ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI KRX pET32b/ASFV/p30-ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА p30 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 2018 года по МПК C12N1/21 C12N15/34 C12N15/70 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Escherichia coli KRX pET32b/ASFV/p30 - продуцента антигенно активного химерного рекомбинантного белка р30 вируса африканской чумы свиней для применения в лабораторной диагностике болезни.

Уровень техники

АЧС - вирусная, контагиозная, септическая болезнь домашних свиней и диких кабанов независимо от породы и возраста, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом, высокой летальностью, сверхострым, острым, подострым, хроническим и бессимптомным течением. Возбудитель относится к семейству Asfarviridae, передается от больных животных и выживших вирусоносителей клещами Ornithodoros sp., контактным и алиментарным путем, а также трансплацентарно. Вакцины против АЧС не разработаны. С учетом этого ранняя и высокоэффективная диагностика болезни имеет решающее значение для принятия решений при ликвидации вспышек и контроле распространения болезни. Для выявления хронически или бессимптомно инфицированных животных наиболее информативными являются серологические методы, основанные на определении антител к вирусным белкам в пробах сывороток крови и органов иммунной системы животных. Согласно рекомендациям Международного эпизоотического бюро (МЭБ) для подтверждения сомнительных результатов серодиагностики АЧС непрямыми вариантами иммуноферментного анализа или реакции непрямой иммунофлуоресценции следует использовать метод иммуноблоттинга. Также его рекомендуется применять при нарушении условий хранения проб сывороток крови и для исключения ложноположительных результатов в случаях, когда антитела сывороток крови от привитых животных реагируют с антигенами клеток, использованных при изготовлении вакцин [1].

В рекомендованных МЭБ тест-системах для выявления АЧС методом иммуноблоттинга вирусные антигены происходят из живого вируса, что предполагает манипуляции с инфекционным агентом. Применение вместо них рекомбинантных белков вируса АЧС гарантирует биологическую безопасность производства диагностических тест-систем и высокую специфичность входящих в их состав антигенов.

В ранние сроки после заражения (3-6 сутки) низко-, умеренно- и высоковирулентными штаммами вируса АЧС в сыворотках крови свиней в первую очередь выявляются антитела к структурному белку р30 [2]. Поэтому применение рекомбинантного белка р30 является предпочтительным для изготовления диагностических тест-систем. Показано, что при использовании тест-системы для выявления антител к вирусу АЧС методом иммуноблоттинга на основе рекомбинантного белка р30 диагностическая специфичность и чувствительность анализа составляют 98.75% и 100.00%, соответственно. Высокая чувствительность метода иммуноблоттинга позволяет выявлять специфические к вирусу АЧС антитела в пробах сывороток крови и органов иммунной системы домашних свиней и диких кабанов, начиная с 6-8 суток после инфицирования, независимо от вирулентности и сероиммунотиповой принадлежности вируса, а также географического происхождения исследуемых проб (Восточная Европа, Южная Европа, Западная Европа, Центральная и юго-восточная Африка) [3].

Разработана методика накопления рекомбинантного белка р30 в бакуловирусной системе [4]. Однако, она технологически сложна в исполнении, поскольку предполагает выращивание личинок тутового шелкопряда (Bombyx mori) в климатической камере в течение 14 суток, затем заражение личинок рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим белок вируса АЧС р30. Конечным продуктом служил экстракт личинок, который содержал примеси клеток насекомого.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является патент, где предложено использование штамма клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) [5]. Однако низкий выход белка (2-4 мг из 1 дм³ бактериальной культуры) и наличие в препарате р30 примесей белков из E.coli после очистки на целлюлозном сорбенте ограничивают возможность его применения для изготовления диагностических тест-систем.

Для устранения перечисленных недостатков существует необходимость в бактериальных продуцентах, обеспечивающих высокий выход высокоочищенного антигенно активного белка р30 вируса АЧС.

Раскрытие изобретения

Сущностью настоящего изобретения является создание нового штамма E.coli KRX pET32b/ASFV/p30, продуцирующего химерный Rec р30 вируса АЧС со свойствами, обеспечивающими высокий выход высокоочищенного антигенно активного продукта.

Технический результат заключается в получении трансформированного плазмидным вектором pET32b(+)ASFV/p30e2 стабильного штамма E.coli KRX pET32b/ASFV/p30, продуцирующего химерный Rec р30, который можно эффективно очищать из лизата клеток и применять в лабораторной диагностике АЧС. В качестве источника нуклеотидной последовательности гена белка р30 использован актуальный для Российской Федерации штамм Ставрополь 01/08 (Stavropol2008) [3].

Задачей заявляемого изобретения является создание нового штамма E.coli, из которого можно выделить и очистить электрофоретически и иммунохимически чистый химерный рекомбинантный белок, включающий антигенно активный фрагмент белка р30 вируса АЧС.

Для достижения технического результата изобретения использовали приготовленный с использованием плазмиды pET32b(+) [6] экспрессирующий плазмидный вектор pET32b(+)ASFV/p30e2 [7] и штамм клеток E.coli KRX (Promega) [8]. В результате трансформации культуры клеток Е. coli KRX рекомбинантной плазмидным вектором pET32b(+)ASFV/p30e2 и последующей селекции получен и охарактеризован новый штамм клеток Escherichia coli KRX pET32b/ASFV/p30, который стабильно экспрессирует химерный Rec р30 с молекулярной массой ~ 40 кДа, состоящий из антигенно активного фрагмента р30, лидирующей последовательности тиоредоксина (Trx-Tag), обеспечивающей сохранение химерного Rec р30 в растворимой в воде форме, и двух полигистидиновых участков (6xHis), присутствие которых гарантирует высокую степень очистки целевого продукта на металлохелатном сорбенте (сефароза с прочно фиксированными ионами Ni²⁺) с выходом 15-20 мг с 1 дм³ бактериальной культуры.

Изобретение предполагает применение очищенного химерного Rec р30 в качестве вирусоспецифического антигена при изготовлении тест-систем для серодиагностики АЧС. В частности, штамм E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 можно использовать для получения химерного Rec р30 при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу АЧС методом иммуноблоттинга в пробах сывороток крови и органов иммунной системы домашних свиней и диких кабанов.

Новый штамм E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) 09.07.2015 года под регистрационным номером №734-МБШ. Характеристики штамма E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 приведены в таблице.

Осуществление изобретения

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма E.coli KRX pET32b/ASFV/p30.

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

Фиг. 1 - Электрофореграмма (треки 1-3) и блоттограмма (треки 4-6) хроматографически очищенного химерного Rec р30 из клеток штамма E.coli KRX pET32b/ASFV/p30.

Фиг. 2 - Антигенная активность очищенного химерного Rec р30 по результатам иммуноблоттинга (треки 1-6 соответствуют разведениям 1:32-1:1024).

Пример 1. Получение штамма клеток E.coli KRX pET32b/ASFV/p30

Для получения штамма клеток E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 сконструированной in vitro плазмидой ДНК pET32b(+)ASFV/p30e2 трансформировали клетки Е. coli штамма KRX [8]. Для этого к 50 мкл суспензии клеток Е. coli KRX вносили 1 мкл плазмиды pET32b(+)ASFV/p30e2 с концентрацией 1 мкг/мкл [7], инкубировали на льду в течение 10 минут, проводили процедуру «термошока» (42°С - 20 сек), охлаждали, а затем переносили суспензию в чашку Петри с твердой агаризованной питательной средой SOB, содержащей ампициллин (100 мкг/см³), и инкубировали в термостате при 37°С в течение 18 часов. Единичные колонии анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием матрицы ДНК клонов и праймеров, применяемых при получении ПЦР-продукта [7]. Положительный в ПЦР штамм E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 наращивали в 3 см³ питательного бульона SOB (ампициллин 100 мкг/см³), часть суспензии закладывали на хранение, а часть использовали для приготовления «ночной культуры», далее проводили процедуру подращивания освеженной культуры и индукцию экспрессии химерного Rec р30.

Штамм E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 хранили в лиофилизированном виде (SOB-бульон + СЖС,1/1) по 1 см³ либо стабилизировали в глицерине (50/50) и хранили в замороженном состоянии при температуре ниже минус 60°С. Освежали один раз в год культивированием его в жидкой питательной среде SOB или в среде LB в присутствии 100 мкг/см³ ампициллина при оптимальной температуре культивирования 37°С в течение 18 часов при умеренном встряхивании 110-120 об/мин.

Пример 2. Культивирование и хроматографическая очистка продуцируемого штаммом E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 химерного Rec р30.

Штамм E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 высевали из аликвот в 20 см³ жидкой питательной среды SOB, содержащей 100 мкг/см³ ампициллина, культивировали на термошейкере 14 часов при 37°С.

На следующий день проводили пересев «ночной культуры» на питательную среду в соотношении среды к расплодке 25:1, соответственно, и культивирование по методу Studier F.W. с соавт. [9] в среде SOB-5052 с 100 мкг/см³ ампициллина в течение 2-3 часов при температуре 37°С и умеренном встряхивании (110-120 об/мин) до концентрации (6-7)×10⁷ жизнеспособных клеток в см³. При этом оптическая плотность бактериальной культуры при длине волны 600 нм (OD₆₀₀) составляла 0,4-0,5 (процедура подращивания пересеянной на свежеприготовленную среду «ночной» бактериальной культуры). Далее бактериальную культуру инкубировали в течение 1-2 часов до концентрации (7-9)×10⁷ жизнеспособных клеток в см (OD₆₀₀ 0,5-0,6) при температуре 28°С при постоянном встряхивании. Затем вносили индуктор экспрессии рекомбинантного белка - 20% раствор L-рамнозы, в отношении 1:200 (5 см³ индуктора /1000 см³ бактериальной культуры) [6; 9, 10], и продолжали инкубировать при тех же параметрах еще 16-18 часов («автоиндукция» экспрессии химерного Rec р30).

Для приготовления лизата клеток бактериальную культуру переносили в предварительно взвешенные полипропиленовые пробирки объемом 50 см³, охлаждали в течение 1 часа при 4°С, центрифугировали при 3400 g в течение 30 мин и температуре 4°С. Супернатант удаляли, а осадок замораживали при минус 40°С. После размораживания готовили лизат, для чего клетки ресуспендировали из расчета на 1 г осадка 10 см³ лизирующего буферного раствора (6 М GuHCl на бидистиллированной воде с рН 7,6) и переносили в стеклянные флаконы по 4 см³. Биомассу разрушали тремя сериями ультразвуковой обработки с постоянным охлаждением смеси при частоте 18 кГц, каждая серия - три раза по 40 сек с перерывом в 1 мин, с перерывом между сериями - 15 мин. Лизис контролировали микроскопически, окрашивая аликвоты лизата фуксином Пфейфера. Обломки клеток удаляли центрифугированием при 13000 g в течение 5 мин. Супернатант отбирали и смешивали с двукратным буферным раствором для нанесения (Na₂HPO₄ - 40 mM, NaCl - 1М, GuHCl - 6 М, 1000х раствор Pefablock SC - 0,5 см³ (содержание в растворе 0,5 мг/см) на бидистиллированной воде в соотношении 1:1, подводя рН пробы до значения 7,8±0,2. Содержание общего белка в лизате определяли по Lowry О.Н. с соавт. [11]. Пробу при концентрации белка 2 мг/см³ фильтровали через мембранные фильтры Millipore 0,45 мкм в стеклянные флаконы, объемом 10 см³.

Для очистки химерного Rec р30 использовали хелатообразующий сорбент из гидрофильной матрицы - Ni²⁺ - сефароза (HIS-Select Nickel Affinity Gel, Sigma), рН буферных растворов в хроматографической системе 7,8±0,2. Очистку рекомбинантного белка проводили в хроматографической колонке объемом 10 см³ (например, Pharmacia Fine Chemicals) при постоянной скорости подачи растворов перистальтическим насосом 0,5 см³/мин. Для элюции химерного Rec р30 использовали фосфатный буферный раствор (ФБР) с рН 7,8±0,2: Na₂HPO₄ - 20 mM, NaCl - 0,5 М, GuHCl - 6 М, имидазол - 500 mM, 0,25 мг/см³ Pefablock SC на бидистиллированной воде. Фракцию с очищенным химерным Rec р30 диализовали в мешках Visking Dialysis Tubing тип 8/32 в ФБР с 300 мМ NaCl с рН 7,8±0,2 в течение 16-18 часов при температуре 4°С. Раствор Rec р30 делили на аликвоты и хранили в замороженном виде при температуре ниже 18°С.

Выход очищенного химерного Rec р30 составил не менее 15-20 мг с 1 дм³ бактериальной культуры, что в пять раз выше, чем при использовании прототипа. Гомогенность очищенного химерного Rec р30 доказывали методами электрофореза в денатурирующих условиях в 10% полиакриламидном геле [SDS-PAAG] [12] с последующим окрашиванием геля 0,2% Кумасси ярко-синим R-250 и методом иммуноблоттинга (см. пример 3). На электрофореграмме и блоттограмме наблюдали симметричные полосы с м.м. ~40 кДа (фиг. 1), что свидетельствовало о гомогенности химерного Rec р30, отсутствии примесей других белков и иммунохимической чистоте.

Пример 3. Оценка антигенной активности очищенного химерного Rec р30 методом иммуноблоттинга

Двукратные разведения (от 1:32 до 1:1024) хроматографически очищенного химерного Rec р30 подвергали электрофорезу в 10% SDS-PAAG [12] с последующим электропереносом полипептидов из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану в полусухой буферной системе [13]. Мембрану после электропереноса блокировали 2,0%-ным раствором обезжиренного сухого молока на ФБР с 0,1% твина-20 (ФБР-т) при 4°С в течение 16-18 часов, после чего мембрану нарезали на единичные треки (иммунострипы).

Постановку реакции иммуноблоттинга осуществляли при 25,0±2,5°С, основываясь на методиках МЭБ [14].

Параметры постановки иммуноблоттинга:

- инкубирование иммунострипов в течение 1,5 ч с исследуемыми пробами сывороток в разведениях 1:20 или с исследуемыми 20% суспензиями проб органов на ФБР-т;

- трехкратная отмывка иммунострипов в ФБР-т по 5 мин (общее время отмывки составляет 15 мин);

- инкубирование иммунострипов в течение 45 мин в рабочем разведении пероксидазного конъюгата с протеином А (рабочее разведение конъюгата 1:2000);

- четырехкратная отмывка иммунострипов в ФБР-т по 5 мин (общее время отмывки составляет 20 мин);

- окрашивание иммунострипов в растворе хромогенного субстрата в течение 10-15 с;

- остановка реакции погружением иммунострипов в дистиллированную воду;

- визуальный учет результатов реакции.

При учете результатов проводили сравнение каждого иммунострипа с отрицательным (К^-) и положительным (К⁺) контрольными образцами. Реакцию считали положительной, если выявляли окрашенную полосу различной интенсивности и ширины на уровне положительного контроля по центру иммунострипа, отрицательной - при отсутствии специфического окрашивания. Антигенную активность определяли по максимальному разведению химерного Rec р30, при котором визуально отчетливо отмечается окрашенная полоса (фиг. 2, трек 4, разведение 1:256).

Источники информации

1. Sanchez-Vizcaino J.M. African swine fever. In: Diseases of Swine/ B.E. Straw, Zimmerman J.J., D'Allaire S. and Taylor D.J. (ads.). 9th ed., Iowa State University Press. 2006: 291-298.

2. Середа А.Д., Колбасов Д.В. Белки вируса африканской чумы свиней. Научный журнал КубГАУ, 2012, 77(03). (http://ej.kubagro.ru/2012/03/pdf/48.pdf).

3. Kazakova A.S., Imatdinov I.R., Dubrovskaya O.A., Imatdinov A.R., Sidlik M.V., Balyshev V.M., Krasochko P.A., Sereda A.D. Recombinant Protein p30 for Serological Diagnosis of African Swine Fever by Immunoblotting Assay. Transbound Emerg Dis. 2016 Jul 8. (doi: 10.1111/tbed. 12539).

4. Barderas M.G., Wigdorovit A., Merelo F., Beitia F., Alonso C., Borca M.V., Escribano J.M. Serodiagnosis of African swine fever using the recombinant protein р30 expressed in insect larvae. Journal of Virological Methods. 2000, 89(1-2): 129-136.

5. Копытов В.О., Цыбанов С.Ж., Казакова А.С., Южук Т.Э., Белянин С.А. Гузалова А.Г., Власова Н.Н., Колбасов Д.В. Пат. RU 2463343 С1. Штамм клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, клон pTT9/ASFVp30, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка р30, для изготовления диагностических препаратов. №2011141517/10. Заявл. 13.10.2011. Опубл. 10.10.2012. Бюл. №28. (http://www.freepatent.ru/images/patents/54/2463343/patent-2463343.pdf).

6. Novagen рЕТ System Manual. 11 th Edition. User Protocol TB055 Rev. С 0611 JN 1-63X.

7. Середа А.Д., Иматдинов И.Р., Казакова A.C., Иматдинов А.Р., Дубровская О.А. Пат. RU 2603056 С2. Экспрессирующий плазмидный вектор pET32b(+)ASFV/p30e2 для синтеза рекомбинантного белка, состоящего из фрагмента р30 вируса африканской чумы свиней, тиоредоксина и полигистидиновых участков. №2015102383/10. Заявл. 26.01.2015. Опубл. 20.11.2016. Бюл. №32. (http://www.fips.ru/Archive4/PAT/2016FULL/2016.11.20/Index_ru.htm).

8. Single Step (KRX) Competent Cells. Technical Bulletin. Promega, 2014. - Part TB352. Rev. 12/14.

9. Green M.R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - 4^th ed. / M.R. Green and J. Sambrook. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.

10. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif., 2005, 41(1): 207-234.

11. Lowry O.H., Rosebrough M.G., Farr A.L. et al. Protein masurement with the folin phenol reagents. J. Gen. Virol., 1972, 14(1): 111-114.

12. Laemmle, U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227: 680-685.

13. Kyhse-Andersen J. Electroblotting of multiple gels:a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J. of Biochem. and Biophys. Methods, 1984, 10(3/4): 203-209.

14. Immunoblotting OIE for Serological Diagnosis of African Swine Fever. (SOP/CISA/ASF/IB/1/2008) http://asf-referencelab.info/asf/images/files/SOPs/SOP-AFSIB12008.pdf.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и ветеринарии. Предложен штамм клеток Escherichia coli KRX pET32b/ASFV/p30, полученный путем трансформации стабильного штамма E.coli KRX pET32b/ASFV/p30 плазмидным вектором pET32b(+)ASFV/p30e2 и депонированный в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №734-МБШ. Предложенный штамм стабильно экспрессирует химерный рекомбинантный белок р30 вируса африканской чумы свиней, состоящий из антигенно активного фрагмента р30, лидирующей последовательности тиоредоксина (Trx-Tag) и двух полигистидиновых участков (6xHis). Предложенный штамм позволяет получать электрофоретически и иммунохимически чистый антигенно активный химерный рекомбинантный белок р30, который может быть использован в тест-системах, предназначенных для серодиагностики африканской чумы свиней, в частности, методом иммуноблоттинга. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Штамм клеток Escherichia coli KRX pET32b/ASFV/p30, депонированный в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №734-МБШ, - продуцент антигенно активного химерного рекомбинантного белка р30 вируса африканской чумы свиней для изготовления диагностических тест-систем.