЯТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ-ОНКОМАРКЕРОВ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА МЕТОДОМ GLAD-ПЦР-АНАЛИЗА И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА 2015
  • Абдурашитов Мурат Абдурашитович
  • Акишев Александр Григорьевич
  • Давидович Евгения Сергеевна
  • Дегтярев Сергей Харитонович
  • Дубинин Евгений Викторович
  • Евдокимов Алексей Альбертович
  • Кузнецов Виталий Викторович
  • Михеев Валерий Николаевич
  • Нетесова Нина Александровна
  • Сметанникова Наталья Анатольевна
  • Карпов Андрей Борисович
  • Тахауов Равиль Манихович
  • Сазонов Алексей Эдуардович
  • Халюзова Мария Вячеславовна
  • Альбах Елена Николаевна
  • Исубакова Дарья Сергеевна
RU2596404C1

Реферат патента 2022 года Способ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки

Изобретение относится к медицине, а именно к области генетики и молекулярной онкологии, и касается способа прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки. Способ включает отбор биопсийного материала, выделение тотальной ДНК из тканевых проб с помощью метода фенол-хлороформной экстракции, бисульфитное конвертирование ДНК с последующим использованием её в качестве матрицы для амплификации участков регуляторных районов в присутствии ген-специфичных праймеров, пиросеквенирование полученных ампликонов в присутствии специфичного праймера, определение метилирования промоторного участка гена. При статусе метилирования MetLINE1 более 72%, MetAPC1 менее 11%, MetMGMT менее 10,5%, MetRASSF1A менее 12% и MetRUNX3 менее 10% следует ожидать благоприятное клиническое течение заболевания, при значениях MetLINE меньше или равно 72%, MetAPC1 больше или равно 11%, MetMGMT больше или равно 10,5%, MetRASSF1A больше или равно 12% и MetRUNX3 больше или равно 10%, напротив, следует ожидать неблагоприятное течение заболевания. Изобретение позволяет на дооперационном этапе выделять две категории пациентов на основании благоприятного и неблагоприятного прогноза клинического течения заболевания и определять рациональную тактику ведения пациента. 2 пр.

Формула изобретения RU 2 771 421 C1

Способ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки заключается в том, что у пациента производят забор биопсийного образца опухолевой ткани, образцы замораживают в жидком азоте для транспортировки в лабораторию и для хранения, выделение геномной ДНК из ткани проводят следующим образом: фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, помещают в лизирующий раствор, дальнейшее выделение ДНК проводят по методу фенол-хлороформной экстракции, выделенную ДНК обрабатывают в ходе бисульфитной конверсии с помощью набора EpiJET Bisulfite Conversion Kit, Thermo Scientific, анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 35 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1x ПЦР-буфер, 0,2 мМ dNTPs, MgCl2, 1 ед. акт. Taq-DNA-полимеразы, по 0,4 мкM прямого и обратного праймеров, амплификацию проводят на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: первичная денатурация: 95°С 5 мин., 45 циклов: 95°С 20 с; 72°С 20 с, терминальное удлинение цепи 72°С 10 мин, ампликоны, полученные после постановки ПЦР на матрице бисульфит-конвертированной ДНК, подвергают очистке, денатурации и отмывке с последующим отжигом с секвенирующим праймером при 80°С и постановкой реакции пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMark Q24, Qiagen, Germany согласно инструкции производителя, постановку пиросеквенирования каждого образца проводят, как минимум, в двух повторах, полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software, Qiagen, Germany, значение метилирования отдельного CpG-сайта используют для вычисления усредненного метилирования промоторного участка каждого гена (Met, %), при статусе метилирования MеtLINE1 более 72%, MеtАРС1 менее 11%, MеtMGМT менее 10,5%, MеtRАSSF1А менее 12% и MеtRUNX3 менее 10% следует ожидать благоприятного клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки, а при значениях MetLINЕ меньше или равно 72%, MetАPС1 больше или равно 11%, MetМGМТ больше или равно 10,5%, MetRАSSF1А больше или равно 12% и MetRUNX3 больше или равно 10%, напротив, следует ожидать неблагоприятного клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2771421C1

Способ диагностики метастазов рака толстой кишки 2016
  • Кит Олег Иванович
  • Водолажский Дмитрий Игоревич
  • Тимошкина Наталья Николаевна
  • Двадненко Константин Владимирович
  • Солдаткина Наталья Васильевна
  • Геворкян Юрий Артушевич
RU2647470C2
КУСТОВА И.Ф
и др
Потенциал использования биомаркеров метилирования для диагностики и прогноза гепатоцеллюлярной карциномы методом жидкостной биопсии / Успехи молекулярной онкологии, 2018, 5(4), стр
Топка с несколькими решетками для твердого топлива 1918
  • Арбатский И.В.
SU8A1
КВАША С.М
Современные методические подходы к определению статуса метилирования ДНК и их применение в онкологии /

RU 2 771 421 C1

Авторы

Кит Олег Иванович

Колесников Евгений Николаевич

Трифанов Владимир Сергеевич

Гвалдин Дмитрий Юрьевич

Мещерякова Милана Юрьевна

Даты

2022-05-04Публикация

2021-07-28Подача