ШТАММ "СТАВРОПОЛЬ 01/08" ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ, МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.

В странах Африканского, Американского и Европейского континентов выделено более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обладающих различными биологическими свойствами. Рядом авторов проводились исследования по классификации имеющихся изолятов вируса АЧС. С этой целью они использовали перекрестное заражение свиней, реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) в культуре клеток костного мозга свиней (КМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), рестрикционный анализ ДНК, генотипирование вируса и др. [1, 3, 4, 5].

Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серотипов [2]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серотипам; Референс-штаммом I-го серотипа определен штамм «Лиссабон 57», II-го - «Конго 49», III-го - «Мозамбик 78», IV-го «Франция 32» [1].

Целью данного изобретения является получение нового вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней, обладающего стабильными культуральными и вирулентными свойствами для свиней различных возрастных групп для использования в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса АЧС от свиньи, павшей в ТОО «Горькая Балка» Советского района Ставропольского края во время эпизоотии болезни в 2008 г., который является новым, ранее неизвестным штаммом этого возбудителя, выделенным на территории РФ. Полученный вирулентный штамм обозначен как штамм «Ставрополь 01/08» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН под №278.

Новый вирулентный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические и молекулярно-генетичесие свойства. При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают округлые частицы диаметром 175-215 нм, состоящие из плотного нуклеотида, 2-слойного икосаэдрического капсида и наружной оболочки. Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1.19-1.24 г/см³, коэффициент седиментации 1800-8000 S. Нуклеотид содержит ДНК, белок и окружен электронно-прозрачным слоем. Геном вируса представлен неинфекционной, двуспиральной, линейной молекулой ДНК, состоящей из 170-190 тыс. пар нуклеотидов. На основании результатов секвенирования фрагментов гена, кодирующего структурный белок Р 72, штамм отнесен к 2-му генотипу вируса АЧС.

Антигенные свойства. Антигенные свойства штамма типичны для вируса АЧС. В вирионах идентифицированы 54 полипептида. Вирусспецифические антигены выявляются в реакциях преципитации, связывании комплемента, иммуноферментном анализе, иммунофлуоресценции, задержки гемадсорбции и др.

Типовая принадлежность. По результатам РЗГАд с использованием полученных в ГНУ ВНИИВВиМ референс-сывороток штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа.

Культуральные свойства. Штамм размножается в первичных культурах клеток КМС и ЛС. Репродукция вируса сопровождается адсорбцией эритроцитов свиней на инфицированных клетках (феномен гемадсорбции) на 3-5 сутки культивирования и их лизисом через 120-144 часов. Накопление вируса в эти сроки составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/cм3. В течение 20 серийных пассажей (срок наблюдения) штамм сохраняет эти свойства. Штамм не размножается в перевиваемых культурах клеток почки поросенка, тестикул поросенка, почки сибирского горного козерога, почки зеленой мартышки.

Инфекционная активность. Инфекционная активность штамма в культуре клеток КМС и на свиньях составляет

соответственно.

Патогенные свойства. Штамм патогенен только для свиней всех пород и возрастных групп. При внутримышечном заражении вирус вызывает их гибель с признаками острой формы болезни с характерными клиническими симптомами АЧС. У заболевших свиней на 3-5 сутки после заражения отмечают повышение температуры тела до 41,5-42,0°С, цианоз кожи, угнетение, отказ от корма, нарушение координации движений, учащенное дыхание, у отдельных животных парез задних конечностей. Длительность болезни у животных составляет от 3 до 6 суток. В ряде случаев животные погибают без проявления характерных клинических признаков АЧС на 3-4 сутки после внутримышечного заражения (сверхострая форма).

Патологоанатомические изменения. Патоморфологические изменения у взрослых свиней характерны для острой формы АЧС. На серозных оболочках внутренних органов наблюдаются кровоизлияния, в грудной и брюшной полостях скопление серозно-геморрагического экссудата, междольковая ткань легких отечна, у отдельных животных с признаками серозно-геморрагической пневмонии. Лимфоузлы увеличены, темно-красного цвета, на разрезе геморрагически воспалены. Селезенка увеличена, кровенаполнена, черного цвета. Печень кровенаполнена, дряблой консистенции, темно-коричневого цвета.

Контагиозность. Штамм контагиозен для свиней. Интактные свиньи заболевают АЧС при совместном содержании с инфицироваными штаммом «Ставрополь 01/08» животными.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Способ получения и условия хранения. Штамм хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной вируссодержащей крови, которую получают от внутримышечно зараженных свиней, находящихся в агональном состоянии. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Накопление вируса в культуре клеток КМС

В табл.1 приведены сведения по культивированию штамма «Ставрополь 01/08»» вируса АЧС в монослое культуры клеток КМС, в течение 20 последовательных пассажей.

Таблица 1 Накопление вируса АЧС в процессе пассирования Характеристика штамма * Доза заражения Накопление вируса (lg ГАЕ_50/см3)   1 пас. 5 пас. 10 пас 20 пас. Лиофилизиро-ванная вирус-кровь (2 пассаж) 1,0 6,0 6,25-6,5 6,5-6,75 6,25-7,0 0,1 6,0-6,25 6,5 6,5-7,0 6,5-6,75 0,001 6,0-6,25 6,25-7,0 6,5-6,75 6,25-7,0 Примечание: * - Доза заражения приведена в lg ГАЕ_{50/клетка.}

Как видно из табл.1, в течение 20 последовательных пассажей штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС стабильно размножается в монослое культуры клеток КМС. Через 96-120 часов культивирования при температуре 37,0-37,5°С накопление вируса составляло 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/см3. Размножение вируса сопровождалось феноменом гемадсорбции с последующим цитолизом инфицированных клеток. Заражающая доза 1,0-0,01 ГАЕ_{50/клетка} не влияла на накопление вируса. В более ранние сроки (48-72 час) цитолиз клеток наступает при инфицирующей дозе 1 ГАЕ_{50/клетка.}

Полученный вируссодержащий материал обладает высокой инфекционной активностью и может быть использован при проведении фундаментальных и прикладных НИОКР.

Пример 2.

Определение типовой принадлежности штамма «Ставрополь 01/08»

Типовая принадлежность штамма определена в РЗГАд со специфическими референс-сыворотками I-VIII серотипов по разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ методике. Установлено, что только специфическая референс-сыворотка, полученная на штамм Родезия вируса АЧС, вызывает задержку гемадсорбции штамма «Ставрополь 01/08». На основании этих исследований штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа и принят в качестве референс-штамма.

Результаты типирования штамма приведены в табл.2.

Таблица 2 Результаты типизации штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС в РЗГАд Штаммы вируса АЧС Типовые референс-сыворотки (серотип) Серотип вируса I II III IV V VI VII VIII Референс-штаммы Лиссабон - 57 - + + + + + + + I Конго - 49 + - + + + + + + II Мозамбик - 78 + + - + + + + + III Франция - 32 + + + - + + + + IV ТСП - 80 + + + + - + + + V ТС/7 + + + + + - + + VI Уганда + + + + + + - + VII Родезия + + + + + + + - VIII Испытуемый вирус Ставрополь 01/08 + + + + + + + - VIII Примечание: (-) - отсутствие (задержка) ГАд   (+) - специфическая ГАд

Пример 3

Изучение биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ.

При изучении биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных при мониторинговых исследованиях в РФ, в качестве референс-штамма использовали штамм «Ставрополь 01/08». Результаты этих исследований приведены в табл.3.

Таблица 3 Результаты изучения вируса АЧС, выделенного в РФ Наименование штаммов и изолятов Биологические свойства Наличие ГАд * Титр вируса в культуре КМС Форма болезни Генотип Серотип   Референс-штамм Ставрополь 01/08 + 6.0-7.0 Острая 2 VIII   Изучаемые изоляты Краснодар 01/09 + 6.0-6,5 Острая 2 VIII Северная Осетия + 6.0-6,5 Острая 2 VIII Ростов 01/09 + 6.25-,70 Острая 2 VIII Чечня 04/09 + 6.0-,75 Острая 2 VIII Примечание: (+) - признак положительный   * - титр вируса выражен в lg ГАЕ_50/см3

Как видно из табл.3, изоляты вируса АЧС «Краснодар 01/09», «Северная Осетия», «Ростов 01/09», «Чечня 04/09» имели сравнимые характеристики с референс-штаммом «Ставрополь 01/08». Это указывает на общность происхождения и идентичность возбудителя АЧС, циркулирующего на территории РФ.

Источники информации

1.Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И.Митин, А.Н.Курносов, В.М.Колосов, Ф.А.Бадаев, И.В.Федорищев, В.А.Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С.57-70.

2. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров и др. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практич. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С.141-143.

3. Селянинов Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О.Селянинов, В.М.Балышев, С.Ж.Цыбанов / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С.75-76.

4. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol.148, - P.693-706.

5. Malmguist W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus / W.A. Malmguist // Amer. J. Vet. Res. 1963. - P.24.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Штамм выделен от свиньи, павшей в ТОО «Горькая Балка» Советского района Ставропольского края во время эпизоотии болезни в 2008 г. Штамм является новым, ранее неизвестным, выделенным на территории РФ и обозначен как штамм «Ставрополь 01/08». Обладает высокой инфекционной активностью, накапливается в культурах клеток костного мозга свиней и лейкоцитах свиней в титре 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/см3. Титр вируса на свиньях составляет 7,0-7,5 lg ЛД_50см3. Гибель зараженных свиней наступает с признаками, характерными для острой формы АЧС через 3-6 суток после проявления клинических признаков болезни. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. 3 табл.

Штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС семейства Asfarviridae рода Asfivirus, инв. №2783, депонированный в Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, предложен в качестве вирулентного референс-штамма 8-го серотипа для проведения вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.