Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного Российский патент 2018 года по МПК C12N15/00 C12N15/62 C12N15/63 A61P19/10 C07K19/00 

Область применения

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а конкретно к рекомбинантному белку склеростина, способу его получения, а также способу повышения костной массы позвоночного животного, особенно млекопитающего. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине для лечения остепороза у позвоночных животных, в том числе млекопитающих и человека. Таким образом, заявленная группа изобретений расширяет арсенал средств, используемых для исследования и лечения остеопороза.

Известный уровень

Среди костных заболеваний наиболее распространенным и драматичным по последствиям остается остеопороз (ОП). С клинических позиций развитие ОП определяется многочисленными факторами: возрастом, массой тела, наступлением менопаузы, приемом глюкокортикоидов и других препаратов, влияющих на костный метаболизм, сопутствующими заболеваниями, и др. На тканевом уровне эти факторы приводят к дисбалансу остеокласт-опосредованной костной резорбции и остеобласт-опосредованного формирования костной ткани с нарушением нормального гомеостаза костной системы и как следствие - к потерям костной массы. Современные концепции фармакологического лечения ОП направлены на ограничение остеокласт-опосредованной костной резорбции. Наиболее изученными и распространенными препаратами являются азотсодержащие бисфосфонаты, которые индуцируют апоптоз остеокластов. Активность остеокластов ограничивают также кальцитонин, эстрогены, селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, а также новый утвержденный антирезорбтивный препарат деносумаб, представляющий собой гуманизированное антитело против рецептора активатора нуклеарного фактора κB (NF-κB), который функционирует как ингибитор образования остеокластов. В США, Канаде, России и некоторых странах Европы разрешен к применению анаболический препарат - паратироидный гормон - терипаратид, который пока в единственном числе выступает в качестве противовеса многочисленным антирезорбтивным препаратам. Однако последние экспериментальные и клинические исследования указывают на то, что данная ситуация должна коренным образом измениться в ближайшем будущем. Это связано в первую очень с открытием белков-ингибиторов, регулирующих костный гомеостаз. Среди таких белков наибольшее внимание привлекает склеростин [Дыдыкина И.С., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма костной ткани. Науч.-практич. ревматол. 2013;3(51): 296-301]. Склеростин является эндогенным ингибитором канонического Wnt/β-катенин-сигнального пути. В его присутствии предшественники остеобластов не подвергаются воздействию Wnt-сигнала, в результате процесс дифференциации остеобластов приостанавливается. Wnt-сигнальный путь прямо влияет на процессы формирования и регенерации костной ткани, а модуляция этого пути может оказаться полезной для лечения ОП и других костных заболеваний [Drake М., Farr J.N. Inhibitors of sclerostin; emerging concepts. Curr. Opin. Rheumatol. 2014;26(40):45-52, Lewieski E.M. Role of sclerostin in bone and cartilage and its potential as a therapeutic target in bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2014;2(6):48-57]. Изучение ряда редких генетических заболеваний, в частности остеосклерозирующих, позволило выявить участие Wnt-сигнального пути в регуляции формирования костной ткани [Дыдыкина И.С., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма костной ткани. Науч.-практич. ревматол. 2013;3(51):296-301]. С другой стороны, склеростин, который продуцируется остеоцитами, ограничивает процесс формирования костной ткани во избежание избыточного окостенения. Например, при генетически детерминированных заболеваниях костной ткани, проявляющихся избыточным окостенением (остеосклероз, болезнь ван Бухема), установлен дефект гена SOST, локализующегося в хромосоме 17q12-21 и отвечающего за экспрессию склеростина [Garnero P. Sclerostin - a specific biochemical marker of osteocyte function. Lyon, 2011. 20 р.]. В соответствии с современной концепцией лечения ОП антирезорбтивные агенты служат препаратами первой линии для уменьшения риска переломов костей у пациентов с ОП, а препараты анаболического действия обычно рекомендуются только при выраженном/тяжелом ОП. Однако при потере костной массы микроструктура кости (микроархитектоника) не может быть восстановлена только за счет влияния на функцию остеокластов. Таким образом, будущая технология лечения ОП будет направлена на реверсию ОП за счет максимального увеличения плотности костной ткани и сохранения микроархитектоники на начальной стадии, а достигнутые результаты будут поддерживаться за счет антирезорбтивной терапии, применяемой на второй стадии.

Сегодня известно, что склеростин представляет собой циркулирующий ингибитор сигнального пути Wnt, который продуцируется остеоцитами и подавляет функцию рецептор - связывающего протеина LPR5. Антитела, направленные против склеростина, обладают анаболическими свойствами. Склеростин-нейтрализующие моноклональные антитела блокируют остеоцит-продуцированный склеростин, который является антагонистом Wnt-сигнального пути и предотвращает связывание Wnt и корецептора LRP5/6. Связанный/блокированный склеростин позволяет связаться Wnt с комплексом LRP5/6, тем самым стимулируя активность Wnt/β-катенин сигнального пути в остеобластах, что приводит в конечном итоге к увеличению их остеосинтетической активности и повышению костеобразования.

За последние годы появилось огромное количество работ о ведущей роли Wnt/β-катенин-сигнального пути в дифференциации остеобластов, пролиферации, и, в конечном счете, в формировании новой костной ткани [Ke H.Z., Richards W.G., Li X., et al.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases. Endocr Rev. 2012;5(33):747-83, Kim J.H., Liu X., Wang J., et al. Wnt signaling in bone formation and its therapeutic potential for bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2013;1(5):13-31, Moester M.J., Papapoulos S.E., C.W., et al. Sclerostin: current knowledge and future perspectives. Calcif. Tissue Int. 2010;2(87):99-107]. Как множество подобных регулирующих сетей, Wnt-регуляция модулируется комплексом агонистов и антагонистов, соотносительное действие которых определяет, будет ли Wnt-сигнальный путь стимулироваться или же ингибироваться. Склеростин идентифицирован только десять лет назад как гликопротеин, продуцирующийся остеоцитами, способный блокировать связывание Wnt и корецептора LRP5/6. У людей с гетерозиготной мутацией, приводящей к инактивации одной копии гена склеростина, сывороточные уровни склеростина приблизительно наполовину ниже нормы, но темпы формирования костной ткани значительно увеличены. Эти результаты позволили предположить, что снижение уровня склеростина может быть новым направлением в регуляции костной массы, что послужило активизации исследований по созданию и апробированию новых анаболических агентов. Открытие склеростина и установление его биологической роли как негативного регулятора остеобластогенеза вызвало большой интерес к склеростину как к перспективной мишени для разработки нового терапевтического подхода к лечению ОП [Willams В. Insights into the mechanism od sclerostin action in regulating bone mass accrual. J. Bone Miner. Res. 2014;1(29):24-8]. Ha сегодняшний день уже созданы гуманизированные моноклональные антитела к склеростину, действие которых было апробировано на грызунах и обезьянах [ЕА 201491286, ЕА 201000559, ЕА 200702402, ЕА 200600037]. При этом был получен убедительный положительный эффект, и в настоящее время их изучение активно продолжается [Drake М., Farr J.N. Inhibitors of sclerostin; emerging concepts. Curr. Opin. Rheumatol. 2014;26(40):45-52].

Многочисленные экспериментальные исследования, проведенные буквально за последние 10 лет с использованием различных моделей заболеваний костной ткани, убедительно демонстрируют, что ингибирование склеростина с помощью моноклональных антител положительно влияет на структуру костной ткани, повышает ее плотность, а также улучшает сращение переломов на моделях мышей и крыс [Agholme F., Macias В., Hamang М., et al.Efficacy of a sclerostin antibody compared to a low dose of PTH on metaphyseal bone healing. Orthop. Res. 2014;3(32):471-76, Hamann C., Rauner M., Y., et al. Sclerostin antibody treatment improves bone mass, bone strength, and bone defect regeneration in rats with type 2 diabetes mellitus. J. Bone Miner. Res. 2013;3(28):627-38, Li C.Y., Tan H.L., Barrero M., et al. Sclerostin antibody treatment enhances fracture healing and increases bone mass and strength in non-fractured bones in an adult rat closed femoral fracture model. J. Bone Miner. Res. 2010;1(25):S129]. Кроме того, с помощью томографического и гистоморфометрического исследований продемонстрировано дозозависимое анаболическое действие на костную ткань склеростин-нейтрализирующих моноклональных антител при подкожном введении овариэктомированным макакам с повышением образования плотности костной ткани в трабекулярной, эндо-интракортикальной и периостальной тканях без негативного влияния на качество костного матрикса [Ominsky M.S., Vlasseros F., Jolette J., et al. Two doses of sclerostin antibody in cynomolgus monkeys increases bone formation, bone mineral density, and bone strength. J. Bone Miner. Res. 2010;5(25):948-59, Ross R.D., Edwards L.H., Acerbo A.S., et al. Bone Matrix Quality After Sclerostin Antibody Treatment. J. Bone Miner. Res. 2014;7(29):1597-607]. При этом прочность костей оценивают с помощью тестов на компрессию тел III и IV поясничных позвонков. Интересно также, что гистоморфометрические исследования у грызунов и обезьян демонстрируют, что лечение ингибиторами склеростина повышает моделирование костеобразования, а не собственно ремоделирование (в ответ на костную резорбцию) [Ominsky M.S., Niu Q.-T., Li Ch., et al. Tissue Level Mechanisms Responsible for the Increase in Bone Formation and Bone Volume by Sclerostin Antibody. J. Bone Miner. Res. 2014;6(29):1424-30]. Следует отметить, что данный механизм отличается от эффектов гормона терипаратида, при котором оба процесса - формирование и резорбция - возрастают. Антисклеростин-терапия также продемонстрировала благотворное влияние на процесс сращения костей у грызунов с ускорением репарации, повышением прочности кости и увеличением плотности костной мозоли [Agholme F., Macias В., Hamang М., et al.Efficacy of a sclerostin antibody compared to a low dose of PTH on metaphyseal bone healing. Orthop. Res. 2014;3(32):471-76,18]. Следует подчеркнуть, что терапия антителами к склеростину повышает плотность и прочность новообразованной костной ткани, [Ominsky M., Samadfan R., Jolette J., et al.Sclerostin monoclonal antibody stimulates bone formation and improves the strength and density of the fracture callus and lumbar spine in a primate fibular osteotomy model. J. Bone Miner. Res. 2009;1(25):S.89-S90].

С декабря 2006 по июль 2007 г. в США проведено рандомизированное контролируемое двойное слепое исследование моноклональных антител к склеростину («ромосозумаб», Амген), которые вводились однократно, при этом участники были разделены на когорты, получающие различные дозы исследуемого препарата [Padhi D., Jang G., Stouch В., et al.Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011;1(26):19-26]. Участники получали терапевтическое антитело или плацебо - подкожно или внутривенно. По сравнению с плацебо однократное подкожное введение антитела повысило минеральную плотность костной ткани (МПКТ) в поясничных позвонках и бедренной кости во всех опытных группах. Повышение МПКТ было дозозависимым. Большинство побочных эффектов, по мнению исследователей, были умеренными [Padhi D., Jang G., Stouch В., et al.Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011;1(26):19-26].

Однако применение антительной терапии против ОП имеет проблему введения в организм больших количеств эндогенного рекомбинантного антитела от 3-х (ромосозумаб, «Амген», США) до 6-ти (блосозумаб, «Эли Лилли», США) граммов в год, и сопутствующие осложнения, характерные для препаратов терапевтических моноклональных антител.

Таким образом, несомненна необходимость разработки альтернативного подхода, основанного на синтезе аутоантител против белка-мишени, в создании безопасной в применении профилактической вакцины против остеопороза, лечебные свойства которой будут равноценны по свойствам уже имеющимся препаратам на основе экзогенных антител, а сопутствующие побочные эффекты существенно снижены.

В уровне техники не были выявлены решения, аналогичные заявляемому. Однако использование фрагмента склеростина в качестве иммуногена известно из ЕА 200600038. Данное решение является ближайшим аналогом заявляемой группы изобретений.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в создании рекомбинантного иммунологически активного склеростина, обладающего достаточной иммуногенностью для образования антител к склеростину, который может быть использован для терапии, в том числе смоделированного ОП. Другая задача изобретения заключается в создании инъекционной формы иммуногенной композиции на основе указанного белка и в разработке способа повышения плотности костной ткани.

Изобретение относится к способу получения целевого рекомбинантного белка склеротина позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающему конструирование векторной конструкции, обеспечивающей стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli, выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген склеростина, очистку белка склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента, последующую отмывку и выделение целевого продукта, при этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование, в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс, в результате чего получают конструкцию, содержащую последовательности, кодирующие целевой ген склеростина и последовательность из шести гистидинов в виде слитного белка.

Также изобретение относится к способу повышения костной массы позвоночного животного, в том числе млекопитающего и человека, включающему двукратное, с интервалом в 14 суток, проведение подкожных инъекций целевым рекомбинантным белком склеростином, полученным вышеуказанным способом, в дозе 0,1-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела позвоночного животного и человека, при этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить костную массу.

Техническим результатом, достигаемым при реализации заявленных изобретений, помимо расширения арсенала средств, применяемых для изучения и лечения остеопороза, является снижение побочных эффектов сопутствующих применению препаратов экзогенных антител при сохранении уровня лечебных свойств.

Примеры

Пример 1. Получение рекомбинантного склеростина мыши

Аминокислотная последовательность белка склеростина видоспецифична, поэтому для каждого вида должен быть синтезирован и модифицирован соответствующий ген с уникальной последовательностью.

Вначале осуществляют получение гена склеростина мыши с последующим его клонированием. Ген склеростина мыши получали химико-ферментативным методом. Был спланирован олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, фланкированный сайтами BamHI и Kpn2I, оптимизированный для экспрессии в E. coli. Затем осуществляли получение плазмиды рССТ - в вектор pQE13 (QIAGEN, США) по сайтам BamHI и Kpn2I был вставлен спланированный олигонуклеотидный дуплекс, в результате чего была получена конструкция, содержащая последовательности, кодирующие ген склеростина мыши и последовательность из шести гистидинов для аффинной очистки целевого белка SEQ ID NO 1 в виде слитного белка.

Пример 2. Получение штамма E. Coli - продуцента рекомбинантного антигена склеростина мыши

Для получения штамма E. coli - продуцента рекомбинантного белка склеростина мыши клетки E. coli M15 трансформировали плазмидой рССТ. Для наработки целевого белка клетках E. coli M15 в культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма E. coli M15 [рССТ], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой массе для рекомбинантного белка склеростина мыши 13,9 кДа. Уровень синтеза белков в E. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок склеростина мыши синтезируется в клетках E.coli в нерастворимой форме в виде телец включения.

Пример 3. Очистка рекомбинантного белка склеростина мыши

Для получения рекомбинантного белка склеростина клеточную культуру штамма E. coli М15 [рССТ] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5500g в течение 15 минут.

Биомассу с рекомбинантным склеростином ресуспендировали в буфере 20 м MTris-HCl рН 8.0+50 мМ NaCl в соотношении 1:10. Добавляли к суспензии клеток лизоцим до концентрации 25 мкг/мл, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора во льду в течение 2 мин. Осаждали нерастворимую фракцию телец включения центрифугированием 15000g 15 мин 4°С. Осадок ресуспендировали в буфере 20 мM Tris 8.0+50 мМ NaCl+0.1% Тритон Х-100 в соотношении 1:10 для отмывки мембранных белков и липидных компонентов клетки от тел включения (ТВ). Осаждали нерастворимую фракцию 15000g 15 мин 4°С. Повторяли отмывку ТВ дважды. Затем таким же образом дважды отмывали осадок в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+50 мМ NaCl либо в воде, чтобы отмыть Тритон Х-100. Отмытые ТВ ресуспендировали 1:4 в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+50 мМ NaCl. Солюбилизировали в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz в соотношении 1:10. Нерастворившиеся компоненты отделяли ЦФ 15000g 15 мин 4°С. Далее проводили хроматографическую очистку на сорбенте WB40Ni (Bio Works, Sweden). Колонку с сорбентом WB40Ni (BioWorks, Sweden) объемом 7 мл уравновешивали буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz. Лизат ТВ наносили на скорости потока 1 мл/мин. После нанесения проводили отмывку сорбента от неспецифики буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz, затем буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+25 мМ Iz. Элюцию целевого белка проводили буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины +250 мМ NaCl+400 мМ Iz. Пик, соответствующий целевому белку, собирали и анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Степень чистоты препарата составляла не менее 95%. Полученные фракции белка диализовали против физраствора.

Пример 4. Приготовление иммуногенной композиции белка склеростина мыши и гидроокиси алюминия

В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат, содержащий рекомбинантный белок склеростина мыши, суспендировали в растворе гидроокиси алюминия в равном объеме.

Пример 5. Влияние иммунизации склеростином на увеличение плотности костной ткани мышей.

Биологическая активность полученной иммуногенной композиции была исследована путем подкожных инъекций дважды с интервалом 20 суток в дозе 0,1-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела мыши.

Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного склеростина мыши с помощью нарабатываемых аутоантител.

Исследование влияния иммунизации склеростином на увеличение плотности костной ткани самок мышей проводили на модели ОП, вызванного овариоэктомией. В эксперименте 8-месячные самки мышей линии Balb/c(21 голова) были случайным образом распределены на 3 группы (по 7 голов): ложнооперированные (группа №1), овариоэктомированные мыши с инъекциями физ.раствора (группа №2), овариоэктомированные мыши с инъекциями склеростином (дважды по 5 мкг подкожно с интервалом 14 суток) (группа №3).

Перед проведением хирургических процедур животных выдерживали на голодной диете для облегчения перенесения наркоза. Для введения животных в общий наркоз проводили интраперитониальную инъекцию смеси анестетиков «Золетил 100» (Virbac С.А., Франция) в дозировке 30 мг/кг веса и «Рометар» (Bioveta, Чехия) в дозировке 10 мг/кг веса. Для предотвращения иссушения роговицы глаз на них наносили «Normlgel» ( Health Care AB, Швеция). Все хирургические процедуры проводили в ламинарном боксе с соблюдением правил асептики и антисептики. Животных фиксировали в лежачем положении на спине на хирургическом столике для грызунов, оборудованном нагревательным элементом для обеспечения поддержания во время операции постоянной температуры тела на уровне 36°С (Rigalli et al., 2009). Хирургическое поле освобождали от шерсти, обрабатывали кожным антисептиком, после чего в нижней части живота проводили лапаротомию длиной 2-3 см, открывая доступ к матке. Далее матку сдвигали в сторону и накладывали 2 лигатуры - между яичниками и маткой и на артерии яичника. Затем яичники удаляли, ткани послойно ушивали атравматическим шовным материалом. Опыты по иммунизации животных проводили через месяц после операции. В группе №1 (ложнооперированные животные) осуществляли только хирургический доступ к яичникам без их последующего удаления и иммунизации препаратом. Инъекции физ.раствора либо иммуногенной композицией склеростина (группы №2 и 3) проводили дважды: через 30 и 45 суток после овариоэктомии. Компьютерную томографию осуществляли in vivo на томографе SkyScan 1176 (Bruker, США) сразу после проведения операции, через 60 суток после операции и перед эвтаназией (120 дней после операции).

Исследование плотности костной ткани диафизарной части бедренных костей обеих задних лап животных проводили с помощью микрокомпьютерной томографии. Сканирование осуществляли с алюминиевым фильтром 0,5 мм, напряжением 60 кВ, силой тока 575 мА и разрешением 35 мкм с последующим анализом плотности костной ткани (BMD, bonemineraldensity). Реконструкция полученных изображений проводилась в программе NRecon (v.1.6.9.8). В качестве настроек реконструкции были выбраны: Postalignment - «300», Smoothing - «3», Ringartefactcorrection - «14», Beam-hardening - «18%». После проведения реконструкции полученные 3D-модели бедренных костей были исследованы с помощью программного обеспечения CTAn (v.1.16) (Bruker, США). Анализу подвергался губчатый матрикс диафизарной части бедренной кости, при этом кортикальный матрикс был удален программно. Плотность костной ткани определялась с помощью калибровочных фантомов с плотностью 0,25 и 0,75 г/мм².

Статистический анализ результатов исследования проводился на программе Statistica 12.0 (Statsoft, США) с помощью непараметрических критериев Краскела-Уоллиса и Фридмана (р<0,01).

Результаты исследования влияния инъекций склеростина на плотность костной ткани мышей приведены на фиг. 1. При исследовании динамики изменений плотности костной ткани бедренных костей ложнооперированных животных (группа №1) не наблюдалось достоверных изменений плотности костной ткани на протяжении всего периода наблюдения. В группе №2 на сроке 2 и 3 (60 и 120 дней после операции) наблюдалась отрицательная динамика изменения плотности костной ткани (р<0,01). В группе №3 на сроке 2 было установлено снижение плотности костной ткани, при этом к 60 суткам после операции (срок 3) проходило возращение значений плотности костной ткани к первоначальному уровню. При сравнении групп между собой наблюдалось достоверное отличие между группами №2 и 3 по сравнению с группой №1 на сроке 2, а также отличие у групп №1 и 2 между собой на сроке 3. Достоверных отличий на сроке 3 между группой №1 ложнооперированных мышей и опытной группой №3 с овариоэктимированными мышами, которым проводили инъекции склеростина, не было выявлено, что свидетельствует о положительном влиянии инъекций склеростина на восстановление плотности костной ткани при остеопорозе.

Другим важным количественным параметром, характеризующим степень развития остеопороза, является толщина трабекул губчатой кости. Определение этого параметра проводится также на участке кости, лишенном кортикальной части, с помощью 3D-анализа бинаризованных изображений. При этом бинаризация проводится таким образом, чтобы получаемые 3D-изображения, соответствующие микроархитектуре исследуемого участка, были лишены нежелательных программных шумов и артефактов. Результатом анализа является усредненное значение толщины трабекул исследуемого участка, которое может быть использовано при количественном сравнении степени развития остеопороза в разных экспериментальных группах.

При исследовании динамики изменений структуры губчатой части бедренных костей ложнооперированных животных (группа №1) не наблюдалось достоверных изменений толщины трабекул губчатой кости (фиг. 2) и плотности костной ткани на протяжении всего периода наблюдения (фиг. 1).

В группе №2 на сроке 2 и 3 (30 и 60 недель после операции) наблюдалось уменьшение толщины трабекул губчатой кости и плотности костной ткани (р<0,01). При этом в группе №3 значения показателей толщины трабекул губчатой кости и плотности костной ткани, сниженные на сроке 2, возвращались к первоначальному уровню к 60 суткам после операции (срок 3).

Для увеличения плотности костной ткани возможно проведение третьей и последующих иммунизаций через каждые 3 месяца после повторной инъекции.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1. Результаты исследования влияния инъекций склеростина на плотность костной ткани мышей.

Фиг. 2. Результаты исследования влияния инъекций иммуногенной композиции на основе склеростина на толщину трабекул губчатой костной ткани.

* - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой №1 (р<0,01)

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и иммунобиологии. Описан способ получения рекомбинантного белка склеростина позвоночного животного. Конструируют векторную конструкцию, обеспечивающую стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli. Выращивают клетки штамма Е. coli, экспрессирующие ген склеростина. Очищают белок склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента. Затем отмывают и выделяют целевой продукт. При этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование. Для этого в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс с получением конструкции, содержащей последовательность, кодирующую слитый белок целевого склеростина и шести гистидинов. Также описан способ повышения костной массы позвоночного животного, особенного млекопитающего и человека. Двукратно, с интервалом в 20 суток, проводят иммунизацию целевым рекомбинантным белком склеростином в дозе 0,1-100 мкг склеростина на один килограмм массы тела позвоночного животного. При этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить плотность костной ткани. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине для лечения остеопороза у позвоночных животных и человека. Таким образом, заявленная группа изобретений расширяет арсенал средств, используемых для исследования и лечения остеопороза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр., 2 ил.

1. Способ получения целевого рекомбинантного белка склеростина позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающий конструирование векторной конструкции, обеспечивающей стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli, выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген склеростина, очистку белка склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента, последующую отмывку и выделение целевого продукта, при этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование, в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс с получением конструкции, содержащей последовательность, кодирующую слитый белок целевоого склеростина и шести гистидинов.

2. Способ повышения костной массы позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающий двукратное, с интервалом в 20 суток, проведение иммунизации целевым рекомбинантным белком склеростином, полученным способом по п. 1, в дозе 0,1-100 мкг склеростина на один килограмм массы тела позвоночного животного, при этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить плотность костной ткани.

3. Способ по п. 2, включающий проведение третьей и последующих иммунизаций через каждые 3 месяца после повторной инъекции.