Рекомбинантный белок GBO-ActRIIB для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы Российский патент 2023 года по МПК C07K19/00 C07K14/475 A61K38/18 A61P21/00 C12P1/00 

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и ветеринарии, а именно к рекомбинантному белку GBD-ActRIIB, включающему фрагмент рецептора ActRIIB (активиновый рецептор II типа В) и глюкансвязывающий домен (GBD), способу получения белка GBD-ActRIIB на альфа-глюкане, инъекционному препарату на основе белка GBD-ActRIIB, а также способу использования указанного инъекционного препарата для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

Уровень техники

Активиновые рецепторы (ActR) - гликопротеины с молекулярной массой -55 кДа, представляющие собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического серин/треонинкиназного домена. Рецепторы активина подразделяются на типы I и II, каждый из которых представлен двумя изоформами - А и В.

Рецепторы ActRIIA и ActRIIB были идентифицированы как рецепторы II типа для активинов [1, 2]. Кроме активинов, ActRIIA и ActRIIB могут взаимодействовать с несколькими белками суперсемейства TGF-β, включая ВМР7, Nodal, GDF8 и GDF11 [3-6].

GDF8 (growth differentiation factor 8), также известный как миостатин, - это секретируемый фактор роста, который подавляет рост и дифференцировку мышечной ткани. Миостатин экспрессируется в мышцах и затем выделяется в кровь, оказывая свое действие на мышцы за счет связывания с рецепторами ActRII (activin type II receptor) [7].

GDF8 представляет собой негативный регулятор массы скелетных мышц. Нокаут гена GDF8 у трансгенных мышей характеризуется выраженной гипертрофией и гиперплазией скелетных мышц [8]. Аналогичное увеличение массы скелетных мышц обнаружено при наличии природных мутаций GDF8 у крупного рогатого скота [9-12]. Пьемонская и бельгийская голубая породы коров несут мутацию гена GDF8, которая вызывает выраженное увеличение мышечной массы [13].

Путем манипулирования с активностью GDF8 можно вызвать значительные физиологические изменения в организме. Исследования на животных показали, что блокирование миостатина приводит к значительному увеличению сухой мышечной массы с практически полным отсутствием жировой прослойки [14]. В настоящее время ведется разработка целого ряда блокаторов действия миостатина.

Патент US 6096506 A заявляет антитело, которое специфически связывается с миостатином.

Патент US 6468535 B1 заявляет способ увеличения мышечной массы животного путем введения моноклонального антитела против миостатина и блокирования его активности.

Кроме этого, известен патент RU 2613420 C1, заявляющий о получении слитого белка с последовательностью миостатина, способного в составе иммуногенной композиции индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину, блокировать его действие и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани.

Разработан препарат ACVR2B на основе растворимой формы рецептора ActRIIB. Белок ACVR2B имеет участок, способный связываться со свободным миостатином, блокируя его способность активировать рецепторы ActRIIB на поверхности миобластов. Варианты полипептидов ActRIIB, обладающие значительно сниженным сродством к активину (например, активину А и/или активину В) по сравнению с другими лигандами ActRIIB, такими как GDF11 и/или миостатин, называются ловушками GDF. Данный препарат был создан Se-Jin Lee (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore). Препарат-ловушка с ACVR2B доказал высокую эффективность на лабораторных мышах. Был зафиксирован мышечный прирост после четырех недель применения препарата. Максимальные показатели мышечного прироста были достигнуты при двух инъекциях в неделю, в дозировке 50 мкг на килограмм массы тела. Мышечная масса этих мышей увеличилась на 61% по сравнению с исходной [15]. Модулированию роста тканей с помощью растворимых форм ActRIIB посвящены патенты US 8252900 B2 и US 8343933 B2. В патенте US 8710016 B2 предлагается использовать лиганд ActRIIB для терапии мышечной дистрофии. Как заявлено в патенте US7842663B2, ловушки GDF могут применяться для повышения мышечной массы и снижения жировой массы. В заявке на патент US 2016/0031993 A1 указано, что моноклональные антитела к ActRIIB могут использоваться для роста мышечной ткани и лечения мышечных расстройств, таких как мышечные потери.

Однако все предложенные технологии блокирования биологической активности миостатина имеют целый ряд ограничений при использовании, поскольку требуют систематического применения дорогостоящих моноклональных антител к миостатину, растворимых форм лигандов-ловушек на основе рецептора ActRIIB или моноклональных антител к рецепторам ActRIIA и ActRIIB на протяжении многих месяцев. Таким образом, крайне актуальна разработка новых технических решений для снижения концентрации миостатина в крови животных и уменьшения связывания с рецепторами ActRIIB на поверхности миобластов. Одной из альтернативных технологий, реализованных в настоящем изобретении, является блокирование рецептора ActRIIB и миостатина с помощью аутоантител.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено изобретение является разработка нового эффективного способа увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в частности в разработке инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и способа его использования.

Достигаемый технический результат заключается в увеличении мышечной массы и повышении мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в легкой очистке белка, где концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB. Кроме того, технический результат заключается в получении универсального средства для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, то есть разработанное средство может быть использовано для всех сельскохозяйственных животных и птиц. Также белок по изобретению имеет повышенную устойчивость к протеазам в сравнении с нативной конформации антигена ActRIIB и демонстрирует высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у иммунизированных животных и птиц может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе блокировать путем индукции синтеза специфических аутоантител эндогенный рецептор ActRIIB, препятствуя его связыванию с миостатином и/или снижая его активность в организме в течение длительного времени, ингибировать сигнал клеткам мышечной ткани, останавливающим их рост.

Механизм действия основан на индукции синтеза специфических аутоантител к эндогенному рецептору ActRIIB, блокировании активности эндогенного миостатина в сыворотке крови и индукции комплексных перестроек адаптивного генеза, выражающихся в структурных преобразованиях в организме и стимуляции роста мышечной ткани.

При реализации изобретения были решены следующие задачи:

1) создание рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с молекулярной массой 36 кДа, включающего фрагмент рецептора ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 3, разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 4 в клетках Escherichia coli BL21, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB;

2) создание инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте, разработка эффективного способа использования этого препарата в виде подкожных или внутримышечных инъекций, решающего задачу повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики и др.) и птицы за счет индукции синтеза специфических аутоантител к ActRIIB, блокировании его действия, снижения активности эндогенного миостатина в сыворотке крови и, как следствие, стимуляции роста мышечной ткани при условии несистематического применения препарата.

Следует отметить, что аминокислотная последовательность ActRIIB высокогомологична (>90%) у всех сельскохозяйственных животных и птиц. Вследствие этого разработанный препарат представляет собой универсальное средство для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

Решение первой поставленной задачи обеспечивается получением рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с молекулярной массой 36 кДа, включающего фрагмент белка ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, глицин-сериновый спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 3.

Способ получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на альфа-глюкане включает следующие стадии:

1) выращивание клеток штамма Е. coli BL21, экспрессирующих ген, кодирующий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4;

2) связывание рекомбинантного белка GBD-ActRIIB в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli BL21 с глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;

3) последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.

Рекомбинантный белок GBD-ActRIIB включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена (GBD), определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащим сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на альфа-глюкане. Иммобилизация на альфа-глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке альфа-глюкансвязывающего домена из Streptococcus mutans, который обладает высоким сродством к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений рН 6,0-9,0 и концентраций соли 0-3 Μ NaCl.

Поскольку в клетках Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках Е. coli рекомбинантный белок GBD-ActRIIB является единственным белком клеток штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа-глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на альфа-глюкансодержащем сорбенте.

Решение второй поставленной задачи обеспечивается созданием инъекционного препарата для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы. Полученный препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе. Метод повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы включает двукратное с интервалом в 20 суток проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, в дозе 5-100 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

Таким образом, получен активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к ActRIIB при введении в составе инъекционного препарата сельскохозяйственным животным и птице и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани и повышать мясную продуктивность.

Осуществление изобретения

Первым этапом работы стал дизайн рекомбинантного белка GBD-ActRIIB. Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 4), кодирующая фрагмент рецептора ActRIIB (SEQ ID NO 1), спейсер (SEQ ID NO 2) и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3). Для эффективной экспрессии в Ε. coli последовательность химерного гена оптимизировали по кодонному составу и вторичной структуре мРНК.

В составе слитого рекомбинантного белка представлен фрагмент рецептора ActRIIB, соответствующий внеклеточному лигандсвязывающему домену. В аминокислотной последовательности фрагмента ActRIIB может содержаться одно или более изменений относительно природного полипептида ActRIIB, но не в лигандсвязывающих последовательностях. Помимо целевого антигена, в состав слитого рекомбинантного белка может входить один или более дополнительных доменов, придающих желаемое свойство, такое как простая и эффективная очистка, например, последовательность полигистидина, слитого с глутатион-8-трансферазой или, предпочтительно, последовательность глюкансвязывающего домена (GBD) по изобретению, который придает целевому белку высокое сродство к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем, позволяя осуществлять эффективную иммобилизацию рекомбинантного белка на глюкансодержащем сорбенте и получение высокоочищенного препарата целевого белка GBD-ActRIIB, не содержащего примесей других бактериальных белков, ДНК штамма-продуцента, липополисахаридов и эндотоксинов.

Полисахарид-связывающий домен может быть присоединен к антигену ActRIIB через оптимально сконфигурированный спейсер переменной длины. Спейсер необходим для обеспечения представления антигена ActRIIB на поверхности белковой молекулы, а также оптимальной презентации иммунной системе животного. Представленный в данном изобретении вариант спейсера с последовательностью SEQ ID NO 2 обеспечивает эффективное формирование нативной конформации антигена ActRIIB, повышенную устойчивость к протеазам, оптимальное воздействие на иммунную систему и в экспериментах по иммунизации сельскохозяйственных животных и птиц с целью увеличения мышечной массы продемонстрировал неожиданное улучшение по сравнению с конструкциями, не имеющими спейсерной последовательности и/или других последовательностей, отличных от представленной в настоящем изобретении.

Целевой ген, кодирующий слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4 синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием. В результате получили плазмиду pGBD-ActRIIB, кодирующую белок GBD-ActRIIB. Для экспрессии рекомбинантного белка предпочтительно использование клеток Е. coli BL21 и их производных, обеспечивающих высокий уровень синтеза целевого слитого белка, а также плазмидных векторов экспрессии типа рЕТ.

Далее получали штамм-продуцент рекомбинантного белка GBD-ActRIIB. Для этого клетки Е. coli BL21 трансформировали полученной плазмидой pGBD-ActRIIB. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 Μ раствора изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 ч при 37°С.При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD-ActRIIB - 36 кДа. Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок GBD-ActRIIB синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения.

Для получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 Μ раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 g в течение 15 мин.

Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок GBD-ActRIIB оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8 Μ мочевине, центрифугировали 30 мин при 12000 g и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в 4 раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25°С в течение 2 ч. Центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза.

Иммобилизованный на альфа-глюкане слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты белкового препарата составляла не менее 90%. Консервацию проводили добавлением бензилового спирта до концентрации 0,1%.

Слитый белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец включения, растворение телец включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и т.п.

Полученный слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Следует отметить, что полисахарид-связывающий домен можно заменить другими полипептидами, например, фрагмент антигена ActRIIB можно комбинировать с KLH (keyhole limpet hemocyanin, гемоцианин лимфы улитки), столбнячным токсоидом, CRM197 (разновидность дифтерийного токсина) или другими белковыми носителями.

Таким образом, по разработанной простой и эффективной технологии был получен слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB для последующего создания на его основе инъекционного препарата для введения сельскохозяйственным животным и птице с целью увеличения мышечной массы. Концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, как правило, она составляет 4-6 мг/мл.

Следующим этапом исследования стала разработка инъекционного препарата на основе белка GBD-ActRIIB для введения сельскохозяйственным животным и птице. Инъекционный препарат представляет собой варианты иммуногенной композиции на основе слитого рекомбинантного белка GBD-ActRIIB (в качестве антигена), суспендированного в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте. Препарат стерилизуется с помощью ультрафильтрации. Альтернативно, иммуногенные композиции в данном изобретении могут быть приготовлены с использованием индивидуально простерилизованных компонентов перед окончательным составлением композиции.

Инъекционный препарат, представляющий собой иммуногенную композицию по настоящему изобретению, включает слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB (1-10 мг/мл), декстран-500 (1-10 мг/мл), DEAE-декстран-500 (0,2-2,0 мг/мл).

Варианты иммуногенной композиции содержат в своем составе оптимизированные адъюванты (пример №2), которые обеспечивают индукцию гуморального иммунного ответа, стабильны, безопасны и эффективны при использовании для сельскохозяйственных животных и птицы. В их составе отсутствуют продукты животного происхождения и канцерогенные соединения. Иммуногенные композиции в данном изобретении могут быть приготовлены в виде стерильной масляной эмульсии с Montanide™ (примеры №3 и 4) или взвеси с гидроокисью алюминия (пример №5). Варианты иммуногенных композиций в данном изобретении могут дополнительно включать диспергирующие или смачивающие агенты, суспендирующие агенты или другие подобные материалы.

Во всех вариантах исполнения иммуногенная композиция должна быть стерильной, стабильной в условиях производства и хранения. Предотвращение роста числа микроорганизмов может быть достигнуто путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, бензилового спирта, парабенов, хлорбутанола, сорбиновой кислоты, тиомерсала и т.п.

Типичные варианты реализации изобретения направлены на сельскохозяйственных животных и птиц, которым вводят инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB по данному изобретению с целью ограничения или предотвращения воздействия эндогенного миостатина на мышечную ткань, что приводит к дополнительному росту мускулатуры. Иммуногенный инъекционный препарат с рекомбинантным белком GBD-ActRIIB и адъювантами оптимизирован для использования у позвоночных, в частности, для лечения заболеваний, вызывающих деградацию мускулатуры. Поскольку рецептор ActRIIB высококонсервативен у позвоночных, варианты реализации настоящего изобретения пригодны для индукции иммунного ответа у всех целевых позвоночных, иммунизированных с использованием способов и композиций, описанных в данном изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инъекционный препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в растворе альфа-глюкана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50% по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем). Разработан способ использования инъекционного препарата по изобретению путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата двукратно с интервалом 20 суток в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

За счет связывания рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с высокополимерными растворимыми полисахаридами формируются молекулярные комплексы большого размера (20-40 нм), обеспечивающие иммуногенность препарата и устойчивость к деградации протеазами. Таким образом, антиген ActRIIB по настоящему изобретению присутствует в тканях у сельскохозяйственных животных и птицы более продолжительное время, оказывая более длительное воздействие на иммунную систему. Настоящее изобретение также обеспечивает максимизированный иммунный ответ за счет оптимизированных адъювантов.

Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у иммунизированных животных и птиц может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе блокировать путем индукции синтеза специфических аутоантител эндогенный рецептор ActRIIB, препятствуя его связыванию с миостатином и/или снижая его активность в организме в течение длительного времени, ингибировать сигнал клеткам мышечной ткани, останавливающим их рост. Как следствие, изобретение обеспечивает способ увеличения мышечной массы, повышения мышечной силы и повышение плотности костей у сельскохозяйственных животных и птицы. Заболевания или расстройства, в терапии или профилактике которых могут использоваться иммуногенные композиции по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, дряхлость, кахексию, возрастную саркопению, мышечное истощение, миопатию, мышечную дистрофию, остеопороз, ожирение, сердечную недостаточность или заболевания сердца.

Таким образом, заявленное изобретение, а именно новый инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB и способ его использования, обладает научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентным преимуществом для достижения технического результата, заключающегося в увеличении мышечной массы и повышении мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в легкой очистке белка, где концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB, в получении универсального средства для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, повышенную устойчивость к протеазам в сравнении с нативной конформации антигена ActRIIB, рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов.

Реализацию изобретения рассмотрим на характерных примерах, которые приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо способом рамок данного изобретения.

Пример 1. Получение рекомбинантного белка GBD-ActRIIB

Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 4), кодирующая фрагмент рецептора ActRIIB (SEQ ID NO 1), спейсер (SEQ ID NO 2) и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutatis (SEQ ID NO 3). Далее ген (SEQ ID NO 4) синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием.

На основе плазмидного вектора экспрессии типа рЕТ получили плазмиду pGBD-ActRIIB, кодирующую белок GBD-ActRIIB, путем клонирования гена (SEQ ID NO 4) в указанную материнскую плазмиду.

Для экспрессии рекомбинантного белка использовали клетки Е. coli BL21, что обеспечило высокий уровень синтеза целевого слитого белка.

Для этого клетки Е. coli BL21 трансформировали полученной плазмидой pGBD-ActRIIB. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 Μ раствора изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 ч при 37°С.При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD-ActRIIB - 36 кДа. Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок GBD-ActRIIB синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения.

Для получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 Μ раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 g в течение 15 мин.

Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок GBD-ActRIIB оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8 Μ мочевине, центрифугировали 30 мин при 12000 g и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в 4 раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25°С в течение 2 ч. Центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза.

Иммобилизованный на альфа-глюкане слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты белкового препарата составляла не менее 90%. Консервацию проводили добавлением бензилового спирта до концентрации 0,1%.

Слитый белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец включения, растворение телец включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и т.п.

Полученный слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении.

Концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, как правило, она составляет 4-6 мг/мл.

Пример 2. Получение иммуногенной композиции с рекомбинантным белком GBD-ActRIIB

Стандартными методами при стандартных условиях проводили соединение полученного очищенного слитого белка GBD-ActRIIB с водно-масляной суспензии Montanide или гидроокиси алюминия.

В конкретных вариантах осуществления изобретения препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в растворе альфа-глюкана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50% по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем), и используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата двукратно с интервалом 20 суток в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

Эффективность применения инъекционного препарата на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы иллюстрируется следующими примерами.

Пример 3. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела поросят

В условиях промышленного свиноводческого комплекса поросятам породы ландрас в возрасте 100-120 суток с массой тела 50-55 кг подкожно вводили препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50% по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 5-100 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животного. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных.

Результаты исследования представлены в таблице 1. Как видно из полученных данных, двукратное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела поросят через 60 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка на 4,8% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг - на 13,7%; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг - на 11,8%.

В таблице 2 представлены результаты определения методом иммуноферментного анализа уровня аутоантител к миостатину в сыворотках крови поросят после иммунизации препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB.

Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов.

Из данных таблиц 1 и 2 следует, что оптимальной дозой препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, для индукции аутоантител у животных является доза, равная 50 мг/кг массы тела животного.

Пример 4. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела быков холмогорской породы

В условиях откормочного комплекса бычкам холмогорской породы в возрасте 10 месяцев подкожно вводили препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50% по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Как видно из представленных в таблице 3 данных, двукратное (с интервалом 20 суток) введение бычкам калмыцкой породы препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 10,8% по сравнению с контрольной группой животных.

Пример 5. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела индеек

Препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, внутримышечно вводили индейкам (самцам) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) в возрасте 30 суток. Препарат применяли в дозах 5 и 50 мкг/кг рекомбинантного белка GBD-ActRIIB, суспендированного в среде из альфа-глюкана (50% по массе), суспензии гидроокиси алюминия (50% по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 5-50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела птицы. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 20 суток) введение индейке (самцы) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела животных через 70 суток после второй инъекции препарата при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка на 12,1%, а в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 13,6% относительно контрольной группы птиц.

Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими. Возможные иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.

Список использованных источников

1 Mathews L.S., Vale W.W. // Cell. - 1991. - V. 65. - P. 973-982.

2 Attisano L., Wrana J.L., Cheifetz S., Massague J. // Cell. - 1992. - V. 68. - P. 97-108.

3 Yamashita H., ten Dijke P., Huylebroeck D. et al. // J. Cell Biol. - 1995. - V. 130. - P. 217-226.

4 Lee S.J., McPherron A.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2001. - V. 98. - P. 9306-9311.

5 Yeo C, Whitman M. // Mol. Cell. - 2001. - V. 7. - P. 949-957.

6 Oh S.P., Yeo C.-Y., Lee Y. et al. // Genes Dev. - 2002. - V. 16. - P. 2749-2754.

7 Carnac G., Ricaud S., Vemus В., Bonnieu A. // Mini Rev. Med. Chem. 2006. V. 6. P. 765-770.

8 McPherron A.C, Lawler A.M., Lee S.J. // Nature. - 1997. - V. 387. - P. 83-90.

9 Ashmore C.R., Parker W., Stokes H., Doerr L. // Growth. - 1974. - V. 38. - P. 501-507.

10 Swatland H.J., Kieffer N.M. // J. Anim. Sci. - 1994. - V. 38. - P. 752-757.

11 McPherron A.C, Lee S.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - V. 94. - P. 12457-12461.

12 Kambadur R., Sharma M., Smith T.P., Bass J.J. // Genome Res. - 1997. - V. 7. - P. 910-915.

13 Grobet L., Martin L.J., Poncelet D. et al. // Nat. Genet. - 1997. - V. 17. - P. 71-74.

14 Kota J., Handy C.R., Haidet A.M. et al. Follistatin Gene Delivery Enhances Muscle Growth and Strength in Nonhuman Primates // Sci. Transl. Med. - 2009. - V. 1. - P. 6ral5.

15 Lee S.J., Reed L.A., Davies M.V. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V. 102. - P. 18117-18122.

Перечень последовательностей:

SEQ ID NO 1 Последовательность аминокислот ActRIIB.

SEQ ID NO 2 Последовательность аминокислот глицин-серинового спейсера.

SEQ ID NO 3 Последовательность аминокислот альфа-глюкансвязывающего домена (GBD) из Streptococcus mutans.

SEQ ID NO 4 Последовательность нуклеотидов гена, кодирующего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и последовательность аминокислот рекомбинантного белка GBD-ActRIIB.

--->

Перечень последовательностей

SEQ ID NO 1

<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artifical Sequence

<400> 3

Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn

1 5 10 15

Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly

20 25 30

Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser

35 40 45

Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn

50 55

Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val

65 70 75

Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His

85 90 95

Leu Pro Gly Ser

100

SEQ ID NO 2

<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artifical Sequence

<400> 3

Gly Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala

1 5 10 15

SEQ ID NO 3

<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Streptococcus mutans

<400> 3

Glu Leu Asn Arg Lys Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr

1 5 10 15

Glu Asn Leu Leu Arg Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln

20 25 30

Thr Phe Thr Ala Asn Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile

35 40 45

Asn Gly Asp Gln Val Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg

50 55 60

Thr Ile Gln Leu Leu Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn

65 70 75 80

Glu Asp Gly Tyr Glu Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu

85 90 95

Leu Val Thr Tyr Pro Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg

100 105 110

Ile Ala Lys Gln Val Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser

115 120 125

Ser Met Ile Ser Leu Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp

130 135 140

Pro Val Leu Tyr Ile Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Glu Thr Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln

165 170 175

Pro Gln His Pro

180

SEQ ID NO 4

CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA 60

ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACT 114

ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CCG GGT TCT GGC 162

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Pro Gly Ser Gly

1 5 10 15

TCC GGC TCT GGT TCC GGT TCT GGC GCC AGA TCC GAA CTG AAC CGC AAA 210

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Arg Lys

20 25 30

AAC TAT CAT TAT CAG CAG TTT ATT ACC GCG TAT GAA AAC CTG CTG CGC 258

Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Arg

35 40 45

GAC AAA GTG GAA AAC GAT AGC GCG GAA CCG CAG ACC TTT ACC GCG AAC 306

Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln Thr Phe Thr Ala Asn

50 55 60

GGC CGC CAG CTG AGC CAG GAT GCT CTG GGC ATT AAC GGC GAT CAG GTG 354

Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile Asn Gly Asp Gln Val

65 70 75 80

TGG ACC TAC GCT AAA AAA GGC AAC GAT TTT CGC ACC ATT CAG CTG CTG 402

Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg Thr Ile Gln Leu Leu

85 90 95

AAC CTG ATG GGC ATT ACC AGC GAC TGG AAA AAC GAA GAT GGC TAT GAA 450

Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn Glu Asp Gly Tyr Glu

100 105 110

AAC AAC AAA ACT CCA GAT GAA CAG ACC AAC CTG CTG GTG ACC TAC CCG 498

Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu Leu Val Thr Tyr Pro

115 120 125

CTG ACC GGT GTT TCT ATG GCT GAA GCT GAT CGC ATT GCG AAA CAG GTG 546

Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Ala Lys Gln Val

130 135 140

TAT CTG ACC AGC CCG GAT GAT TGG CTG CAG AGC AGC ATG ATT AGC CTG 594

Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser Ser Met Ile Ser Leu

145 150 155 160

GCG ACC CAG GTG AAA ACC AAC GAA AAC GGC GAT CCG GTG CTG TAT ATT 642

Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp Pro Val Leu Tyr Ile

165 170 175

CAG GTG CCG CGC CTG ACC CTG TGG GAT ATG ATT TAT ATT AAC GAA ACC 690

Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile Tyr Ile Asn Glu Thr

180 185 190

ATT AAA CCG GAA ACC CCG AAA GTG CCG GAA CAG CCG CAG CAT CCG AGA 738

Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln Pro Gln His Pro Arg

195 200 205

TCC GGC TCT GGT TCT GGT GGC CGC GGC GAA GCG GAA ACC CGC GAA TGC 786

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys

210 215 220

ATT TAT TAT AAC GCG AAC TGG GAA CTG GAA CGC ACC AAC CAG AGC GGC 834

Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly

225 230 235 240

CTG GAA CGC TGC GAA GGC GAA CAG GAT AAA CGC CTG CAT TGC TAT GCG 882

Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala

245 250 255

AGC TGG CGC AAC AGC AGC GGC ACC ATT GAA CTG GTG AAA AAA GGC TGC 930

Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys

260 265 270

TGG CTG GAT GAT TTT AAC TGC TAT GAT CGC CAG GAA TGC GTG GCG ACC 978

Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr

275 280 285

GAA GAA AAC CCG CAG GTG TAT TTT TGC TGC TGC GAA GGC AAC TTT TGC 1026

Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys

290 295 300

AAC GAA CGC TTT ACC CAT CTG CCG GGC AGC TAA CCG 1062

Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Gly Ser stop

305 310 315

GTCCGGAATT TCGTATGGCA ATGAAAGACG GTGAGCTGGT GATATGGGAT AGTGTTCACC 1132

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может использоваться для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы. Описан иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, содержащий фрагмент рецептора ActRIIB (активиновый рецептор II типа В) и глюкансвязывающий домен (GBD). Разработан способ получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB в составе клеточных экстрактов штамма Escherichia coli BL21, включающий связывание белка с альфа-глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия, последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта. Получен инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB, суспендированного в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте. Разработан способ использования этого препарата, включающий проведение подкожных или внутримышечных инъекций двукратно с интервалом 20 дней в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на один килограмм массы тела животного или птицы. Технический результат заключается в создании рекомбинантного белка GBD-ActRIIB, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB, а также создание инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и его способа применения. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

1. Рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, включающий фрагмент рецептора ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 3, для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

2. Способ получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB по п. 1, включающий следующие этапы:

- получение белка GBD-ActRIIB с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4 в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli BL21;

- связывание белка GBD-ActRIIB с альфа-глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;

- последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого рекомбинантного белка GBD-ActRIIB.

3. Препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы, представляющий собой композицию, содержащую рекомбинантный белок GBD-ActRIIB по п. 1, суспендированный в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте.

4. Препарат по п. 3, где приемлемым для инъекционного использования жидким адъювантом является водно-масляная суспензия Montanide или гидроокись алюминия.

5. Препарат по п. 4, где водно-масляная суспензия Montanide составляет 50% по массе или гидроокись алюминия составляет равный объем.

6. Способ использования препарата по пп. 3-5 для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птиц, включающий проведение подкожных или внутримышечных инъекций двукратно с интервалом 20 дней в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на один килограмм массы тела животного или птицы.